JP5265092B2 - Method for testing faint light specimens - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多数の細胞又は細胞を含む多数の生物学的試料から発生される微弱光に基づいて、多検体由来の各種生物学的活性を網羅的に評価する方法および装置ならびにシステムに関し、種々の生体に関連する生物学的活性の調査に適している。 The present invention relates to a method, apparatus and system for comprehensively evaluating various biological activities derived from multiple specimens based on faint light generated from a large number of cells or a large number of biological samples containing cells. It is suitable for investigating biological activities related to living organisms.
近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質(GFP;Green Fluorescent Protein)や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識や発光標識を付して生体細胞を観察する必要性が高まっている。
GFPを用いる観察では、GFPが励起光の照射に応じて蛍光を発する蛋白質であり、GFPを作用させた標本に大きな強度の励起光を照射して蛍光を得るため、肉眼でも観察可能である反面、標本に損傷を与えやすく1〜2時間程度の観察が限度である。また、蛍光は、複数回の励起光によって退色が進行するので、長期間ないし連続的解析に適さない一面が有る。さらに蛍光強度のばらつきが生じ易いので、たとえ退色の影響を補正ないし回避するような改善を実現できたとしても、蛍光強度に依存した定量的評価は実質的に不可能である。これにより、生きた細胞を含んでいる試料に対して、解析の種類ないし解析期間によっては、何らかの悪影響を含む解析結果が得られる可能性有る。
In recent years, in research fields such as cell biology and molecular biology, GFP (Green Fluorescent Protein) and luciferase gene, which is a bioluminescent enzyme, act as an expression reporter to fluoresce at specific sites and functional proteins in cells. There is an increasing need to observe biological cells with labels and luminescent labels.
In observation using GFP, GFP is a protein that emits fluorescence in response to irradiation with excitation light, and a sample with GFP applied is irradiated with high intensity excitation light to obtain fluorescence. The specimen is easily damaged, and the observation is limited to about 1 to 2 hours. In addition, since the fading of fluorescence proceeds by a plurality of excitation light, there is one aspect that is not suitable for long-term or continuous analysis. Furthermore, since variations in fluorescence intensity are likely to occur, even if an improvement that corrects or avoids the influence of fading can be realized, quantitative evaluation depending on the fluorescence intensity is virtually impossible. As a result, an analysis result including some adverse effect may be obtained for a sample containing living cells depending on the type of analysis or the analysis period.
これに対し、ルシフェラーゼのような生物発光を用いる観察では、ルシフェラーゼが自己発光酵素であり、標本に損傷を与える励起光を必要としないため、5日間程度の観察が可能である。また、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を指標にして発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のDNA断片をつなぐことによって、そのDNA断片の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターにつないで共発現させることによって、その遺伝子産物のレポーター遺伝子の発現に対する影響を調べることができる。さらに、蛍光と異なり、発光反応による発光はばらつきが殆ど無いので、定量的評価に適している。ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法などがあるが、それぞれの目的や細胞の種類によって使い分けられている。 On the other hand, in the observation using bioluminescence such as luciferase, the luciferase is a self-luminescent enzyme and does not require excitation light that damages the specimen, so that it can be observed for about 5 days. In addition, when a luciferase gene is introduced into a cell as a reporter gene and the intensity of expression is examined using luciferase activity as an indicator, the target DNA fragment is linked upstream or downstream of the luciferase gene, thereby affecting the transcription of the DNA fragment. You can investigate the impact. In addition, by co-expressing a gene such as a transcription factor that is thought to affect transcription and connecting it to an expression vector, the effect of the gene product on the expression of the reporter gene can be examined. Furthermore, unlike fluorescence, light emission due to a luminescence reaction has almost no variation, which is suitable for quantitative evaluation. Methods for introducing a reporter gene such as a luciferase gene into cells include the calcium phosphate method, the lipofectin method, and the electroporation method, which are properly used depending on the purpose and cell type.
細胞内に導入され発現しているルシフェラーゼ活性を定量的にモニターする技術としては、多数の細胞を溶解させた溶解液をルシフェリン、ATP、マグネシウムなどを含む基質溶液と反応させ、光電子増倍管を用いた発光用分光装置(以下、ルミノメーターと称する)によって発光量を計測している(特許文献1)。多数の細胞(600万個)をウェル内で発光反応させた後に細胞を溶解して、その細胞溶液を測定用チューブに入れ替えてルミノメーター内での光量測定を行なうため、ある時点での発現量を細胞全体の平均値として計測していることとなる。 As a technique for quantitatively monitoring the luciferase activity introduced and expressed in cells, a lysate containing a large number of cells is reacted with a substrate solution containing luciferin, ATP, magnesium, etc., and a photomultiplier tube is used. The amount of luminescence is measured by the used emission spectrometer (hereinafter referred to as a luminometer) (Patent Document 1). Since a large number of cells (6 million cells) are allowed to luminescence in the wells, the cells are lysed, and the cell solution is replaced with a measurement tube to measure the amount of light in the luminometer. Is measured as the average value of the whole cell.
ところで、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性による細胞からの発光量を指標にしてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のDNA断片をつなぐことによって、このDNA断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、ルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターにつないでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることによって、その遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現におよぼす影響を調べることができる。ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法などがあるが、これらの方法は、導入の目的や細胞の種類に応じて使い分けられる。そして、ルシフェラーゼ活性による細胞からの発光量の測定では、細胞溶解液をルシフェリン、ATP、マグネシウムなどを含む基質溶液と反応させた後、光電子増倍管を用いたルミノメーターによって発光量が定量される。この測定では、細胞を溶解した後に発光量が測定されるため、ある時点での発現量が細胞全体の平均値として計測される。 By the way, when the luciferase gene is introduced into a cell as a reporter gene and the intensity of luciferase gene expression is examined using the amount of luminescence from the cell as an index, the target DNA fragment is connected upstream or downstream of the luciferase gene. Thus, the influence of this DNA fragment on the transcription of the luciferase gene can be examined. In addition, by connecting a gene such as a transcription factor that is thought to affect transcription of the luciferase gene to an expression vector and co-expressing it with the luciferase gene, the influence of the gene product on the expression of the luciferase gene can be examined. Methods for introducing a reporter gene such as a luciferase gene into a cell include the calcium phosphate method, the lipofectin method, and the electroporation method. These methods can be used depending on the purpose of introduction and the type of cell. In the measurement of the amount of luminescence from cells by luciferase activity, the amount of luminescence is quantified by a luminometer using a photomultiplier tube after reacting the cell lysate with a substrate solution containing luciferin, ATP, magnesium, etc. . In this measurement, since the amount of luminescence is measured after the cells are lysed, the expression level at a certain point in time is measured as an average value of the whole cell.
また、遺伝子の発現量の経時変化を捉えるためには、生きた細胞からの発光量を経時的(ないし時系列)に測定する必要がある。たとえば、細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を設け、培養している全細胞集団から発せられる光量を一定時間ごとに測定することによって、一定の周期性をもった発現リズムなどを計測することができる。この場合、多数の細胞その他の成分から発生する発光総量による経時的な発現量の変化が計測される。一方、遺伝子の発現が一過性である場合には、個々の細胞での発現量に大きなばらつきが生じる。たとえば、HeLa細胞などのクローン化した培養細胞であっても、細胞膜表面のレセプターを介した薬剤の応答が個々の細胞でばらつくことがある。すなわち、細胞全体としての応答は検出されなくとも、数個の細胞は応答している場合がある。とくに時計遺伝子のように、細胞内に存在する複数種類の時計遺伝子ごとに異なる発現パターンを示す場合にはさらに複雑な応答を示すことが考えられる。このような場合、細胞全体からではなく個々の細胞での発現量を測定することが重要である。さらに、従来のルミノメータは、多数の細胞を含んだ細胞溶液が1回の測定時点にしか使えないので、測定したい時間に応じた回数に相当する数量の細胞ならびに収容容器を最低限必要とする。しかも、異なる測定時点ごとに別々の細胞溶液を準備することにより、同一の細胞を長期に亘り、連続的ないし経時的に評価または自動解析することができない。以上のように、従来の技術では、生きた細胞を低浸襲のまま多数解析する方法および装置が提供できない状況にあった。 In addition, in order to capture changes in gene expression over time, it is necessary to measure the amount of luminescence from living cells over time (or in time series). For example, measuring the expression rhythm with a certain periodicity by providing a luminometer function in an incubator for culturing cells and measuring the amount of light emitted from the whole cell population being cultured at regular intervals. Can do. In this case, the change in the amount of expression over time due to the total amount of luminescence generated from many cells and other components is measured. On the other hand, when the gene expression is transient, the expression level in individual cells varies greatly. For example, even in the case of cloned cultured cells such as HeLa cells, the response of drugs via receptors on the cell membrane surface may vary among individual cells. That is, even if a response as a whole cell is not detected, several cells may be responding. In particular, when a different expression pattern is shown for each of a plurality of types of clock genes present in a cell, such as a clock gene, a more complicated response can be considered. In such a case, it is important to measure the expression level in individual cells, not from the whole cells. Furthermore, since a conventional luminometer can use a cell solution containing a large number of cells only at one measurement time point, the number of cells corresponding to the number of times corresponding to the time to be measured and a container are required at a minimum. Moreover, by preparing separate cell solutions for different measurement time points, the same cells cannot be evaluated or automatically analyzed over a long period of time or continuously. As described above, the conventional technique cannot provide a method and apparatus for analyzing a large number of living cells with low invasion.
従って、本発明は、生きた細胞に悪影響を与えることなく網羅的な解析することによって、信頼性の高い解析結果を提供できる方法および装置を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method and apparatus that can provide a highly reliable analysis result by comprehensive analysis without adversely affecting living cells.
以上の課題を解決するために、本発明の方法は、細胞又は該細胞を含む生物学的試料を検体として画像取得可能な状態に準備し、多数の前記検体からの生物学的活性に起因する微弱な光学的データを蓄積して画像解析可能な画像情報を取得する微弱光画像取得手段と連携し、前記微弱光画像を形態的に解析して個々の細胞を認識するとともに、認識した個々の細胞に対応する微弱光の光強度を網羅的に評価するための画像解析を行うことを特徴とする。ここで、前記微弱光画像取得手段がさらに異なる所望の経過時間ごとの微弱光画像を連続的ないし断続的に取得する構成を有する場合であって、1以上の同一の細胞に関する時間ごとの光強度を網羅的に解析することにより、例えば時間遺伝子の活性パターンや薬剤等による細胞内物質の応答パターンを網羅的に評価することができるようになる。また、前記認識した細胞のうち所定の光強度ないし光分布を示さない細胞については網羅的評価を行わないことにより、解析すべきでない細胞を除外して正確な評価を実施できるようになる。また、前記画像解析した全ての細胞の光強度を合計値または平均値を算出することにより、個々の細胞の評価の他に解析した細胞全体の評価も実施できるようになる。また、前記画像解析した2以上の細胞の光強度および/または光強度パターンに応じて同一または異なる細胞グループに分類することにより、解析したパターンごとに活性を評価できるようになる。場合によっては、パターンが異なる細胞ごとに活性度ないし活性変化の詳細を調べることができるようになる。 In order to solve the above problems, the method of the present invention prepares a cell or a biological sample containing the cell as a specimen so that an image can be obtained , and results from biological activity from a large number of the specimens. accumulated weak optical data in cooperation with faint light image obtaining means for obtaining image analysis can be image information, recognizes the individual cells the weak light image by morphological analysis, recognized individual Image analysis is performed to comprehensively evaluate the light intensity of the weak light corresponding to the cell. Here, in the case where the weak light image acquisition means has a configuration for continuously or intermittently acquiring weak light images at different desired elapsed times, the light intensity per time for one or more identical cells. By comprehensively analyzing the above, it becomes possible to comprehensively evaluate, for example, the temporal gene activity pattern and the response pattern of intracellular substances due to drugs and the like. In addition, the cells that do not exhibit a predetermined light intensity or light distribution among the recognized cells are not subjected to exhaustive evaluation, so that accurate evaluation can be performed excluding cells that should not be analyzed. Further, by calculating the total value or the average value of the light intensities of all the cells subjected to the image analysis, it becomes possible to perform the evaluation of the analyzed whole cells in addition to the evaluation of the individual cells. Further, by classifying the cells into the same or different cell groups according to the light intensity and / or light intensity pattern of two or more cells subjected to the image analysis, the activity can be evaluated for each analyzed pattern. In some cases, it becomes possible to examine details of activity or activity change for each cell having a different pattern.
