JP2007151479A - Method for feeble light analysis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞や組織等の生体試料中における生物学的活性をその活性を極力損なわないようにして長期間ないし連続的に検出する微弱光解析方法に関する。本発明は、その方法により実行される自動化装置と、該装置と連携するソフトウェアにも適用可能である。 The present invention relates to a weak light analysis method for detecting a biological activity in a biological sample such as a cell or tissue for a long period or continuously without losing the activity as much as possible. The present invention can also be applied to an automation apparatus executed by the method and software associated with the apparatus.
生物学分野や医学分野の研究において、細胞等の生体試料の生物学的活性をレポータアッセイにより検出する技術が広く利用されてきた。レポータアッセイを用いると、視覚的に調べることが不可能な様様な生物学的活性を可視化することができる。従来の臨床的な検査は、生体試料から調べたい生体関連物質（核酸、血液、ホルモン、タンパク質等）のみを種々の分離方法により単離して、その単離した生体関連物質の量や活性を試薬と反応させていた。しかし、生命体においては、多様な生体関連物質同士の相互作用こそが真の生物学的活性を示すものである。近年、医療用薬剤を研究または開発する場合、生きた生体試料中での生物学的活性に対して最も効果的に作用する薬剤が決定的条件となっている。生きた生体試料を対象としたレポータアッセイには、生体試料と調べたい生体関連物質とを画像化して、生体試料内外におぇる動的変化を経時的に観察する必要性が高まってきている。 In research in the fields of biology and medicine, techniques for detecting biological activity of biological samples such as cells by reporter assays have been widely used. Reporter assays can be used to visualize biological activities that cannot be visually examined. In conventional clinical tests, only biological substances (nucleic acid, blood, hormones, proteins, etc.) to be examined from biological samples are isolated by various separation methods, and the amount and activity of the isolated biological substances are determined as reagents. And reacted. However, in living organisms, the interaction between various biological materials shows true biological activity. In recent years, when researching or developing medical drugs, drugs that most effectively act on biological activity in living biological samples have become critical conditions. In reporter assays for living biological samples, there is a growing need to image biological samples and biological substances to be examined and observe dynamic changes in and out of biological samples over time. .
具体的には、レポーター物質としての発光（生物発光、化学発光）や蛍光を用いる観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子の動的な機能発現を捉えるためにタイムラプスや動画撮像が求められている。現状では、蛍光試料を対象として撮像した画像による動的変化の観察（例えば、蛍光を利用したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。蛍光試料の撮像の場合、励起光を照射し続けることで蛍光試料から発せられる光量が時間の経過とともに減少するという性質があるため、定量的な評価に利用できる安定した画像を経時的に撮ることが困難であったが、しかし、鮮明な、つまり、空間分解能の高い画像を短い露出時間で撮ることができた。一方、発光試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察においては、発光試料からの発光が極めて小さいので、発光試料の観察には、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて行われていた。発光試料の撮像の場合、励起光を照射する必要がないため、定量的な評価に利用できる安定した画像を経時的に撮ることができた。 Specifically, in research fields that utilize observation using luminescence (bioluminescence, chemiluminescence) or fluorescence as a reporter substance, time-lapse or video imaging is required to capture the dynamic functional expression of protein molecules in a sample. It has been. At present, dynamic changes are observed using an image picked up from a fluorescent sample (for example, observation of a moving image of one protein molecule using fluorescence). In the case of imaging a fluorescent sample, the amount of light emitted from the fluorescent sample decreases with the lapse of time by continuing to irradiate excitation light, so that a stable image that can be used for quantitative evaluation can be taken over time. However, it was possible to take a clear, high spatial resolution image with a short exposure time. On the other hand, in the time-dependent observation of dynamic changes by images for a luminescent sample, the luminescence from the luminescent sample is extremely small, so a CCD camera equipped with an image intensifier was used to observe the luminescent sample. It was done. In the case of imaging of a luminescent sample, it was not necessary to irradiate excitation light, so that stable images that could be used for quantitative evaluation could be taken over time.
これまで、発光試料の観察においては、発光試料からの発光量の測定が行われていた。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞の観察では、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べるために、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量の測定が行われていた。そして、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量の測定は、まず細胞を溶解した細胞溶解液とルシフェリンやＡＴＰやマグネシウムなどを含む基質溶液とを反応させ、ついで基質溶液と反応させた細胞溶解液からの発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量する、という手順で行われていた。つまり、発光量は細胞を溶解した後に測定されていた。これにより、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を細胞全体の平均値として測定することができた。ここで、ルシフェラーゼ遺伝子などの発光遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入する方法には例えばリン酸カルシウム法やリポフェクチン法やエレクトロポーション法などがあり、各方法は目的や細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。また、ルシフェラーゼ遺伝子がレポーター遺伝子として導入された細胞においてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さをルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量を指標として調べる際、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぐことで当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができ、また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターに繋いでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることで当該遺伝子の遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることができる。 Until now, in the observation of a luminescent sample, the amount of luminescence from the luminescent sample has been measured. For example, in the observation of a cell into which a luciferase gene has been introduced, the amount of luminescence from the cell due to the luciferase activity was measured in order to investigate the intensity of the luciferase gene expression (specifically, the expression level). . The amount of luminescence from the cells due to luciferase activity is measured by first reacting a cell lysate in which cells are lysed with a substrate solution containing luciferin, ATP, magnesium, etc., and then reacting with the substrate solution. The amount of luminescence from was quantified with a luminometer using a photomultiplier tube. That is, the amount of luminescence was measured after cell lysis. Thereby, the expression level of the luciferase gene at a certain time point could be measured as an average value of the whole cell. Here, methods for introducing a luminescent gene such as a luciferase gene into a cell as a reporter gene include, for example, a calcium phosphate method, a lipofectin method, an electroporation method, and the like, and each method is properly used depending on the purpose and the type of cell. Yes. In addition, when investigating the intensity of luciferase gene expression in cells transfected with a luciferase gene as a reporter gene using the amount of luminescence from the cell due to luciferase activity as an indicator, the target luciferase gene is introduced upstream or downstream of the luciferase gene introduced into the cell. By linking DNA fragments, it is possible to examine the effect of the DNA fragment on the transcription of the luciferase gene. In addition, genes such as transcription factors that are thought to affect the transcription of the luciferase gene to be introduced into cells are linked to the expression vector. By co-expressing with the luciferase gene, the effect of the gene product of the gene on the expression of the luciferase gene can be examined.
また、時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を捉えるには生きた細胞からの発光量を経時的に測定する必要がある。そして、生きた細胞からの発光量の経時的測定は、まず細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を付け、ついで培養している全細胞集団からの発光量をルミノメーターで一定時間ごとに定量する、という手順で行われていた。これにより、一定の周期性をもった発現リズムなどを測定することができ、よって、細胞全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができた。一方、発光遺伝子の発現が一過性である場合には、個々の細胞での発現量に大きなばらつきがある。例えば、ＨｅＬａ細胞などのクローン化した培養細胞であっても、細胞膜表面のレセプターを介した薬剤の応答が個々の細胞でばらつくことがある。すなわち、細胞全体としての応答は検出されなくとも数個の細胞は応答している場合がある。このことから、発光遺伝子の発現が一過性である場合には、細胞全体からではなく個々の細胞から発光量を経時的に測定することが重要である。そして、顕微鏡を用いた生きた個々の細胞からの発光量の経時的測定は、各細胞の発光が極めて弱いので、液体窒素温度レベルの冷却ＣＣＤカメラで長時間露光したり、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラとフォトンカウンティング装置とを用いたりして行われていた。これにより、生きた個々の細胞における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができた。 In addition, in order to capture the expression level of the luminescent gene over time, it is necessary to measure the amount of luminescence from living cells over time. In order to measure the amount of luminescence from living cells over time, first add the function of a luminometer to the incubator that cultivates the cells, and then quantitate the amount of luminescence from the whole cell population cultured at regular intervals with the luminometer. The procedure was to do. As a result, it was possible to measure an expression rhythm with a certain periodicity, and thus, it was possible to capture changes over time in the expression level of the luminescent gene in the entire cell. On the other hand, when the expression of the luminescent gene is transient, the expression level in individual cells varies greatly. For example, even in the case of cloned cultured cells such as HeLa cells, the response of drugs via receptors on the cell membrane surface may vary among individual cells. That is, several cells may be responding even if the response as a whole cell is not detected. For this reason, when the expression of the luminescent gene is transient, it is important to measure the amount of luminescence from individual cells over time rather than from the whole cell . The time-dependent measurement of the amount of light emitted from living individual cells using a microscope shows that the light emitted from each cell is extremely weak, so it can be exposed for a long time with a cooled CCD camera at a liquid nitrogen temperature level, or an image intensifier. Or a photon counting device. As a result, it was possible to capture changes over time in the expression level of the luminescent gene in individual living cells.
以上の説明において、例えば蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として用いる遺伝子発現の解析方法および装置は特許文献１（特表２００４−５００５７６）に開示されている。また、ルミノメーターを用いて生物発光による遺伝子発現の解析方法およぼ装置は特許文献２（特開２００５−１１８０５０）に開示されている。 In the above description, for example, a method and an apparatus for analyzing gene expression using a fluorescent protein as a reporter gene are disclosed in Patent Document 1 (Japanese Translation of PCT International Publication No. 2004-5000576). A method and apparatus for analyzing gene expression by bioluminescence using a luminometer is disclosed in Patent Document 2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-1118050).
