JP5510712B2

JP5510712B2 - Nonlinear microscope

Info

Publication number: JP5510712B2
Application number: JP2010035503A
Authority: JP
Inventors: 直樹福武
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2010-02-22
Filing date: 2010-02-22
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2030-02-22
Also published as: JP2011170212A

Description

本発明は、非線形顕微鏡に関し、特に、非線形光学効果により試料から発せられる物体光の位相情報を取得できるようにした非線形顕微鏡に関する。 The present invention relates to a nonlinear microscope, and more particularly, to a nonlinear microscope capable of acquiring phase information of object light emitted from a sample by a nonlinear optical effect.

従来、生体試料の３次元画像を得るために共焦点顕微鏡が広く使用されている。また、共焦点顕微鏡は、物質と光の線形現象である蛍光を観察するものであるが、最近この技術を応用して、物質と光の非線形現象を利用する非線形顕微鏡の研究が盛んに行われている。代表的な非線形顕微鏡として、２光子蛍光、第２高調波（SHG）、第３高調波（THG）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）などを利用したものがある。 Conventionally, confocal microscopes are widely used to obtain a three-dimensional image of a biological sample. In addition, confocal microscopes observe fluorescence, which is a linear phenomenon between matter and light. Recently, research on nonlinear microscopes that utilize nonlinear phenomena between matter and light has been actively conducted by applying this technology. ing. Typical nonlinear microscopes use two-photon fluorescence, second harmonic (SHG), third harmonic (THG), coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS), and the like.

従来の非線形顕微鏡は、試料の観察したい面（以下、観察面と称する）上で励起光を走査しながら、非線形光学効果により試料から発せられる光（以下、非線形物体光と称する）を検出し、検出した非線形物体光の強度を示す電気信号の強度を２次元にマッピングすることにより、２次元の観察画像を得ている。また、観察面を励起光の光軸方向に移動させながら、各観察面において観察画像を取得し、重ね合わせることにより３次元の観察画像を得ることができる。 A conventional nonlinear microscope detects light (hereinafter referred to as nonlinear object light) emitted from a sample by a nonlinear optical effect while scanning excitation light on a surface to be observed (hereinafter referred to as an observation surface) of the sample, A two-dimensional observation image is obtained by two-dimensionally mapping the intensity of the detected electrical signal indicating the intensity of the nonlinear object light. In addition, a three-dimensional observation image can be obtained by acquiring and superimposing observation images on each observation surface while moving the observation surface in the optical axis direction of the excitation light.

非線形顕微鏡は、近赤外光を用いて試料を励起するので、可視光では届かなかった試料の深部の情報を取り出すことが可能である。また、非線形顕微鏡は、共焦点顕微鏡とは異なり、観察像の明るさを確保するために検出側のピンホールを開放しても、奥行き分解能を良好に保つことができる。 Since the nonlinear microscope excites the sample using near-infrared light, it is possible to extract information on the deep part of the sample that did not reach with visible light. Further, unlike the confocal microscope, the non-linear microscope can maintain good depth resolution even if the detection-side pinhole is opened in order to ensure the brightness of the observation image.

しかしながら、従来の非線形顕微鏡では、非線形物体光の位相情報を取り出すことはできなかった。しかし、２光子励起のような非線形インコヒーレント現象を利用する非線形顕微鏡は別にして、SHG、THG、CARS等の非線形コヒーレント現象を利用する非線形顕微鏡に対しては、非線形物体光の強度情報だけでなく、位相情報も検出できるようにすることが要望されている。 However, conventional nonlinear microscopes cannot extract phase information of nonlinear object light. However, apart from nonlinear microscopes that use nonlinear incoherent phenomena such as two-photon excitation, for nonlinear microscopes that use nonlinear coherent phenomena such as SHG, THG, CARS, etc., only the intensity information of nonlinear object light is used. There is a need to be able to detect phase information as well.

例えば、CARSを利用した非線形顕微鏡（以下、CARS顕微鏡と称する）について考える。CARS顕微鏡では、角振動数（角速度）がω１およびω２（ただし、ω１＞ω２）の２種類の波長が異なるパルス状の励起光ω１および励起光ω２が用いられる。そして、励起光ω１および励起光ω２が照射された試料において、励起光ω１と励起光ω２の角振動数の差（ω１−ω２）と一致する角振動数の振動モードを有する分子から、共鳴過程による光（以下、CARS光と称する）が発せられ、他の分子から非共鳴過程（４光波混合）による光（以下、非共鳴光と称する）が発せられる。CARS光は、例えば、観察対象となる試料の特定の分子から発せられ、非共鳴光は、例えば、主に試料を浸している水から発せられる。CARS顕微鏡で検出される非線形物体光には、このCARS光と非共鳴光が含まれる。 For example, consider a nonlinear microscope using CARS (hereinafter referred to as CARS microscope). In the CARS microscope, pulsed excitation light ω1 and excitation light ω2 having two different wavelengths having angular frequencies (angular velocities) of ω1 and ω2 (where ω1> ω2) are used. Then, in the sample irradiated with the excitation light ω1 and the excitation light ω2, a resonance process is started from a molecule having a vibration mode with an angular frequency corresponding to the difference (ω1-ω2) in the angular frequency between the excitation light ω1 and the excitation light ω2. Light (hereinafter referred to as CARS light) is emitted, and light (hereinafter referred to as non-resonant light) due to non-resonant processes (four-wave mixing) is emitted from other molecules. CARS light is emitted from, for example, specific molecules of a sample to be observed, and non-resonant light is emitted from, for example, water in which the sample is mainly immersed. The nonlinear object light detected by the CARS microscope includes this CARS light and non-resonant light.