また、本発明の装置は、細胞又は該細胞を含む生物学的試料を検体とし、多数の前記検体を画像取得可能な状態に保持する保持手段と、前記生物学的試料から発する微弱な光学的データを蓄積して画像解析可能な画像情報を取得する微弱光画像取得手段と、前記微弱光画像を形態的に解析して個々の細胞を認識するとともに認識した個々の細胞に対応する微弱光の光強度を網羅的に評価するための画像解析手段とを備えたことを特徴とする。ここで、前記保持手段が、複数のウェルを一体化したプレートをアドレス化可能に保持する構成を有することにより、複数のウェル間の評価を同一視野内または所定の順番で行うようになるので、異なる試料または異なる薬剤等による活性評価の結果を比較したり相関させることができるようになる。こ場合、前記保持手段が複数の独立した容器をアドレス化可能に保持する構成としてもよく、画像取得手段の視野に限定されず、多数の容器についての評価を行えるようになる。また、画像取得した時刻に応じた評価を行うように制御する制御手段を有することにより、経過時間ごとの同一細胞に関する解析、特定の活性を示した異なる時間同士の細胞(同一または異なる細胞)の比較解析といった多様な時間解析ができるようになる。また、前記画像解析した結果を画像情報と関連付けて表示する表示手段をさらに有することにより、解析結果の中から画像として見たい結果に対応する画像を表示できるよになる。また、前記表示手段が所望の画像情報を動画表示する構成を有することにより、1以上の所望の細胞に関する活性の変化をリアルタイムな映像でもって観察することができるようになる。動画表示としては、同一細胞に関する時間ごとの微弱光画像を画像処理により重ね合わせて臨場感を向上させるようにするとさらに好ましい。また、同一細胞に関する時系列の複数画像を駒送りで並列(ないし一部ずらしただけでもよい)表示するようにして、時間ごとの画像を全貌できるようにしてもよい。 In addition, the apparatus of the present invention uses a cell or a biological sample containing the cell as a specimen, a holding means for holding a large number of the specimens in a state in which an image can be acquired, and a weak optical emitted from the biological sample. Weak light image acquisition means for accumulating data and acquiring image information that can be analyzed, and recognizing individual cells by morphologically analyzing the weak light image and detecting weak light corresponding to the recognized individual cells An image analysis means for comprehensively evaluating the light intensity is provided. Here, since the holding means has a configuration in which a plate in which a plurality of wells are integrated is held so as to be addressable, evaluation between the plurality of wells is performed in the same field of view or in a predetermined order. It becomes possible to compare and correlate the results of activity evaluation with different samples or different drugs. In this case, the holding unit may be configured to hold a plurality of independent containers in an addressable manner, and is not limited to the field of view of the image acquisition unit, and can evaluate a large number of containers. In addition, by having a control unit that controls to perform evaluation according to the time of image acquisition, analysis of the same cell for each elapsed time, cells of different times (identical or different cells) exhibiting a specific activity Various time analysis such as comparative analysis can be performed. Further, by further including display means for displaying the image analysis result in association with image information, it is possible to display an image corresponding to the result desired to be viewed as an image from the analysis result. In addition, since the display means has a configuration in which desired image information is displayed as a moving image, a change in activity relating to one or more desired cells can be observed with a real-time image. As a moving image display, it is more preferable to enhance the sense of reality by superimposing weak light images of the same cell for each time by image processing. Further, a plurality of time-series images related to the same cell may be displayed in parallel (or just partially shifted) by frame advance so that the entire image for each time can be displayed.
以上の方法および装置は、必要とする装置構成を制御したり連携するためのソフトウェアまたは該ソフトウェアを特徴づけるコンピュータプログラムの形態で提供されてもよい。また、本発明の方法または装置を装置と同一ないし別個に配置されたデータベースと電気的に接続することにより、画像容量ないし解析情報量に制限されることなく、高速で且つ信頼性と質の高い解析結果を提供することが可能になる。 The above method and apparatus may be provided in the form of software for controlling or coordinating a required apparatus configuration or a computer program characterizing the software. In addition, by electrically connecting the method or apparatus of the present invention to a database arranged identically or separately from the apparatus, it is fast and reliable and high quality without being limited by image capacity or analysis information amount. Analysis results can be provided.
本発明によれば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞の発光像を,以下の条件を満たす光学系で撮像することが実用面で重要な鍵を握っている。本出願人による光学的実験によれば、対物レンズの開口数(NA)および投影倍率(β)で表される(NA÷β)の2乗の値が0.01以上の光学系で撮像することによって、単一の細胞から発生する発光だけで画像化できることが証明された(特願2005−267531号参照)。さらに、本出願人は、検討を進め、同一シャーレ内で培養された複数の細胞において、遺伝子発現の変動パターンが異なることも発見した。さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、撮像装置の対物レンズを開口数(NA)/投影倍率(β)の2乗で表される光学的条件が0.071以上である場合に、1〜5分以内で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できること突き止めた。これらの発光画像を蓄積型の撮像装置により顕微鏡観察する発光解析システムを発光顕微鏡と呼ぶこととする。発光顕微鏡には、好ましくは遮光のための開閉蓋(ないし開閉窓)を具備する遮光手段を有し、この遮光手段の開閉によって必要な生体試料をセットまたは交換する。目的に応じて、生体試料を収容する容器に対して化学的ないし物理学的刺激を行なう操作を手動ないし自動で行なうようにしてもよい。最良の一形態では、発光顕微鏡は公知または独自の培養装置を搭載いる。培養装置は、長期間のシステム内での解析を可能にするように、温度、湿度、pH、外気成分、培地成分、培養液成分を最適に維持する機能を備えている。 According to the present invention, it is important in practical use to capture a luminescence image of a cell into which a luciferase gene has been introduced with an optical system that satisfies the following conditions. According to the optical experiment by the present applicant, imaging is performed with an optical system in which the square of (NA ÷ β) expressed by the numerical aperture (NA) of the objective lens and the projection magnification (β) is 0.01 or more. Thus, it was proved that an image can be formed only by luminescence generated from a single cell (see Japanese Patent Application No. 2005-267531). Furthermore, the present applicant has proceeded with studies and found that the variation pattern of gene expression is different among a plurality of cells cultured in the same petri dish. Further, according to the optical condition investigated by the inventor, when the optical condition expressed by the square of the numerical aperture (NA) / projection magnification (β) of the objective lens of the imaging apparatus is 0.071 or more. It was found that a cell image that can be imaged within 1 to 5 minutes and can be analyzed is provided. A light emission analysis system that observes these light emission images with a storage-type imaging device under a microscope is called a light emission microscope. The light emission microscope preferably has a light shielding means having an opening / closing lid (or an opening / closing window) for shielding light, and a necessary biological sample is set or exchanged by opening / closing the light shielding means. Depending on the purpose, an operation for chemically or physically stimulating a vessel containing a biological sample may be performed manually or automatically. In the best mode, the luminescence microscope is equipped with a known or unique culture device. The culture apparatus has a function of optimally maintaining the temperature, humidity, pH, outside air component, medium component, and culture solution component so as to enable analysis in the system for a long period of time.
従って、本発明の解析方法は、細胞内外の相互作用を画像情報に基づいて解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を1以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および/または量を示していることを特徴とする。 Therefore, the analysis method of the present invention is a method for analyzing intracellular / extracellular interactions based on image information, wherein at least one of the interactable substances is labeled with a luminescent substance as a biological excitation substance. Including the step of causing the agent to be present in one or more cells, optically imaging the resulting emission of the interaction, and imaging the captured optical information for a single cell, wherein the image representation is an interaction It is characterized by the presence and / or amount of weak light caused by it.
本発明においては、次の適用範囲が有効的に含まれる。
(1)アッセイ項目
次の広範なアッセイ項目において、微弱な発光を用いた低浸襲性でかつ直接的な解析を詳細かつ正確に実行し得る。例えば、遺伝子発現異常(例えば遺伝子発現頻度の決定および/または変動のモニタリング)、体内リズム障害関連疾患(例えば睡眠障害、過労症候群、時差ボケ)、時間薬理学的応答(例えば薬物感受性または薬物代謝活性の日内変動)、日照応答リズム(例えば植物生育速度、走光性運動活性)、化学物質応答評価(創薬スクリーニング、抗癌剤効果モニタリング、移植または遺伝子治療後の細胞(ないし生体組織)の術後経過観察、水類(ないし血清)ストレス評価)、物理学的刺激応答評価(熱ショック、電気ショック、圧力ショック)、発生学的生物活性の評価が挙げられる。
In the present invention, the following application ranges are effectively included.
(1) Assay Items In the following wide range of assay items, low invasiveness and direct analysis using weak luminescence can be performed in detail and accurately. For example, gene expression abnormalities (eg determination of gene expression frequency and / or monitoring of fluctuations), internal rhythm disorder related diseases (eg sleep disorders, overwork syndrome, jet lag), temporal pharmacological responses (eg drug sensitivity or drug metabolic activity) Diurnal fluctuations), sunshine response rhythms (eg plant growth rate, phototactic motor activity), chemical response evaluation (drug discovery screening, anticancer drug effect monitoring, post-surgical follow-up of cells (or biological tissues) after transplantation or gene therapy , Water (or serum) stress evaluation), physical stimulus response evaluation (heat shock, electric shock, pressure shock), and developmental biological activity evaluation.
(2)アッセイ原理
核内移行、レセプタ受容シグナル伝達、神経細胞成長、生体日概リズムが挙げられる。
このうち、アッセイにおいて、光学的ないし熱的刺激を利用するものについては、従来の蛍光検出は複数回の励起光照射による余分な光刺激または熱上昇をもたらすが、発光においては冷光である故に、過剰な外来ビームや熱上昇による細胞への影響は殆ど無い。
(2) Assay principle Nuclear translocation, receptor receptor signal transduction, nerve cell growth, and biological circadian rhythm.
Among these, in the case of using an optical or thermal stimulus in the assay, the conventional fluorescence detection causes an extra light stimulus or a heat increase due to multiple excitation light irradiations, but because it is a cold light in the luminescence, There is almost no influence on the cell by excessive exogenous beam and heat rise.
(3)使用可能な機器
撮像装置(例えば光学顕微鏡、フォトマルチプライヤー型イメージャー(フォトマル)、イメージサイトメーター)、分光測定装置(例えばルミノメータ、積分球光度計、フォトンカウンター)が挙げられる。このうち、撮像装置は、フォトマルによる画像生成よりも、CCDカメラ(培養装置と一体化しているシステムにおいてインキュベーター温度による感度低下が問題になる場合には、冷却性能に優れるCCDである方が好ましい)による画像生成の方が鮮明な画質を短時間で得易い点で好ましい。但し、生物学的活性を計測する上では、上記の撮像装置、分光測定装置のいずれであってもデータが得られる。例えば、上記撮像装置において画像が生成されるより前に生物学的活性を示すに充分な発光量(ないし発光強度)が蓄積できる。従って、上記撮像手段にいずれかを用いて発光画像を取得した場合には、同じ発光画像を用いて高感度な発光データを得ることが可能である。連続的ないし経時的(ないし時系列)な解析を行う場合には、複数回の異なる時間のうち、最少1回(好ましくは初回)の発光シグナルの取得時において画像生成を行い、それ以外は画像生成することなく、好ましくは指定された部位または部分領域について、発光データのみを繰返し得るようにすれば、評価ないし解析時間のさらなる効率化が図れる。なお、本発明において、分光測定装置を使用する場合には、生物学的試料の特定部位ないし部分領域に限定した計測が可能な手段(例えば光学的絞り)と組み合わせることにより特定の単一細胞を含む若干大きめの小フレームまたは或る程度の広がりを持った細胞集団を含む大フレームによって、受光可能な最大面積よりも小さく且つ余分な領域がなるべく含まれないような受光データを連続的ないし経時的(好ましくは時系列的)に繰返し測光するようにすればよい。
(3) Usable devices An imaging device (for example, an optical microscope, a photomultiplier type imager (photomal), an image cytometer), and a spectroscopic measurement device (for example, a luminometer, an integrating sphere photometer, a photon counter) can be mentioned. Among these, the image pickup apparatus is preferably a CCD camera (excellent cooling performance when sensitivity reduction due to incubator temperature is a problem in a system integrated with a culture apparatus) rather than image generation by photomultiplier. ) Is preferable in that a clear image quality can be easily obtained in a short time. However, in measuring biological activity, data can be obtained by any of the imaging apparatus and the spectroscopic measurement apparatus. For example, a light emission amount (or light emission intensity) sufficient to show biological activity can be accumulated before an image is generated in the imaging device. Therefore, when a luminescent image is acquired using any one of the imaging means, it is possible to obtain highly sensitive luminescent data using the same luminescent image. When performing continuous or time-lapse (or time-series) analysis, image generation is performed at least once (preferably the first time) of the emission signals among a plurality of different times, otherwise the image is generated. If only light emission data can be repeated preferably for a designated part or partial region without generation, it is possible to further improve the efficiency of evaluation or analysis time. In the present invention, when a spectroscopic measurement device is used, a specific single cell can be obtained by combining with a means (for example, an optical aperture) capable of measurement limited to a specific part or partial region of a biological sample. The received light data that is smaller than the maximum light-receiving area and contains as little extra area as possible can be obtained continuously or over time by a slightly larger small frame or a large frame including a cell population having a certain extent. Photometry may be repeated repeatedly (preferably in time series).
