JP5596931B2 - Receptor expression level analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、細胞内のATPの濃度を非侵襲的に解析することにより、例えばD2受容体などの受容体(受容体遺伝子)の発現量を解析する受容体発現量解析方法および受容体の発現量を解析するための発光タンパク質に関するものである。 The present invention relates to a receptor expression level analysis method for analyzing the expression level of a receptor (receptor gene) such as a D2 receptor by noninvasively analyzing the concentration of intracellular ATP and expression of the receptor. It relates to a photoprotein for analyzing the amount.
多くのホルモンや神経伝達物質は、Gタンパク質共役型受容体に働き、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こしている。Gタンパク質共役型受容体に働く神経伝達物質は、ヒトの情動や気分、依存、認知、学習、記憶などの広範囲に亘る脳機能の調節に関わっており、なかでも、モノアミンおよびその受容体は、躁うつ病や統合失調症、気分障害、自閉症、注意欠陥/多動性障害などの精神疾患に対する治療の標的とされている。このような脳の高次機能は、脳内の伝達物質およびその受容体の時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の情動活動に関する情報伝達機構を解析するにあたって、脳内のGタンパク質共役型受容体の時間的および空間的な変化をリアルタイムに捉えることが必要である。 Many hormones and neurotransmitters act on G protein-coupled receptors and cause various cellular activities through intracellular second messengers. Neurotransmitters that act on G protein-coupled receptors are involved in the regulation of brain functions over a wide range of human emotions, moods, dependence, cognition, learning, memory, etc. Among them, monoamines and their receptors are It is targeted for treatment of mental disorders such as manic depression, schizophrenia, mood disorders, autism, attention deficit / hyperactivity disorder. Such higher-order functions of the brain are controlled by the temporal and spatial concentration distributions of transmitter substances and their receptors in the brain. Therefore, it is necessary to capture in real time the temporal and spatial changes of G protein-coupled receptors in the brain when analyzing information transmission mechanisms related to specific emotional activities.
従来、Gタンパク質共役型受容体の量や分布は、放射線ラベルした化合物を用いて測定されている。これは、受容体に対するリガンドを放射線ラベルして、細胞や組織、個体またはこれらの粗精製画分に存在する受容体に対して標識リガンドと被験化学物質とを競合的に結合させた後、結合および遊離したリガンド量を測定することにより被験化学物質と受容体との結合を知る方法である。さらに、近年、新たな受容体検出方法が見出されてきた。例えば、Bertran−Gonzalezらは、ドーパミン受容体のサブタイプであるD1およびD2受容体遺伝子のプロモーター領域の下流に蛍光タンパク質であるEGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)の遺伝子を繋いだトランスジェニックマウスを作製して、当該トランスジェニックマウスの細胞もしくは組織を蛍光観察することを開示している(非特許文献1参照)。このトランスジェニックマウスでは、D1またはD2受容体遺伝子のプロモーターが働いている細胞、すなわちD1またはD2受容体が発現している細胞において蛍光タンパク質が発現しているので、細胞もしくは組織を蛍光観察することでD1またはD2受容体が発現している細胞を観察できることが明らかにされている。 Conventionally, the amount and distribution of G protein-coupled receptors have been measured using radiolabeled compounds. This is because the ligand for the receptor is radiolabeled, and the labeled ligand and test chemical are bound competitively to the receptor present in cells, tissues, individuals or their crude fractions, and then bound. And a method of knowing the binding between the test chemical and the receptor by measuring the amount of the released ligand. Furthermore, in recent years, new receptor detection methods have been found. For example, Bertran-Gonzalez et al. Produced transgenic mice in which a fluorescent protein EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) gene was linked downstream of the promoter region of the D1 and D2 receptor genes, which are subtypes of the dopamine receptor. Thus, fluorescence observation of the cells or tissues of the transgenic mouse is disclosed (see Non-Patent Document 1). In this transgenic mouse, the fluorescent protein is expressed in the cell in which the promoter of the D1 or D2 receptor gene works, that is, the cell in which the D1 or D2 receptor is expressed. It is revealed that cells expressing D1 or D2 receptor can be observed.
しかしながら、放射性ラベルしたリガンドを用いた従来技術の受容体の発現・分布解析方法では、被験化学物質がアゴニストなのかアンタゴニストであるのかは判別できない上、標識リガンドの検出時における解像度が悪いため、受容体の発現量や分布・機能状態(応答)を正確には示せていない、という問題点があった。
また、受容体遺伝子のプロモーターに蛍光タンパク質を繋いだプローブを用いた従来技術の受容体の発現・分布解析方法では、プロモーター活性と遺伝子発現量が必ずしも一致しないため、受容体の発現量や分布・機能状態(応答)を正確には示せていない、という問題点があった。
However, in the conventional receptor expression / distribution analysis method using a radiolabeled ligand, it cannot be determined whether the test chemical substance is an agonist or an antagonist, and the resolution at the time of detection of the labeled ligand is poor. There was a problem that the expression level and distribution / functional state (response) of the body could not be accurately shown.
Moreover, in the conventional receptor expression / distribution analysis method using a probe in which a fluorescent protein is linked to the promoter of the receptor gene, the promoter activity and the gene expression level do not necessarily match. There was a problem that the functional state (response) could not be accurately shown.
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができる受容体発現量解析方法および受容体の発現量を解析するための発光タンパク質を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and can obtain an accurate quantitative result from each cell regarding the expression level of the receptor without being influenced by the promoter activity of the cell. It is an object of the present invention to provide a receptor expression level analysis method capable of observing changes in the expression level and distribution of receptors in cells with good reproducibility, and a photoprotein for analyzing the expression level of receptors.
