JP5603442B2 - 増進された細胞増殖のための表面修飾された多孔性ポリマー - Google Patents

Description

本発明は、細胞増殖（growth）を増進し、微生物の増殖を抑制する、表面処理されたポリマーの製造方法に関する。

多孔性ポリエチレン（ｐＰＥ）インプラントは長年使用されているよく確立された医療品である。前記物質は生物的適合性であり、医学界によく受け入れられている。しかしながら、従来のｐＰＥ足場（scaffold）への細胞増殖は乏しい。細胞増殖を改善するためにポリマーへの表面修飾が試みられてきた。そのようなアプローチは、自己組織化単層形成、シラン分子を通しての機能化、層−層（layer-by-layer）集合、ナノ−圧痕（indentation）並びに様々な利点及び不利点でのエッチングによる表面処理を含む。

GugalaらはJ.Biomed Mater Res A, 2006, 76, 288において、様々なプラズマを用いて、無孔のポリラクチド及び多孔性ポリラクチド上での骨芽細胞の接着特性を研究している。彼らは、アンモニア処理によって接着細胞が最大数となるが、この処理のより長い持続時間はポリマーには不利であることが証明され得るため避けるべきであると結論を出している。

米国特許第5387237号明細書は、インスリン依存性糖尿病の治療のためのバイオ人工（bioartificial）移植可能な膵臓に関する。移植のためのバイオ人工臓器は、血管新生しているチャンバー（chamber）中に生物的適合性の繊維基質又は発泡基質を含む。前記基質物質は有機又は無機物質で構成され、前記有機物質はハロゲン化及びフッ素化されていないポリエチレン、ポリプロピレン等のようなポリオレフィンから選択される。従って、基質の厚さはタンパク質、ＥＣＭ物質、成長因子物質の十分な吸着を可能とし、血液供給を発達させ、基質はまた好ましくは哺乳類の体に吸収されず、繊維の（fibriotic）過成長及びカプセル化を最小限にする。

米国特許第6551608号明細書は、抗ウイルス性及び／又は抗菌性特性を有する新規な多孔性物質に関する。その発明は、多孔性基質及び抗ウイルス剤又は抗菌剤から成ってウイルス及び／又は細菌の蓄積又は増殖に抵抗する多孔性、非繊維性物質への要求を克服する、抗ウイルス性又は抗菌性特性を有する多孔性物質を含む。前記新規な粒子の製造方法は、抗菌剤との熱可塑性物質の焼結を含む。

従って、従来技術の検討からは、当該分野において、増進した細胞増殖特性を有するポリマー組成物の必要性が明らかになる。更に、当該分野においては、そのような組成物の製造方法を提供し、そのような膜上で成長し得る様々な細胞を同定する必要がある。

文献報告は、イオン又は金属形態の遷移金属、ここでの例は銀イオン、は抗菌作用を有するが、特に水性媒体中において不安定であり、持続した期間抗菌作用を発揮できないことを示唆する。本発明においては、目的はリザーバとして機能するポリマーの組成物を提供することであり、バイオフィルムの形成を防ぐために抗菌剤の持続作用があることが必要である。これらの欠点を克服するため、本発明者は、銀イオンをナノ粒子へ還元し、同じ剤を使用してそれらをキャップし、それによって、銀ナノ粒子がバイオフィルムの形成を妨げるため、持続した抗菌作用及び望むように機能性を保持するポリマー抗菌組成物を提供する目的を達成する簡単な方法を提案する。