(4)アッセイ対象(試料)
真核動物、シアノバクテリア由来の細胞または組織が挙げられる。医学用途において、哺乳類、とくひヒトにおける検査すべき部位からバイオプシーにより切除した細胞を含む試料がとくに例示される。再生医療においては、少なくとも一部が人工的に改良ないし合成された生体試料であって、生物学的活性を良好に維持するかどうかを検査する目的に利用できる。他の一面において、本発明のアッセイ対象は、動物由来の細胞または生体組織に限らず、植物や昆虫由来の細胞または生体組織であったもよい。菌、ウイルスにおいては、従来のルミノメータでは実行されなかった容器内の部分ごとの解析が対象となり得る。ルミノメータではウエルまたはシャーレ等の容器内に無数の試料(例えば1ウェル当り100万個以上)を重積することで強大な発光量を得るようにしている。本発明では、個々の細胞が識別できる程度の密度で容器内に収容することで、個別の細胞ないし生体組織を解析できる。個別の解析には、発光している細胞だけの個数を計算する工程を含めることができるので、細胞1個当りの正確な相互作用に関する評価が行なえる。
(4) Target of assay (sample)
Examples include cells or tissues derived from eukaryotes and cyanobacteria. In medical use, a sample containing cells excised by biopsy from a site to be examined in mammals, especially humans is particularly exemplified. In regenerative medicine, at least a part of an artificially modified or synthesized biological sample can be used for the purpose of examining whether biological activity is maintained well. In another aspect, the assay subject of the present invention is not limited to cells or biological tissues derived from animals, but may be cells or biological tissues derived from plants or insects. In the case of bacteria and viruses, the analysis of each part in the container that has not been performed by a conventional luminometer can be targeted. In the luminometer, a large amount of light emission is obtained by stacking an infinite number of samples (for example, 1 million or more per well) in a container such as a well or a petri dish. In the present invention, individual cells or living tissues can be analyzed by storing them in a container at a density that allows individual cells to be identified. Since individual analysis can include a step of calculating the number of only luminescent cells, an accurate interaction per cell can be evaluated.
(5)本発明によって得られる進歩性有る情報
個々の細胞のそれぞれから発生する1種または複数種類の発光データである。一例として、細胞のそれぞれが異なる発光量または発光分布を示すことを統計的に解明する方法および装置を提供する。別の例として、同一の細胞から異なる種類の発光が同一または異なる時機に発生するかどうかを解明するマルチアッセイのための方法および装置を提供する。また、別な例として、同一の撮像領域において発光量で分類される複数の同一または異なる細胞集団を解明し、必要に応じて分類結果をヒストグラムや正規分布等のグラフィック表現を行なうような方法および装置を提供する。また、別な例として、同一の細胞(ないし組織)の特定部位ないし一定の拡がりの有る領域についての各種変化を安定的に高精度で解析する方法および装置を提供する。分布状態撮像領域において発光量で分類される複数の同一または異なる細胞集団を解明し、必要に応じて分類結果をヒストグラムや正規分布等のグラフィック表現を行なうような方法および装置を提供する。
(5) Inventive information obtained by the present invention One or more kinds of luminescence data generated from each individual cell. As an example, a method and apparatus for statistically elucidating that each cell exhibits a different light emission amount or light emission distribution is provided. As another example, a method and apparatus for a multi-assay that elucidates whether different types of luminescence from the same cell occur at the same or different times is provided. As another example, a method for elucidating a plurality of identical or different cell populations classified by the amount of luminescence in the same imaging region, and performing a graphic expression such as a histogram or a normal distribution on the classification results as necessary, and Providing equipment. As another example, there is provided a method and apparatus for stably and accurately analyzing various changes in a specific region of a same cell (or tissue) or a region having a certain spread. Provided is a method and apparatus for elucidating a plurality of identical or different cell populations classified by the amount of luminescence in a distribution state imaging region, and performing a graphic expression such as a histogram or a normal distribution on the classification results as necessary.
本発明は、肉眼では見えないような微弱光画像に基づく解析を網羅的に行うようにしたので、生きた細胞に悪影響を与えることなく信頼性の高い解析結果を提供できる。 According to the present invention, since the analysis based on the weak light image that cannot be seen with the naked eye is comprehensively performed, a highly reliable analysis result can be provided without adversely affecting the living cells.
以下の説明において、光学条件の詳細については出願人による特願2005−267531および特願2005−44737を参照できる。また、本発明の要旨に関連する画像情報取得後の画像情報処理と適用例については、特開平11−271209、特開2000−279168、特開平10−293094、特開平3−255365に記載のイメージサイトメータに関する構成を本発明の参照とすることができる。但し、従来のイメージサイトメータは、蛍光等の肉眼で観察可能な光シグナルを発生するような試料を用いるので、フローサイトメータやレーザ走査型顕微鏡のように試料または測定用ビームを移動させながら順番に個々の細胞を解析する方法および装置であるのに対して、本発明の方法および装置は、肉眼では暗黒状態の見えない微弱光(例えば生物発光)を複数の細胞について同時に画像化するような蓄積型の光検出装置を具備する点で同時に網羅解析可能である点で大きく異なる。 In the following description, Japanese Patent Application No. 2005-267531 and Japanese Patent Application No. 2005-44737 by the applicant can be referred to for details of optical conditions. Further, image information processing and application examples after obtaining image information related to the gist of the present invention are described in JP-A-11-271209, JP-A-2000-279168, JP-A-10-293094, and JP-A-3-255365. The configuration related to the cytometer can be referred to for the present invention. However, since conventional image cytometers use samples that generate optical signals that can be observed with the naked eye, such as fluorescence, the sample or measurement beam is moved in sequence as in a flow cytometer or a laser scanning microscope. In contrast to the method and apparatus for analyzing individual cells, the method and apparatus of the present invention is capable of imaging faint light (eg, bioluminescence) invisible to the naked eye on a plurality of cells simultaneously. It differs greatly in that an exhaustive analysis can be performed at the same time in that a storage type photodetection device is provided.
第1の実施の形態
図13および図14を用いて、第1の実施の形態の構成について説明する。図13は倒立型顕微鏡をベースとする微弱光検出装置の概略図である。微弱光検出装置は、光源2と、光源2から発せられた光を平行光とし、被験試料4へ導くための照明光学系1と、被験試料4の像を生成するための観察光学系5と、被験試料4の像を拡大して目視観察するための接眼レンズ6と、被験試料4の像を撮像するための撮像素子7を有するCCDカメラ8とにより構成されている。またCCDカメラ8には、テレビモニターを兼ねるコンピューター16が信号ケーブル100によって接続されている。
First Embodiment A configuration of the first embodiment will be described with reference to FIGS. 13 and 14. FIG. FIG. 13 is a schematic view of a weak light detection device based on an inverted microscope. The feeble light detection apparatus includes a light source 2, an illumination optical system 1 for guiding the light emitted from the light source 2 to parallel light, and guiding the light to the test sample 4, and an observation optical system 5 for generating an image of the test sample 4. The eyepiece 6 for enlarging and visually observing the image of the test sample 4 and the CCD camera 8 having the image sensor 7 for capturing the image of the test sample 4 are configured. Further, a computer 16 also serving as a television monitor is connected to the CCD camera 8 by a signal cable 100.
照明光学系1は、光源2側から順に、コレクターレンズ10、照明光の光軸11を偏向させるための偏向ミラー12、及びコンデンサレンズ14により構成される。光源2はハロゲンランプ、LED光源、タングステンランプ、水銀ランプなどの可視域の波長のインコヒーレント光源を用いる。あるいはレーザーのようなコヒーレント光源の光を拡散板などを用いてインコヒーレントな光に変えて、光源として用いても良い。光源の波長は通常、可視光を用いるが、赤外光を用いても良い。 The illumination optical system 1 includes a collector lens 10, a deflection mirror 12 for deflecting the optical axis 11 of illumination light, and a condenser lens 14 in order from the light source 2 side. The light source 2 uses an incoherent light source having a visible wavelength such as a halogen lamp, an LED light source, a tungsten lamp, or a mercury lamp. Alternatively, the light of a coherent light source such as a laser may be changed to incoherent light using a diffusion plate or the like and used as a light source. Visible light is usually used as the wavelength of the light source, but infrared light may be used.
観察光学系5は、被験試料4側から順に、被験試料4の像を形成するための対物レンズ15、第1のリレーレンズ16、対物レンズ15からの光を偏向するための偏向ミラー17、第1のリレーレンズ16と共に対物レンズ15の像(被験試料4の像)を結像面19に結像させるための第2のリレーレンズ18により構成される。また、第2のリレーレンズ18と結像面19との間には、被験試料4の像を接眼レンズ6による目視観察とCCDカメラ8による観察が任意に切り替えることができるように、切替ミラー20が配置されている。なお、切替ミラー20は機械的な切り替えタイプ以外に、ハーフミラーを用いて2つの光路を分離するようにしても良い。 The observation optical system 5 includes, in order from the test sample 4 side, an objective lens 15 for forming an image of the test sample 4, a first relay lens 16, a deflection mirror 17 for deflecting light from the objective lens 15, a first mirror. The first relay lens 16 and the second relay lens 18 for forming an image of the objective lens 15 (image of the test sample 4) on the imaging surface 19 are formed. Further, a switching mirror 20 is provided between the second relay lens 18 and the imaging plane 19 so that the visual observation with the eyepiece 6 and the observation with the CCD camera 8 can be arbitrarily switched with respect to the image of the test sample 4. Is arranged. In addition to the mechanical switching type, the switching mirror 20 may use a half mirror to separate the two optical paths.
次に本発明による微弱光検出装置の検出部分に関する詳細な構成について、図14を用いて説明する。被験試料はシャーレなどの試料容器21に、培養液と共に入れられる。試料容器21の周囲には水槽22が配置されており、この水槽22内に純水がノズル23を通して供給される。この純水は試料容器内の湿度を保つために送られる。また水槽22の上面にはガス供給チューブ24を通してCO2ガスが供給される。CO2ガスは測定装置本体の外部に置かれたガスボンベ25から供給される。ガスボンベ内はCO25%、O295%の混合ガスで満たされている。CO2ガスはガスボンベ25から試料容器21が入ったフタ付き密閉容器30内へ、ガス供給チューブ24を通って、50mL/minの流速で供給される。また、試料容器全体はヒートプレート27の上に乗っている。ヒートプレート27は温度コントローラー(図示しない)により環境温度の設定が0.5°ステップ間隔で行なわれている。試料容器21の底面は顕微鏡用カバーガラスと同じ材質で、厚さ0.17mmになっており、通常の対物レンズが対応できるようになっている。試料容器21の底面は光学的に透明になっている。なお、試料容器21はシャーレに限ることなく、スライドガラス、マイクロプレート、フローセルなどを用いても良く、好ましくは2次元的データが得られやすいように、幅広(ないし扁平)な底面を有する容器であるのがさらに好ましい。複数の収容部分を一体化したウェルやキュベットにおいては、各収容部分の仕切り部分が遮光性の材料ないし染料で全面的に成形するのが好ましい。また、シャーレ等の上部開口を有する容器については、蒸発防止用のフタを覆い被せるのが好ましく、さらにフタの内面が反射防止用の被膜ないし染色を施すのがS/N比を向上させる上で好ましい。このような硬質のフタの代わりに、容器内の試料の上面にミネラルオイルのような液状のフタを配置するようにしてもよい。 Next, the detailed structure regarding the detection part of the weak light detection apparatus by this invention is demonstrated using FIG. A test sample is put into a sample container 21 such as a petri dish together with a culture solution. A water tank 22 is disposed around the sample container 21, and pure water is supplied into the water tank 22 through a nozzle 23. This pure water is sent to maintain the humidity in the sample container. Further, CO 2 gas is supplied to the upper surface of the water tank 22 through a gas supply tube 24. The CO 2 gas is supplied from a gas cylinder 25 placed outside the measuring apparatus main body. The gas cylinder is filled with a mixed gas of 5% CO 2 and 95% O 2 . The CO 2 gas is supplied from the gas cylinder 25 into the sealed container 30 with the lid containing the sample container 21 through the gas supply tube 24 at a flow rate of 50 mL / min. Further, the entire sample container is on the heat plate 27. The environmental temperature of the heat plate 27 is set at 0.5 ° step intervals by a temperature controller (not shown). The bottom surface of the sample container 21 is made of the same material as the microscope cover glass and has a thickness of 0.17 mm so that a normal objective lens can be used. The bottom surface of the sample container 21 is optically transparent. The sample container 21 is not limited to a petri dish, and a slide glass, a microplate, a flow cell, or the like may be used. Preferably, the sample container 21 is a container having a wide (or flat) bottom so that two-dimensional data can be easily obtained. More preferably. In a well or cuvette in which a plurality of storage portions are integrated, it is preferable that the partition portion of each storage portion is formed entirely with a light-shielding material or dye. In addition, for containers having an upper opening such as a petri dish, it is preferable to cover the evaporation prevention lid, and the inner surface of the lid is coated with an antireflection coating or dyeing in order to improve the S / N ratio. preferable. Instead of such a hard lid, a liquid lid such as mineral oil may be arranged on the upper surface of the sample in the container.