しかしながら、微弱な発光の発光試料を撮像する場合、発光試料からの発光量が極めて少ないため、どうしても肉眼では見ることが出来ず、ＣＣＤのような蓄積型の撮像手段を用いて光量を蓄積しなければ画像生成することができない、という制約が有る。しかも、単一の細胞ないし組織を構成する細胞群において、細胞１個当りから発生する微弱光は、あまりに弱過ぎるので、鮮明な画像を撮るのに必要な露出時間が長くなる、という問題点があった。即ち、撮像の時間間隔は単位時間あたりの光量に制約されるため、微弱な発光の発光試料を撮像する場合、鮮明な画像を長い時間間隔で、例えば６０分間隔で、経時的に撮ることができても、１０〜３０分程度の短い露光時間、ひいては１〜５分の露光でリアルタイムに撮像することはできなかった、という問題点があった。特に生細胞を長時間（例えば、５０分以上）露光すると、培養容器等の支持体上でさえ細胞自身が動いて鮮明な画像を形成できない場合がある。一般に、画像を用いた解析を行なうためには、正確な輪郭を認識できなければならない。従って、画像が不鮮明なときは解析結果が不正確である可能性が有る。 However, when imaging a weakly luminescent sample, the amount of light emitted from the luminescent sample is extremely small, so it cannot be viewed with the naked eye, and the amount of light must be accumulated using a storage-type imaging means such as a CCD. Therefore, there is a restriction that an image cannot be generated. Moreover, in the cell group constituting a single cell or tissue, the weak light generated from each cell is too weak, so that the exposure time required for taking a clear image becomes long. there were. That is , since the imaging time interval is limited by the amount of light per unit time, when imaging a luminescent sample with weak light emission, a clear image can be taken over time at a long time interval, for example, at an interval of 60 minutes. Even if it was possible, there was a problem that imaging could not be performed in real time with a short exposure time of about 10 to 30 minutes , and thus with an exposure of 1 to 5 minutes . In particular, when living cells are exposed for a long time (for example, 50 minutes or longer), the cells themselves may move even on a support such as a culture vessel and a clear image may not be formed. Generally, in order to perform an analysis using an image, it is necessary to recognize an accurate contour. Therefore, the analysis result may be inaccurate when the image is unclear.
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、肉眼で見えないような微弱光を発生する微弱光試料でも、所望の細胞解析が可能な解析方法を提供することを目的とする。また、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる発光試料撮像方法を組合わせた解析方法を提供することも目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an analysis method capable of performing desired cell analysis even with a faint light sample that generates faint light that cannot be seen with the naked eye. . It is another object of the present invention to provide an analysis method combined with a luminescent sample imaging method capable of taking a clear image with a short exposure time and in real time.
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる請求項１に記載の微弱光解析方法は、N末から開始コドン、解析対象のシグナルペプチド、発光関連遺伝子、既知の膜貫通ドメイン、終止コドンの順でタンパク質をコードするＤＮＡ構造物を導入した細胞を含む試料を、撮像手段の撮像視野内に配置する工程と、前記試料に前記刺激用物質を接触させて刺激を行なう工程と、刺激に応答した細胞において発現した前記のレポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを前記撮像手段により光学イメージングするとともに、前記レポーター遺伝子が生ずるシグナルの量を定量的に決定する光学的処理工程とを備え、前記光学的処理工程が微弱光を画像解析可能な画像を生成する工程をさらに有することを特徴とする。
ここで、前記ＤＮＡ構造物が、GPIアンカー型であるのが好ましい。また、前記ＤＮＡ構造物が、細胞内へ基質溶液が侵入し難い成分である場合には、細胞内と細胞外に発現したレポーター分子の識別を可能にするので好ましい。また、前記のレポーター遺伝子が発光タンパク質であることにより、一定量の基質溶液との混合状態において、遺伝子の発現量に対応する光量を長期間安定に発生するので好ましい。また、前記のレポーター遺伝子が生ずるシグナルの強度を輝度値に変換することにより、正確な解析ができるので好ましい。また、前記のレポーター遺伝子が生ずるシグナルの光学イメージング像と細胞の明視野像を重ね合わせすることにより、発光した細胞を正確に同定できる点で好ましい。
In order to solve the above-described problems and achieve the object, the weak light analysis method according to claim 1 according to the present invention includes an initiation codon from the N-terminal, a signal peptide to be analyzed, a luminescence-related gene, a known transmembrane A step of placing a sample containing cells into which a DNA structure encoding a protein in the order of a domain and a stop codon has been introduced within the imaging field of the imaging means, and a step of stimulating the sample by contacting the sample with the stimulating substance And an optical processing step for optically imaging the detectable signal produced by the reporter gene expressed in the cell in response to the stimulus by the imaging means and quantitatively determining the amount of the signal produced by the reporter gene. And the optical processing step further includes a step of generating an image capable of image analysis of weak light.
Here, the DNA structure is preferably a GPI anchor type. Further, when the DNA structure is a component that makes it difficult for the substrate solution to enter the cell, it is preferable because the reporter molecule expressed inside and outside the cell can be distinguished. In addition, it is preferable that the reporter gene is a photoprotein because a light amount corresponding to the expression level of the gene is stably generated for a long period of time in a mixed state with a certain amount of substrate solution. Moreover, it is preferable because accurate analysis can be performed by converting the intensity of the signal generated by the reporter gene into a luminance value. Moreover, it is preferable at the point which can identify the light-emitted cell correctly by superimposing the optical imaging image of the signal which the said reporter gene produces, and the bright field image of a cell.
本発明において、発光試料を光学イメージングするには、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いることにより、発光だけの画像もイメージングできる点で好ましい。この光学条件によると、高価な極低温冷却型の撮像素子を使わずに撮像できる利点もある。 In the present invention, for optical imaging of a luminescent sample, by using an objective lens having a value of (NA ÷ β) 2 expressed by a numerical aperture (NA) and a projection magnification (β) of 0.01 or more, This is preferable in that an image of only light emission can be imaged. According to this optical condition, there is an advantage that imaging can be performed without using an expensive cryogenic cooling type imaging device.
とくに、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０３９以上である対物レンズを用いることにより、従来よりも高速にイメージングを実行できる点で好ましい。 In particular, by using an objective lens whose numerical value (NA ÷ β) 2 expressed by numerical aperture (NA) and projection magnification (β) is 0.039 or more, imaging can be performed at a higher speed than in the past. preferable.
さらに、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０７１以上である場合に１分〜５分という短時間で対物レンズを用いることにより、リアルタイムなイメージングを実行できる点で好ましい。 Furthermore, by using the objective lens in a short time of 1 to 5 minutes when the value of (NA ÷ β) 2 expressed by the numerical aperture (NA) and the projection magnification (β) is 0.071 or more, This is preferable in that real-time imaging can be performed.
また、本発明は発光イメージングを高い開口数（ＮＡ）の対物レンズを用いて、短かい時間間隔の画像解析を行なうことが可能になるので、あらゆる刺激応答性を見逃さない。これにより、創薬や診断において優れた方法を提供する。また、発光量の少ない発光試料（例えば、発光タンパク質（例えば、導入された遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞または発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体（例えば動物や臓器など）など）でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムな解析が可能となる。 Further, the present invention makes it possible to perform image analysis at short time intervals using an objective lens having a high numerical aperture (NA) for luminescence imaging, so that all stimulus responsiveness is not missed. This provides an excellent method in drug discovery and diagnosis. In addition, a luminescent sample (eg, a luminescent protein (eg, a luminescent protein expressed from an introduced gene (eg, luciferase gene)), a luminescent cell or a collection of luminescent cells, Even a tissue sample or a luminescent individual (such as an animal or an organ) can be analyzed with a clear exposure time and in real time.
本発明の微弱光解析方法によれば、肉眼で見えないような微弱光を発生する微弱光試料でも、所望の細胞解析が可能な解析方法を提供できる。また、対物レンズが特定の条件を満たす場合に、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに解析できる解析方法を提供できる。 According to the feeble light analysis method of the present invention, it is possible to provide an analysis method capable of performing desired cell analysis even with a feeble light sample that generates faint light that cannot be seen with the naked eye. In addition, when the objective lens satisfies a specific condition, it is possible to provide an analysis method capable of analyzing a clear image with a short exposure time and in real time.
以下に、本発明にかかる微弱光解析方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。 Embodiments of a faint light analysis method according to the present invention will be described below in detail with reference to the drawings. Note that the present invention is not limited to the embodiments.
本発明にかかる方法を実施するための装置の構成について図１を参照して説明する。図１は、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置の構成の一例を示す図である。図１に示すように、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置は、撮像対象であるサンプル１を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するためのものであり、対物レンズ２と集光レンズ３とＣＣＤカメラ４とモニタ５とで構成されている。なお、当該装置は図示の如くズームレンズ６をさらに備えてもよい。 A configuration of an apparatus for carrying out the method according to the present invention will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a diagram showing an example of the configuration of an apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method according to the present invention. As shown in FIG. 1, an apparatus for carrying out a luminescent sample imaging method according to the present invention is for imaging a sample 1 to be imaged with a short exposure time, and in real time. The condenser lens 3, the CCD camera 4, and the monitor 5 are included. The apparatus may further include a zoom lens 6 as shown.
サンプル１は、発光試料であり、例えば、発光タンパク質（例えば導入された遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子など）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞や、発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の臓器や、発光性の個体（動物など）などである。また、サンプル１は、具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞でもよい。対物レンズ２は、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上のものである。集光レンズ３は、対物レンズ２を介して到達したサンプル１からの発光を集める。ＣＣＤカメラ４は、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラであり、対物レンズ２や集光レンズ３を介してサンプル１を撮像する。モニタ５はＣＣＤカメラ４で撮像した画像を出力する。 Sample 1 is a luminescent sample, for example, a luminescent protein (for example, a luminescent protein expressed from an introduced gene (such as a luciferase gene)), a luminescent cell, an aggregate of luminescent cells, or a luminescent property. Tissue samples, luminescent organs, and luminescent individuals (animals, etc.). Sample 1 may specifically be a luminescent cell into which a luciferase gene has been introduced. The objective lens 2 has a numerical value (NA ÷ β) 2 expressed by a numerical aperture (NA) and a projection magnification (β) of 0.01 or more. The condenser lens 3 collects light emitted from the sample 1 that has reached through the objective lens 2. The CCD camera 4 is a cooled CCD camera at about 0 ° C. and images the sample 1 through the objective lens 2 and the condenser lens 3. The monitor 5 outputs an image captured by the CCD camera 4.
そして、対物レンズ２や対物レンズ２の包装容器（パッケージ）には、（ＮＡ／β）2の値を表記する。従来の対物レンズにはレンズ種類（例えば“ＰｌａｎＡｐｏ”）、倍率／ＮＡ油侵（例えば“１００×／１．４０ｏｉｌ”）および無限遠／カバーガラス厚（例えば“∞／０．１７”）が表記されていた。しかし、本発明の方法にかかる撮像手段の対物レンズ（対物レンズ２）には、レンズ種類（例えば“ＰｌａｎＡｐｏ”）、倍率／ＮＡ油侵（例えば“１００×／１．４０ｏｉｌ”）、無限遠／カバーガラス厚（例えば“∞／０．１７”）の他に、さらに射出開口角（例えば、“（ＮＡ／β）2：０．０５”）が表記されている。 The value of (NA / β) 2 is written in the objective lens 2 and the packaging container (package) of the objective lens 2. The conventional objective lens indicates the lens type (eg “PlanApo”), magnification / NA oil immersion (eg “100 × / 1.40 oil”) and infinity / cover glass thickness (eg “∞ / 0.17”). It had been. However, the objective lens (objective lens 2) of the imaging means according to the method of the present invention includes a lens type (for example, “PlanApo”), magnification / NA oil immersion (for example, “100 × / 1.40 oil”), infinity / In addition to the cover glass thickness (for example, “∞ / 0.17”), an injection opening angle (for example, “(NA / β) 2: 0.05”) is also described.