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、細胞において受容体の発現量を解析する受容体発現量解析方法であって、ATP依存性のレポータタンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行う発光処置工程と、前記発光処置工程が行われた後の前記細胞に当該細胞外から所定の受容体結合物質を添加する物質添加工程と、前記物質添加工程が行われた後の前記細胞の発光量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記ATPの濃度を解析する濃度解析工程と、前記濃度解析工程で解析した前記ATPの濃度に基づいて前記受容体の発現量を解析する発現量解析工程と、を含むことを特徴とする。ここで、本発明において、レポータタンパク質とは、蛍光タンパク質や発光タンパク質を包含するものである。また、発光タンパク質とは、具体的には生物発光タンパク質などである。また、発光させるための所定の処置とは、例えば発光基質を添加することや励起光を照射することなどである。 In order to solve the above-described problems and achieve the object, a receptor expression level analysis method according to the present invention is a receptor expression level analysis method for analyzing the expression level of a receptor in a cell, which is ATP-dependent. A production process for producing the cells containing a reporter protein, a luminescence treatment process for performing a predetermined treatment for causing the cells produced in the production process to emit light from outside the cell, and after the luminescence treatment process A substance addition step of adding a predetermined receptor binding substance from the outside of the cell to the cell, a measurement step of measuring the amount of luminescence of the cell after the substance addition step is performed, and the measurement step A concentration analysis step for analyzing the concentration of the ATP in the cell based on the amount of luminescence, and an expression for analyzing the expression level of the receptor based on the concentration of the ATP analyzed in the concentration analysis step Characterized in that it comprises an analysis step. Here, in the present invention, the reporter protein includes a fluorescent protein and a photoprotein. The photoprotein is specifically a bioluminescent protein. Moreover, the predetermined treatment for causing light emission includes, for example, adding a luminescent substrate or irradiating excitation light.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記作製工程において、前記レポータタンパク質は前記ATP依存性の発光タンパク質であること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, in the preparation step, the reporter protein is the ATP-dependent photoprotein. .
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記発光タンパク質は前記細胞内の前記ATPと相互作用して発光するものであること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, the photoprotein emits light by interacting with the ATP in the cell. And
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記発光タンパク質はホタルのルシフェラーゼまたはヒカリコメツキのルシフェラーゼであること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, the photoprotein is a firefly luciferase or a lightning luciferase.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記作製工程において、前記細胞は前記受容体を含有するものであること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, in the preparation step, the cell contains the receptor.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記作製工程において、前記細胞は前記受容体の遺伝子が導入されたものであること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, in the preparation step, the cell is a gene into which the receptor gene has been introduced. And
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記測定工程は、前記ATP依存性の発光標識の光子量を測定する光子量測定工程をさらに含むこと、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is the receptor expression level analysis method described above, wherein the measurement step further includes a photon amount measurement step of measuring the photon amount of the ATP-dependent luminescent label. Including.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記測定工程は、前記ATP依存性の発光標識を撮像する撮像工程をさらに含むこと、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, the measurement step further includes an imaging step of imaging the ATP-dependent luminescent label. And
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記撮像工程は、複数の異なる前記細胞に対して同時に実行され、前記濃度解析工程は、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像を前記細胞ごとに照合する照合工程をさらに含むこと、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is the receptor expression level analysis method described above, wherein the imaging step is performed simultaneously on a plurality of different cells, and the concentration analysis step includes It further includes a collation step of collating the plurality of luminescent images captured in the imaging step for each of the cells.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記測定工程は繰り返し実行されること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, the measurement step is repeatedly executed.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記受容体はD2受容体であること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, the receptor is a D2 receptor.
また、本発明にかかる受容体発現量解析方法は、前記に記載の受容体発現量解析方法において、前記物質添加工程において、前記受容体結合物質はドーパミンであること、を特徴とする。 The receptor expression level analysis method according to the present invention is characterized in that, in the receptor expression level analysis method described above, in the substance addition step, the receptor binding substance is dopamine.
また、本発明は発光タンパク質に関するものであり、本発明にかかる発光タンパク質は、ATP依存性の発光タンパク質であって、受容体の発現量を解析するためのものであること、を特徴とする。 In addition, the present invention relates to a photoprotein, and the photoprotein according to the present invention is an ATP-dependent photoprotein for analyzing the expression level of a receptor.
また、本発明にかかる発光タンパク質は、前記に記載の発光タンパク質において、ATPと相互作用して発光するものであること、を特徴とする。 Moreover, the photoprotein according to the present invention is characterized in that, in the photoprotein described above, the photoprotein emits light by interacting with ATP.
また、本発明にかかる発光タンパク質は、前記に記載の発光タンパク質において、前記受容体はD2受容体であること、を特徴とする。 The photoprotein according to the present invention is characterized in that, in the photoprotein described above, the receptor is a D2 receptor.
この発明によれば、ATP依存性のレポータタンパク質を含む細胞を作製し、作製した細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行い、当該処置が行われた後の細胞に当該細胞外から所定の受容体結合物質を添加し、当該添加が行われた後の細胞の発光量を測定し、測定した発光量に基づいて細胞内におけるATPの濃度を解析し、解析したATPの濃度に基づいて受容体の発現量を解析するので、細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, a cell containing an ATP-dependent reporter protein is prepared, the prepared cell is subjected to a predetermined treatment for causing light emission from outside the cell, and the cell after the treatment is applied to the cell. A predetermined receptor-binding substance is added from the outside, the amount of luminescence of the cell after the addition is measured, the concentration of ATP in the cell is analyzed based on the measured amount of luminescence, and the analyzed ATP concentration Based on the analysis of the receptor expression level, it is possible to obtain an accurate quantitative result from each cell regarding the expression level of the receptor without being influenced by the promoter activity of the cell. The effect is that the change in the expression level and distribution of the receptor can be observed with good reproducibility.
この発明によれば、レポータタンパク質はATP依存性の発光タンパク質であるので、生物発光によるATP検出原理を利用して受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。 According to this invention, since the reporter protein is an ATP-dependent photoprotein, an accurate quantitative result from each cell regarding the expression level of the receptor can be obtained using the ATP detection principle by bioluminescence, As a result, it is possible to observe changes in receptor expression level and distribution in individual cells with good reproducibility.
この発明によれば、発光タンパク質は細胞内のATPと相互作用して発光するものであるので、ATPの存在下で相互作用が強化された発光によりATP濃度を検出することができるという効果を奏する。 According to this invention, since the photoprotein emits light by interacting with intracellular ATP, the ATP concentration can be detected by luminescence with enhanced interaction in the presence of ATP. .
この発明によれば、発光タンパク質はホタルのルシフェラーゼまたはヒカリコメツキのルシフェラーゼであるので、発光量を測ればATP濃度を算出することができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the photoprotein is a firefly luciferase or a light click luciferase, the ATP concentration can be calculated by measuring the amount of luminescence.
この発明によれば、細胞は受容体を含有するものであるので、解析対象となる受容体を人工的に含めた扱い易い細胞を用いて実験をやり易くすることができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the cell contains a receptor, there is an effect that the experiment can be facilitated by using an easy-to-handle cell that artificially includes the receptor to be analyzed.