試料容器21の上面には試料容器フタ26が、試料容器21の上面前面を覆って、かぶせられるように配置されている。試料容器フタ26は光学的に透明なアクリル樹脂などの合成樹脂でできており、試料容器21内の被験試料4内にゴミなどの異物が侵入することを防いでいる。また、試料容器21内の被験試料4が蒸発することも防いでいる。水槽22を含めた試料容器21はフタ付き密閉容器30内に収められている。フタ付き密閉容器30は光学的に遮光性が高く且つ耐水性、耐熱性に優れた材質(例えば、アルミニウム、ステンレス等の金属、暗黒色の染料ないし金属粒子を密に含有するプラスチックや合成樹脂等、隙間用シリコンゴムなど)で出来ており、上面には蝶番32を介して、同様の材質のフタ31が取り付けられている。フタ31は蝶番32により、手動で開閉することができる。このようにして、試料容器21を完全に遮光された光環境に置くことができる構成となっている。必要に応じてさらに装置本体を覆うハウジング(図示せず)を設けることで、二重の遮光構造にしてもよい。 A sample container lid 26 is disposed on the upper surface of the sample container 21 so as to cover the upper surface of the upper surface of the sample container 21. The sample container lid 26 is made of a synthetic resin such as an optically transparent acrylic resin, and prevents foreign matters such as dust from entering the test sample 4 in the sample container 21. Further, evaporation of the test sample 4 in the sample container 21 is also prevented. The sample container 21 including the water tank 22 is housed in a sealed container 30 with a lid. The airtight container 30 with a lid is optically highly light-shielding and is excellent in water resistance and heat resistance (for example, a plastic such as aluminum or stainless steel, a plastic or synthetic resin containing a dark black dye or metal particles densely, etc. , And a lid 31 of the same material is attached to the upper surface via a hinge 32. The lid 31 can be manually opened and closed by a hinge 32. In this way, the sample container 21 can be placed in a light environment that is completely shielded from light. If necessary, a double light shielding structure may be provided by further providing a housing (not shown) that covers the apparatus main body.
試料ステージ3には2個のステッピング・モーター(図示しない)がそれぞれ90°方向に別々に取り付けられており、それぞれのステッピング・モーターは試料ステージコントローラーに接続されている。試料ステージコントローラーはコンピューター16に接続されており、コンピューター16からの指令により、2個のステッピング・モーターを駆動し、試料ステージ3をX方向、Y方向に移動させる。試料ステージ3下方には対物レンズ15が倒立に配置されており、対物レンズヒーター28が対物レンズ15に接触して周囲に取り付けられている。対物レンズヒーター28は温度調整装置につながれており、0.5°ステップ間隔で温度コントロールが行なわれ、対物レンズを外側から一定温度に保持している。また、対物レンズヒーターの周囲には対物レンズZ軸駆動機構9が備えられており、対物レンズ15をZ軸(光軸方向)に沿って自動的に駆動する。対物レンズZ軸駆動機構9はラックピニオン機構(図示しない)で対物レンズを上下に移動させる。ラックピニオン機構のノブの回転動作はコンピューター制御されたステッピングモーター(図示しない)により行なう。なお、対物レンズZ軸駆動機構9はラックピニオン機構のほかに、フリクションローラー機構で行なっても良い。 Two stepping motors (not shown) are separately attached to the sample stage 3 in the 90 ° direction, and each stepping motor is connected to a sample stage controller. The sample stage controller is connected to the computer 16, and in response to a command from the computer 16, the two stepping motors are driven to move the sample stage 3 in the X direction and the Y direction. An objective lens 15 is arranged upside down below the sample stage 3, and an objective lens heater 28 is attached to the periphery in contact with the objective lens 15. The objective lens heater 28 is connected to a temperature adjusting device, temperature is controlled at 0.5 ° step intervals, and the objective lens is held at a constant temperature from the outside. An objective lens Z-axis drive mechanism 9 is provided around the objective lens heater to automatically drive the objective lens 15 along the Z-axis (optical axis direction). The objective lens Z-axis drive mechanism 9 moves the objective lens up and down by a rack and pinion mechanism (not shown). The rotation of the knob of the rack and pinion mechanism is performed by a computer-controlled stepping motor (not shown). The objective lens Z-axis drive mechanism 9 may be a friction roller mechanism in addition to the rack and pinion mechanism.
受光器はCCD(Charge Coupled Device)カメラを用い、例えば受光部分の構成が、CCDカメラ8の受光面上で1,360×1,024個程度の画素からなる撮像素子となっている。被験試料から発せられた光が微弱光のため、受光器としてのCCDカメラ8はできる限り高感度のものを用いる。CCDカメラ8から発する暗電流を抑えるために、CCDカメラ8の底部にはペルチエ素子から成る冷却装置29が備え付けられており、CCDカメラ8の温度を0℃程度で冷却保温する。CCDカメラ8の受光面の上方に赤外線カットフィルターを配置し、背景光となる赤外線を遮断する。CCDカメラ8は、図示するように信号ケーブル100を通じてコンピュータ16におけるTVモニターと接続されており、TVモニター上に種々の試料画像が描出される。CCDカメラは、3板式カラーカメラとして、カラーの明視野像が得られるようにしても良い。ここで、コンピュータ16におけるキーボードやマウスポインター(もしくはタッチパネル、電子入力用ペン、テンキーボード、グリッド座標入力手段等)といった指定手段が、TVモニター上の画像の所望の部位または部分領域を指定(ないし入力)できるように構成されている。 The light receiver uses a CCD (Charge Coupled Device) camera. For example, the structure of the light receiving portion is an image pickup element composed of about 1,360 × 1,024 pixels on the light receiving surface of the CCD camera 8. Since the light emitted from the test sample is faint, the CCD camera 8 serving as the light receiver has a sensitivity as high as possible. In order to suppress the dark current generated from the CCD camera 8, a cooling device 29 composed of a Peltier element is provided at the bottom of the CCD camera 8, and the temperature of the CCD camera 8 is cooled and kept at about 0 ° C. An infrared cut filter is disposed above the light receiving surface of the CCD camera 8 to block infrared rays that are background light. The CCD camera 8 is connected to a TV monitor in the computer 16 through a signal cable 100 as shown, and various sample images are rendered on the TV monitor. The CCD camera may be a three-plate color camera so that a color bright field image can be obtained. Here, designation means such as a keyboard and mouse pointer (or touch panel, electronic input pen, numeric keyboard, grid coordinate input means, etc.) in the computer 16 designate (or input) a desired part or partial area of the image on the TV monitor. ) Is configured to be able to.
なお光検出器はCCDカメラに限ることなく、例えばCMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサーやSIT(Silicon Intensified Target)カメラなどを用いても良いのは勿論である。また、培養温度や光検出期間の長さに応じて、必要充分な感度を有する冷却型CCDカメラを使用するのが好ましい。 Of course, the photodetector is not limited to a CCD camera, and a CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) image sensor, a SIT (Silicon Intensified Target) camera, or the like may be used. Further, it is preferable to use a cooled CCD camera having necessary and sufficient sensitivity according to the culture temperature and the length of the light detection period.
生物発光タンパク質による発光現象を測定する場合、試料セッティング時には発光強度がまだ極めて微弱で、ほとんど光信号として、受光器で検出することができない。従って、細胞の内部構造は通常、観察できない。すなわち、通常の顕微鏡観察のように、試料内の観察対象である細胞を確認しながら対物レンズのフォーカスを合わせることができない。そこで明視野像観察として、ハロゲンランプなどの光源からの光を照明光学系を通して、被験試料に投光し、被験試料による顕微鏡の明視野像を得て、これに基づいて対物レンズのフォーカス位置を決定する。すなわち、明視野観察において、高いコントラスト像が得られる、対物レンズの光軸上の2箇所の略中心位置を対物レンズのフォーカス位置とする。これにより、生物発光タンパク質による発光強度が大きくなってきたときに、CCDカメラに合焦された鮮明な発光像が得られる。 When measuring a luminescence phenomenon caused by a bioluminescent protein, the luminescence intensity is still very weak at the time of sample setting, and almost cannot be detected as a light signal by a light receiver. Therefore, the internal structure of the cell cannot usually be observed. That is, the objective lens cannot be focused while confirming the cell that is the observation target in the sample, as in normal microscope observation. Therefore, as a bright field image observation, light from a light source such as a halogen lamp is projected onto the test sample through the illumination optical system to obtain a bright field image of the microscope by the test sample, and based on this, the focus position of the objective lens is determined. decide. That is, in the bright field observation, two substantially central positions on the optical axis of the objective lens that can obtain a high contrast image are set as the focus positions of the objective lens. Thereby, when the luminescence intensity by the bioluminescent protein becomes large, a clear luminescent image focused on the CCD camera can be obtained.
次に、第1の実施の形態の光学系の作用について図13に基づいて説明する。光源2はコレクタレンズ10により平行光とされ、コンデンサーレンズ14の瞳位置に投影される。この光源2の像は、コンデンサーレンズ14によってケーラー照明として被験試料4を照明する。被験試料4を照明した光は、被験試料4を透過して対物レンズ15に入射する。対物レンズ15に入射した測定光は、対物レンズ15と第1のリレーレンズ16及び第2のリレーレンズ18により結像面19に被験試料4の像を形成する。ここでは倍率×20の対物レンズを用いている。対物レンズは、所望の倍率に応じて適宜、油浸式にすることができる。また、どの倍率を選択するかは、評価(ないし解析)すべき試料のサイズに応じて適宜選択すればよい。図示した装置(発光顕微鏡)による検討では、40倍〜100倍での発光画像の取得が可能となるように光学系を設計出来ている。 Next, the operation of the optical system according to the first embodiment will be described with reference to FIG. The light source 2 is collimated by the collector lens 10 and projected onto the pupil position of the condenser lens 14. The image of the light source 2 illuminates the test sample 4 as Koehler illumination by the condenser lens 14. The light that illuminates the test sample 4 passes through the test sample 4 and enters the objective lens 15. The measurement light incident on the objective lens 15 forms an image of the test sample 4 on the image plane 19 by the objective lens 15, the first relay lens 16 and the second relay lens 18. Here, an objective lens with a magnification of 20 is used. The objective lens can be appropriately oil-immersed according to the desired magnification. Further, which magnification is selected may be appropriately selected according to the size of the sample to be evaluated (or analyzed). In the examination with the illustrated apparatus (light emission microscope), the optical system can be designed so that the emission image can be obtained at 40 to 100 times.
結像面19に形成された被験試料4の像は、接眼レンズ6にそのまま入射すると共に、切替ミラー20により、CCDカメラ8の撮像素子7上に結像する。CCDカメラ8の受光面の前方に赤外線カットフィルター13が設置され、これにより背景光となる赤外線を遮断する。なお、対物レンズを移動させるに限らず、試料ステージ3を光軸に沿って移動させても良いことは勿論である。 The image of the test sample 4 formed on the imaging surface 19 is incident on the eyepiece 6 as it is, and is imaged on the image sensor 7 of the CCD camera 8 by the switching mirror 20. An infrared cut filter 13 is installed in front of the light receiving surface of the CCD camera 8, thereby blocking infrared rays that are background light. It goes without saying that the sample stage 3 may be moved along the optical axis in addition to moving the objective lens.
本発明は、以下に説明する実施例に記載の細胞を多数処理する方法及び装置として具現化することが可能である。なお、以下に示す解析データは、同一の容器(とくにシャーレ)内の多数の細胞に対して網羅的に解析した結果の代表データであり、容器内(もしくは同一視野内)に存在する全ての細胞についての解析が可能であることはいうまでもない。
実施例1 テトラサイクリンによる遺伝子発現誘導
単一細胞での経時的なレポーターアッセイの例を説明する。
このレポーターアッセイでは、まず、テトラサイクリン・リプレッサー(TetR)を恒常的に発現させるベクター「pcDNA6/TR(インビトロジェン社製)」と、テトラサイクリン・オペレータ(TetO2)をもつ発現ベクター「pcDNA4/TO(インビトロジェン社製)」にルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドとをHeLa細胞に共発現させて標本を作製する。この状態では、図1に示すように、TetRホモダイマーがTetO2領域に結合しているため、ルシフェラーゼ遺伝子の転写は抑制される。つぎに、図2に示すように、培養液中にテトラサイクリンを添加してTetRホモダイマーに結合させ、TetRホモダイマーの立体構造を変化させることによって、TetO2からTetRホモダイマーを分離させ、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。なお、培養液は10mMのHEPESを含むD−MEM培地であり、1mMのルシフェリンを含む。対物レンズおよび結像レンズとして用いたレンズは、それぞれ「Oil、20倍、NA0.8」および「5倍、NA0.13」の仕様である市販の顕微鏡用対物レンズであり、倍率Mgに対応する総合倍率は4倍である。カメラC1として用いたカメラは、5℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「DP30BW(オリンパス社製)」であり、CCD3としてのCCD素子は、2/3インチ型、画素数1360×1024、画素サイズ6μm角である。
The present invention can be embodied as a method and apparatus for treating a large number of cells described in the examples described below. The analysis data shown below is representative data of the result of exhaustive analysis of a large number of cells in the same container (especially a petri dish), and all cells present in the container (or in the same field of view). Needless to say, it is possible to analyze the above.
Example 1 Gene Expression Induction by Tetracycline An example of a reporter assay over time in a single cell is described.