以上、説明したように、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置において、対物レンズ２は、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である。これにより、発光量の少ない発光試料（例えば、発光タンパク質（例えば、導入された遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞または発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体（例えば動物や臓器など）など）でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像対象として、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる。また、対物レンズ２は、従来の対物レンズと比較して、開口数が大きく且つ倍率が小さいので、対物レンズ２を用いれば広範囲を分解能よく撮像することができる。これにより、例えば動きのある発光試料や移動する発光試料や広い範囲に分布する発光試料を撮像対象とすることができる。また、対物レンズ２は、当該対物レンズ２および／または当該対物レンズ２を包装する包装容器（パッケージ）に、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値（例えば０．０１以上）を表記した。これにより、例えば発光画像観察を行う者は、表記された（ＮＡ÷β）2の値を確認すれば、発光試料を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するのに適した対物レンズを容易に選択することができる。 As described above, in the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method according to the present invention, the objective lens 2 is represented by (NA ÷ β) 2 represented by the numerical aperture (NA) and the projection magnification (β). The value is 0.01 or more. As a result, a luminescent sample (for example, a luminescent protein (for example, a luminescent protein expressed from an introduced gene (for example, luciferase gene)), a luminescent cell, or a collection of luminescent cells, A clear image can be taken with a short exposure time and in real time even with a sex tissue sample or a luminescent individual (such as an animal or an organ). Specifically, a luminescent cell into which a luciferase gene has been introduced can be used as an imaging target, and a clear image can be taken with a short exposure time and in real time. In addition, since the objective lens 2 has a larger numerical aperture and a lower magnification as compared with a conventional objective lens, a wide range can be imaged with high resolution by using the objective lens 2. Thereby, for example, a moving luminescent sample, a moving luminescent sample, or a luminescent sample distributed over a wide range can be set as an imaging target. The objective lens 2 is expressed by the numerical aperture (NA) and the projection magnification (β) (NA ÷ β) 2 on the objective lens 2 and / or a packaging container (package) that wraps the objective lens 2. Value (for example, 0.01 or more) was expressed. Thus, for example, a person who observes a luminescent image can easily find an objective lens suitable for imaging a luminescent sample with a short exposure time and in real time if the value of (NA ÷ β) 2 is confirmed. You can choose.
従来、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイにおいては、細胞を溶解した後に発光量を測定するため、ある時点での発現量しか捉えることができず、しかも細胞全体の平均値としての計測になってしまう。また、培養しながらの計測においては、細胞コロニーの経時的な発現量の変化を捉えることはできるが、個々の細胞での発現量の変化を捉えることはできない。そして、個々の細胞の発光を顕微鏡で観察するためには、生きた細胞からの発光量が極めて弱いため、液体窒素温度レベルの冷却ＣＣＤカメラで長時間露光したり、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラでフォトンカウンティングをしたりしなければならない。そのため、発光検出のカメラは高価で大掛かりなものになってしまう。しかし、レポーター遺伝子産物としてのルシフェラーゼ活性を示す個々の細胞の発光を顕微鏡によって観察する際、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、イメージ・インテンシファイアを装着することなく、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラを用いて定量的な画像を取得することができる。すなわち、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、生きた状態で個々の細胞の発光を０℃程度の冷却ＣＣＤカメラによって観察することができるので、イメージ・インテンシファイアやフォトンカウンティングのための装置が不要である。つまり、低コストで発光試料の撮像を行うことができる。また、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、個々の生きた細胞の発光を、培養しながら経時的に観察することができ、さらにリアルタイムに観察することもできる。また、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、同じ細胞について、異なった条件での薬剤や刺激の応答をモニタすることができる。 Conventional reporter assays using the luciferase gene measure the amount of luminescence after lysing the cells, so only the expression level at a certain point in time can be captured, and the average value of the entire cell is measured. . Further, in measurement while culturing, changes in the expression level of cell colonies over time can be caught, but changes in the expression level in individual cells cannot be caught. In order to observe the luminescence of individual cells with a microscope, the amount of luminescence from living cells is extremely weak, so it can be exposed for a long time with a cooled CCD camera at the liquid nitrogen temperature level, or an image intensifier is attached. You have to do photon counting with a CCD camera. Therefore, the camera for detecting light emission is expensive and large. However, when observing the luminescence of individual cells exhibiting luciferase activity as a reporter gene product with a microscope, an image intensifier is attached if the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method according to the present invention is used. The quantitative image can be acquired using a cooled CCD camera at about 0 ° C. That is, if the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method according to the present invention is used, the luminescence of individual cells can be observed with a cooled CCD camera at about 0 ° C. in an alive state. No fire or photon counting device is required. That is, the luminescent sample can be imaged at low cost. In addition, if the apparatus for performing the luminescent sample imaging method according to the present invention is used, the luminescence of individual living cells can be observed over time while being cultured, and can also be observed in real time. . Moreover, if the apparatus for performing the luminescent sample imaging method according to the present invention is used, it is possible to monitor the response of drugs and stimuli under different conditions for the same cell.
ここで、本発明にかかる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズの理解を容易にするために、従来の対物レンズおよびそれを用いた発光画像観察について簡単に説明する。
一般に、顕微鏡観察における空間分解能εは、下記数式１で表される。
ε＝０．６１×λ÷ＮＡ ・・・（数式１）
（数式１において、λは光の波長であり、ＮＡは開口数である。）
また、観察範囲の直径ｄは、下記数式２で表される。
ｄ＝Ｄ÷Ｍ ・・・（数式２）
（数式２において、Ｄは視野数であり、Ｍは倍率である。なお、視野数は一般に２２から２６である。）
従来、顕微鏡用対物レンズの焦点距離は国際規格で４５ｍｍとされていた。そして、最近では、焦点距離を６０ｍｍとする対物レンズが使われはじめている。この焦点距離を前提にしてＮＡが大きい、つまり空間分解能が高いレンズを設計すると作動距離（ＷＤ）は一般には０．５ｍｍ程度であり、また長ＷＤ設計のものでも８ｍｍ程度であった。このような対物レンズを用いた場合、観察範囲は０．５ｍｍ径程度である。
Here, in order to facilitate understanding of the luminescent sample imaging method, the luminescent cell imaging method and the objective lens according to the present invention, a conventional objective lens and luminescent image observation using the objective lens will be briefly described.
In general, the spatial resolution ε in microscopic observation is expressed by the following mathematical formula 1.
ε = 0.61 × λ ÷ NA (Formula 1)
(In Equation 1, λ is the wavelength of light and NA is the numerical aperture.)
Further, the diameter d of the observation range is expressed by the following mathematical formula 2.
d = D ÷ M (Formula 2)
(In Equation 2, D is the number of fields of view and M is the magnification. The number of fields of view is generally 22 to 26.)
Conventionally, the focal length of an objective lens for a microscope has been set to 45 mm according to international standards. Recently, an objective lens having a focal length of 60 mm has been used. If a lens with a large NA, that is, a high spatial resolution is designed on the assumption of this focal length, the working distance (WD) is generally about 0.5 mm, and even a long WD design is about 8 mm. When such an objective lens is used, the observation range is about 0.5 mm in diameter.
しかし、ディッシュやガラズボトムディッシュに分散した細胞群や組織、個体の観察を行う場合、観察範囲が１から数ｃｍに及ぶことがある。このような範囲を分解能よく観察したいときには、低倍率でありながらＮＡを大きい値で維持しなければならない。換言すると、ＮＡはレンズ半径と焦点距離との比であるので、ＮＡが大きいまま広い範囲を観察できる対物レンズは、低倍である必要がある。そして、結果的に、このような対物レンズは大口径となる。なお、大口径の対物レンズの製作では、一般的に光学材料の物性の均一性やコーティングの均一性において、また、レンズ形状においても高い精度が求められる。 However, when observing a cell group, tissue, or individual dispersed in a dish or glass bottom dish, the observation range may range from 1 to several centimeters. When it is desired to observe such a range with a high resolution, the NA must be maintained at a large value while the magnification is low. In other words, since NA is the ratio of the lens radius to the focal length, an objective lens that can observe a wide range with a large NA needs to be low magnification. As a result, such an objective lens has a large aperture. In manufacturing a large-diameter objective lens, generally high accuracy is required in terms of uniformity of physical properties and coating uniformity of an optical material and lens shape.
また、顕微鏡観察の場合、光学系の透過率や対物レンズの開口数やＣＣＤカメラのチップ面での投影倍率やＣＣＤカメラの性能などが像の明るさに大きく影響してくる。そして、像の明るさは、開口数（ＮＡ）を投影倍率（β）で割った値の２乗、すなわち（ＮＡ／β）2で評価される。ここで、対物レンズには、一般に、入射開口角ＮＡと射出開口角ＮＡ'との間に下記数式３の関係があり、ＮＡ'2が観察者の目やＣＣＤカメラなどに届く明るさを示す値である。
ＮＡ'＝ＮＡ÷β ・・・（数式３）
（数式３において、ＮＡは入射開口角（開口数）であり、ＮＡ'は射出開口角であり、βは投影倍率である。）
一般の対物レンズにおいて、ＮＡ'は高々０．０４であり、ＮＡ'2は０．００１６である。また、現在市販されている一般的な顕微鏡の対物レンズにおける像の明るさ（ＮＡ／β）2の値を調査したところ、０．０００５から０．００２の範囲であった。
In the case of microscopic observation, the light transmittance of the optical system, the numerical aperture of the objective lens, the projection magnification on the chip surface of the CCD camera, the performance of the CCD camera, etc. greatly affect the brightness of the image. The brightness of the image is evaluated by the square of the value obtained by dividing the numerical aperture (NA) by the projection magnification (β), that is, (NA / β) 2. Here, the objective lens generally has a relationship of the following Equation 3 between the incident aperture angle NA and the exit aperture angle NA ′, and NA ′ 2 indicates the brightness that reaches the observer's eyes, a CCD camera, or the like. Value.