本発明の主な目的は、細胞増殖を増進し、微生物の増殖を抑制する、表面修飾されたポリマーの製造方法を提供することである。

本発明の別の目的は、細胞増殖の増進方法を提供することである。

本発明の更なる目的は、生じる細胞増殖の培地として機能し、同時に細菌の増殖を抑制する、表面処理されたポリマー組成物を提供することである。

更なる目的は前記組成物及び本発明の方法を使用して人工の体内組織及び臓器を作ることである。

本発明のもう一つの目的は、本明細書で上述したようにリザーバとして機能し得る表面処理されたポリマーから成形品を作ることである。

従って、本発明は、細胞増殖を増進し、微生物の増殖を抑制する表面修飾されたポリマーの製造方法を提供する。

本発明の一つの態様において、表面修飾されたポリマーの製造方法であって、前記方法が、
ａ．プラズマ処理されたポリマーを提供する工程、
ｂ．脂肪酸のソホロリピド（sophorolipid）を工程（ａ）で得たプラズマ処理された多孔性ポリマー表面に共有結合させる工程、
ｃ．工程（ｂ）で得たポリマー表面を抗菌剤の溶液にさらし、煮沸してソホロリピドによって表面上で抗菌剤のイオンをナノ粒子に還元して、表面修飾されたポリマーを得る工程、
を含む方法に関する。

本発明の別の態様において、工程（ｂ）で使用されるソホロリピドは脂肪酸由来の脂質であり、還元糖部分を有し、前記脂肪酸はステアリン酸、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸から選ばれるがそれらに限定されず、前記糖部分は好ましくはソホロース、ラムノース及びトリハロース（trihalose）である。

本発明の別の態様において、工程（ａ）で使用されるポリマーはポリエーテルイミド及びポリエチレンからなる群から選択される。

本発明の別の態様において、工程（ｃ）で使用される抗菌剤は硝酸銀である。

本発明の別の態様において、前記表面修飾されたポリマーは、微生物の増殖を抑制するのみでなく、細胞増殖を増進する。

本発明の別の態様において、工程（ａ）のプラズマ処理されたポリマーは、任意に更に金属ナノ粒子、好ましくは金を付着させる工程及びアミノ酸を金属ナノ粒子に付着させ、表面修飾されたポリマーを得る工程を含む。

本発明の別の態様において、前記アミノ酸はリジンである。

発明の別の態様において、表面修飾されたポリマーは、微生物の増殖を抑制するのみでなく、細胞増殖を増進する。

図１は異なる処理のＰＥ（ポリエチレン）足場である。図は、それぞれの処理後に測定した水接触角を表す。接触角は１１０度（処理なし）から２５度（リジン処理）まで減少する明らかな兆候がある。 グラフは異なる処理をされた足場から得られた細胞数を示す。細胞は細胞増殖の９６時間後に足場からトリプシン処理され、ノイバウエルチャンバー（Neubauer's chamber）において数えられた。 ＳＥＭ像はＰＥ足場で増殖したＮＩＨ３Ｔ３細胞を示す。細胞を１０⁴細胞／足場の密度で蒔き、９６時間増殖させ、その後に４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）によって固定した。その後、これらの足場をＳＥＭにおいて観察した。 ＰＥ足場において増殖したＣＨＯ細胞の位相差像。細胞を１０⁴細胞／足場の密度で蒔き、９６時間増殖させ、その後に４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）によって固定した。その後、これらの足場を２０倍で観察した。 オレイン酸及びリノール酸並びにそれぞれのソホロリピドの構造。 多孔性ポリエチレン足場の像。 銀ナノ粒子がちりばめられた多孔性ポリエチレン足場を得る完全な手順の描写。 ｐＰＥ足場の異なる処理後に得られた接触角。 異なる時間間隔後のＩ）ｐＰＥ−ＮＨ₂足場；ＩＩ）ｐＰＥ−ＮＨ₂−ＳＬ足場及びＩＩＩ）ｐＰＥ−ＮＨ₂−ＳＬ−Ａｇ足場に対する枯草菌（Bacillus subtilis）（Ａ）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ｂ）、及び黄色ブドウ球菌（Staphyloccocus aureus）（Ｃ）の細胞生存％を表す統計データ。

本発明において、プラズマ処理ポリマーの組成物及び機能化金属ナノ粒子が提供される。特に、前記組成物はプラズマ処理されたポリマー及び前記金属ナノ粒子を機能化する少なくとも２つのアミン基を有するアミノ酸を含む。本発明の一つの態様において、前記組成物はアミノ酸及びプラズマ処理されたポリマーを含む。