In this reporter assay, first, a vector “pcDNA6 / TR (manufactured by Invitrogen)” that constantly expresses tetracycline repressor (TetR) and an expression vector “pcDNA4 / TO (Invitrogen) having a tetracycline operator (TetO2)” are used. And a luciferase gene-linked plasmid are co-expressed in HeLa cells to prepare a specimen. In this state, as shown in FIG. 1, since the TetR homodimer is bound to the TetO2 region, transcription of the luciferase gene is suppressed. Next, as shown in FIG. 2, tetracycline is added to the culture medium to bind to the TetR homodimer, and by changing the three-dimensional structure of the TetR homodimer, the TetR homodimer is separated from TetO2 to induce transcription of the luciferase gene. To do. The culture solution is a D-MEM medium containing 10 mM HEPES and contains 1 mM luciferin. The lens used as the objective lens and the imaging lens is a commercially available microscope objective lens having specifications of “Oil, 20 ×, NA 0.8” and “5 ×, NA 0.13”, and corresponds to the magnification Mg. The overall magnification is 4 times. The camera used as the camera C1 is a digital camera “DP30BW (manufactured by Olympus)” cooled at 5 ° C., and the CCD element as the CCD 3 is a 2/3 inch type, the number of pixels is 1360 × 1024, and the pixel size is 6 μm square. It is.
図3はテトラサイクリンを添加してから9時間後の標本の自己発光による像を1分間露光して撮像した画像である。テトラサイクリン添加後、0時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間経過後の観察画像を示してある。なお、これらの観察は、標本がインキュベーター内に載置されるため、37℃の環境で観察を行っている。 FIG. 3 is an image obtained by exposing an image of self-emission of a specimen 9 hours after addition of tetracycline for 1 minute. Observation images after 0, 2, 4, 6, 8, and 10 hours have elapsed after the addition of tetracycline. In addition, since these specimens are mounted in an incubator, these observations are performed in an environment of 37 ° C.
図4に画像上で指定した4つの部分領域ROI−1,ROI−2、ROI−3、ROI−4について、それぞれ拡大フレームで連番表示した状態を示している。図5は、これら4つの領域ごとに、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を測定した結果を示す図である。図5に示すように、テトラサイクリンを添加した2時間後から発光が捉えられ,6〜7時間後でプラトーに達したことを示している。このように、この実施の形態にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によれば、発光するルシフェラーゼ遺伝子の位置を特定して経時的(ないし時系列)に追跡し、発光現象の経時変化を測定することができる。 FIG. 4 shows a state in which the four partial areas ROI-1, ROI-2, ROI-3, and ROI-4 designated on the image are sequentially displayed in enlarged frames. FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the change over time in the luminescence intensity of the luciferase gene for each of these four regions. As shown in FIG. 5, luminescence was captured 2 hours after the addition of tetracycline, indicating that a plateau was reached after 6-7 hours. As described above, according to the weak light sample imaging unit and the weak light sample imaging device according to this embodiment, the position of the luciferase gene that emits light is identified and traced over time (or in time series), and the time course of the luminescence phenomenon is determined. Changes can be measured.
実施例2 HSP70B遺伝子プロモーターアッセイ
HSP70B(Heat shock Protein70B)は、熱、毒性物質、酸素不足などの環境因子によって発現が誘導されるストレスタンパク質であり、HSPは分子シャペロンとして細胞の機能調節に寄与するだけではなく、細胞内情報伝達物質としても注目されている。そこで、この実施例でレポーターアッセイに用いたのは、pGL3-Basic Vector(プロメガ社)にHSP70Bプロモーター配列を導入したベクターである(図6)。このベクターを導入した細胞に、熱ショックなどのストレスを与えると、熱ショック因子がHSP70Bプロモーター部分に結合し、転写が開始される(図7)。ガラスボトムディッシュにて培養したHeLa細胞に前記ベクターをリポフェクション法によりトランスフェクションを行った。一晩培養後、1mM Luciferinを加え、熱刺激(43℃60分)後にて、発光顕微鏡内にて30分ごと20時間タイムラプス計測を行った。培地は、D-MEM5%FCS-10mM HEPESを用いた。はじめに明視野観察にて、細胞の形状および位置情報を得た後、発光画像を取得した。対物レンズは20倍レンズを用いて、露出時間は5分であった。発光画像と明視野画像の重ね合わせ画像の一部を図8に示す。発光している細胞を目立ち易い擬似カラー(図では白色の部分)で示してある。
Example 2 HSP70B gene promoter assay
HSP70B (Heat shock Protein70B) is a stress protein whose expression is induced by environmental factors such as heat, toxic substances, and oxygen deficiency. HSP not only contributes to the regulation of cell functions as a molecular chaperone, but also transmits intracellular information. It is also attracting attention as a substance. Therefore, the vector used in the reporter assay in this example was a vector in which the HSP70B promoter sequence was introduced into pGL3-Basic Vector (Promega) (FIG. 6). When stress such as heat shock is applied to the cells into which this vector has been introduced, the heat shock factor binds to the HSP70B promoter portion and transcription is initiated (FIG. 7). HeLa cells cultured in a glass bottom dish were transfected with the vector by the lipofection method. After overnight culture, 1 mM Luciferin was added, and after heat stimulation (43 ° C., 60 minutes), time-lapse measurement was performed every 30 minutes in a luminescence microscope for 20 hours. As the medium, D-MEM5% FCS-10 mM HEPES was used. First, after obtaining the cell shape and position information by bright field observation, a luminescence image was obtained. The objective lens was a 20x lens, and the exposure time was 5 minutes. A part of the superimposed image of the light emission image and the bright field image is shown in FIG. The luminescent cells are shown in a pseudo color (white portion in the figure) that is easily noticeable.
1細胞が入る領域(ROI)を5箇所設定して(図9)、データ数値化・平均値のプロットを行った(図10)。Heat shock後、10−15時間の時点でプロモーター活性が最も高かったが、5細胞間においてプロモーター活性の上昇率や活性上昇まで要する時間にかなりの開きがあった。図10Aには、プロモーター活性が刺激後14時間前後で最大となった細胞群、図10Bには刺激後10時間前後で最大となった細胞群を示した。 従来のルミノメーターでの観察においては、ある一定の細胞数をまとめて解析しているため、トランスフェクション効率および細胞間の違いなどは平均化されている。しかし、実際には図8に示すように、トランスフェクションされていない細胞も多く混在しており、また細胞によって発現の強弱などの違いも見られる。発光顕微鏡で、1細胞毎のデータを測定する事が可能となれば、トランスフェクション効率の違い、細胞周期による影響を考慮し解析を行うことができる。 Five regions (ROI) where one cell enters were set (FIG. 9), and the data were converted into numerical values and average values were plotted (FIG. 10). The promoter activity was highest at 10-15 hours after heat shock, but there was a considerable difference in the rate of increase in promoter activity and the time required for activity increase among 5 cells. FIG. 10A shows a cell group in which the promoter activity becomes maximum around 14 hours after stimulation, and FIG. 10B shows a cell group in which the promoter activity becomes maximum around 10 hours after stimulation. In the observation with a conventional luminometer, since a certain number of cells are analyzed together, transfection efficiency, differences between cells, and the like are averaged. However, as shown in FIG. 8, there are actually many untransfected cells, and there are also differences in expression depending on the cells. If data for each cell can be measured with a luminescence microscope, the analysis can be performed in consideration of the difference in transfection efficiency and the influence of the cell cycle.
実施例3 細胞内局在の観察
細胞内でのオルガネラへの局在の観察を行った結果を図11に示す。HeLa細胞に、核、小胞体、細胞膜へ局在させるためのシグナル配列を導入したpGL3ベクターをトランスフェクションし、一晩培養後、1mM LuciferinをD-MEM5%FCS-10mM HEPES培地に加えて発光顕微鏡により観察を行った。明視野画像、発光画像、明視野と発光画像の重ね合わせを行った画像を示してある。核、小胞体、細胞膜、それぞれにおいて、目的の場所への局在が観察された。細胞内局在を検出可能であると、例えば、細胞に何らかの刺激を与えた際に細胞質から核への移行を観察することが可能となる(図12)。例えば、核内レセプターであるグルココルチコイドレセプターを発現させ、グルココルチコイドホルモンを処理した際の核移行などの検出などがあげられる。
Example 3 Observation of Subcellular Localization Results of observation of intracellular localization in organelles are shown in FIG. HeLa cells were transfected with a pGL3 vector into which a signal sequence for localization to the nucleus, endoplasmic reticulum, and cell membrane was introduced. Was observed. A bright field image, a luminescent image, and an image obtained by superimposing the bright field and the luminescent image are shown. Localization to the target location was observed in each of the nucleus, endoplasmic reticulum, and cell membrane. If the intracellular localization can be detected, for example, it is possible to observe the transition from the cytoplasm to the nucleus when a certain stimulus is given to the cell (FIG. 12). For example, detection of nuclear translocation or the like when a glucocorticoid receptor, which is an intranuclear receptor, is expressed and treated with a glucocorticoid hormone.
実施例4 異なる細胞間の相互作用の解析
従来行われてきた発光検出では、ルミノメーターにより平均化された発光量を計測していたが、発光顕微鏡によりイメージングを行うことで、異なる細胞間での相互作用の解析も可能となる。一例として、神経細胞とグリア細胞の解析が挙げられる。神経系は、主に神経細胞とグリア細胞の2種類の細胞で構成されており、神経細胞は電気的活動とシナプス結合を介して脳の情報処理に対して中心的な役割を果たしているが、グリア細胞にはそのような電気的活動性はなく、神経細胞の周囲を取り巻いて神経細胞の活動をサポートする役割をしていると考えられている。神経細胞の周囲にあるグリア細胞の果たす役割にはまだ解明されてない部分も多い。
Example 4 Analysis of interaction between different cells In the conventional luminescence detection, the amount of luminescence averaged by a luminometer was measured. Interaction analysis is also possible. An example is analysis of nerve cells and glial cells. The nervous system is mainly composed of two types of cells: neurons and glial cells, which play a central role in brain information processing through electrical activity and synaptic connections. Glial cells do not have such electrical activity and are thought to play a role in supporting nerve cell activity by surrounding nerve cells. Many of the roles of glial cells around nerve cells have not been clarified yet.
実施例5 組織における発光レポーターアッセイ
細胞での発光レポーターアッセイだけではなく、対象として組織サンプルが挙げられる。例えば脳スライス組織を利用する事で、生物時計の座であり生物に昼と夜の違いをもたらす場所である視交叉上核において、細胞毎に異なる周期・位相などを捕らえる事が可能となる。
Example 5 Luminescent Reporter Assay in Tissues In addition to luminescent reporter assays in cells, subjects include tissue samples. For example, by using a brain slice tissue, it is possible to capture different periods and phases for each cell in the suprachiasmatic nucleus, which is the place of a biological clock and brings a difference between day and night to the living thing.
本発明は上述した実施の形態に限定されず、次のような変更または改良が可能である。例えば、発光物質として遺伝子として機能する発光蛋白を用いたが、遺伝子機能を持たない他の生物発光物質であってもよい。本発明では、好適には、生体試料(例えば細胞または組織)の生物学的活性にとって最小限の光マーカー物質を蓄積型の撮像装置により蓄積しながら画像化する工程を有する。この撮像工程により、蛍光解析のような、従来の走査型(スキャニング式)の高輝度解析では撮像不可能な微弱光による試料画像を取得するので、長期間、生体試料への光毒性ないし光ダメージを与えずに発光解析できる。ここにおいて、発光とは別な目的で、発光と同程度ないし半分未満の極低濃度の蛍光物質または化学発光物質を併用するようにしてもよい。また、単一の試料当りの総量を発光物質と蛍光物質とで所望の比率で分配するようにして、その発光総量が蓄積型の撮像にとって必要最小限であるように調整してもよい。また、細胞核と細胞質に対して発光波長がなるべく重ならないような2色以上の発光標識を別々に施すことにより、細胞認識を確実に行うようにしてもよい。細胞質を認識することにより同一細胞内の多様な画像化可能な成分(小核、多核、GPCR(G蛋白受容体)凝集体等)を他の細胞と確実に区別して正確に解析できる。また、細胞質以外にも細胞膜を特異的に標識するようにしてもよく、この場合には、上述した実施例3のような細胞質内の成分の解析に影響を与えることなく細胞を認識することが可能となる。なお、調べたい生物学的活性成分の分布領域ないし部位以外の部分であれば、蛍光標識(色素または融合蛋白)を標識に用いるようにすることにより、細胞の認識だけを確実に行うようにしてもよいが、この場合にも、適宜蛍光強度をなるべく最小限になるような蛍光標識ないし励起光に設定することにより間接的な悪影響を生じないようにするのが好ましい。 The present invention is not limited to the embodiments described above, and the following changes or improvements are possible. For example, although a photoprotein that functions as a gene is used as a luminescent substance, another bioluminescent substance having no gene function may be used. The present invention preferably includes a step of imaging while accumulating with a storage-type imaging device a photomarker substance that is minimal for the biological activity of a biological sample (for example, a cell or tissue). This imaging process obtains sample images with weak light that cannot be imaged with conventional scanning (scanning) high-intensity analysis such as fluorescence analysis. Emission analysis can be performed without giving Here, for a purpose different from light emission, a fluorescent substance or chemiluminescent substance having an extremely low concentration that is comparable to or less than half of the light emission may be used in combination. Further, the total amount per single sample may be distributed between the luminescent material and the fluorescent material at a desired ratio, and the total amount of luminescence may be adjusted to be the minimum necessary for storage-type imaging. Alternatively, cell recognition may be performed reliably by separately providing two or more colors of luminescent labels that do not overlap the nuclei and cytoplasm as much as possible. By recognizing the cytoplasm, various imageable components (micronuclei, multinuclear, GPCR (G protein receptor) aggregates, etc.) in the same cell can be reliably distinguished from other cells and accurately analyzed. In addition to the cytoplasm, the cell membrane may be specifically labeled. In this case, the cell can be recognized without affecting the analysis of the components in the cytoplasm as in Example 3 described above. It becomes possible. In addition, if it is a part other than the distribution region or part of the biologically active ingredient to be examined, a fluorescent label (dye or fusion protein) is used for the label, so that only cell recognition is performed reliably. However, in this case as well, it is preferable not to cause an indirect adverse effect by appropriately setting the fluorescence label or excitation light so that the fluorescence intensity is minimized as much as possible.