NA ′ = NA ÷ β (Formula 3)
(In Equation 3, NA is the incident aperture angle (numerical aperture), NA ′ is the exit aperture angle, and β is the projection magnification.)
In a general objective lens, NA ′ is at most 0.04, and NA ′ 2 is 0.0016. Further, when the value of image brightness (NA / β) 2 in a general microscope objective lens currently on the market was examined, it was in the range of 0.0005 to 0.002.
ところが、上記のような現在市販されている対物レンズを装着した顕微鏡を用いて、例えば細胞内でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ発光している細胞を観察しても、当該細胞からの発光を目視で観察することができないし、さらに０℃程度に冷却したＣＣＤカメラを用いて撮像した発光画像を観察しても細胞からの発光を確認することができない。なお、発光試料を観察する場合には、蛍光観察に必要な励起光の投影は不要である。例えば、落射蛍光観察では、対物レンズは、励起光投影レンズと蛍光を集光して画像を形成するレンズとの両方の機能を満たしている。そこで、光量の少ない発光を画像で観察するためには、大きなＮＡと小さいβの特性を有する対物レンズが必要である。そして、結果的に、当該対物レンズは大口径となる傾向がある。なお、このような対物レンズでは、励起光投影の機能を考慮することなく機能を単純化して設計、製造しやすくすることが求められる。 However, using a microscope equipped with a commercially available objective lens as described above, for example, even if a cell expressing a luciferase gene and illuminating it is observed, the light emitted from the cell is visually observed. In addition, even if a light emission image taken using a CCD camera cooled to about 0 ° C. is observed, light emission from the cells cannot be confirmed. When observing a luminescent sample, it is not necessary to project excitation light necessary for fluorescence observation. For example, in epifluorescence observation, the objective lens satisfies both functions of an excitation light projection lens and a lens that collects fluorescence and forms an image. Therefore, in order to observe light emission with a small amount of light with an image, an objective lens having large NA and small β characteristics is required. As a result, the objective lens tends to have a large aperture. Such an objective lens is required to be designed and manufactured easily by simplifying the function without considering the function of projecting the excitation light.
また、発光や蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子の動的な機能発現を捉えるためにタイムラプスや動画撮像が求められている。最近では、蛍光を利用したタンパク質１分子の動画観察が行われている。これらの撮像では単位時間の撮像フレーム数が多いほど画像１フレームあたりの露出時間は短くなる。このような観察においては、明るい光学系、特に、明るい対物レンズが必要となる。しかし、蛍光に比べて発光タンパク質の光量は少ないので、１フレームの撮像に、例えば２０分の露出時間を要することが多い。このような露出時間でタイムラプス観察を行うには動的な変化が非常に遅い試料に限られる。例えば、約１時間に一度分裂する細胞では、その周期内の変化を観察することはできない。従って、シグナル・ノイズ比を高く維持しながら少ない光量を効率よく画像化するために、光学系の明るさを向上することは重要である。 In the research field using luminescence and fluorescence observation, time-lapse and moving image capturing are required to capture the dynamic functional expression of protein molecules in a sample. Recently, video observation of one molecule of protein using fluorescence has been performed. In these imaging operations, the exposure time per image frame becomes shorter as the number of imaging frames per unit time increases. Such observation requires a bright optical system, particularly a bright objective lens. However, since the amount of photoprotein is less than that of fluorescence, it often takes an exposure time of, for example, 20 minutes to image one frame. In order to perform time- lapse observation with such an exposure time, a dynamic change is limited to a very slow sample. For example, in cells that divide once every hour, changes within that cycle cannot be observed. Therefore, it is important to improve the brightness of the optical system in order to efficiently image a small amount of light while maintaining a high signal-to-noise ratio.
以上の経緯を踏まえて製作された本発明の対物レンズは、上記の一般に市販されている対物レンズに比べて、大きなＮＡと小さいβの特性を有している。よって、本発明の対物レンズのＮＡ'2は大きな値である。つまり、本発明の対物レンズは明るい対物レンズであると言うことができる。これにより、本発明の対物レンズのような明るい対物レンズを用いれば、光量の少ない発光試料からの発光を画像で観察することができる。また、より暗い像を観察するために、開口数の大きい本発明の対物レンズを実体顕微鏡に装着することで、イメージ・インテンシファイアを装着することなく、０℃程度に冷却したＣＣＤカメラでも、細胞の発光を画像で観察することができる。また、液体窒素冷却を用いるＣＣＤカメラで感度を上げる方法があるが、この場合ＣＣＤカメラが非常に高価に、大規模になる。しかし、本発明の対物レンズを用いれば、ペルチェ冷却によるＣＣＤカメラでも、細胞の発光を画像で観察することができる。また、本発明の対物レンズは、数から１０ｃｍ程度の大口径である。これにより、従来では撮像対象となり得なかった移動する発光試料や広い範囲に分布する発光試料などを撮像対象とすることができる。 The objective lens of the present invention manufactured based on the above circumstances has characteristics of a large NA and a small β as compared with the above-described objective lenses generally on the market. Therefore, NA′2 of the objective lens of the present invention is a large value. That is, it can be said that the objective lens of the present invention is a bright objective lens. Thereby, if a bright objective lens like the objective lens of this invention is used, the light emission from the light emission sample with little light quantity can be observed with an image. In order to observe a darker image, a CCD camera cooled to about 0 ° C. without mounting an image intensifier by mounting the objective lens of the present invention having a large numerical aperture on a stereomicroscope, Cell luminescence can be observed with images. In addition, there is a method of increasing the sensitivity with a CCD camera using liquid nitrogen cooling. In this case, the CCD camera becomes very expensive and large-scale. However, if the objective lens of the present invention is used, the light emission of the cells can be observed as an image even with a CCD camera using Peltier cooling. Moreover, the objective lens of the present invention has a large diameter of several to about 10 cm. Thereby, a moving luminescent sample that could not be an imaging target in the past or a luminescent sample distributed over a wide range can be set as an imaging target.
本発明の方法を実施するための測定原理、光学系の構成その他については、図１により既に説明したが、本出願人による出願（特願２００５−２６７５３１号および特願２００５−４４７３７号）を参照してもよい。前記出願にも記載されるように、本出願人は、光学的実験を通じ、対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の２乗の値が０．０１以上の光学系で撮像することによって、単一の細胞から発生する発光だけで画像化できる証明データを取得した。さらに、本出願人は、検討を進め、同一シャーレ内で培養された複数の細胞において、遺伝子発現の変動パターンが異なることも発見した。驚くべきことに、上記の撮像条件は、本発明において実施される応用例で取り扱われる微弱な発光画像に対しても適用でき、短い時間（例えば１分〜２０分）で生物発光のような微弱な発光成分による細胞画像を撮像できる。さらに、撮像装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できることも分かった。 The measurement principle for implementing the method of the present invention, the configuration of the optical system, and the like have already been described with reference to FIG. 1, but refer to the applications by the present applicant (Japanese Patent Application Nos. 2005-267531 and 2005-44737). May be. As described in the above-mentioned application, the applicant, through optical experiment, has a square value of (NA ÷ β) represented by a numerical aperture (NA) of the objective lens and a projection magnification (β) of 0. By taking an image with an optical system of 0.01 or more, proof data that can be imaged only by light emission generated from a single cell was obtained. Furthermore, the present applicant has proceeded with studies and found that the variation pattern of gene expression is different among a plurality of cells cultured in the same petri dish. Surprisingly, the above imaging conditions can also be applied to weak luminescent images handled in the application examples implemented in the present invention, and weak such as bioluminescence in a short time (for example, 1 to 20 minutes). Cell images can be captured with various luminescent components. Further, when the optical condition expressed by the square of the numerical aperture (NA) / projection magnification (β) is 0.071 or more, the objective lens of the imaging device can be imaged within 1 to 5 minutes. It was also found that cell images that can be analyzed can be provided.
上述した図１に示すように、本発明にかかる撮像方法を実施するための装置は、撮像対象であるサンプル１を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するためのものであり、従来採用されたことの無い高開口数（ＮＡ）の対物レンズ２とＣＣＤカメラ４とモニタ５とで基本的に構成されている。これらの基本構成を備える装置を、本発明では発光顕微鏡と称することとする。発光顕微鏡は、暗視野での撮像を行うために、適宜、遮光用のフタまたはハウジングによって収容されているのが好ましい。また、適当な培養条件を維持できる培養装置を発光顕微鏡と一体に組合せることで、撮像を長期間に亘り、自動的に実行できる。なお、撮像を行う機構を有する構造であれば、顕微鏡の形態である必要はなく、マイクロプレートリーダーのような測定機器の形態であってもよい。 As shown in FIG. 1 described above, the apparatus for carrying out the imaging method according to the present invention is for imaging a sample 1 to be imaged with a short exposure time and in real time, and has been conventionally employed. A high numerical aperture (NA) objective lens 2, a CCD camera 4 and a monitor 5 are basically configured. In the present invention, an apparatus having these basic configurations is referred to as a light emission microscope. In order to perform imaging in a dark field, the light emission microscope is preferably accommodated by a light shielding lid or housing as appropriate. Moreover, imaging can be automatically performed over a long period of time by combining a culture apparatus capable of maintaining appropriate culture conditions integrally with a light emission microscope. In addition, if it is a structure which has an imaging mechanism, it does not need to be in the form of a microscope, and may be in the form of a measuring instrument such as a microplate reader.