本発明のポリマーはプラズマ処理に対して安定している。前記ポリマーは任意に多孔性又は無孔である。好ましい態様は多孔性のポリエチレン及びポリエーテルイミドである。

前記金属は金、銀、白金及びそのようなものから選択されるがそれらに限定されない群を含む貴金属から選択される。本発明の一つの態様において、前記組成物はプラズマ処理されたポリマー及び非金属を含む。

前記プラズマ処理はＯ₂、ＣＯＯ^-、Ｎ₂ ^-、ＮＯ₂ ^-、Ｈ₂、ＳＯ₂＋Ｈ₂、ＮＨ₃及びそのようなものから選択されたガスを使用してなされる。

金属ナノ粒子の機能化は、アルギニン、リジン及びそのようなものから選択されるがそれらに限定されない、少なくとも２つのアミン基を有するアミノ酸を使用して実施される。

ポリマーの組成物、金属ナノ粒子の製造及びそれらの機能化のための本発明の方法は、以下の工程、
１．プラズマ、好ましくはＮ₂及びＨ₂プラズマ、を使用してポリマー表面をプラズマ処理する工程、
２．金属、好ましくは金、ナノ粒子を前記プラズマ処理された表面に付着させる工程、及び
３．アミノ酸、好ましくはリジン、分子を前記金ナノ粒子に付着させる工程、
を含む。

接触角は最初は１１０度であり、工程１においては細胞増殖が増えると共に角度は６５度に減り、工程２の後に角度はわずか４５度であり、細胞増殖が非常に高くなると共に２５°への角度の更なる減少が見られる。図１を参照のこと。

表面修飾を有するポリマーの組成物は改善された固定及び安定性と共に改善された細胞の統合を有するであろう。細胞増殖を増進する組成物はまた、増大した表面湿潤性及び表面における細胞の増進した接着及び増殖を有するだろう。

本発明の一つの態様においては、プラズマ安定ポリマーは多孔性であり、その増進した増殖のために細胞を蒔かれる。本発明の好ましい態様において、多孔性ポリマーはランゲルハンス島の細胞を蒔かれる。

本発明において、抗菌剤を有する表面処理された多孔性ポリマー組成物が本明細書に開示されている。前記抗菌剤を有する表面処理された多孔性ポリマー組成物は細胞増殖に役立つ。前記抗菌剤を有する表面処理された多孔性ポリマー組成物は細胞増殖に役立つと同時に微生物の増殖を抑制する。前記抗菌剤を有する表面処理された多孔性ポリマー組成物はポリマー、抗菌剤及び脂肪酸のソホロリピドを含む。本発明は更に、抗菌剤を有する表面処理された多孔性ポリマー組成物の製造方法を開示する。

本発明の表面処理された多孔性ポリマー組成物の製造方法は、以下の工程
ａ）多孔性ポリマーをプラズマで処理する工程、
ｂ）脂肪酸のソホロリピドをプラズマ処理された多孔性ポリマー表面に共有結合させる工程、
ｃ）工程（ｂ）のポリマー表面を抗菌剤の溶液にさらし、煮沸してソホロリピドによって表面上で抗菌剤のイオンをナノ粒子に還元する工程、
を含む。

本発明の表面処理された多孔性ポリマー−抗菌剤組成物中のポリマーはあらゆるポリマーであり、好ましくはポリエチレンである。

本発明の抗菌剤はイオン又は金属形態の遷移金属であり、好ましくは硝酸銀である。

プラズマ処理の選択肢はＮ₂及びＨ₂、酸素、二酸化炭素、二酸化硫黄−水素プラズマ及びそのようなものから選択される。

脂肪酸由来であり還元糖部分を有する脂質が、本発明の脂質である。前記脂肪酸はステアリン酸、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸型であるが、それらに限定されない。前記糖部分は好ましくはトホロース、ラムノース、トリハロース及びそのようなものである。

本発明の表面処理された多孔性ポリマー−抗菌剤組成物は、融合された粒子のネットワークであり、４００〜１０００ミクロンに形成され、１００〜１５０ミクロンの孔径を有する成形品である。