また、本発明で使用可能な生物発光(または化学発光)の例として、特定の関心ある遺伝子領域のプロモーターの下流に連結したレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むDNAが導入された細胞または組織が挙げられる。ルシフェラーゼをレポーターとして発現させた細胞または組織を用いることにより、所望の発現部位におけるルシフェラーゼ活性を検出することによって、転写の経時的変化を実時間で検出することが可能である。 Examples of bioluminescence (or chemiluminescence) that can be used in the present invention include cells or tissues into which DNA containing a luciferase gene has been introduced as a reporter gene linked downstream of a promoter of a specific gene region of interest. . By using a cell or tissue in which luciferase is expressed as a reporter, it is possible to detect changes in transcription over time by detecting luciferase activity at a desired expression site.
好ましい態様は、導入した発光遺伝子が末梢組織中でリズムを有するように発現される脊椎動物由来の細胞または組織である。末梢組織には、肝臓、肺、および骨格筋が含まれるが、これらに限定されることはない。これらの末梢組織は、7〜12時間の位相差でもって概日リズムを刻んでいることが報告されている。概日リズムの遅延パターンを示したことは、多器官から構成される複雑な哺乳動物の生物リズムの正常な協調性を反映したものと考えられる。 A preferred embodiment is a vertebrate cell or tissue in which the introduced luminescent gene is expressed in a rhythm in peripheral tissues. Peripheral tissues include, but are not limited to, liver, lung, and skeletal muscle. These peripheral tissues are reported to have a circadian rhythm with a phase difference of 7-12 hours. The delay pattern of circadian rhythm is thought to reflect the normal coordination of the biological rhythm of complex mammals composed of multiple organs.
これによれば、本発明により解析した情報が、概日リズムと関係のある時差ぼけまたは睡眠障害の機序を解明するため、ならびに概日リズム障害の治療に有用な化合物のスクリーニングおよび試験を目的として用いる哺乳動物モデルを開発するために有用であるといえる。 According to this, the information analyzed according to the present invention is intended to elucidate the mechanism of jet lag or sleep disorder related to circadian rhythm, and to screen and test compounds useful for the treatment of circadian rhythm disorder. It can be said that it is useful for developing a mammal model to be used as
また、レポーター遺伝子を発現する本発明のDNAを含む形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用ると、種々の試験またはスクリーニングを行うことができる。さまざまな任意の条件下でこれらの組織または細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を調節する刺激もしくは化合物の効果を評価すること、またはこれらをスクリーニングすることが可能である。刺激には温度、光、運動、および他のショックが含まれる。使用する化合物に制限はない。本発明は特に、本発明の形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物に導入された時計遺伝子(例えばPeriod 1)のプロモーターによって誘導される発現を改変する化合物を、その形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用いて試験またはスクリーニングする方法に適用可能である。 Moreover, various tests or screenings can be performed by using a transformant or a transgenic mammal containing the DNA of the present invention that expresses a reporter gene. By detecting reporter gene expression in these tissues or cells under a variety of arbitrary conditions, it is possible to assess or screen for the effects of stimuli or compounds that modulate reporter gene expression . Stimulation includes temperature, light, exercise, and other shocks. There are no restrictions on the compounds used. In particular, the present invention relates to a compound that modifies the expression induced by the promoter of a clock gene (for example, Period 1) introduced into the transformant or transgenic mammal of the present invention, and the transformant or transgenic mammal. It is applicable to the method of using or testing.
本発明の試験またはスクリーニングの方法としては、以下の方法が挙げられる。
方法(1):本発明の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、(a)前記形質転換体を前記化合物で処理する段階;および(b)処理した形質転換体における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
方法(2):本発明の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、(a)前記哺乳動物を前記化合物で処理する段階;および(b)処理した哺乳動物における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
Examples of the test or screening method of the present invention include the following methods.
Method (1): A method for testing or screening a compound having an activity of altering the expression of a transgene in the transformant of the present invention, comprising: (a) treating the transformant with the compound; b) measuring the expression of the transgene in the treated transformant.
Method (2): A method for testing or screening a compound having an activity of altering transgene expression in a mammal of the present invention, comprising: (a) treating the mammal with the compound; and (b) Measuring the expression of the transgene in the treated mammal.
本発明の方法は、Period 1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングするために有用である。本方法はまた、概日リズム障害に対する医薬品をスクリーニングするためにも有用である。従って、上記の方法(1)、(2)に加えて、以下に挙げるスクリーニング法も本発明によって可能となる。
方法(3): 概日リズム睡眠障害の治療に有用な医薬品の試験またはスクリーニングの方法であって、(a)本発明の形質転換体またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその医薬品で処置する段階;および (b)処置した形質転換体または哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
The method of the present invention is useful for screening compounds that modulate the expression of Period 1 gene. The method is also useful for screening pharmaceuticals for circadian rhythm disorders. Therefore, in addition to the above methods (1) and (2), the following screening methods are also possible according to the present invention.
Method (3): A method for testing or screening a pharmaceutical agent useful for the treatment of circadian rhythm sleep disorder, wherein (a) treating the transformant or transgenic non-human mammal of the present invention with the pharmaceutical agent; And (b) measuring the expression of a reporter gene in the treated transformant or mammal.
本発明の試験またはスクリーニングの方法に使用する化合物に特に制限はない。その例には、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成性の低分子化合物、天然または合成性の高分子化合物、組織または細胞の抽出物、微生物の培養上清、植物または海洋生物に由来する天然成分などが含まれるが、これらに限定されることはない。遺伝子ライブラリーまたはcDNA発現ライブラリーなどの発現産物を使用してもよい。化合物による処置の方法に特に制限はない。インビトロでの処置は、例えば化合物を培養液に添加して細胞を化合物と接触させたり、微量注入またはトランスフェクション試薬を用いて化合物を細胞内に導入することなどにより実施しうる。インビボでの治療の方法には、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または腹腔内注射;経口投与、経腸投与、筋肉内投与、または鼻腔内投与;眼への投与;注射もしくはカテーテルを介した脳内投与、脳室内投与、または末梢器官内投与などの、当業者に公知の方法が含まれる。化合物は適宜組成物として投与する。例えば、それを水、生理食塩水、緩衝液、塩、安定剤、保存剤、懸濁剤などと混合することができる。 There is no particular limitation on the compound used in the test or screening method of the present invention. Examples include inorganic compounds, organic compounds, peptides, proteins, natural or synthetic low molecular compounds, natural or synthetic high molecular compounds, tissue or cell extracts, microbial culture supernatants, plants or marine organisms. Natural ingredients derived from, etc. are included, but are not limited thereto. Expression products such as gene libraries or cDNA expression libraries may be used. There is no particular limitation on the method of treatment with the compound. In vitro treatment may be performed, for example, by adding the compound to the culture medium and contacting the cell with the compound, or introducing the compound into the cell using a microinjection or transfection reagent. Methods of treatment in vivo include intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or intraperitoneal injection; oral administration, enteral administration, intramuscular administration, or intranasal administration; ocular administration; injection or catheterization. Methods known to those skilled in the art, such as intracerebral administration, intraventricular administration, or peripheral organ administration, are included. The compound is suitably administered as a composition. For example, it can be mixed with water, saline, buffers, salts, stabilizers, preservatives, suspending agents and the like.
レポーター遺伝子の発現は、哺乳動物または細胞が生きたまま測定することもでき、細胞を可溶化した後に測定することもできる。例えば、生組織におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定するために、実施例に示すように光電子増倍管により、または本明細書に参照として組み入れられるヤマザキ(Yamazaki, S.)ら(Science、2000、288、682〜685)に記載された他の類似の検出器により、生物発光を連続的に測定することが可能である。可溶化した組織または細胞におけるルシフェラーゼ活性は、例えば、ルシフェラーゼレポーター二重アッセイ系(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)などを使用して測定することができる。レポーター遺伝子の発現は、時間的または空間的に測定することができる。発現リズムの位相、振幅、および/または周期を検出することによって発現を分析することもできる。本発明の方法により、化合物の即時的または長期的な効果(位相変化を含む)の評価が可能となる。化合物の投与によってこれらの発現が改変されれば、その化合物はPeriod 1遺伝子の発現を調節する薬剤候補となる。このような化合物は、睡眠障害を含むさまざまな概日リズム障害に対する医薬品として適用されることが期待される。例えば、レポーター遺伝子の発現の振動をリセットまたは開始する薬剤は、ペースメーカの位相を後退または前進させると期待される。したがって、これらの薬剤は脱同調した発現パターンを正常な同調に導くために使用することができる。本発明によってスクリーニングされる医薬品は、薬剤の治療効果を評価するために、概日リズム障害モデルとなるように誘導した本発明のトランスジェニック哺乳動物に投与される。 Reporter gene expression can be measured while the mammal or cell is alive, or can be measured after solubilizing the cell. For example, to measure the expression of a luciferase gene in living tissue, Yamazaki, S. et al. (Science, 2000, 288) incorporated by reference as described herein with reference to photomultiplier tubes. 682-685), it is possible to measure bioluminescence continuously. The luciferase activity in solubilized tissue or cells can be measured using, for example, a Luciferase Reporter Assay System (Promega). Reporter gene expression can be measured temporally or spatially. Expression can also be analyzed by detecting the phase, amplitude, and / or period of the expression rhythm. The method of the present invention makes it possible to evaluate the immediate or long-term effects (including phase changes) of a compound. If these expressions are altered by administration of a compound, the compound becomes a drug candidate that regulates the expression of the Period 1 gene. Such compounds are expected to be applied as pharmaceuticals against various circadian rhythm disorders including sleep disorders. For example, an agent that resets or initiates a reporter gene expression oscillation would be expected to reverse or advance the pacemaker phase. Thus, these agents can be used to direct a desynchronized expression pattern to normal synchronization. The pharmaceutical product screened by the present invention is administered to the transgenic mammal of the present invention induced to become a circadian rhythm disorder model in order to evaluate the therapeutic effect of the drug.
トランスジェニック哺乳動物における遺伝子の発現を検出する場合、測定する器官に特に制限はなく、これには視床下部のSCNを含む中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)、ならびに肝臓、肺、および骨格筋を非制限的に含む他の末梢組織が含まれる。本発明で開示する系は、SCNおよび末梢組織におけるPeriod 1発現の位相関係および同調機構を評価するために有用である。 When detecting gene expression in a transgenic mammal, the organ to be measured is not particularly limited, and this includes the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS) including the hypothalamic SCN, liver, lung, And other peripheral tissues including but not limited to skeletal muscle. The system disclosed in the present invention is useful for assessing the phase relationship and synchronization mechanism of Period 1 expression in SCN and peripheral tissues.
本発明の系は、Period 1の発現を調節すると推定される多くの因子を同定するために使用され得る。概日リズムと関係のある新規なインビボ因子および遺伝子が本発明の系を用いて同定されれば、これらの因子および遺伝子の発現のインビボでの振動を評価することができる。それにより、SCNおよび末梢組織の振動位相を制御する因子を単離することが可能である。これらは概日リズムに関与する新規な遺伝子および蛋白質であると考えられ、これらを標的として用いることにより、新規薬剤のスクリーニングが可能になると考えられる。このようなスクリーニングはインビボおよびインビトロのどちらでも行える。 The system of the present invention can be used to identify a number of factors presumed to modulate Period 1 expression. Once new in vivo factors and genes related to circadian rhythm are identified using the system of the present invention, the in vivo oscillations of expression of these factors and genes can be assessed. Thereby, it is possible to isolate factors that control the vibration phase of SCN and peripheral tissues. These are considered to be novel genes and proteins involved in circadian rhythm, and by using these as targets, it is considered that screening for new drugs becomes possible. Such screening can be done both in vivo and in vitro.