この発明によれば、細胞は受容体の遺伝子が導入されたものであるので、解析対象となる受容体を人工的に含めた扱い易い細胞を用いて実験をやり易くすることができる他、自然に近い応答を得ることができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the cell is introduced with a receptor gene, the experiment can be facilitated using an easy-to-handle cell artificially including the receptor to be analyzed. It is possible to obtain a response close to.
この発明によれば、ATP依存性の発光標識の光子量を測定するので、フォトンカウンティングの技術を利用して細胞全体または細胞集団全体からの発光量を得ることができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the photon amount of the ATP-dependent luminescent label is measured, the luminescence amount from the entire cell or the entire cell population can be obtained using the photon counting technique.
この発明によれば、ATP依存性の発光標識を撮像するので、発光顕微鏡を利用して個々の細胞からの発光量を得ることができるという効果を奏する。 According to this invention, since an ATP-dependent luminescent label is imaged, there is an effect that it is possible to obtain the amount of luminescence from individual cells using a luminescence microscope.
この発明によれば、撮像を複数の異なる細胞に対して同時に実行し、撮像した複数の発光画像を細胞ごとに照合するので、細胞一つ一つからの発光量を個別に且つ同時に得ることができるという効果を奏する。 According to this invention, since imaging is performed simultaneously on a plurality of different cells and the plurality of captured luminescent images are collated for each cell, the amount of luminescence from each cell can be obtained individually and simultaneously. There is an effect that can be done.
この発明によれば、発光量の測定を繰り返し実行するので、発光量の経時変化を観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the measurement of the light emission amount is repeatedly executed, it is possible to observe the temporal change of the light emission amount.
この発明によれば、受容体はD2受容体であるので、D2受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてD2受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the receptor is a D2 receptor, an accurate quantitative result from each cell regarding the expression level of the D2 receptor can be obtained, and as a result, the expression of the D2 receptor in each individual cell can be obtained. There is an effect that changes in the amount and distribution can be observed with good reproducibility.
この発明によれば、受容体結合物質はドーパミンであるので、D2受容体の活性を観察することができるという効果を奏する。 According to this invention, since the receptor-binding substance is dopamine, there is an effect that the activity of the D2 receptor can be observed.
この発明によれば、発光タンパク質はATP依存性であって受容体の発現量を解析するためのものであるので、当該発光タンパク質を用いれば、細胞のプロモーター活性に影響されずに、受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, since the photoprotein is ATP-dependent and is used for analyzing the expression level of the receptor, the photoprotein is used without being influenced by the promoter activity of the cell. An accurate quantitative result from each cell regarding the expression level can be obtained, and as a result, changes in receptor expression level and distribution in individual cells can be observed with good reproducibility.
この発明によれば、発光タンパク質はATPと相互作用して発光するものであるので、当該発光タンパク質を用いれば、ATPの存在下で相互作用が強化された発光によりATP濃度を検出することができるという効果を奏する。 According to the present invention, the photoprotein emits light by interacting with ATP. Therefore, when the photoprotein is used, the ATP concentration can be detected by luminescence with enhanced interaction in the presence of ATP. There is an effect.
この発明によれば、発光タンパク質はD2受容体の発現量を解析するためのものであるので、当該発光タンパク質を用いれば、D2受容体の発現量に関する各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてD2受容体の発現量や分布の変化を再現性良く観察することができるという効果を奏する。 According to the present invention, the photoprotein is used for analyzing the expression level of the D2 receptor. Therefore, when the photoprotein is used, an accurate quantitative result from each cell regarding the expression level of the D2 receptor is obtained. As a result, it is possible to observe changes in the expression level and distribution of the D2 receptor in individual cells with good reproducibility.
以下に、本発明にかかる受容体発現量解析方法および受容体の発現量を解析するための発光タンパク質の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施の形態により本発明が限定されるものではない。ここで、本実施の形態では発光タンパク質(具体的には生物発光タンパク質)を用いてD2受容体の発現量を解析する場合を一例として説明するが、蛍光タンパク質や他の受容体に対しても同様に実施することができる。 Embodiments of a receptor expression level analysis method and a photoprotein for analyzing receptor expression levels according to the present invention will be described below in detail with reference to the drawings. In addition, this invention is not limited by this Embodiment. Here, in this embodiment, a case where the expression level of the D2 receptor is analyzed using a photoprotein (specifically, a bioluminescent protein) will be described as an example. However, the present invention also applies to fluorescent proteins and other receptors. It can be implemented similarly.
[1.構成]
まず、本発明にかかる受容体発現量解析方法で用いる発光観察システム100の構成について、図1、図2および図3を参照して説明する。図1は、発光観察システム100の全体構成の一例を示す図である。
[1. Constitution]
First, the structure of the luminescence observation system 100 used in the receptor expression level analysis method according to the present invention will be described with reference to FIG. 1, FIG. 2, and FIG. FIG. 1 is a diagram illustrating an example of the overall configuration of the light emission observation system 100.
図1に示すように、発光観察システム100は、細胞102を収納した容器103(具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など)と、容器103を配置するステージ104と、微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット106と、画像解析装置110と、で構成されている。なお、発光画像撮像ユニット106をステージ104の下側に配置してもよい。これにより、カバー(図示せず)の開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断でき、その結果、発光画像のS/N比を増すことができる。発光画像撮像ユニット106は、レーザー走査式の光学系であってもよい。 As shown in FIG. 1, a luminescence observation system 100 includes a container 103 (specifically, a petri dish, a slide glass, a microplate, a gel support, a fine particle carrier, etc.) that contains cells 102, and a stage 104 on which the container 103 is arranged. And a light emission image capturing unit 106 for measuring weak light emission, and an image analysis device 110. Note that the luminescent image capturing unit 106 may be disposed below the stage 104. Thereby, disturbance light from above the sample due to opening and closing of a cover (not shown) can be completely blocked, and as a result, the S / N ratio of the luminescent image can be increased. The light emission image capturing unit 106 may be a laser scanning optical system.
細胞102は、例えば、ATP(adenosine triphosphate)濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。ここで、ATP濃度に依存して発光するタンパク質(発光タンパク質)として、ホタルのルシフェラーゼの他に、例えばヒカリコメツキのルシフェラーゼやこれらの改変体を用いてもよい。また、ここで、当該発光タンパク質が発現されるよう構成した、当該発光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞102に導入することにより、当該発光タンパク質が細胞102内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞102には、当該細胞102外から所定の発光基質(例えばルシフェリンなど)および所定の刺激(例えば薬物刺激など)が与えられる。 The cell 102 is, for example, a living cell that is luminescence-labeled so as to emit light depending on an ATP (adenosine triphosphate) concentration. Here, as a protein that emits light depending on the ATP concentration (photoprotein), in addition to firefly luciferase, for example, lightning luciferase or a modified form thereof may be used. Here, the photoprotein is expressed in the cell 102 by introducing an expression vector containing the polynucleotide encoding the photoprotein, which is configured to express the photoprotein, into the cell 102. May be. The cell 102 is given a predetermined luminescent substrate (for example, luciferin) and a predetermined stimulus (for example, drug stimulus) from outside the cell 102.