以下の実施例は、好ましい態様を含んでおり、本発明の実施を説明するのに役立ち、示される詳細は例示の目的及び本発明の好ましい態様を解説する議論の目的であることが理解される。

実施例１：ＰＥフィルムのプラズマ処理
表面修飾の方法において、ＰＥ足場の一部をＮ₂及びＨ₂ガスを含むプラズマにさらした。前記プラズマを、水素及び窒素ガス（比７：３）を電子サイクロトロン共鳴（ＥＣＲ）反応チャンバーに導入することによって励起した。ＥＣＲプラズマを、電磁石によって生み出した８７５ガウスの必要な磁場と共にＴＥ₁₁モードにおいて２．４５ＧＨｚのマイクロ波源によって励起した。ＥＣＲキャビティは高さ１５ｃｍ、直径１２．５ｃｍの円筒形のステンレス鋼チャンバーからなり、３０ｃｍの高さ及び２０ｃｍの直径を有する反応チャンバーに繋がれる。反応チャンバーをガス注入口、真空ポート、試料容器ポート及びフィードスルー（feed-throughs）のような様々なポートで容易化した。５００Ｗマイクロ波源を石英窓を通して空洞共振器に繋いだ。基礎圧力は１０^-6ｍｂａｒ（１０^-4Ｐａ）、操作圧力は１０^-2ｍｂａｒ（１Ｐａ）であった。全てのフィルムをエタノールでよく洗浄してから処理した。２０分の曝露は、続く金ナノ粒子（ＧＳＰ）の付着のための固着部位として作用するアミン基を表面上に導入した。

実施例２：ＧＮＰの層形成
それぞれの足場を２回又は３回脱イオン水で洗浄して、表面上に存在するあらゆる不純物を除去した。更に洗浄した足場を７０％アルコール中に１５分浸して完全な殺菌を確実にした。これらの足場を無菌条件下において殺菌した金ゾル中に浸した。

実施例３：リジン分子によるＧＮＰ層を形成された足場の修飾
リジンの１０^-4Ｍ溶液を脱イオン水に新しく調製した。ＧＮＰ層を形成された足場をこの溶液に浸して一晩維持し、さらされたＧＮＰ表面へのリジン分子の完全な付着を確実にした。

実施例４：細胞成長及び増殖
加湿した５％ＣＯ₂／９５％空気雰囲気において３７℃で１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む細胞培養フラスコ（ファルコン）中で、ＣＨＯ（中国ハムスター卵細胞系統）細胞を維持及び培養した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処理（０．５％トリプシン溶液）によって引き離し、遠心分離によって回収した。その後、細胞を既知の体積の培地中に１０⁵細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁した。細胞の倍加時間を、基質上に１０⁵細胞／ｍＬの濃度で細胞を蒔き、５％ＣＯ₂を用いて３７℃で培養することによって計算した。典型的な実験では、それぞれの足場を脱イオン水で十分に洗浄し、余分なリジン分子を除去し、７０％アルコールで殺菌し、層状のチャンバーの気流中で乾燥して、１２穴培養プレート中に注意深く置いた。足場の処理された側を上に向かせた。１００μＬの再懸濁させた細胞懸濁液をゆっくりと足場の表面上に蒔いた。細胞をフィルムの表面に付着させ、１０〜１５分後、配置を乱さずに１ｍＬのＤＭＥＭを穴の壁に沿って加えた。加湿した５％ＣＯ₂／９５％空気雰囲気において３７℃で２４時間及び４８時間細胞を培養した。一定の間隔で任意の顕微鏡写真を撮影して細胞増殖を観察した。

実施例５：オレイン酸及びリノール酸ソホロリピドの合成
Spencer, J. F. T.; Gorin, P. A. J.; Tulloch, A. P. Antonie Van Leeuwenhoek 1970, 36, 129.に記載されているように、カンジダ・ボンビコラ（Candida bombicola）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・アピコラ（Candida apicola）及びカンジダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）を使用する、オレイン酸及び／又はリノール酸のような脂肪酸の生体内変換によってソホロリピドを調製した。