具体的には、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いるインビボでのスクリーニング方法は以下の段階を含む方法(4)により達成される。
方法(4):(a)概日リズムが既に決定されているトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与する段階;(b)トランスジェニック哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出し、発現リズムを検証する段階; (c)化合物の投与後のレポーター遺伝子の発現リズムを投与前のものと比較する段階;および(d)発現リズムの位相、周期、または振幅を改変する化合物を選択する段階。
Specifically, the in vivo screening method using the transgenic mammal of the present invention is achieved by the method (4) including the following steps.
Method (4): (a) administering a compound to a transgenic mammal whose circadian rhythm has already been determined; (b) periodically detecting the expression level of the reporter gene in the transgenic mammal, and expressing the rhythm (C) comparing the expression rhythm of the reporter gene after administration of the compound with that before administration; and (d) selecting a compound that alters the phase, period, or amplitude of the expression rhythm.
レポーター遺伝子の発現リズムは、生きた動物の体内でのレポーター遺伝子の発現リズムを検出する方法;切り出した組織を培養することによって発現の変動を連続的に観察する方法;または動物組織の抽出物を定期的に調製して、各時点での発現レベルを検出する方法によって検出可能である。例えば、適した方法(例えば、静脈内注射、腹腔内投与、脳室内投与など)により、適切なタイミングでトランスジェニック動物にルシフェリンを投与する。続いてこの動物を麻酔し、CCDカメラによってルシフェラーゼ発光を計測することにより、レポーター遺伝子の発現部位および発現レベルを決定する。個々の動物の発現リズムを確認するために、この測定を数時間毎に数回ずつ行う(Sweeney TJら、「生きた動物における腫瘍細胞クリアランスの可視化(Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals)」、PNAS、1999、96、12044〜12049;およびContag PRら、「生きた哺乳動物における生物発光標識(Bioluminescent indicators in living mammals)」、Nature Medicine、1998、4、245〜247を参照のこと)。 The expression rhythm of the reporter gene can be determined by a method of detecting the expression rhythm of the reporter gene in the living animal body; a method of continuously observing expression fluctuations by culturing the excised tissue; or an extract of animal tissue It can be detected by a method that is prepared periodically and detects the expression level at each time point. For example, luciferin is administered to a transgenic animal at an appropriate timing by a suitable method (eg, intravenous injection, intraperitoneal administration, intraventricular administration, etc.). Subsequently, the animal is anesthetized, and the luciferase luminescence is measured by a CCD camera to determine the expression site and expression level of the reporter gene. This measurement is performed several times every few hours to confirm the expression rhythm of individual animals (Sweeney TJ et al., “Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals ) ", PNAS, 1999, 96, 12044-12049; and Contag PR et al.," Bioluminescent indicators in living mammals ", Nature Medicine, 1998, 4, 245-247. ).
前記の通り、インビトロでも本発明を用いて新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。このようなインビトロスクリーニング法は以下の段階を含む方法(5)により達成できる。
方法(5): (a)本発明の形質転換体、または本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織もしくは細胞を培養する段階; (b)形質転換体または組織もしくは細胞を適切な期間にわたって化合物で処理し、さらに培養を続ける段階; (c)レポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出する段階;および(d)(b)の処理後にレポーター遺伝子の発現リズム(位相、周期、および振幅)を改変する化合物を選択する段階。
As described above, a novel drug can be screened in vitro using the present invention. Such an in vitro screening method can be achieved by the method (5) including the following steps.
Method (5): (a) culturing a tissue or cell derived from the transformant of the present invention or the transgenic mammal of the present invention; (b) compound of the transformant or tissue or cell over an appropriate period of time; (C) a step of periodically detecting the expression level of the reporter gene; and (d) the expression rhythm (phase, cycle, and amplitude) of the reporter gene after the treatment of (b). Selecting a compound to be modified.
本明細書において、本発明の撮像すべき組織または細胞は、初代培養物または樹立細胞系の細胞であってもよい。本明細書で用いる組織、細胞などに制限はないが、脊椎動物におけるSCN、視床下辺縁細胞、末梢神経などが好ましい。化合物による処理は、例えば、化合物を添加しておいた溶媒中に組織、細胞などを一定期間、浸漬することによって行ってもよい。レポーター遺伝子の発現リズムの変化を測定する場合には、発現リズムがあらかじめ決定された同一の組織もしくは細胞、または化合物による処理を受けていない対照組織または細胞を用いた比較を行ってもよい。 As used herein, the tissue or cell to be imaged of the present invention may be a primary culture or an established cell line cell. Although there is no restriction | limiting in the tissue, cell, etc. which are used by this specification, SCN in a vertebrate, a hypothalamic margin cell, a peripheral nerve, etc. are preferable. The treatment with the compound may be performed, for example, by immersing tissues, cells, and the like for a certain period in a solvent to which the compound has been added. When measuring the change in the expression rhythm of the reporter gene, comparison may be performed using the same tissue or cell in which the expression rhythm has been determined in advance, or a control tissue or cell that has not been treated with the compound.
上記のインビボおよびインビトロのスクリーニング方法において、光刺激などの刺激処理を、化合物の投与または処理とともに行ってもよい。 In the in vivo and in vitro screening methods described above, stimulation treatment such as light stimulation may be performed together with administration or treatment of the compound.
本発明の試験またはスクリーニングの方法により同定された化合物は、所望の概日リズム疾患または障害に対する医薬品として用いることができる。これらの薬剤は、適宜薬学的に許容される担体、溶質、および溶媒と組み合わせることによって医薬組成物として製剤化することができる。本薬剤は、時差症候群、交代制勤務による睡眠障害、睡眠相後退症候群、および不規則性睡眠覚醒障害などの疾患または障害に対して適用することができる。 A compound identified by the test or screening method of the present invention can be used as a pharmaceutical agent for a desired circadian rhythm disease or disorder. These agents can be formulated as pharmaceutical compositions by appropriately combining with pharmaceutically acceptable carriers, solutes and solvents. The drug can be applied to diseases or disorders such as jet lag syndrome, sleep disorder due to shift work, sleep phase regression syndrome, and irregular sleep-wake disorder.
本発明のスクリーニング法によって単離された化合物を医薬品として用いる場合には、それを患者に直接的に投与することもでき、またはそれを公知の医薬品製剤法によって医薬組成物の形態に製剤化することもできる。例えば、それを薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせた後に投与することができる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、吸入液などの形態でありうる。化合物の含有量は適宜決定してよい。これらは例えば、通常は動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または経口投与によって患者に投与することができ、このような方法は当業者に公知である。投与量は患者の体重、年齢、投与方法、および症状により変動するが、当業者であれば投与量を適宜選択することができる。一般に、投与量は薬剤の有効血中濃度および代謝時間により異なるが、1日当たりの維持用量は約0.001mg/kg〜1g/kg、好ましくは、0.01mg/kg〜100mg/kg、より好ましくは0.1mg/kg〜10mg/kgであると考えられる。投与は1日当たり1回から複数回であってもよい。化合物がDNAによってコードされうる場合には、遺伝子治療を行うためにDNAを遺伝子治療用ベクターに組み入れることが可能である。 When the compound isolated by the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical, it can be directly administered to a patient, or it can be formulated into a pharmaceutical composition by a known pharmaceutical formulation method. You can also. For example, it can be administered after appropriately combining it with a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle, specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent and the like. The pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution, tablet, capsule, troche, buccal tablet, elixir, suspension, syrup, nasal solution, inhalation solution and the like. The content of the compound may be determined as appropriate. These can be administered to a patient, for example, usually by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or oral administration, and such methods are known to those skilled in the art. The dose varies depending on the patient's weight, age, administration method, and symptoms, but those skilled in the art can appropriately select the dose. In general, the dosage varies depending on the effective blood concentration of the drug and the metabolic time, but the daily maintenance dose is about 0.001 mg / kg to 1 g / kg, preferably 0.01 mg / kg to 100 mg / kg, more preferably Is considered to be 0.1 mg / kg to 10 mg / kg. Administration may be from once to multiple times per day. If the compound can be encoded by DNA, the DNA can be incorporated into a gene therapy vector for gene therapy.
以上説明した本発明の方法及び装置を最適化した検査システムの一例を図15に示す。この検査システムにおいては、複数の容器(とくにマイクロプレートの多数のウェル)ごとの検体を網羅的に解析するのに適したスループットの高い構成を有している。
図15は、多数のウェルをマトリックス状に配置したマイクロプレート(不図示)を格納するマイクロプレートチャンバ111が電動ステージ112上に取り外し可能に固定されている。マイクロチャンバ111の上方には、明視野観察を行うための照明系が配置されている。一方、マイクロチャンバ111の下方には、マイクロプレートの各ウェルに収納されている細胞等の試料画像を、接眼レンズ113により肉眼で明視野観察するための観察系と、撮像装置114で暗視野撮像するための撮像系とが配置されている。ウェル内に収容される細胞を含む試料ないし生体組織は、個々の細胞が認識できる程度に、光路上で重ならない程度の低密度である(この点、ルミノメータのようなウェル全体の発光量を解析するシステムのような重畳された高密度の細胞数による測定とは異なる)。マイクロチャンバ111と照明系のレンズ要素は、細胞や抗原・抗体等の生物学的試料を活性維持可能な温度に維持するための保温箱115内に格納されている。ここで、前述の観察系および撮像系の各種レンズ要素は、保温箱115の外部に配置され、さらに遮光性を有する断熱部材(例えばアルミフィルム、セラミックス筒体)により保護されている。チャンバ内の試料から発した光は、適切な光学条件に設定された対物レンズ121(上述の説明を参照)を通過後、最下部の結像用ミラーを反射し、さらに結像用レンズを経て撮像装置114に送られる。他方、接眼レンズ113に対しては、図に示すような可動ミラーを選択的に光路上に侵退させて選択的な観察を実行することによって、試料からの微弱光を検出する場合の光損失を極力防止するとともに、接眼レンズ113に観察に最適な高反射性のミラーを採用できる点で好ましい。可動ミラーの駆動は自動切換え式であっても、スライド棒の手動操作式であってもよい。
FIG. 15 shows an example of an inspection system that optimizes the method and apparatus of the present invention described above. This inspection system has a configuration with high throughput suitable for comprehensive analysis of specimens in a plurality of containers (in particular, a large number of wells in a microplate).
In FIG. 15, a microplate chamber 111 storing a microplate (not shown) in which a large number of wells are arranged in a matrix is detachably fixed on an electric stage 112. An illumination system for performing bright field observation is disposed above the micro chamber 111. On the other hand, below the microchamber 111, an observation system for observing a sample image of a cell or the like stored in each well of the microplate with the naked eye using the eyepiece 113, and dark field imaging using the imaging device 114 And an imaging system for performing the operation. The sample or biological tissue containing cells contained in the well has a low density that does not overlap in the optical path to the extent that individual cells can recognize (this point, the amount of light emitted from the entire well such as a luminometer is analyzed. This is different from the measurement by the number of cells with high density superimposed). The microchamber 111 and the lens element of the illumination system are stored in a heat insulation box 115 for maintaining a biological sample such as a cell or an antigen / antibody at a temperature at which the activity can be maintained. Here, the various lens elements of the observation system and the imaging system described above are disposed outside the heat insulating box 115 and are further protected by a heat insulating member (for example, an aluminum film or a ceramic cylinder) having a light shielding property. The light emitted from the sample in the chamber passes through the objective lens 121 (see the above description) set to appropriate optical conditions, then reflects the lowermost imaging mirror, and further passes through the imaging lens. The image is sent to the imaging device 114. On the other hand, with respect to the eyepiece lens 113, light loss in the case of detecting weak light from a sample by selectively infiltrating a movable mirror as shown in the figure and performing selective observation. This is preferable in that a highly reflective mirror optimal for observation can be adopted for the eyepiece lens 113. The driving of the movable mirror may be an automatic switching type or a manual operation type of a slide bar.
保温箱115は、外部環境(光、気温、湿度、酸素等)からの影響を遮断するための暗箱116にさらに格納されており、装置全体を二重構造にしている。暗箱116には、内部の空調効率を適宜考慮した位置に対し、温風導入装置117(図では、暗箱の上部左側壁側)及び温風排出装置118(図では、暗箱の上部右側壁側)を設置している。また、保温箱115及び暗箱116にはそれぞれ内側扉及び外側扉を設けており、電動ステージ112上に設置するマイクロプレートを交換可能にしている。 The heat insulating box 115 is further stored in a dark box 116 for blocking the influence from the external environment (light, temperature, humidity, oxygen, etc.), and the entire apparatus has a double structure. In the dark box 116, the hot air introduction device 117 (in the drawing, the upper left wall side of the dark box) and the hot air discharge device 118 (in the drawing, the upper right wall side of the dark box) with respect to a position that appropriately considers the internal air conditioning efficiency. Is installed. Further, the heat insulation box 115 and the dark box 116 are provided with an inner door and an outer door, respectively, so that the microplate installed on the electric stage 112 can be replaced.
暗箱116の外部には、照明系のための光源(図ではハロゲンランプ)120、撮像系のための撮像装置(図ではC−CCDカメラ)114を配置し、熱的トラブルを回避するように配慮している。撮像装置114のための結像レンズと波長選択用の回転フィルタホイールは、保温箱115と暗箱116の間に配置されている。 A light source (halogen lamp in the figure) 120 for the illumination system and an imaging device (C-CCD camera in the figure) 114 for the imaging system are arranged outside the dark box 116, so as to avoid thermal troubles. doing. An imaging lens for the image pickup device 114 and a rotary filter wheel for wavelength selection are arranged between the heat insulating box 115 and the dark box 116.