発光画像撮像ユニット106は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞102の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット106は、図示の如く、対物レンズ106aと、ダイクロイックミラー106bと、CCD(charge−coupled device)カメラ106cと、結像レンズ106fと、で構成されている。対物レンズ106aは、具体的には(開口数/倍率)2の値が0.01以上のものが好ましい。ダイクロイックミラー106bは、細胞102から発せられた発光を色別に分離し、2色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。CCDカメラ106cは、対物レンズ106a、ダイクロイックミラー106bおよび結像レンズ106fを介して当該CCDカメラ106cのチップ面に投影された細胞102の発光画像および明視野画像を撮る。また、CCDカメラ106cは、画像解析装置110と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞102が撮像範囲中に複数存在する場合、CCDカメラ106cは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞102の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ106fは、対物レンズ106aおよびダイクロイックミラー106bを介して当該結像レンズ106fに入射した像(具体的には細胞102を含む像)を結像する。なお、図1では、ダイクロイックミラー106bで分離した2つの発光に対応する発光画像を2台のCCDカメラ106cで別々に撮像する場合の一例を示しており、1つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット106は、対物レンズ106a、1台のCCDカメラ106cおよび結像レンズ106fで構成されてもよい。 The luminescence image capturing unit 106 is specifically an upright luminescence microscope and captures a luminescence image of the cell 102. As shown in the figure, the luminescent image capturing unit 106 includes an objective lens 106a, a dichroic mirror 106b, a CCD (charge-coupled device) camera 106c, and an imaging lens 106f. Specifically, it is preferable that the objective lens 106a has a value of (numerical aperture / magnification) 2 of 0.01 or more. The dichroic mirror 106b is used when the light emitted from the cell 102 is separated by color and the light emission amount and light emission intensity are measured by color using two colors of light emission. The CCD camera 106c takes a light emission image and a bright field image of the cell 102 projected onto the chip surface of the CCD camera 106c via the objective lens 106a, the dichroic mirror 106b, and the imaging lens 106f. The CCD camera 106c is connected to the image analysis device 110 so as to be able to communicate with each other by wire or wirelessly. Here, when there are a plurality of cells 102 in the imaging range, the CCD camera 106c may capture a light-emitting image and a bright-field image of the plurality of cells 102 included in the imaging range. The imaging lens 106f forms an image (specifically, an image including the cell 102) incident on the imaging lens 106f via the objective lens 106a and the dichroic mirror 106b. Note that FIG. 1 shows an example in which a light emission image corresponding to two light emissions separated by the dichroic mirror 106b is separately captured by the two CCD cameras 106c. The image capturing unit 106 may include an objective lens 106a, a single CCD camera 106c, and an imaging lens 106f.
ここで、2色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット106は、図2に示すように、対物レンズ106aと、CCDカメラ106cと、スプリットイメージユニット106dと、結像レンズ106fと、で構成されてもよい。そして、CCDカメラ106cは、スプリットイメージユニット106dおよび結像レンズ106fを介して当該CCDカメラ106cのチップ面に投影された細胞102の発光画像(スプリットイメージ)および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット106dは、細胞102から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー106bと同様、2色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。 Here, when measuring the light emission amount and the light emission intensity for each color using the light emission of two colors, as shown in FIG. 2, the light emission image pickup unit 106 includes an objective lens 106a, a CCD camera 106c, and a split image unit 106d. And the imaging lens 106f. The CCD camera 106c may capture a light emission image (split image) and a bright field image of the cell 102 projected onto the chip surface of the CCD camera 106c via the split image unit 106d and the imaging lens 106f. The split image unit 106d separates the light emitted from the cell 102 by color, and is used when measuring the light emission amount and light emission intensity by color using two colors of light, similar to the dichroic mirror 106b.
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合(つまり、多色の発光を用いる場合)、発光画像撮像ユニット106は、図3に示すように、対物レンズ106aと、CCDカメラ106cと、フィルターホイール106eと、結像レンズ106fと、で構成されてもよい。そして、CCDカメラ106cは、フィルターホイール106eおよび結像レンズ106fを介して当該CCDカメラ106cのチップ面に投影された細胞102の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール106eは、細胞102から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。 Further, when measuring the emission amount and emission intensity for each color using light emission of a plurality of colors (that is, when using multicolor light emission), the light emission image pickup unit 106 includes an objective lens 106a and an objective lens 106a as shown in FIG. The CCD camera 106c, the filter wheel 106e, and the imaging lens 106f may be used. Then, the CCD camera 106c may capture a light emission image and a bright field image of the cell 102 projected onto the chip surface of the CCD camera 106c via the filter wheel 106e and the imaging lens 106f. The filter wheel 106e is used when light emitted from the cells 102 is separated by color by exchanging filters, and a light emission amount and light emission intensity are measured for each color using light emission of a plurality of colors.
図1に戻り、画像解析装置110は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置110は、図4に示すように、大別して、制御部112と、システムの時刻を計時するクロック発生部114と、記憶部116と、通信インターフェース部118と、入出力インターフェース部120と、入力装置122と、出力装置124と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。 Returning to FIG. 1, the image analysis apparatus 110 is specifically a personal computer. As shown in FIG. 4, the image analysis device 110 is roughly divided into a control unit 112, a clock generation unit 114 that measures the system time, a storage unit 116, a communication interface unit 118, and an input / output interface unit. 120, an input device 122, and an output device 124. These units are connected via a bus.