実施例６：ｐＰＥ足場の組立
狭く分散させた（s=log D₉₀/D₁₀= 0.12）線状の高密度ポリエチレン小球のマイクロ−小球（中央粒子径、Ｄ₅₀〜３８０ミクロン：平均粒子径〜４２６ミクロン）を注文品の型（custom made moulds）において１６０℃で焼結し、平均孔径〜２０８ミクロン及び空隙率〜４６％を有する多孔性ポリエチレン足場を生じた。これらの多孔性ポリエチレン足場は、主に上顎−顔部位におけるインプラントとして臨床診療において広く使用されている多孔性ポリエチレン足場と大雑把に比較できた。結果は図２、３に見られる通りである。

実施例７
オレイン酸ソホロリピド（ＯＡ−ＳＬ）及びリノール酸ソホロリピド（ＬＡ−ＳＬ）の足場への付着。
第一工程において、ポリマー足場をＮ₂及びＨ₂プラズマで５分処理した。その後、以下に記載するように、オレイン酸ソホロリピド（ＯＡＳＬ）／リノール酸ソホロリピド（ＬＡＳＬ）分子を足場上に共有結合的に縫った（stitch）。１．５ｃｍ²の大きさのｐＰＥ足場を、１００／２００ｍｇの触媒１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣＩ）及び５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下において１００ｍｇのＯＡ−ＳＬ／ＬＡ−ＳＬと共に丸底フラスコに入れ、連続的に攪拌して３２時間還流した。反応が完了した後、上清をデカントし、足場を分離し、ＤＣＭ／ＤＭＦ／酢酸エチルで数回洗浄して、真空下で乾燥器において乾燥した。

実施例８：銀ナノ粒子の形成
実施例３に見られるようにその表面に共有結合的に縫われたＯＡ−ＳＬ及びＬＡ−ＳＬを有する足場を、煮沸条件下で１ｍＬの１Ｍ ＫＯＨ（ｐＨ〜１１）を含む５０ｍＬの１０^-3Ｍ ＡｇＮＯ₃溶液にさらした。ＳＬ分子によってＡｇ⁺イオンを還元して銀ナノ粒子へ変換した。ＳＬ(ソホロリピド)分子はポリマー足場に共有結合されているので、銀ナノ粒子がちりばめられた３Ｄ足場が生じる。これは、そうでなければ白色の足場上での茶色がかった色の発達によって示唆される。

比較例：
未処理の足場及びプラズマ処理された足場を含む比較実験も実施し、Ａｇ⁺イオンのＡｇ⁰への還元は生じなかった。これは化学的に縫われたＳＬ分子はこの反応においてキャッピング剤（capping agent）であるのみでなく還元剤であることを示唆する。
水接触角をそれぞれのレベルで測定した。図８は未処理のｐＰＥ足場は接触角１１０度の高い疎水性であることを示す。この値は我々が足場をプラズマ及びソホロリピドで処理するにつれて大幅に減少していく。これらのソホロリピドは本質的に投げ縄−両親媒性（bola-amphiphilic）なので、足場上のその存在はその表面を疎水性から親水性に変える。ＳＬ（ソホロリピド）分子がポリマー表面に共有結合的に縫われるとき、脂質の−ＣＯＯＨ基とポリマー表面上の−ＮＨ₂基との間で反応が起き、脂質の別の末端、すなわちソホロース、をさらす。これは表面を親水性にし、同じことが、１１０度（未処理のポリマー足場）から６５度（プラズマ処理）、４５度（ＳＬ付着）へと変化する水接触角に反映されている。ポリマー足場上の銀ナノ粒子のその場形成の後、これは２５度まで更に減少する。細胞接着及び増殖についての更なる研究が、親水性である表面を必要としているので、これは良い兆候である。

