JP5534200B2 - 薬剤評価方法 - Google Patents
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Description
〔定義〕
本発明において、「体毛」とはヒト及び動物における各種の体毛を包含する概念であり、体毛を単に「毛」ということもある。「毛髪」とは、いわゆる頭髪、即ち、頭部における顔面部以外の部分に生える体毛をいう。ヒトの体毛として、毛髪、口髭、顎鬚、眉毛、睫毛の他に、腕・脚・胸に生える毛を好ましく例示することができる。毛髪、口髭、顎鬚、眉毛、睫毛を更に好ましく例示することができ、毛髪、口髭、顎鬚を特に好ましく例示することができる。
上記課題を解決するための本願第1発明の構成は、体毛の白毛割合が経時変化する白髪モデル動物に供試薬剤を適用し、前記白髪モデル動物の白毛評価によって前記供試薬剤の白毛制御効果を評価する方法であって、
前記白毛評価を以下(a)〜(c)のいずれか1以上の評価指標に基づいて行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第2発明の構成は、前記第1発明に係る薬剤評価方法において、(a)の測色値が、L*a*b*表色系の明度指数L*の測色値である、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第3発明の構成は、前記第1発明又は第2発明に係る薬剤評価方法において、(b)の体毛発生部分の皮膚組織の観察結果が、毛胞部分の色素細胞生産組織における色素幹細胞数である、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第4発明の構成は、前記第3発明に係る薬剤評価方法において、色素幹細胞数を計数するに当たり、白髪モデル動物の皮膚組織を採取し、c−kitとdctの二重染色により免疫組織染色し、以下(1)〜(3)の全ての条件を満たす細胞を色素幹細胞と認定する、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第5発明の構成は、前記第3発明又は第4発明に係る薬剤評価方法において、明度指数L*の測色値を、この測色値と第3発明又は第4発明に記載の色素幹細胞数の計数値との相関に基づいて色素幹細胞数に換算し、この色素幹細胞数の換算値を評価指標として白毛評価を行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第6発明の構成は、前記第3発明又は第4発明に係る薬剤評価方法において、一定数の体毛の内の白毛の比率を視覚的観察により計数して得られる白毛率を、この白毛率と第3発明又は第4発明に記載の色素幹細胞数の計数値との相関に基づいて色素幹細胞数に換算し、この色素幹細胞数の換算値を評価指標として白毛評価を行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第7発明の構成は、前記第2発明〜第6発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、明度指数L*の測色値を、この測色値と第1発明の(c)に記載のメラニン量測定値との相関に基づいてメラニン量に換算し、このメラニン量の換算値を評価指標として白毛評価を行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第8発明の構成は、前記第6発明又は第7発明に係る薬剤評価方法において、明度指数L*の測色値を、この測色値と白毛率との相関に基づいて白毛率に換算し、この白毛率の換算値を評価指標として白毛評価を行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第9発明の構成は、前記第5発明〜第8発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、ファクターAとしての測色値あるいは白毛率と、ファクターBとしての色素幹細胞数、メラニン量あるいは白毛率との関係(ファクターA、ファクターBが共に白毛率である場合を除く)を表す一次回帰直線を予め作成し、これらの一次回帰直線を用いて、前記換算値をファクターAからファクターBへの換算として求める、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第10発明の構成は、前記第1発明〜第9発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、薬剤評価方法が、