記憶部116は、ストレージ手段であり、具体的には、RAM(random access memory)やROM(read−only memory)等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部116は制御部112の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部118は、画像解析装置110と、CCDカメラ106cと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部118は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部120は、入力装置122や出力装置124に接続する。ここで、出力装置124には、モニタ(家庭用テレビを含む)の他、スピーカやプリンタを用いることができる(なお、以下で、出力装置124をモニターとして記載する場合がある。)。また、入力装置122には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。 The storage unit 116 is a storage unit, and specifically, a memory device such as a random access memory (RAM) or a read-only memory (ROM), a fixed disk device such as a hard disk, a flexible disk, an optical disk, or the like is used. Can do. And the memory | storage part 116 memorize | stores the data etc. which were obtained by the process of each part of the control part 112. FIG. The communication interface unit 118 mediates communication between the image analysis device 110 and the CCD camera 106c. That is, the communication interface unit 118 has a function of communicating data with other terminals via a wired or wireless communication line. The input / output interface unit 120 is connected to the input device 122 and the output device 124. Here, in addition to a monitor (including a home television), a speaker or a printer can be used as the output device 124 (hereinafter, the output device 124 may be described as a monitor). In addition to the keyboard, mouse, and microphone, the input device 122 can be a monitor that realizes a pointing device function in cooperation with the mouse.
制御部112は、OS(Operating System)等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部112は、大別して、発光画像撮像指示部112aと、発光画像取得部112bと、画像解析部112cと、解析結果出力部112dと、で構成されている。 The control unit 112 has an internal memory for storing a control program such as an OS (Operating System), a program that defines various processing procedures, and necessary data, and executes various processes based on these programs. . The control unit 112 is roughly composed of a light emission image capturing instruction unit 112a, a light emission image acquisition unit 112b, an image analysis unit 112c, and an analysis result output unit 112d.
発光画像撮像指示部112aは、通信インターフェース部118を介して、CCDカメラ106cへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部112bは、CCDカメラ106cで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部118を介して取得する。制御部112は、発光画像撮像指示部112aを制御して、CCDカメラ106cに細胞102の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像させ、発光画像取得部112bを制御して、撮像した発光画像および明視野画像を、撮像される度に又は全撮像が終了後纏めて取得する。 The luminescent image capturing instruction unit 112a instructs the CCD camera 106c to capture a luminescent image and a bright field image via the communication interface unit 118. The luminescent image acquisition unit 112b acquires the luminescent image and bright field image captured by the CCD camera 106c via the communication interface unit 118. The control unit 112 controls the emission image capturing instruction unit 112a to cause the CCD camera 106c to repeatedly capture the emission image and the bright field image of the cell 102, and controls the emission image acquisition unit 112b to control the captured emission image and the bright image. A field-of-view image is acquired every time it is imaged or after all imaging is completed.
画像解析部112cは、発光画像取得部112bで取得した複数の発光画像に基づいて、細胞102から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する。解析結果出力部112dは、画像解析部112cでの解析結果を出力装置124に出力する。具体的には、解析結果出力部112dは、画像解析部112cで得られた、細胞102から発せられる発光の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置124に表示する。 The image analysis unit 112c measures the luminescence intensity of the luminescence emitted from the cells 102 over time based on the plurality of luminescence images acquired by the luminescence image acquisition unit 112b. The analysis result output unit 112d outputs the analysis result from the image analysis unit 112c to the output device 124. Specifically, the analysis result output unit 112d graphs and displays on the output device 124 time-series data regarding the emission intensity of the luminescence emitted from the cell 102 obtained by the image analysis unit 112c.
[2.実施例]
本実施の形態における実施例について、以下に図5〜図9を用いて説明する。ここで、図5はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いたATPの検出原理を示す図である。
[2. Example]
Examples of the present embodiment will be described below with reference to FIGS. Here, FIG. 5 is a diagram showing the principle of ATP detection using the luciferin-luciferase reaction.
ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において、ルシフェリンとATPが反応してアデニル酸ルシフェリンとなり、当該アデニル酸ルシフェリンと酸素がルシフェラーゼの存在下で酸化的脱炭酸反応により分解されるとオキシルシフェリン、AMP(adenosine monophosphate)および二酸化炭素が生じる。この反応の過程で得られるエネルギーの一部が発光する。この発光を定量することでATPの定量を行うことが出来る。 In the luciferin-luciferase reaction, luciferin and ATP react to form adenylate luciferin, and when the adenylate luciferin and oxygen are degraded by oxidative decarboxylation in the presence of luciferase, oxyluciferin, AMP (adenosine monophosphate) and carbon dioxide Carbon is produced. Part of the energy obtained in the course of this reaction emits light. By quantifying this luminescence, ATP can be quantified.
本実施例では、上述したATPの検出原理を用いてD2受容体の発現量を解析する解析方法について説明する。本実施例における実験の流れ(手順)は、以下の通りである。 In this example, an analysis method for analyzing the expression level of the D2 receptor using the above-described ATP detection principle will be described. The flow of the experiment (procedure) in this example is as follows.
[前準備:ヒトD1受容体遺伝子およびD2受容体遺伝子のクローニング]
[手順1]
ヒトD1受容体遺伝子およびD2受容体遺伝子の作製のために、PCR(polymerase chain reaction)に用いる合成オリゴDNA(deoxyribonucleic acid)を以下に示す配列で調整した。
[ヒトD1受容体遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
HU_D1R_Fw(配列番号1):5’−GCCACCATGAGGACTCTGAACACCTCTGCC−3’
HU_D1R_Rv(配列番号2):5’−TCAGGTTGGGTGCTGACCGTTTTGTGTGAT−3’
[ヒトD2受容体遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
HU_D2R_Fw(配列番号3):5’−GCCACCATGGATCCACTGAATCTGTCCTGG−3’
HU_D2R_Rv(配列番号4):5’−TCAGCAGTGGAGGATCTTCAGGAAGGCCTT−3’
[Preparation: Cloning of human D1 receptor gene and D2 receptor gene]
[Procedure 1]
In order to prepare the human D1 receptor gene and the D2 receptor gene, a synthetic oligo DNA (deoxyribonucleic acid) used for PCR (polymerase chain reaction) was prepared with the sequences shown below.
[Synthetic oligo DNA sequence for preparing human D1 receptor gene]
HU_D1R_Fw (SEQ ID NO: 1): 5′-GCCACATGAGGACTCTGAACACCCTCTCC-3 ′
HU_D1R_Rv (SEQ ID NO: 2): 5′-TCAGGTTGGGTGCTGACCGTTTTGTGTGAT-3 ′
[Synthetic oligo DNA sequence for preparing human D2 receptor gene]
HU_D2R_Fw (SEQ ID NO: 3): 5′-GCCACATGGATCCACTGAATCTGCTCGG-3 ′
HU_D2R_Rv (SEQ ID NO: 4): 5′-TCAGCAGTGGAGGATCTTCAGGAAGGCCT-3 ′
[手順2]
ヒト脳cDNAライブラリ(タカラバイオ社製)を鋳型として、D1受容体遺伝子(ヒトのD1受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。)およびD2受容体遺伝子(ヒトのD2受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む。)を、上記合成オリゴDNAをプライマーとしてPCRにより増幅した。
[Procedure 2]
Using a human brain cDNA library (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template, the D1 receptor gene (including the region corresponding to the full length of the human D1 receptor gene) and the D2 receptor gene (the full length of the human D2 receptor gene) Corresponding region was amplified by PCR using the synthetic oligo DNA as a primer.