実施例９：抗菌性分析
ルリアベルターニ寒天斜面上で３種の微生物全てを維持した。上記菌種のプレ接種材料（Pre-inoculums）を１００ｍＬのルリアベルターニ培地に別々に接種し、更なる実験を実施するために２４時間培養した（３０℃、２００ｒｐｍ）。銀がちりばめられた足場の抗菌性試験を標準希釈ミクロ法（standard dilution micro-method）を用いて実施した。１０⁸ｃｆｕ／ｍＬを含む培地を連続的に希釈して１０⁴ｃｆｕ／ｍＬを得た。典型的な実験において、１０⁴ｃｆｕ／ｍＬを含むＬＢ培養液を含む５本の試験管を未処理のｐＰＥ足場、プラズマ処理されたｐＰＥ足場、ＯＡ−ＳＬ／ＬＡ−ＳＬ含有ｐＰＥ足場及びＡｇＮＰｓを含む足場と共に培養した。５本目の試験管をいずれの足場もなしに培養し、対照とした。すべての組立（setup）を振盪条件（２００ｒｐｍ）において３７℃で培養した。７５μＬのアリコート（aliquot）を上記セットのそれぞれから一定間隔で汲み出し、ルリアベルターニ寒天プレート上に蒔いた。これらのプレートをまた３７℃で２４時間培養し、手作業でコロニーを数えた。細菌細胞生存率を以下の式に従って計算した。
細胞生存％＝１００・（Ｎ_e／Ｎ_c） ・・・・・（１）
式中、Ｎ_e＝実験プレート上の生存細菌コロニーの数
Ｎ_c＝対照プレート上の生存細菌コロニーの数
図９は、異なる時間間隔後のＩ）ｐＰＥ−ＮＨ₂足場；ＩＩ）ｐＰＥ−ＮＨ₂−ＳＬ足場及びＩＩＩ）ｐＰＥ−ＮＨ₂−ＳＬ−Ａｇ足場に対する枯草菌（Ａ）、緑膿菌（Ｂ）及び黄色ブドウ球菌（Ｃ）の細胞生存％を表す統計データを指す。

１．表面修飾されたポリマーは微生物の増殖を抑制するのみでなく、細胞増殖を増進する。
２．表面修飾の方法はプラズマ処理に最小限に依存しているため、広い範囲でポリマーを無傷に保つ。
３．ポリマーの表面修飾の方法は、細胞増殖のための媒体を提供する簡単だが効果的な方法を提示する。
４．表面修飾されたポリマーは異なる型の細胞の細胞増殖の増進のための足場として使用され得る。
５．表面修飾されたポリマーは、そのような製品を必要とする対象のニーズを満たす成形品を製造するために更に使用され得る。

Claims (9)

1. 表面修飾されたポリマーの製造方法であって、以下の工程：
   ａ．プラズマ処理されたポリマー表面を提供する工程、
   ｂ．脂肪酸及び還元糖に由来する脂質を工程（ａ）で得られたプラズマ処理されたポリマー表面に共有結合させる工程であって、前記還元糖がソホロース及びラムノースからなる群から選択される、工程、
   ｃ．工程（ｂ）で得られたポリマー表面を抗菌剤の溶液にさらし、煮沸して前記脂質によって表面上で抗菌剤のイオンをナノ粒子に還元して、表面修飾されたポリマーを得る工程、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記脂肪酸はステアリン酸、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）で使用される前記ポリマーがポリエーテルイミド及びポリエチレンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｃ）で使用される前記抗菌剤が硝酸銀である、請求項１に記載の方法。
5. 前記表面修飾されたポリマーが微生物の増殖を抑制するのみでなく、細胞増殖を増進する、請求項１に記載の方法。
6. 前記工程（ａ）が、更に金属ナノ粒子を前記プラズマ処理されたポリマー表面に付着させる工程及びアミノ酸を前記金属ナノ粒子に付着させ、表面修飾されたポリマーを得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記金属が金である、請求項６に記載の方法。
8. 前記アミノ酸がリジンである、請求項６に記載の方法。
9. 前記表面修飾されたポリマーが微生物の増殖を抑制するのみでなく、細胞増殖を増進する、請求項６に記載の方法。

Images