図15に示すように、マイクロプレート内の観察及び撮像を厳密に合焦するために、赤外光又は可視光による指定点フォーカスを行うレーザ検出機構を設置してもよい。指定点フォーカスを行う場合には、例えばマイクロプレートの底面からの反射を測定するために、電動ステージ112の下方に光分割ミラーを配置することとなる。このような指定点フォーカスは、細密な画像分解能を要求する場合を除いて、必須な構成ではない。なお、光分割ミラーに関しては、赤外線を用いることで、ダイクロックミラーにより試料からの光損失を最小限にすることが好ましく、可視光線を用いる場合には、フォーカシングできる最小限の反射率からなるハーフミラーを使用するか、或いは上述したような可動式のミラーにすることで同様に光損失を防止するのが好ましい。 As shown in FIG. 15, a laser detection mechanism that performs designated point focusing with infrared light or visible light may be installed in order to strictly focus observation and imaging within the microplate. When performing designated point focusing, for example, a light splitting mirror is disposed below the electric stage 112 in order to measure reflection from the bottom surface of the microplate. Such a designated point focus is not an essential configuration unless a fine image resolution is required. As for the light splitting mirror, it is preferable to minimize the light loss from the sample by using a dichroic mirror by using infrared rays. When using visible light, the half of the minimum reflectance that can be focused is used. It is preferable to similarly prevent light loss by using a mirror or by using a movable mirror as described above.
撮像装置114から送出された画像データは、演算処理部130により統計解析ないし形状解析されて、表示部131に表示される。上述した各実施例で示したように、時系列での解析をウェルごとに行ったり、ウェル間の比較を行うような多様な解析を網羅的に実行できる。表示部131における表示形式は、図5、図10に示したような時系列曲線でもってグラフィカルに数値データを表示することが可能である。また、この検査システムの特徴として、画像データをコントローラ132と接続した画像データ記憶部133に記憶するとともに、必要に応じて、表示部131に呼び出したり、映像を再生することが可能となっている。従って、グラフィカルな表示データのうち、興味有るデータについて、適宜の指定手段(マウスポインタ、タッチペン、キーボード等)を地位手データ部分(測定点ないしデータ領域)を指定することにより、部分時系データを静止画像ないし動画像で再生するリコール機能を発揮させることも可能である。逆に、表示部131に、画像データ単独、または画像データと数値データとの組合せを表示することもでき、さらにこの場合に、表示された画像のうち、興味有る画像の部位または領域を同様の指定手段で指定することによって対応する数値やグラフを呼び出したり、特定の数値ないしグラフ部位を色別等で強調し確認し易いようにすることも可能である。さらに、多数の容器ごとに異なる検体(例えば、臓器別、病態別、患者別、測定項目別)を収容する場合には、検体別に所望の順番ないし相関関係を表示部131に表現するように解析させることも可能である。これら各種の多様な解析ないし表示形式は、交換可能なソフトウェアないし内部プログラムによって、実行可能に設計することで実現できる。 Image data sent from the imaging device 114 is subjected to statistical analysis or shape analysis by the arithmetic processing unit 130 and displayed on the display unit 131. As shown in each of the above-described embodiments, it is possible to comprehensively perform various analyzes such as performing time-series analysis for each well or comparing wells. As the display format in the display unit 131, it is possible to graphically display numerical data with a time series curve as shown in FIGS. Further, as a feature of this inspection system, image data is stored in an image data storage unit 133 connected to the controller 132, and can be called to the display unit 131 or a video can be reproduced as necessary. . Accordingly, for the data of interest in the graphical display data, the partial time series data can be obtained by specifying the position data portion (measurement point or data area) with an appropriate designation means (mouse pointer, touch pen, keyboard, etc.). It is also possible to exert a recall function for playing back still images or moving images. Conversely, the display unit 131 can also display image data alone or a combination of image data and numerical data. In this case, the part or region of the image of interest among the displayed images is similar. It is also possible to call up corresponding numerical values and graphs by specifying with the specifying means, or to emphasize specific numerical values or graph parts by color or the like so that they can be easily confirmed. Furthermore, when different specimens (for example, organs, pathological conditions, patients, and measurement items) are accommodated in many containers, analysis is performed so that a desired order or correlation is represented on the display unit 131 for each specimen. It is also possible to make it. These various analysis and display formats can be realized by designing them to be executable by interchangeable software or internal programs.
以上の構成において、各種の電気的制御および信号処理の管理及び制御は、コントローラ132が一元的に行う構成となっている。コントローラ132は、上述した多数の検査装置ないし検査システムを通信回線(無線でも有線でもよい)等で通信可能に連携可能した遠隔システムによって分散的ないしホストコンピュータとの集中管理して、リアルタイムにデータ共有化ないし診断等の医療連携を行うようにしてもよい。また、種々の有用な医学的データベースとコントローラ132を通信等で接続可能にすることにより、リアルタイムに最新データを入手しながら、生体システムとの関連を解析するようにすることも可能である。 In the configuration described above, the controller 132 is configured to centrally perform management and control of various electrical controls and signal processing. The controller 132 distributes data centrally with a host computer through a remote system capable of cooperating with the above-described multiple inspection apparatuses or inspection systems via a communication line (wireless or wired), and shares data in real time. Medical cooperation such as conversion or diagnosis may be performed. Further, by making it possible to connect various useful medical databases and the controller 132 by communication or the like, it is possible to analyze the relation with the biological system while obtaining the latest data in real time.
図16は、上述したシステムの一部の変形例であり、液浸式の対物レンズで画像化する場合の例を示す。電動制御されるXYステージ201上には、底面が平坦なガラス製ないしプラスチック製のマイクロプレート203が固定されいている。ここで、マイクロプレート203に形成された全てのウェル207が下方に露出するように、プレート203の周囲のみをステージ201上に接地させるようになっている。プレート203の上方には、各ウェル207及びプレート上部を覆うように蓋をし、且つプレート203をステージ201上に固定するためのプレートカバー202が配置している。このプレートカバー202には図示せぬ配管が形成され、軟性のチューブ209aを通じて各ウェルに所定条件の気体(例えば炭酸ガス、熱風)を給排するための気体供給部210に接続している。また、全体を格納するハウジング206は、プレート交換、試薬分注、換気等を行うための開閉式の上部ハウジング206aと、各手段を固定するためのベースとなる下部ハウジング206bとを具備している。ハウジング内全体の温度は、温風発生装置208からチューブ209bを通じてハウジング内に温風が送られることで生物活性に都合の良いように昇温される構成である。なお、マイクロプレート203及びXYステージ201の温度は、温度センサ211により、図15のようなコントローラを通じて所望の温度となるように温度制御するのが好ましい。 FIG. 16 shows a modification of a part of the above-described system, and shows an example of imaging with an immersion type objective lens. A glass or plastic microplate 203 having a flat bottom surface is fixed on the XY stage 201 that is electrically controlled. Here, only the periphery of the plate 203 is grounded on the stage 201 so that all the wells 207 formed in the microplate 203 are exposed downward. A plate cover 202 for covering the wells 207 and the upper part of the plate and fixing the plate 203 on the stage 201 is disposed above the plate 203. The plate cover 202 is formed with a pipe (not shown), and is connected to a gas supply unit 210 for supplying and discharging a gas (for example, carbon dioxide gas and hot air) of a predetermined condition to each well through a flexible tube 209a. The housing 206 for storing the whole includes an openable and closable upper housing 206a for performing plate exchange, reagent dispensing, ventilation, and the like, and a lower housing 206b serving as a base for fixing each means. . The temperature inside the housing is configured so that the warm air is sent from the hot air generator 208 through the tube 209b into the housing so as to be convenient for biological activity. Note that the temperature of the microplate 203 and the XY stage 201 is preferably controlled by the temperature sensor 211 so as to be a desired temperature through a controller as shown in FIG.
図16に示すように、対物レンズ204の先端部分には、液浸用の液体が配置されている。ここにおいて、液浸用の液体は、適宜の液体供給機構(例えば、国際公開WO2006/9212公報を参照)により、連続的に対物レンズ表面に液供給することにより、ステージ201によるマイクロプレート203の移送中の液不足を解消することが可能となるので好ましい。液浸式にすることで、高倍率(例えば40〜100倍)の対物レンズによる細密な画像解析ないしレーザ測定等を実行できるようになる点で好ましい。なお、本発明で説明した微弱光の例である発光(=とくに細胞内生物発光)は、低倍率(例えば2倍〜20倍、とくに4倍〜10倍)の対物レンズでもって個々の細胞を網羅的に認識できる視野を有するのが好ましいので、液浸式である必要はなく、マイクロプレート203の移送を自在に行うのに適している。いずれの倍率の対物レンズ204においても、マイクロプレート203の接地誤差やロット差を考慮すべきである場合には、図示するようなZ軸駆動機構205によって、マイクロプレート203の底面との距離を適宜の距離に保つような調整を行うのが好ましい。
As shown in FIG. 16, a liquid for immersion is disposed at the tip of the objective lens 204. Here, the liquid for immersion is transferred to the microplate 203 by the stage 201 by continuously supplying the liquid to the surface of the objective lens by an appropriate liquid supply mechanism (for example, see International Publication WO2006 / 9212). It is preferable because it is possible to eliminate the shortage of liquid inside. The immersion type is preferable in that fine image analysis or laser measurement using an objective lens with a high magnification (for example, 40 to 100 times) can be performed. In addition, light emission (= particularly intracellular bioluminescence), which is an example of the weak light described in the present invention, is used for individual cells with an objective lens having a low magnification (for example, 2 to 20 times, particularly 4 to 10 times). Since it is preferable to have a field of view that can be recognized comprehensively, it is not necessary to be immersion type, and is suitable for freely transferring the microplate 203. In any objective lens 204 of any magnification, when the grounding error or lot difference of the microplate 203 should be taken into consideration, the distance from the bottom surface of the microplate 203 is appropriately set by a Z-axis drive mechanism 205 as shown in the figure. It is preferable to make an adjustment so as to keep the distance of the
1 照明光学系
3 試料ステージ
2 光源
4 被験試料
5 観察光学系
8 CCDカメラ
9 対物レンズZ軸駆動機構
15 対物レンズ
19 結像面
21 試料容器
22 水槽
27 ヒートプレート
111 マイクロプレートチャンバ
112 電動ステージ
113 接眼レンズ
114 撮像装置
115 保温箱
116 暗箱
117 温風導入装置
118 温風排出装置
203 マイクロプレート
211 温度センサ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Illumination optical system 3 Sample stage 2 Light source 4 Test sample 5 Observation optical system 8 CCD camera 9 Objective lens Z-axis drive mechanism 15 Objective lens 19 Imaging surface 21 Sample container 22 Water tank 27 Heat plate 111 Microplate chamber 112 Electric stage 113 Eyepiece Lens 114 Imaging device 115 Insulation box 116 Dark box 117 Hot air introduction device 118 Hot air discharge device 203 Microplate 211 Temperature sensor
Claims (4)
する微弱な光学的データを蓄積して画像解析可能な画像情報を取得する微弱光画像取得手
段と連携し、前記微弱光画像取得手段がさらに異なる所望の経過時間ごとの微弱光画像を連続的ないし断続的に取得する構成を有する場合であって、前記微弱光画像を形態的に解析して前記検体中における個々の細胞を認識して画像上の細胞を個々に領域指定するとともに、認識して指定された個々の細胞に対応する領域ごとに1以上の同一の細胞に関する時間ごとの前記生物学的活性に起因する光学的データの光強度を網羅的に評価するための画像解析を行うことを特徴とする微弱光検体の検査方法。 A weak light image acquisition unit that prepares a specimen including a biological sample in a state capable of acquiring an image, accumulates weak optical data resulting from biological activity from the specimen, and acquires image information capable of image analysis; In cooperation, the weak light image acquisition means has a configuration for continuously or intermittently acquiring weak light images at different desired elapsed times, and the weak light image is morphologically analyzed and the Recognizing individual cells in a specimen to individually designate cells on the image, and the biology per time for one or more identical cells for each region corresponding to the recognized and designated individual cells A method for inspecting a weak light specimen, characterized in that image analysis is performed to comprehensively evaluate the light intensity of optical data resulting from the physical activity .
検査方法。 The method for examining a weak light specimen according to claim 1 , further comprising a step of performing an evaluation according to the time at which the image was acquired.
を特徴とする請求項2に記載の微弱光検体の検査方法。 The method for examining a weak light specimen according to claim 2 , wherein a moving image is generated based on optical data for each time acquired by the weak light image acquisition means.
は異なる細胞グループに分類することを特徴とする請求項1または2に記載の微弱光検体
の検査方法。
3. The method for examining a weak light specimen according to claim 1, wherein the two or more cells subjected to image analysis are classified into the same or different cell groups according to light intensity patterns and / or light intensity patterns.
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