(イ)毛周期(体毛サイクル)が休止期間中の白髪モデル動物の体毛の白毛評価を行う段階と、
(ロ)白髪モデル動物の体毛を除去する段階と、
(ハ)白髪モデル動物に対し、供試薬剤を1回以上適用する段階と、
(ニ)供試薬剤の適用後に発毛した時点で白毛評価を行う段階と、
を含む、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第11発明の構成は、前記第10発明に係る薬剤評価方法において、(イ)の段階を経た白髪モデル動物に対して、(ロ)〜(ニ)の段階からなるサイクルを複数サイクル行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第12発明の構成は、前記第10発明又は第11発明に係る薬剤評価方法において、薬剤の白毛制御効果の評価を、(イ)の段階で得られた白毛評価の評価指標と、(ロ)〜(ニ)の段階からなるサイクルを1サイクル又は複数サイクル行う場合における(ニ)の段階で得られた白毛評価の評価指標との比較によって行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第13発明の構成は、前記第1発明〜第12発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、白髪モデル動物に対する供試薬剤の適用を、白髪モデル動物の皮膚への塗布、皮下注射、皮内注射、吸入投与及び経口投与から選ばれる一つ以上の形態で行う、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第14発明の構成は、前記第1発明〜第13発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、供試薬剤の白毛制御効果の評価が、該供試薬剤の白毛抑制効果を評価するものである、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第15発明の構成は、前記第1発明〜第13発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、供試薬剤の白毛制御効果の評価が、該供試薬剤の白毛促進効果を評価するものである、薬剤評価方法である。
上記課題を解決するための本願第16発明の構成は、前記第1発明〜第15発明のいずれかに係る薬剤評価方法において、白髪モデル動物がマウスである、薬剤評価方法である。
本発明に係る薬剤評価方法は、白髪モデル動物に供試薬剤を適用し、その白髪モデル動物における白毛評価によって前記供試薬剤の白毛制御効果を評価する方法である。
白髪モデル動物は、ヒト以外の動物であって、体毛の白毛割合が経時変化するという表現型を持つ各種のモデル動物中から任意に選択することができるが、より好ましくは体毛の白毛化現象についてヒトとの共通性が大きい哺乳動物であり、更に好ましくは、小型、体毛サイクルの適切さ、管理の容易さ等の点からラット、マウス等の齧歯目動物であり、とりわけ好ましくはマウスである。
白髪モデル動物に適用する供試薬剤の種類は限定されない。供試薬剤の剤型も限定されず、供試薬剤のみからなり又はこれを主成分として含む液剤、粉剤、錠剤等を、そのまま、あるいは餌料等に混合して用いることができる。
本発明において、薬剤評価方法の評価項目は白毛制御効果である。「白毛制御効果」とは、白毛抑制効果と白毛促進効果とを含む。「白毛抑制効果」とは、体毛の白毛化を予防し、既に生じた白毛化の一層の進行を抑制又は停止させ、あるいは更に既に生じた白毛を黒毛化させる効果をいう。「白毛促進効果」とは、体毛の白毛化を誘発し、又は既に生じた白毛化を一層進行させる効果をいう。
薬剤評価方法における薬剤評価の具体的なスケジュールは、少なくとも、白髪モデル動物に対して供試薬剤を適用する段階と、供試薬剤の適用後に白髪モデル動物の体毛について白毛評価を行う段階とが含まれる限りにおいて、限定されない。
本発明においては、白髪モデル動物の白毛評価を、以下(a)〜(c)のいずれかの評価指標に基づき、又はこれらの内の二つ以上の評価指標に基づいて行う。
この評価指標は、白髪モデル動物の一定量の体毛を毛刈りして検体とし、この検体を綿塊状の束のままで、適宜な光学的測色系で測定して得られる数値化された指標である。
〔実施例1:薬剤評価のスケジュール〕
(白髪モデル動物)