次に、本発明で使用する発光顕微鏡の構成、形態とその作用を説明する。 発光顕微鏡の基本的な特徴は、顕微鏡視野中の細胞に発現させた発光タンパク質から発する光を、対物レンズ(NA0.75)および光学フィルタを通してデジタルカメラで画像化することで、短時間でモニタリング出来ることである。遺伝子の発現パターンを発光画像としてリアルタイムに取得できるため、細胞を用いた遺伝子発現アッセイ系の幅広い研究対象に応用できると期待されている技術である。基本的な測定系の構成は、培養装置部に隣接した光学系を試料観察部とし、そこでの発光を対物レンズ(NA０．７５、好ましくはNA０．７５以上)および光学フィルタを通してデジタルカメラで捉えた後、デジタル画像取り込み用のパソコンでデータの記録と解析を行うようになっている。培養装置部はヒートプレートおよびチャンバーにより保温、保湿することができる。培養装置部内の温度は25−37℃に設定して試料を観察する。好ましくは37℃に設定して試料を観察する。湿度は０〜１００％に設定して観察する。好ましくは６０〜１００％に設定する。 さらに、発光の光学イメージングを行なったときと同視野において明視野による画像を取得し、画像解析ソフト等で発光画像と明視野画像を重ね合わせることによって、発光している細胞を同定することができる。 Next, the configuration, form, and operation of the light emission microscope used in the present invention will be described. The basic feature of the luminescence microscope is that light emitted from the photoprotein expressed in the cells in the microscope field can be monitored in a short time by imaging with a digital camera through the objective lens (NA0.75) and optical filter. That is. Since a gene expression pattern can be obtained in real time as a luminescence image, it is a technology that is expected to be applicable to a wide range of research subjects in gene expression assay systems using cells. The basic measurement system consists of a sample observation unit that is an optical system adjacent to the culture apparatus unit, and the light emitted from the optical system is captured by a digital camera through an objective lens (NA 0.75, preferably NA 0.75 or more) and an optical filter. Later, data recording and analysis are performed on a digital image capturing personal computer. The culture apparatus part can be kept warm and moisturized by a heat plate and a chamber. The temperature in the culture apparatus is set to 25-37 ° C and the sample is observed. The sample is preferably observed at 37 ° C. The humidity is set to 0 to 100% and observed. Preferably, it is set to 60 to 100%. Furthermore, by acquiring a bright-field image in the same field as when optical luminescence imaging was performed, and superimposing the light-emission image and the bright-field image with image analysis software or the like, it is possible to identify the cells that emit light. .
本発明の方法および装置は、以下に説明するような態様への応用が有用である。
技術分野
この態様は、本発明において、タンパク質の細胞外への分泌または、細胞表面への発現を解析する方法に関する。より具体的には、発光顕微鏡などを用いた解析法で、疎水性アミノ酸に富む配列から予測したシグナルペプチドや膜貫通ドメインをルシフェラーゼを用いた融合タンパク質コードする遺伝子をレポーターとし、細胞の表面に発現させルシフェラーゼ活性を検出する方法に関する。
The method and apparatus of the present invention are useful for application to the embodiments described below.
TECHNICAL FIELD This aspect relates to a method for analyzing secretion of a protein to the outside of the cell or expression on the cell surface in the present invention. More specifically, a signal peptide predicted from a sequence rich in hydrophobic amino acids or a gene encoding a transmembrane domain encoding a fusion protein using luciferase is expressed on the surface of a cell by an analysis method using a light emission microscope or the like. And a method for detecting luciferase activity.
背景となる技術
ヒトを含め多細胞動物では、個体の構築・維持のための細胞間コミュニケーションや細胞外環境造成が必要である。そのために、細胞は莫大な種類のタンパク質を、小胞体-ゴルジ装置という細胞内小器官を介して細胞外に分泌する。例えばホルモンなどの分泌型水溶性タンパク質は細胞膜を通り抜けて細胞外に分泌されるし、膜タンパク質は細胞膜などの適切な膜に組み込まれる。分泌タンパク質は、N末端に「分泌シグナルペプチド」と呼ばれる配列を持っている。シグナルペプチドは、細胞質のリボソームで最初に翻訳されるや否や、これを認識する分子群によって、小胞体の膜のチャンネル（穴）に挿入され、続いて合成されるタンパク質本体部分を通過させつつ、自身は切断、破棄される。シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸に富む配列であり、これを高確率で予測できるプログラムがある。
Background technology Multicellular animals, including humans, require cell-to-cell communication and the creation of an extracellular environment for individual construction and maintenance. For this purpose, cells secrete a huge variety of proteins out of the cell through an organelle called the endoplasmic reticulum-Golgi apparatus. For example, secretory water-soluble proteins such as hormones are secreted outside the cell through the cell membrane, and the membrane protein is incorporated into an appropriate membrane such as a cell membrane. Secreted proteins have a sequence called “secreted signal peptide” at the N-terminus. As soon as the signal peptide is first translated in the cytoplasmic ribosome, it is inserted into a channel (hole) in the membrane of the endoplasmic reticulum by a group of molecules that recognize it, and then passes through the protein body part that is synthesized, It is disconnected and destroyed. The signal peptide is a sequence rich in hydrophobic amino acids, and there is a program that can predict this with high probability.
例えば、任意のアミノ酸配列に対してシグナルペプチドの有無とその領域を判別する技術がある。その判別アルゴリズムの概要は、各アミノ酸に固有の疎水性指標・負電荷指標を用いて、入力されたアミノ酸配列のなかのある閾値を越えて平均疎水性値が高く、かつ負電荷残基を含まない領域を探索し、それらのうち最もN末端に近い領域をシグナルペプチドの候補領域とする。次に、候補領域のうち平均疎水性値が最大の位置、ここからN末端側に直近の正電荷残基の位置(ない場合はN末端)を用いて、シグナルペプチドの判別領域を設定する。この判別領域は、候補領域とは一致しない場合が多い。判別領域を構成するアミノ酸に、新規に発明したシグナルペプチド判別のための2つの指標SS-index、SP-indexを割り振る。これらの値と候補領域の位置情報とを考慮に入れた判別式から、候補領域がシグナルペプチドであるか否かを判別する。また、SOSUIsignalという予測プログラムは、３つのドメイン構造のアミノ酸配列に見られる物理化学的特徴に着目したもので、その予測システムは、疎水性の高いセグメント検出、シグナルアンカーを含むシグナル配列の予測、シグナルアンカーとシグナルペプチドの判別という３つのモジュールからなる。
これら、シグナルペプチドを検出することで、(1) プロテオーム情報解析、ゲノム計画の進展により明らかになった、新規な遺伝子・タンパク質の機能推定、(2) バイオインフォマティクス・コンピュータを用いた大量の生物情報の処理、(3) ゲノム創薬、シグナルペプチドを用いた、リゾチームやホルモン剤などのタンパク質製剤の生産技術向上 といった用途の利用がある。
For example, there is a technique for discriminating the presence and the region of a signal peptide with respect to an arbitrary amino acid sequence. The outline of the discrimination algorithm is that the average hydrophobicity value exceeds a certain threshold in the input amino acid sequence and includes negatively charged residues using the hydrophobicity index and negative charge index unique to each amino acid. A region that is not present is searched, and the region closest to the N-terminal is used as a candidate region for the signal peptide. Next, the discrimination region of the signal peptide is set using the position having the maximum average hydrophobicity value in the candidate region, and the position of the positively charged residue closest to the N-terminal side (N-terminal in the absence). This discrimination area often does not match the candidate area. Two indices SS-index and SP-index for discriminating the newly invented signal peptide are allocated to amino acids constituting the discrimination region. Whether or not the candidate region is a signal peptide is determined from a discriminant that takes these values and position information of the candidate region into consideration. The SOSUIsignal prediction program focuses on the physicochemical characteristics found in the amino acid sequences of the three domain structures. Its prediction system detects highly hydrophobic segments, predicts signal sequences including signal anchors, signals It consists of three modules: discrimination between anchor and signal peptide.
By detecting these signal peptides, (1) analysis of proteome information, estimation of new gene / protein functions revealed by the progress of genome planning, and (2) a large amount of biological information using bioinformatics computers (3) Genome drug discovery, and use of signal peptides to improve production technology of protein preparations such as lysozyme and hormones.
また、生体防御においてサイトカインは免疫応答・炎症・造血反応などの生体防御などに重要な役割を果たしており、新たなサイトカインあるいは、サイトカイン様の生理活性タンパク質遺伝子を探索し、構造と機能の解明をすることは、疾患の原因解明や治療への応用からも非常に重要である。さらに培養上清中に目的タンパク質を分泌することができれば、精製を容易にすることができ、宿主細胞での組換え型タンパク質生産量を大幅に増大させることが可能となり、サイトカインをはじめとする種々の組換え型タンパク質製剤のコストダウンが実現するようになる。 In addition, cytokines play an important role in biological defenses such as immune responses, inflammation, and hematopoietic reactions, and search for new cytokines or cytokine-like bioactive protein genes to elucidate their structures and functions. This is also very important for elucidating the cause of the disease and applying it to treatment. Furthermore, if the target protein can be secreted into the culture supernatant, purification can be facilitated and the production of recombinant protein in the host cell can be greatly increased. The cost reduction of the recombinant protein preparation will be realized.
上記背景から生じる課題
これらのシグナルペプチドの予測や機能は、最終的に細胞を用いて検証する。従来の方法として、ジーントラップ法は、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を目的の細胞に導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された時のレポーター活性により内在性の遺伝子発現を同定するものである。例えば、レポーターは、β-balactosidase（β-gal）と（hygromycin (Hyg.) phosphotransferaseの融合遺伝子で、この遺伝子が翻訳されレポータータンパク質が合成され細胞内にとどまればβ-gal活性が発現してX-gal存在化に細胞質に青染される領域が出現するが、ER側に入るとその活性は失われる。レポータの上流に疎水性の膜貫通領域を組み込みβ-gal活性を指標にシグナル配列をコードする遺伝子を選択する。これらシグナル配列をターゲットとしたジーントラップ法により軟骨細胞に特異的な分泌型および膜表面タンパク質の同定が可能である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.92, pp.6592-6596）。しかしながら、シグナルペプチドが存在するとβ-balactosidase活性がなくなるため、フォールスポジティブが多くなりまた検出感度も良く無いといった問題点がある。
Issues arising from the above background The prediction and function of these signal peptides are finally verified using cells. As a conventional method, the gene trap method introduces a reporter gene lacking a promoter into a target cell and suppresses endogenous gene expression by the reporter activity when inserted downstream of the promoter activated on the chromosome. To identify. For example, the reporter is a fusion gene of β-balactosidase (β-gal) and (hygromycin (Hyg.) Phosphotransferase. When this gene is translated and the reporter protein is synthesized and stays in the cell, β-gal activity is expressed and X A region that is stained blue in the cytoplasm appears in the presence of -gal, but its activity is lost when entering the ER side, a hydrophobic transmembrane region is incorporated upstream of the reporter, and a signal sequence is defined using β-gal activity as an indicator. The gene to be encoded can be selected and the secretory type and membrane surface protein specific to chondrocytes can be identified by the gene trap method targeting these signal sequences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp.6592-6596) However, in the presence of a signal peptide, β-balactosidase activity is lost, so there are problems that false positives increase and detection sensitivity is not good.