[手順3]
PCRで増幅させたD1受容体遺伝子およびD2受容体遺伝子をpBluescriptIIベクターにサブクローニングした後、作製したDNAの配列をDNAシーケンシングにより確認した。
[Procedure 3]
After subcloning the D1 receptor gene and D2 receptor gene amplified by PCR into the pBluescript II vector, the sequence of the prepared DNA was confirmed by DNA sequencing.
[手順4]
それぞれの遺伝子を哺乳類細胞の発現ベクターpcDNA3.1(+)(インビトロジェン社製)へ組み込み、ヒトD1受容体発現用プラスミドpcDNA/D1RおよびヒトD2受容体発現用プラスミドpcDNA/D2Rを作製した。
[Procedure 4]
The respective genes were incorporated into mammalian cell expression vector pcDNA3.1 (+) (manufactured by Invitrogen) to prepare plasmid DcDNA / D1R for human D1 receptor expression and plasmid pcDNA / D2R for expression of human D2 receptor.
[実験その1:D2受容体を発現させたHEK293細胞でのドーパミン刺激による発光量測定]
[手順1:HEK293細胞の培養]
ATCC(American Type Culture Collection)社より入手したHEK293細胞を、5% CO2インキュベーター内で、10% Fetal Bovine Serumおよび1× Nonessential amino acidsを添加したEarle's MEM/培地(GIBCO社製)で培養した。
[Experiment 1: Measurement of luminescence level by dopamine stimulation in HEK293 cells expressing D2 receptor]
[Procedure 1: Culture of HEK293 cells]
HEK293 cells obtained from ATCC (American Type Culture Collection) were cultured in Earle's MEM / Medium (GI) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum and 1 × Nonesential amino acids in a 5% CO2 incubator. .
[手順2:ルシフェラーゼ発現プラスミドの導入]
HEK293細胞を、直径35mmガラスボトムディッシュに2×105/dishの細胞密度で播種し、5% CO2インキュベーター内で一晩培養し、ルシフェラーゼ発現用プラスミドpGL3−control(プロメガ社製)とヒトD1受容体発現用プラスミドpcDNA/D1RまたはヒトD2受容体発現用プラスミドpcDNA/D2Rとを混合し、FuGENE HD(ロシュ社製)を用いてトランスフェクションを行い、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。なお、ヒトD1受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号5のアミノ酸配列であり、ヒトD2受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号6のアミノ酸配列である。また、ルシフェラーゼのアミノ酸配列は具体的には配列番号7のアミノ酸配列である。
[Procedure 2: Introduction of luciferase expression plasmid]
HEK293 cells were seeded at a cell density of 2 × 10 5 / dish in a 35 mm diameter glass bottom dish, cultured overnight in a 5% CO 2 incubator, and the plasmid pGL3-control (Promega) for luciferase expression and human D1 receptor The plasmid pcDNA / D1R for body expression or the plasmid pcDNA / D2R for expression of the human D2 receptor was mixed, transfected using FuGENE HD (Roche), and cultured overnight in a 5% CO2 incubator. The amino acid sequence of human D1 receptor is specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of human D2 receptor is specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The amino acid sequence of luciferase is specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
[手順3:発光量の測定]
培地中にルシフェリン2mM(プロメガ社製)を加えて1時間静置してから、培養ディッシュを培養ディッシュ対応型ルミノメーターKronos(アトー社製)にセットし、3分間隔で発光量の測定を行った。発光量測定条件として、装置内温度は36℃、各培養ディッシュの露出時間は10秒とした。
[Procedure 3: Measurement of luminescence]
After adding 2 mM luciferin (Promega) in the medium and allowing to stand for 1 hour, the culture dish is set in a culture dish-compatible luminometer Kronos (Ato) and the amount of luminescence is measured at intervals of 3 minutes. It was. As conditions for measuring luminescence, the temperature in the apparatus was 36 ° C., and the exposure time of each culture dish was 10 seconds.
[手順4:ドーパミン刺激による発光量の測定]
発光量測定開始から1時間後、ドーパミン(DA:最終濃度10μM)で刺激を行い、引き続き発光量の経時的測定を行った。
[Procedure 4: Measurement of light emission by dopamine stimulation]
One hour after the start of measurement of luminescence, stimulation was performed with dopamine (DA: final concentration 10 μM), and the luminescence was measured over time.
[手順5:発光量の経時変化のグラフ表示]
測定した発光量(発光強度)の経時変化をグラフ(図6参照)で表示した。なお、図6において、D1Rに対応するグラフはD1受容体における発光強度の経時変化を示しており、D2Rに対応するグラフはD2受容体における発光強度の経時変化を示している。
[Procedure 5: Graphical display of change in light emission over time]
The time-dependent change of the measured luminescence amount (luminescence intensity) was displayed as a graph (see FIG. 6). In FIG. 6, the graph corresponding to D1R shows the change over time of the emission intensity in the D1 receptor, and the graph corresponding to D2R shows the change over time in the emission intensity of the D2 receptor.
[実験その1の結果]
以上の実験の結果、図6に示すように、D2受容体へのドーパミン刺激に対する細胞の応答の変化を検出することができた。一方、図6に示されているD1受容体へのドーパミン刺激に対する発光強度の変化を見ると、ドーパミン刺激に対する細胞の応答は見られなかった。このように、ルミノメーターを用いた発光量変化の解析で、細胞集団全体の応答をリアルタイムに観察することができ、D2受容体の発現量を詳細に研究することができた。
[Result of Experiment 1]
As a result of the above experiment, as shown in FIG. 6, it was possible to detect a change in the response of the cells to the dopamine stimulation on the D2 receptor. On the other hand, when the change of the luminescence intensity with respect to dopamine stimulation to the D1 receptor shown in FIG. 6 was observed, no cellular response to dopamine stimulation was observed. Thus, by analyzing the change in the amount of luminescence using a luminometer, the response of the entire cell population could be observed in real time, and the expression level of the D2 receptor could be studied in detail.