白髪モデル動物として、PCT/JP2006/302783号に開示された公知の白髪モデルマウス(以下、単に「マウス」という)を使用した。このマウスは、詳細な説明は省くが、一定の遺伝子型を持ったノックアウト・トランスジェニックマウスであって、生後はじめて生える体毛の色が黒色ないしほぼ黒色であり、加齢と共に白毛を自然発症するという表現型を持っている。
本実施例における薬剤評価のスケジュールを図1に示す。図1の上部に示すタイムテーブルにおいて右端に「age」の表記で示す段はマウスの月齢を示し、最初の「4M」との表記は「4ケ月齢の時点で評価を開始した」ことを意味する。本実施例における評価の開始時点は休止期の体毛を持った4ヶ月齢のマウスをバリカンとシェーバーにて毛刈りした時点である。
〔実施例2:白毛率の視覚的観察による測定〕
白毛率とL*値との相関を求めるため、検体毛中の白毛の数を視覚的観察による計数によって算出した。バリカン・シェーバーによって刈り取ったマウスの検体毛について、光学顕微鏡(オリンパス社製BX61、10倍〜20倍)にて1本ずつ白毛か黒毛かを分別し、「白毛率=白毛本数/全体毛本数」として算出した。白毛か黒毛かの分別においては、毛髪のメジュラー中にメラニンが見られるか否かを基準として判断した。この基準に基づく黒毛の例を図2の「黒毛」と表記した上側の顕微鏡写真(メジュラー中にメラニンが詰まっている)に示し、白毛の例を図2の「白毛」と表記した下側の顕微鏡写真(メジュラー中にメラニンが見られない)に示す。
〔実施例3:検体毛のL*値の測定〕
刈り取った検体毛を図3で示したように毛束状にした。図3の右側には白毛の毛束を、左側には白毛混じりの黒毛の毛束を示す。色彩色差計(コニカミノルタ社製CR-400)のプローブをこれらの毛束に押し当ててL*値を測定した。なお、毛刈りせず直接マウスの体毛にプローブを押し当てても測定は可能であるが、マウスが動いたり、データがばらつくなどのデメリットが生じるため、前記の通り毛束状での測定がより好ましい。なお、後述するL*値はすべて本方法により求めたものである。
〔実施例4:白毛率とL*値の相関〕
実施例2で測定した白毛率と実施例3で測定したL*値との相関性を、白毛率が異なる61種の検体毛を対象に検討した。その実測値を表1に示す。
〔実施例5:色素幹細胞数の計数〕
体毛発生部分の皮膚組織を観察し評価する方法として、色素幹細胞数を以下の(1)〜(9)に述べる手順により計数した。
〔実施例6:白毛率と色素幹細胞数の相関〕
実施例5の手順に従って計数した毛包70本当たりの色素幹細胞数と、該当する皮膚部分に生えていた検体毛についての実施例2と同じ視覚的観察による計数により測定した白毛率との相関性を、白毛率が異なる29種の検体毛を対象に検討した。実測値を表2に示す。
〔実施例7:メラニン量の測定〕
検体毛中のメラニン量を以下の方法により測定した。即ち、メラニン量を、検体毛を溶解した溶液の吸光度により測定をおこなうため、試薬として入手できるメラニンを用い、常法により検量線を作成し、それを用いてメラニン量M(μg/ml)を求めた。吸光度は、バイオラッドラボラトリー社製のプレートリーダー(450nm)を用いて測定した。検体毛10mgを精秤し、NaOH0.6g、200mMのEDTA250μl、蒸留水49.75mlを混合し調製したアルカリ溶液(pH>13)に10分間浸漬させ、メラニンを抽出した後、吸光度を測定し、検量線を用いてメラニン量Mに変換した。
〔実施例8:L*値とメラニン量の関係〕
実施例7において測定した一定量の検体毛当たりのメラニン量と、その検体毛からなる毛束について実施例7に先立って測定しておいたL*値との相関性を、白毛率が異なる8種の検体毛を対象に検討した。実測値を表3に示す。
〔実施例9:皮膚への塗布による薬剤の白毛予防効果の評価〕
実施例1の方法に基づく薬剤評価を、ポリフェノールの一種であるルテオリンを用いて行った例を示す。
〔実施例10:経口投与による薬剤の白毛予防効果の評価〕
次に、上記の供試薬剤であるルテオリンの適用形態を皮膚への塗布から経口投与に変更し、それ以外の点は実施例1の薬剤評価スケジュールに従って、ルテオリンの白毛予防効果を評価した。
〔実施例11:皮膚への塗布による薬剤の白毛促進効果の評価〕
実施例1の薬剤評価スケジュールに基づいて行った薬剤評価の他の一例を示す。植物抽出液として市販されているタイムエキス(一丸ファルコス株式会社社製 ファルコレックスタイムB)を1%含有する70%エタノール溶液を実施例に係るマウス4個体に適用し、これとは別に70%エタノール溶液をコントロールに係るマウス4個体に適用して、タイムエキスの白毛促進効果を評価した。
Claims (13)