また、蛍光タンパク質や、ルシフェラーゼなどの生物発光を用いた方法として、遺伝子をトランスフェクション後の培養上清を集め、その培養上清中の蛍光タンパク質の蛍光や、ルシフェラーゼ活性による発光を検出することで未知の分泌タンパク質の同定を行っている。しかしながら、培養上清を集めるため、感度が低くなりまたどの細胞から分泌されたかや、発現の強弱を細胞レベルで計測することが出来ないといった問題点があった。 In addition, as a method using bioluminescence such as fluorescent protein and luciferase, the culture supernatant after gene transfection is collected, and fluorescence of the fluorescent protein in the culture supernatant and luminescence due to luciferase activity are detected. We are identifying unknown secreted proteins. However, since the culture supernatant is collected, there is a problem that the sensitivity becomes low, the cell is secreted, and the intensity of expression cannot be measured at the cell level.
ここで、蛍光タンパク質を用いた従来技術では、励起光照射による細胞への光毒性について考慮されておらず、細胞を生存し続けられる状態で維持するという点について対応することが出来ない。よって、この点に着目し、励起光を照射する必要が無いため細胞に傷害が少ない、生物発光を用いた単一細胞での遺伝子発現解析方法を提供することが課題となる。また、蛍光タンパク質を用いた従来技術では、励起光自身や細胞内物質の自家蛍光によるバックグラウンドについて考慮されておらず、レポーター遺伝子が生ずるシグナルの量を高いS/N比で、定量的に決定するという点について対応することが出来ない。よって、励起光が必要なく比較的バックグランドが少ない発光タンパクを利用する、生物発光を用いた単一細胞での遺伝子発現解析方法を提供することも課題となる。 Here, in the prior art using a fluorescent protein, the phototoxicity to cells by irradiation with excitation light is not considered, and it is not possible to cope with the point of maintaining cells in a state where they can continue to survive. Therefore, paying attention to this point, it is an object to provide a method for analyzing gene expression in a single cell using bioluminescence, in which there is no need to irradiate excitation light, and thus there is little damage to cells. In addition, the conventional technology using fluorescent proteins does not consider the background of excitation light itself or autofluorescence of intracellular substances, and quantitatively determines the amount of signal generated by the reporter gene with a high S / N ratio. I cannot cope with the point of doing. Therefore, it is also an object to provide a method for analyzing gene expression in a single cell using bioluminescence, which uses a photoprotein that does not require excitation light and has a relatively low background.
また、免疫染色法による観察では、細胞を固定出来ず生細胞の状態で染色しなければならず、接着性の細胞では、プレートから細胞がはがれたり、洗浄操作が伴うため、時間と労力がかかるといった問題がある。
さらに、細胞表面への発現を観察するうえで、従来GFPなどに膜貫通ドメインを融合したタンパク質で観察する方法が試みられてきたが、細胞外へ発現したかの判断が困難である。また、フォールスポジティブが多いという問題がある。具体的にGFPのC末端にCD40の187アミノ酸からC末端までの膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をトランスフェクションした。この融合タンパク質を発現したHela細胞を4℃の環境で抗GFP抗体(sigma)と2次抗体として抗mouse-IgG-Cy3 (sigma)で免疫染色し、観察した。免疫染色でシグナルペプチドが無いのに細胞表面に発現している細胞が観察される（図２参照）。
In addition, in the observation by immunostaining method, the cells cannot be fixed and must be stained in the state of living cells, and in the case of adhesive cells, it takes time and labor because the cells are peeled off from the plate or accompanied by a washing operation. There is a problem.
Furthermore, when observing the expression on the cell surface, a method of observing with a protein in which a transmembrane domain is fused to GFP or the like has been attempted, but it is difficult to determine whether it is expressed outside the cell. There is also a problem that there are many false positives. Specifically, a fusion protein containing a transmembrane domain from 187 amino acids to the C terminus of CD40 was transfected into the C terminus of GFP. Hela cells expressing this fusion protein were immunostained with an anti-GFP antibody (sigma) and anti-mouse-IgG-Cy3 (sigma) as a secondary antibody in an environment at 4 ° C. and observed. Cells that are expressed on the cell surface are observed in the absence of signal peptide by immunostaining ( see FIG. 2 ).
さらに、発光タンパク質を用いた従来技術では、レポーター遺伝子が生ずるシグナルを単一細胞において観察することについて考慮されておらず、レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを光学イメージングするという点について対応することが出来ない。よって、この点に着目し、レポーター遺伝子が生ずるシグナルを発している細胞が同定出来るように発光顕微鏡で撮像する、生物発光を用いた単一細胞での遺伝子発現解析方法を提供することも課題となる。 Furthermore, in the prior art using a photoprotein, it is not considered to observe a signal generated by a reporter gene in a single cell, and it is possible to cope with optical imaging of a detectable signal generated by a reporter gene. I can't. Therefore, focusing on this point, it is also an object to provide a method for analyzing gene expression in a single cell using bioluminescence, in which imaging is performed with a luminescence microscope so that cells emitting a signal generated by a reporter gene can be identified. Become.
上記課題を解決する手段と作用効果について
１．従来技術では上記のように、シグナルペプチド検出に関連した従来の分析方法は何れも、 β-balactosidase活性を用いる方法では細胞１つずつのシグナルペプチドの有無を観察することが出来るが、小胞体内にターゲティングされているのは解るが細胞外へ放出されるかどうかは直接解らないし β-balactosidase活性を指標にしているため感度が低いといった問題点がある。また、細胞からGFPやルシフェリンの分泌された培養上清を測定する方法では、直接細胞を観察出来ず測定する培養液全体の情報しか解らず感度を上げるためには、培養上清を濃縮しなければならないといった問題点がある。
Means and effects for solving the above problems In the prior art, as described above, any of the conventional analysis methods related to signal peptide detection can observe the presence or absence of a signal peptide for each cell in the method using β-balactosidase activity. However, it is not directly known whether it is released to the outside of the cell, and it has the problem of low sensitivity because it uses β-balactosidase activity as an index. In addition, in the method of measuring the culture supernatant in which GFP or luciferin is secreted from the cells, the culture supernatant must be concentrated in order to increase the sensitivity because it is not possible to directly observe the cells and only the information of the whole culture medium to be measured can be obtained. There is a problem that must be.
本発明は、細胞外への分泌などの測定にレポーターを細胞外の膜に留めることで高感度に検出することが可能である。すなわち生物発光を観察する遺伝子例えばルシフェラーゼで基質が細胞内にほとんど入らない物を用い、解析したいシグナルペプチドのC末へつなげ、さらにそのC末に細胞表面にとどまる既知のタンパク質をつなげたレポーター遺伝子を構築し、発光顕微鏡で観察することでシグナルペプチドの作用を高感度に個々の情報を得ることが可能である。 In the present invention, it is possible to detect with high sensitivity by retaining the reporter on the extracellular membrane for measurement of secretion to the outside of the cell. In other words, a gene that observes bioluminescence, such as a luciferase that has almost no substrate in the cell, is connected to the C terminus of the signal peptide to be analyzed, and a reporter gene that is connected to a known protein that remains on the cell surface at the C terminus. By constructing and observing with a light emission microscope, it is possible to obtain individual information with high sensitivity to the action of the signal peptide.
GPIアンカーの生合成については、次のように要約される。第一段階はUDP-/ N/-アセチルグルコサミンからホスファチジルイノシトールへの、/ N/-アセチルグルコサミンの転移である。生成物である/N/-アセチルグルコサミン-ホスファチジルイノシトールは次に脱アセチル化され、グルコサミ ン-ホスファチジルイノシトールが生成する。この反応によって、GPIに非常に特異的なアセチル化されていないグルコサミンが生成される。 哺乳動物細胞のGPIアンカー生合成変異株の研究により、グルコサミン-ホスファチジルイノシトールの生合成には、少なくとも三つの遺伝子が含まれることが示された。 コア構造として保存される三つのマンノースの鎖を形成するマンノースの付加は、GDP-マンノースから活 性化されたマンノースのドリコールマンノースリン酸への転移による、疎水性のドナーの形成によって起こる。 次に、エタノールアミンリン酸が3番目(コアグリカンの還元末端から数えて)のマンノースに、疎水 的ドナーであるホスファチジルエタノールアミンによって付加され 、このようにして保存的なコアグリカンの生合成が完結する。 The biosynthesis of GPI anchors can be summarized as follows. The first step is the transfer of / N / -acetylglucosamine from UDP- / N / -acetylglucosamine to phosphatidylinositol. The product / N / -acetylglucosamine-phosphatidylinositol is then deacetylated to produce glucosamine-phosphatidylinositol. This reaction produces unacetylated glucosamine that is very specific for GPI. Studies of GPI-anchored biosynthetic mutants of mammalian cells have shown that glucosamine-phosphatidylinositol biosynthesis involves at least three genes. Addition of mannose, which forms three mannose chains conserved as a core structure, occurs by the formation of a hydrophobic donor by the transfer of GDP-mannose to activated mannose to dolichol mannose phosphate. Next, ethanolamine phosphate is added to the third mannose (counted from the reducing end of the core glycan) by the hydrophobic donor phosphatidylethanolamine, thus completing the conservative core glycan biosynthesis.
小胞体の内腔側で起こるトランスアミダーゼ反応は、タンパク質が小胞体膜の適切な位置に挿入されるとすぐに開始される。前駆体タンパク鎖が小胞体膜を貫通することが、続いて起こるGPIアンカー化に必要で ある。この反応それ自身はタンパク質のC末端が切断され、エタノールアミンリン酸のアミノ基を介して、GPIア ンカーによって置換されるアミノ基転移タイプの反応である。GPIアンカー化されるタンパク質は、小胞体の内腔側にあるGPI-トランスアミダーゼと相互作用する。この酵素は、C末端側に伸びている疎水的なアミノ酸 鎖を認識する。このアミノ酸鎖は一時的に膜貫通領域として働くと仮定され、このアミノ酸鎖のトランスアミダーゼによる切断で 生じた新たなC末端アミノ酸に、あらかじめ生成されていたGPIアンカーが付着する。 The transamidase reaction that occurs on the luminal side of the endoplasmic reticulum is initiated as soon as the protein is inserted into the appropriate location in the endoplasmic reticulum membrane. It is necessary for the subsequent GPI anchoring that the precursor protein chain penetrates the endoplasmic reticulum membrane. This reaction itself is a transamination type reaction in which the C-terminal of the protein is cleaved and replaced by a GPI anchor through the amino group of ethanolamine phosphate. GPI-anchored proteins interact with GPI-transamidase on the lumen side of the endoplasmic reticulum. This enzyme recognizes a hydrophobic amino acid chain extending to the C-terminal side. This amino acid chain is assumed to temporarily function as a transmembrane region, and a previously generated GPI anchor is attached to a new C-terminal amino acid generated by transamidase cleavage of this amino acid chain.