[実験その2:D2受容体を発現させたHEK293細胞でのドーパミン刺激による発光イメージング]
[手順1:HEK293細胞の培養]
ATCC(American Type Culture Collection)社より入手したHEK293細胞を、5% CO2インキュベーター内で、10% Fetal Bovine Serumおよび1× Nonessential amino acidsを添加したEarle's MEM/培地(GIBCO社製)で培養した。
[Experiment 2: Dopamine-stimulated luminescence imaging in HEK293 cells expressing D2 receptor]
[Procedure 1: Culture of HEK293 cells]
HEK293 cells obtained from ATCC (American Type Culture Collection) were cultured in Earle's MEM / Medium (GI) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum and 1 × Nonesential amino acids in a 5% CO2 incubator. .
[手順2:ルシフェラーゼおよびドーパミン受容体発現プラスミドの導入]
HEK293細胞を、直径35mmガラスボトムディッシュに2×105/dishの細胞密度で播種し、5% CO2インキュベーター内で一晩培養し、ルシフェラーゼ発現用プラスミドpGL3−control(プロメガ社製)とヒトD2受容体発現用プラスミドpcDNA/D2Rとを混合し、FuGENE HD(ロシュ社製)を用いてトランスフェクションを行い、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。なお、ヒトD2受容体のアミノ酸配列は具体的には配列番号6のアミノ酸配列である。また、ルシフェラーゼのアミノ酸配列は具体的には配列番号7のアミノ酸配列である。
[Procedure 2: Introduction of luciferase and dopamine receptor expression plasmid]
HEK293 cells were seeded at a cell density of 2 × 10 5 / dish in a 35 mm diameter glass bottom dish, cultured overnight in a 5% CO 2 incubator, and the plasmid pGL3-control (Promega) for luciferase expression and human D2 reception The somatic expression plasmid pcDNA / D2R was mixed, transfected using FuGENE HD (Roche), and cultured overnight in a 5% CO2 incubator. The amino acid sequence of the human D2 receptor is specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The amino acid sequence of luciferase is specifically the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
[手順3:発光画像の撮像]
培地中にルシフェリン2mM(プロメガ社製)を加えて1時間静置してから、培養ディッシュを発光顕微鏡“LV(LUMINOVIEW)−200”(オリンパス社製)にセットし、20秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、装置内温度が36℃、対物レンズの倍率は60倍、露出時間は10秒、ビニングは1×1とした。CCDカメラ106cとしてEM−CCDカメラiXon(アンドール社製)を用い、画像解析装置110として構成したパーソナルコンピュータに発光画像を取り込んだ。
[Procedure 3: Shooting a luminescent image]
After adding 2 mM luciferin (Promega) in the medium and allowing to stand for 1 hour, the culture dish was set on a luminescence microscope “LV (LUMINOVIEW) -200” (Olympus), and the luminescence images were displayed at 20-second intervals. Time-lapse photography was performed. As the light emission observation conditions, the temperature in the apparatus was 36 ° C., the magnification of the objective lens was 60 times, the exposure time was 10 seconds, and the binning was 1 × 1. An EM-CCD camera iXon (manufactured by Andor Co.) was used as the CCD camera 106c, and the luminescence image was taken into a personal computer configured as the image analysis device 110.
[手順4:ドーパミン刺激による発光画像の撮像]
タイムラプス撮影開始から5分後、ドーパミン(DA:最終濃度10μM)で刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
[Procedure 4: Shooting Luminescent Image by Dopamine Stimulation]
Five minutes after the start of time-lapse photography, stimulation was performed with dopamine (DA: final concentration 10 μM), and then time-lapse photography of the luminescence image was performed.
[手順5:発光量の経時変化のグラフ表示]
ドーパミン刺激前に撮影した各々の発光画像(図7参照)に対して図示の如く複数のROI(Region of Interest:関心領域)を指定し、またドーパミン刺激後に撮影した各々の発光画像(図8参照)に対して図示の如く複数のROIを指定した。指定した各ROIの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、当該測定した発光強度の経時変化をグラフ(図9参照)で表示した。発光画像の解析は、画像解析部112cとして機能するMetamorphソフトウェア(ユニバーサルイメージング社製)を用いて行った。なお、図9において、Cell1〜Cell5のそれぞれに対応する各グラフは、図7および図8における番号1〜番号5のそれぞれに対応する各ROIの発光強度の経時変化を示している。
[Procedure 5: Graphical display of change in light emission over time]
As shown in the figure, a plurality of ROIs (Region of Interest) are designated for each luminescence image (see FIG. 7) photographed before dopamine stimulation, and each luminescence image (see FIG. 8) photographed after dopamine stimulation. A plurality of ROIs are designated as shown in FIG. The emission intensity of each designated ROI was measured based on each emission image, and the change over time of the measured emission intensity was displayed in a graph (see FIG. 9). The analysis of the luminescence image was performed using Metamorph software (made by Universal Imaging) that functions as the image analysis unit 112c. In FIG. 9, each graph corresponding to each of Cell 1 to Cell 5 shows a change over time in the emission intensity of each ROI corresponding to each of numbers 1 to 5 in FIGS. 7 and 8.
[実験その2の結果]
以上の実験の結果、図7、図8および図9に示すように、D2受容体へのドーパミン刺激に対する細胞の応答の変化をシングルセルレベル(一細胞レベル)で検出することができた。また、図9に示されている個々の細胞における発光強度の変化を見ると、ドーパミン刺激に対する細胞間の応答に大きなばらつきがあることがわかった。ドーパミン受容体を介する細胞内情報伝達機構のこれまでの研究から、刺激されたドーパミン受容体の数あるいは分布が異なるとシグナルの意味が異なる、ということが明らかにされている。ルミノメーターを用いた従来の発光量変化の解析では、細胞集団全体の応答を観察することはできるが、個々の細胞の応答までを解析することはできなかった。ところが、発光顕微鏡“LV−200”では、生体内の変化を一細胞毎にリアルタイムに観察することができ、組織または細胞集団におけるシグナルの働きを詳細に研究することができた。
[Result of Experiment 2]
As a result of the above experiment, as shown in FIG. 7, FIG. 8, and FIG. 9, the change in the response of the cells to the dopamine stimulation to the D2 receptor could be detected at the single cell level (one cell level). Moreover, when the change of the emitted light intensity in each cell shown by FIG. 9 was seen, it turned out that there is big dispersion | variation in the response between cells with respect to dopamine stimulation. Previous studies of intracellular signal transduction mechanisms via dopamine receptors have revealed that the meaning of the signal differs depending on the number or distribution of stimulated dopamine receptors. In the conventional analysis of changes in the amount of luminescence using a luminometer, the response of the entire cell population can be observed, but the response of individual cells cannot be analyzed. However, with the luminescence microscope “LV-200”, changes in the living body can be observed in real time for each cell, and the function of signals in tissues or cell populations can be studied in detail.