- 加齢と共に白毛を自然発症する小型の齧歯目動物である白髪モデル動物に供試薬剤を適用し、前記白髪モデル動物の白毛評価によって前記供試薬剤の白毛制御効果を評価する薬剤評価方法であって、
1)前記薬剤評価方法が以下(イ)〜(ニ)の段階を含むと共に、(イ)の段階を経た白髪モデル動物に対して(ロ)〜(ニ)の段階からなるサイクルを複数サイクル行うものであって、
(イ)毛周期(体毛サイクル)が休止期間中の白髪モデル動物の体毛の白毛評価を行う段階
(ロ)白髪モデル動物の体毛を除去する段階
(ハ)白髪モデル動物に対し、供試薬剤を1回以上適用する段階
(ニ)供試薬剤の適用後に発毛した時点で白毛評価を行う段階
2)かつ、前記薬剤の白毛制御効果の評価を、前記(イ)の段階で得られた白毛評価の評価指標と、前記(ロ)〜(ニ)の段階からなる複数サイクルにおける前記(ニ)の段階で得られた白毛評価の評価指標との比較によって行うものであり、
3)前記白毛評価の評価指標が以下(a)〜(c)のいずれか1以上であることを特徴とする薬剤評価方法。
(a)白髪モデル動物の体毛の測色値。
(b)白髪モデル動物における体毛発生部分の皮膚組織の観察結果。
(c)白髪モデル動物の体毛におけるメラニン量の測定値。 - 前記(a)の測色値が、L*a*b*表色系の明度指数L*の測色値であることを特徴とする請求項1に記載の薬剤評価方法。
- 前記(b)の体毛発生部分の皮膚組織の観察結果が、毛胞部分の色素細胞生産組織における色素幹細胞数であることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の薬剤評価方法。
- 前記色素幹細胞数を計数するに当たり、白髪モデル動物の皮膚組織を採取し、c−kitとdctの二重染色により免疫組織染色し、以下(1)〜(3)の全ての条件を満たす細胞を色素幹細胞と認定することを特徴とする請求項3に記載の薬剤評価方法。
(1)体毛バルジ領域に存在する細胞である。
(2)dctの発現状態によって色素細胞であると判定できる。
(3)c−kitの発現状態によって未分化細胞であると判定できる。 - 前記明度指数L*の測色値を、この測色値と請求項3又は請求項4に記載の色素幹細胞数の計数値との相関に基づいて色素幹細胞数に換算し、この色素幹細胞数の換算値を評価指標として白毛評価を行うことを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の薬剤評価方法。
- 一定数の体毛の内の白毛の比率を視覚的観察により計数して得られる白毛率を、この白毛率と請求項3又は請求項4に記載の色素幹細胞数の計数値との相関に基づいて色素幹細胞数に換算し、この色素幹細胞数の換算値を評価指標として白毛評価を行うことを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の薬剤評価方法。
- 前記明度指数L*の測色値を、この測色値と請求項1の(c)に記載のメラニン量測定値との相関に基づいてメラニン量に換算し、このメラニン量の換算値を評価指標として白毛評価を行うことを特徴とする請求項2〜請求項6のいずれかに記載の薬剤評価方法。
- 前記明度指数L*の測色値を、この測色値と請求項6に記載の白毛率との相関に基づいて白毛率に換算し、この白毛率の換算値を評価指標として白毛評価を行うことを特徴とする請求項6又は請求項7に記載の薬剤評価方法。
- ファクターAとしての測色値あるいは白毛率と、ファクターBとしての色素幹細胞数、メラニン量あるいは白毛率との関係(ファクターA、ファクターBが共に白毛率である場合を除く)を表す一次回帰直線を予め作成し、これらの一次回帰直線を用いて、前記換算値をファクターAからファクターBへの換算として求めることを特徴とする請求項5〜請求項8のいずれかに記載の薬剤評価方法。
- 前記白髪モデル動物に対する供試薬剤の適用を、白髪モデル動物の皮膚への塗布、皮下注射、皮内注射、吸入投与及び経口投与から選ばれる一つ以上の形態で行うことを特徴とする請求項1〜請求項9のいずれかに記載の薬剤評価方法。
- 前記供試薬剤の白毛制御効果の評価が、該供試薬剤の白毛予防・治療効果を評価するものであることを特徴とする請求項1〜請求項10のいずれかに記載の薬剤評価方法。
- 前記供試薬剤の白毛制御効果の評価が、該供試薬剤の白毛促進・増加効果を評価するものであることを特徴とする請求項1〜請求項10のいずれかに記載の薬剤評価方法。
- 前記白髪モデル動物がマウスであることを特徴とする請求項1〜請求項12のいずれかに記載の薬剤評価方法。
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