タンパク質が結合したGPIの最も明らかとなっている機能は、通常細胞外環境に向かう形で細胞膜の外側に、膜に対して安定 した構造で特定のタンパク質を局在化させることである。このことは、なぜこのタンパク質が、膜貫通領域を介してつなぎ止めら れるタンパク質とは異なり、GPIアンカー化されているのかという一般的な理由であろう。GPIアンカー化されることによる主な 利点の一つは、細胞外部への機能を有する表面タンパク質の、細胞質からの物理的隔離であり、これによって細胞内部を保護する ことである。GPIは、膜貫通型タンパク 質では考えられないような極端に高い密度で表面分子を集合することを可能とし、このことによって敵対する環境からの完全な隔離を可能にしている。このような細胞表面にとどまる既知のタンパク質をGPIアンカー型を用いることで特異性を上げることが可能となる。 The most obvious function of a protein-bound GPI is to localize a specific protein with a stable structure to the membrane, usually on the outside of the cell membrane, in the direction of the extracellular environment. This may be a general reason why this protein is GPI-anchored, unlike proteins that are tethered via the transmembrane domain. One of the main advantages of being GPI anchored is the physical sequestration of the surface protein that functions outside the cell from the cytoplasm, thereby protecting the inside of the cell. GPI makes it possible to assemble surface molecules at an extremely high density that is unthinkable for transmembrane proteins, thereby allowing complete isolation from the hostile environment. Specificity can be increased by using a GPI anchor type for such a known protein remaining on the cell surface.
また、既知のシグナルペプチドのC末へつなげ、さらにそのC末に解析したい細胞表面にとどまるタンパク質をつなげたレポーター遺伝子を構築し、発光顕微鏡で観察することで膜貫通ドメインやGPIアンカー型の作用を高感度に個々の情報を得ることが可能である。
細胞個々の情報を高感度に観察することが可能なため、同一容器内で異なるシグナルペプチドや膜貫通ドメインかどうかを同時に解析出来、試料の必要量の低減、反応容器数の低減が可能で検査の簡便化出来る。
In addition, a reporter gene that connects to the C terminus of a known signal peptide, and a protein that remains on the cell surface to be analyzed is constructed at the C terminus, and the action of the transmembrane domain and GPI anchor type is observed by observing with a light emission microscope. It is possible to obtain individual information with high sensitivity.
Since it is possible to observe individual cell information with high sensitivity, it is possible to simultaneously analyze whether different signal peptides or transmembrane domains in the same container, and it is possible to reduce the required amount of sample and the number of reaction containers. Can be simplified.
実施の態様
ウミシイタケのLuciferase遺伝子のN末にラットのneurotrophin-3 (NT-3)のシグナルペプチド部分- MSILFYVIFLAYLRGI- をつなげたもの（sig pep-Luci-GPI）とつなげないもの（Luci-GPI）にそれぞれC末端にヒトThy-1 のN末端から117（Ser）-161番（Leu）の部分をつなげた融合タンパク質を発現する遺伝子を構築した。
まず、トランスフェクション前日、35mmのカルチャーディシュに5x105 cells/mlの濃度で2ml（10% FBSを含むD-MEM培地）まき、5% CO2環境下37℃で培養した。翌日pDNA3.1発現ベクターにsig pep-Luci-GPIまたはLuci-GPI遺伝子を挿入したプラスミドをHela細胞にLipofectamine2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後24-48時間10% FBSを含むD-MEM培地で5% CO2環境下37℃で培養した。
Embodiments of the Renilla Luciferase gene with the N-terminal signal peptide portion of rat neurotrophin-3 (NT-3)-MSILFYVIFLAYLRGI- (sig pep-Luci-GPI) and the one not connected (Luci-GPI) Each gene was constructed to express a fusion protein in which 117 (Ser) -161 (Leu) was connected to the C-terminus from the N-terminus of human Thy-1.
First, the day before transfection, 2 ml (D-MEM medium containing 10% FBS) was seeded at a concentration of 5 × 10 5 cells / ml in a 35 mm culture dish and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. On the next day, a plasmid in which the sig pep-Luci-GPI or Luci-GPI gene was inserted into the pDNA3.1 expression vector was transfected into Hela cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 24 to 48 hours after transfection, the cells were cultured in D-MEM medium containing 10% FBS at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment.
計測は、細胞をHANKSで洗浄し、0.5mlのD-MEM培地にRenilla Luciferase Assay Substrate (100x) (Promega)を5μl加え、発光顕微鏡を用いて観察した（図３、図４参照）。測定条件は、明視野画像を撮像した後に、発光画像を露光時間５分、対物倍率20倍で撮像した。図３−１に示すように、明視野観察による画像（図の左側）に対応する発光観察した画像（図の右側）において、sig pep-Luci-GPIは有意な発光が認められた。これに対して、図４−１に示すように、明視野観察による画像（図の左側）に対応する発光観察した画像（図の右側）において、シグナルペプチドの無いLuci-GPIは、ほとんど発光が認められなかった。 Measurement, cells were washed with HANKS, added 5μl of D-MEM medium Renilla Luciferase Assay Substrate (100x) ( Promega) in 0.5 ml, were observed with a light emission microscope (see FIG. 3, FIG. 4). The measurement conditions were that after taking a bright field image, a luminescence image was taken with an exposure time of 5 minutes and an objective magnification of 20 times. As shown in FIG. 3A, sig pep-Luci-GPI showed significant luminescence in the image observed on the luminescence (right side of the figure) corresponding to the bright field observation image (left side of the figure). On the other hand, as shown in FIG. 4-1, in the observed image (right side) of the light emission corresponding to the bright field image (left side), Luci-GPI without the signal peptide emits almost no light. I was not able to admit.
遺伝子の発現は、Renilla Luciferase Assay System (Promega)のプロとコールに従い、細胞を溶解してLuminescencer-JNRII (ATTO)ルミノメーターで測定した（図４参照）。測定時間は10秒間で、sig pep-Luci-GPI、Luci-GPIともに、発光が測定されルシフェラーゼの発現に問題が無いことを確認した。 The expression of the gene was measured with a Luminescencer-JNRII (ATTO) luminometer after lysis of the cells in accordance with Renilla Luciferase Assay System (Promega) Pro and Cole ( see FIG. 4 ). The measurement time was 10 seconds, and luminescence was measured for both sig pep-Luci-GPI and Luci-GPI, and it was confirmed that there was no problem in the expression of luciferase.
A．語句の定義
＜レポーター遺伝子＞
本発明におけるレポーター遺伝子は、検出可能な蛍光を発するレポータータンパク質をコードする遺伝子を意味する。例えば、蛍もしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼを挙げることができる。さらには、例えば、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
A. Definition of words <reporter gene>
The reporter gene in the present invention means a gene encoding a reporter protein that emits detectable fluorescence. For example, luciferase derived from firefly or Renilla can be mentioned. Furthermore, the gene which codes (beta) galactosidase and the gene which codes alkaline phosphatase can be mentioned, for example.
＜刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域＞
本発明におけるプロモーター領域としては、最初期遺伝子のプロモーターが挙げられる。
本発明で用いられる最初期遺伝子のプロモーターとしては、例えば、c-fosプロモーター領域が挙げられる。また、本発明で用いられるプロモーターとしては、前記プロモーターの任意の動物種の対応物も含まれる。ここでプロモーター領域とは、プロモーター活性を有するために必要な最小の塩基配列を含む任意の領域を意味する。例えば、該遺伝子の転写部位に対して上流500から2000塩基の領域の一部または全部を用いることができる。
<Promoter region of a gene whose expression is induced by stimulation>
Examples of the promoter region in the present invention include an early gene promoter.
Examples of the promoter of the early gene used in the present invention include the c-fos promoter region. In addition, the promoter used in the present invention includes a counterpart of any animal species of the promoter. Here, the promoter region means an arbitrary region containing the minimum base sequence necessary for having promoter activity. For example, a part or all of the region of 500 to 2000 bases upstream from the transcription site of the gene can be used.
＜物質＞
下記に説明する発明において使用される「物質」とは、自然界に存在する天然の物質あるいは人工的に調製される任意の物質を意味する。具体的には、例えば、化学的に合成された任意の化合物を挙げることができる。該化合物の種類および分子量などについては特に限定されない。該物質がタンパク質、またはペプチドである場合には、生体組織や細胞から単離されるもの、および遺伝子組換えや化学的合成により調製されるものも含まれる。さらにまた、それらの化学修飾体も含まれる。
<Substance>
The “substance” used in the invention described below means a natural substance existing in nature or any substance prepared artificially. Specifically, for example, any compound synthesized chemically can be mentioned. The type and molecular weight of the compound are not particularly limited. When the substance is a protein or peptide, those isolated from living tissues and cells and those prepared by genetic recombination or chemical synthesis are also included. Furthermore, those chemical modifications are also included.
＜遺伝子発現ベクターの作製＞
動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、目的のタンパク質をコードするDNA、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、該タンパク質をコードする遺伝子の5'側および3'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリA付加シグナル、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
<Production of gene expression vector>
When using animal cells, the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, DNA encoding the protein of interest, and a stop codon. Also includes DNA encoding signal peptide, enhancer sequence, 5 'and 3' untranslated regions of gene encoding the protein, splicing junction, poly A addition signal, selectable marker region or replicable unit, etc. You may go out.
＜細胞への遺伝子導入方法＞
遺伝子を細胞へ導入する方法としては、塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。本発明で使用される遺伝子導入した細胞には一過性発現細胞あるいは安定発現細胞のいずれもが含まれる。
<Gene transfer method into cells>
Examples of methods for introducing genes into cells include calcium chloride method or calcium chloride / rubidium chloride method, lipofection method, electroporation method and the like. The gene-introduced cells used in the present invention include both transiently expressing cells and stable expressing cells.