[本実施例のまとめ]
以上、本実施例によれば、細胞の受容体遺伝子プロモーター活性に影響されず、細胞集団あるいは各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、細胞集団や個々の細胞においてD2受容体の発現量および分布を再現性良く経時的に観察することができた。
[Summary of this example]
As described above, according to this example, it is possible to obtain an accurate quantitative result from a cell population or each cell without being influenced by the receptor gene promoter activity of the cell. As a result, D2 in the cell population or individual cells can be obtained. The expression level and distribution of the receptor could be observed over time with good reproducibility.
[3.他の実施の形態]
上述した実施の形態においては、主に、ホタルのルシフェラーゼ(配列番号7)をATPセンサータンパク質として説明を行ったが、本発明はこれに限られず、ホタルのルシフェラーゼに替えてヒカリコメツキのルシフェラーゼ(配列番号8)およびこれらの改変体を用いてもよい。
[3. Other Embodiments]
In the above-described embodiment, firefly luciferase (SEQ ID NO: 7) has been mainly described as an ATP sensor protein. However, the present invention is not limited to this, and instead of firefly luciferase, a light click luciferase (sequence) No. 8) and variants thereof may be used.
また、上述した実施の形態においては、主に、株化された細胞または細胞集団を用いて説明を行ったが、本発明はこれに限られず、個体由来の細胞および細胞集団、切片、組織、個体を用いてもよい。 In the above-described embodiment, the description has been made mainly using the established cell or cell population, but the present invention is not limited to this, and the cell and cell population derived from an individual, a section, a tissue, Individuals may be used.
以上説明したように、本発明にかかる受容体発現量解析方法および発光タンパク質は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。 As described above, the receptor expression level analysis method and photoprotein according to the present invention can be suitably used in various fields such as biotechnology, pharmaceuticals, and medicine.
100 発光観察システム
103 容器(シャーレ)
104 ステージ
106 発光画像撮像ユニット
106a 対物レンズ(発光観察用)
106b ダイクロイックミラー
106c CCDカメラ
106d スプリットイメージユニット
106e フィルターホイール
106f 結像レンズ
110 画像解析装置
112 制御部
112a 発光画像撮像指示部
112b 発光画像取得部
112c 画像解析部
112d 解析結果出力部
114 クロック発生部
116 記憶部
118 通信インターフェース部
120 入出力インターフェース部
122 入力装置
124 出力装置
100 Luminescence observation system
103 container (petri dish)
104 stages
106 Luminous image pickup unit
106a Objective lens (for light emission observation)
106b Dichroic mirror
106c CCD camera
106d Split image unit
106e Filter wheel
106f Imaging lens
110 Image analyzer
112 Control unit
112a Luminous image capturing instruction unit
112b Luminescent image acquisition unit
112c Image analysis unit
112d Analysis result output part
114 Clock generator
116 storage unit
118 Communication interface
120 I / O interface section
122 Input device
124 Output device
Claims (7)
ATP依存性の発光タンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から、発光させるための所定の処置を行う発光処置工程と、
前記発光処置工程が行われた後の前記細胞に当該細胞外からドーパミンを添加する物質添加工程と、
前記物質添加工程の前後の前記細胞における前記ATP依存性の発光標識を撮像する撮像工程を含み、該撮像工程により撮像された発光画像をもとに発光量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定した前記発光量に基づいて前記細胞内における前記ATPの濃度を解析する濃度解析工程と、
前記濃度解析工程で解析した前記ATPの濃度に基づいて前記D2受容体の発現量を解析する発現量解析工程と、
を含み、
前記撮像工程は、複数の異なる前記細胞に対して同時に実行され、
前記濃度解析工程は、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像を前記細胞ごとに照合する照合工程をさらに含むこと、
を特徴とする受容体発現量解析方法。 A receptor expression level analysis method for analyzing the expression level of a D2 receptor in a cell,
A production step of producing said cell comprising an ATP-dependent photoprotein ;
A luminescence treatment step of performing a predetermined treatment for causing the cells produced in the production step to emit light from outside the cells;
A substance addition step of adding dopamine from the outside of the cells to the cells after the luminescence treatment step is performed;
Includes an imaging step of imaging the luminescent label in the ATP-dependent in the cells before after the material addition step, a measuring step of measuring the amount of light emission based on the emission image captured by the imaging step,
A concentration analysis step of analyzing the concentration of the ATP in the cell based on the amount of luminescence measured in the measurement step;
An expression level analysis step of analyzing the expression level of the D2 receptor based on the concentration of the ATP analyzed in the concentration analysis step;
Only including,
The imaging step is performed simultaneously on a plurality of different cells,
The concentration analysis step further includes a collation step of collating the plurality of luminescent images captured in the imaging step for each of the cells,
Receptor expression level analysis method characterized by the above.
を特徴とする請求項1に記載の受容体発現量解析方法。 The photoprotein interacts with the ATP in the cell and emits light;
The receptor expression level analysis method according to claim 1 .
を特徴とする請求項1または2に記載の受容体発現量解析方法。 The photoprotein is a firefly luciferase or a lightning luciferase;
The receptor expression level analysis method according to claim 1 or 2 .
を特徴とする請求項1から3のいずれか1つに記載の受容体発現量解析方法。 In the production step, the cell contains the D2 receptor.
The receptor expression level analysis method according to any one of claims 1 to 3 , wherein:
を特徴とする請求項1から3のいずれか1つに記載の受容体発現量解析方法。 In the production step, the cell is one into which the gene for the D2 receptor has been introduced,
The receptor expression level analysis method according to any one of claims 1 to 3 , wherein:
を特徴とする請求項1から5のいずれか1つに記載の受容体発現量解析方法。 The measurement step is repeatedly performed;
The receptor expression level analysis method according to any one of claims 1 to 5 , wherein:
を特徴とする請求項1から6のいずれか1つに記載の受容体発現量解析方法。The receptor expression level analysis method according to any one of claims 1 to 6, wherein:
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