＜刺激による遺伝子発現の光学イメージング＞
本発明は例えば、下記のように実施することが出来る。
細胞の定数（例えば、該物質を細胞に接触させる刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、c-fos遺伝子のプロモーター領域）に発現可能に連結されたレポーター遺伝子（好ましくは蛍もしくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ）を前記の遺伝子導入方法を用いて細胞に導入する。得られた前記の遺伝子導入された細胞の定数（例えば、1〜1x109個、好ましくは1ｘ103〜1x106個）を所望の細胞培養が可能な器具（例えば、シャーレ、多数のウェルを有するマルチプレートなど）を用いて所望の栄養培地（例えば、D-MEM培地など）中で培養する。この定数の細胞からなる試料を、あらかじめ細胞にとって最適な温度（例えば、25〜37℃、好ましくは35〜37℃）に保温し、試料の乾燥を防ぐため水を注入して保湿した発光顕微鏡の培養装置部に設置し、該発光顕微鏡の試料観察部にある対物レンズを通してデジタルカメラで発光イメージを記録する。前記の試料に、細胞に接触させて刺激を行なうための物質（例えば、化合物）を所望の濃度（例えば、1pM〜１M、好ましくは100nM〜1mM）で加えて、所望の時間間隔（例えば5分間〜５時間、好ましくは10分間〜1時間）で発光イメージを記録する。記録した画像を市販の画像解析ソフト（例えば、MetaMorph；ユニバーサルイメージング社製など）を用いて画像内の所望の領域における輝度値を取得する。さらに、発光イメージと同視野において明視野イメージを記録し、前記の画像解析ソフトを用いて発光イメージと明視野イメージを重ね合わせて、発光している細胞を同定する。
<Optical imaging of gene expression by stimulation>
The present invention can be implemented, for example, as follows.
A reporter gene (preferably a firefly or a reporter gene) operably linked to a cell constant (for example, a promoter region of a gene whose expression is induced by stimulation with which the substance is brought into contact with the cell (preferably, the promoter region of the c-fos gene)) A luciferase derived from Renilla, etc. is introduced into a cell using the above-described gene introduction method, and constants (for example, 1 to 1 × 10 9 cells, preferably 1 × 10 3 to 1 × 10 6 cells) of the obtained cells into which the gene has been introduced are obtained. ) Is cultured in a desired nutrient medium (eg, D-MEM medium) using an apparatus capable of culturing the desired cell (eg, petri dish, multi-plate having a large number of wells, etc.) In advance, keep the sample at a temperature optimal for the cells (for example, 25 to 37 ° C, preferably 35 to 37 ° C), and inject water to prevent the sample from drying. A luminescence image is recorded by a digital camera through an objective lens in a sample observation section of the luminescence microscope, and a substance for stimulating the sample by contacting the cell (for example, , Compound) at a desired concentration (eg, 1 pM to 1 M, preferably 100 nM to 1 mM), and recording a luminescent image at a desired time interval (eg, 5 minutes to 5 hours, preferably 10 minutes to 1 hour). The brightness value in the desired area in the image is acquired using commercially available image analysis software (for example, MetaMorph; manufactured by Universal Imaging Co., Ltd.), and the bright field image is recorded in the same field of view as the emission image. Then, the light emitting image and the bright field image are superimposed using the image analysis software to identify the light emitting cells.
＜光学イメージング＞
本発明における光学イメージングとは、レポーター遺伝子を導入した細胞において、レポーター遺伝子により発せられる検出可能なシグナルの存在、不在または強度をモニタリング、記録および分析するイメージング方法を意味する。光学イメージングを達成するためには、レポーター遺伝子により発せられるシグナルの強度が、シグナルを細胞の外部から分析することができるように、十分に高くなくてはならない。光学イメージングは自動化に容易に適用可能であることから、多数の遺伝子発現を同時にモニタリングするのに用いることができる。なお、イメージングした試料画像の任意の位置について、時系列に２次元または３次元に画像情報を処理する技術は、本出願人による特願２００４−１７２１５６、特願２００４−１７８２５４等を参照してもよい。蛍光観察と発光観察における時系列な画像取得の違いは、発光観察が励起光による光学的走査（レーザスキャン）を必要としない点で余計な光による影響が無い点にある。本発明で行うイメージング技術によれば、リアルタイムに発光画像を撮像できる。本発明の方法では特に、上述したような発光顕微鏡を使用することにより、発光画像による解析を実現することが可能となった。
<Optical imaging>
Optical imaging in the present invention means an imaging method for monitoring, recording and analyzing the presence, absence or intensity of a detectable signal emitted by a reporter gene in a cell into which the reporter gene has been introduced. In order to achieve optical imaging, the intensity of the signal emitted by the reporter gene must be high enough so that the signal can be analyzed from outside the cell. Since optical imaging is readily applicable to automation, it can be used to monitor multiple gene expressions simultaneously. Note that the technology for processing image information two-dimensionally or three-dimensionally at an arbitrary position of an imaged sample image can also be referred to Japanese Patent Application Nos. 2004-172156 and 2004-178254 by the present applicant. Good. The difference between time-series image acquisition in fluorescence observation and light emission observation is that there is no influence of extra light because light emission observation does not require optical scanning (laser scan) with excitation light. According to the imaging technique performed in the present invention, a luminescent image can be captured in real time. In particular, in the method of the present invention, it is possible to realize analysis based on a luminescence image by using the luminescence microscope as described above.
付記項１
疎水性アミノ酸に富む配列から予測したシグナルペプチドを検出する方法であって、N末から開始コドン、解析対象のシグナルペプチド、発光関連遺伝子、既知の膜貫通ドメイン、終止コドンの順でタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物であって、ＤＮＡ構築物を検査用細胞に遺伝子導入し、コードする遺伝子が転写・翻訳されタンパク分子が細胞外の表面にとどまる行程と、
細胞表面に発現したタンパク分子の発光活性を発光顕微鏡で検出する行程と、測定結果を解析する行程と、上記の反応を生じせしめる反応溶液及び反応容器と、これらの細胞を観察し解析し細胞の情報からシグナルペプチドを決定することの出来る方法を具備した方法。
付記項２
疎水性アミノ酸に富む配列から予測した膜貫通ドメインを検出する方法であって、N末から開始コドン、既知のシグナルペプチド、発光関連遺伝子、解析対象の膜貫通ドメイン、終止コドンの順でタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物であって、ＤＮＡ構築物を検査用細胞に遺伝子導入し、コードする遺伝子が転写・翻訳されタンパク分子が細胞外の表面にとどまる行程と、
細胞表面に発現したタンパク分子の発光活性を発光顕微鏡で検出する行程と、測定結果を解析する行程と、上記の反応を生じせしめる反応溶液及び反応容器と、これらの細胞を観察し解析し細胞の情報から膜貫通ドメインを決定することの出来る方法を具備した方法。
付記項３
上記１の方法において、少なくとも一つのシグナルペプチドの塩基配列が異なるＤＮＡ構築物が含まれたDNA構築物を同時に導入した細胞を同一容器に培養し、同一容器内で他種類の発光活性を同時に解析する方法。
付記項４
上記１の方法において、細胞表面への発現にGPIアンカー型を用いることで膜貫通ドメインによる擬陽性を開眼することをを可能にした検出法。
付記項５
上記１または２の方法において基質が細胞内へ入りづらい物を用いることで、細胞内と細胞外に発現したレポーター分子を識別することを可能とした検出法。
付記項６
上記方法におけるシグナルシーケンスまたは、膜貫通ドメインのスクリーニング法。
付記項７
上記方法における分泌量を検出する方法。
Additional Item 1
A method of detecting a signal peptide predicted from a sequence rich in hydrophobic amino acids, encoding a protein in the order of N-terminal to start codon, signal peptide to be analyzed, luminescence-related gene, known transmembrane domain, and stop codon. A process in which the DNA construct is introduced into a test cell, the encoded gene is transcribed and translated, and the protein molecule remains on the extracellular surface;
The process of detecting the luminescence activity of protein molecules expressed on the cell surface with a luminescence microscope, the process of analyzing the measurement results, the reaction solution and the reaction vessel that cause the above reaction, and observing and analyzing these cells A method comprising a method capable of determining a signal peptide from information.
Additional Item 2
A method for detecting a transmembrane domain predicted from a sequence rich in hydrophobic amino acids, encoding a protein in the order of N-terminal to start codon, known signal peptide, luminescence-related gene, transmembrane domain to be analyzed, and stop codon A process in which the DNA construct is introduced into a test cell, the encoded gene is transcribed and translated, and the protein molecule remains on the extracellular surface;
The process of detecting the luminescence activity of protein molecules expressed on the cell surface with a luminescence microscope, the process of analyzing the measurement results, the reaction solution and the reaction vessel that cause the above reaction, and observing and analyzing these cells A method comprising a method capable of determining a transmembrane domain from information.
Additional Item 3
A method of culturing cells simultaneously introduced with a DNA construct containing a DNA construct having a different base sequence of at least one signal peptide in the same container in the above method 1, and simultaneously analyzing other types of luminescent activity in the same container .
Additional Item 4
The detection method according to the method 1, wherein the GPI anchor type is used for expression on the cell surface, thereby making it possible to open a false positive due to a transmembrane domain.
Additional Item 5
Detection substrate by using things difficult to enter into cells, which made it possible to identify a reporter molecule expressed intracellular and extracellular in the method of the above 1 or 2.
Additional Item 6
The signal sequence in the said method or the screening method of a transmembrane domain.
Additional Item 7
A method for detecting the amount of secretion in the above method.
１：サンプル
２：対物レンズ
３：集光レンズ
４：ＣＣＤカメラ
５：モニタ
６：ズームレンズ
1: Sample 2: Objective lens 3: Condensing lens 4: CCD camera 5: Monitor 6: Zoom lens
Claims (13)
前記試料に前記刺激用物質を接触させて刺激を行なう工程と、刺激に応答した細胞において発現した前記のレポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを前記撮像手段により光学イメージングするとともに、前記レポーター遺伝子が生ずるシグナルの量を定量的に決定する光学的処理工程とを備え、
前記光学的処理工程が微弱光を画像解析可能な画像を生成する工程をさらに有することを特徴とする微弱光解析方法。 In the imaging field of the imaging means, a sample containing a cell into which a DNA structure encoding a protein in the order of N-terminal initiation codon, signal peptide to be analyzed, luminescence-related gene, known transmembrane domain, and termination codon has been introduced. Arranging, and
Stimulating the sample by bringing the stimulating substance into contact with the sample, and optically imaging the detectable signal generated by the reporter gene expressed in the cells in response to the stimulation by the imaging means, and generating the reporter gene An optical processing step to quantitatively determine the amount of signal,
The weak light analysis method, wherein the optical processing step further includes a step of generating an image capable of image analysis of weak light.
The method to detect the secretion amount in the method in any one of Claim 1 to 10.
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