より具体的には、図１に示されるように、共鳴過程では、分子の状態が、励起光ω１により基底状態から中間状態１に遷移した後、励起光ω２により励起状態に遷移し、さらに励起光ω１により中間状態２に遷移した後、基底状態に戻るときに、角振動数ωｒのCARS光が発せられる。一方、非共鳴過程では、分子の状態が、２つの励起光ω１により中間状態３に遷移し、さらに励起光ω２により基底状態に戻るときに、角振動数ωｒの非共鳴光が発せられる。CARS光と非共鳴光は、角振動数が同じωｒであり、同じ波長となるが、位相が９０度ずれている。 More specifically, as shown in FIG. 1, in the resonance process, the molecular state transitions from the ground state to the intermediate state 1 by the excitation light ω1, and then transitions from the ground state to the excitation state by the excitation light ω2. After transitioning to the intermediate state 2 by the light ω1, when returning to the ground state, CARS light having an angular frequency ωr is emitted. On the other hand, in the non-resonant process, when the molecular state transitions to the intermediate state 3 by the two excitation lights ω1 and further returns to the ground state by the excitation light ω2, non-resonant light having an angular frequency ωr is emitted. CARS light and non-resonant light have the same angular frequency ωr and the same wavelength, but are 90 degrees out of phase.

非共鳴光は、背景光となってCARS光の検出を妨げるため、例えば、CARS光と非共鳴光とを分離して観察できるように、CARS光と非共鳴光を含む非線形物体光の位相情報を取得できるようにすることが望まれている。 Since non-resonant light becomes background light and prevents detection of CARS light, for example, phase information of nonlinear object light including CARS light and non-resonant light can be observed separately from CARS light and non-resonant light. It is desirable to be able to get

また、従来、ホモダインCARS顕微鏡が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。このホモダインCARS顕微鏡では、非線形物体光（試料の３次非線形感受率χ⁽³⁾）の複素振幅の実部に基づく画像、すなわち、CARS光のみに基づく画像を取得することができる。また、このホモダインCARS顕微鏡では、非線形物体光の複素振幅の実部の絶対値と虚部の絶対値を２回に分けて測定することができる。 Conventionally, a homodyne CARS microscope has been proposed (see, for example, Non-Patent Document 1). In this homodyne CARS microscope, an image based on the real part of the complex amplitude of the nonlinear object light (third-order nonlinear susceptibility χ ^{(3) of the} sample), that is, an image based only on the CARS light can be acquired. Further, in this homodyne CARS microscope, the absolute value of the real part and the absolute value of the imaginary part of the complex amplitude of the nonlinear object light can be measured in two steps.

Eric O. Potma, Conor L. Evans, and X. Sunney Xie, “Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging”, Optics Letters, Vol. 31, No.2, 2006年1月, p. 241-243Eric O. Potma, Conor L. Evans, and X. Sunney Xie, “Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging”, Optics Letters, Vol. 31, No. 2, January 2006, p. 241- 243

しかしながら、非特許文献１に記載されているホモダインCARS顕微鏡では、非線形物体光の複素振幅の実部の絶対値と虚部の絶対値を取得することは可能であるが、位相情報を取得することはできない。 However, in the homodyne CARS microscope described in Non-Patent Document 1, it is possible to obtain the absolute value of the real part and the absolute value of the imaginary part of the complex amplitude of the nonlinear object light, but to obtain the phase information. I can't.

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、非線形物体光の複素振幅を取得できるようにするものである。 The present invention has been made in view of such a situation, and makes it possible to acquire the complex amplitude of nonlinear object light.

本発明の第１の側面の非線形顕微鏡は、励起光を試料に照射し、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡であって、試料の観察面において励起光を走査する走査手段と、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、非線形物体光と参照光との第１の干渉光を検出する検出手段と、第１の干渉光に基づく第１の画像を生成する画像生成手段と、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅を計算する計算手段と、非線形物体光の複素振幅の位相を補正する補正手段とを備え、位相シフト手段は、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、参照光の位相を所定の角度ずつシフトし、走査手段、位相シフト手段、および、検出手段により、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光をさらに検出し、画像生成手段は、第２の干渉光に基づく第２の画像をさらに生成し、計算手段は、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅をさらに計算し、補正手段は、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相を補正することを特徴とする。 A nonlinear microscope according to a first aspect of the present invention is a nonlinear microscope that irradiates a sample with excitation light and observes nonlinear object light emitted from the sample by a nonlinear optical effect, and scans the excitation light on the observation surface of the sample. Scanning means; reference light generating means for generating reference light having the same angular frequency as that of the nonlinear object light from the excitation light ; phase shifting means for shifting the phase of the reference light; and a first of the nonlinear object light and the reference light. Detection means for detecting interference light, image generation means for generating a first image based on the first interference light, calculation means for calculating a complex amplitude of nonlinear object light based on the first image, and nonlinear object Correction means for correcting the phase of the complex amplitude of the light, and the phase shift means changes the phase of the reference light by a predetermined angle each time the position of the excitation light on the observation surface moves by a predetermined distance in a predetermined direction. shifts, scanning hand The phase shift means and the detection means further detect the second interference light between the linear object light and the reference light emitted by scanning the irradiation light having the same angular frequency as the reference light on the observation surface of the sample. The image generating means further generates a second image based on the second interference light, the calculating means further calculates a complex amplitude of the linear object light based on the second image, and the correcting means is linear The phase of the complex amplitude of the nonlinear object light is corrected based on the phase of the complex amplitude of the object light .

本発明の第１の側面においては、試料の観察面において励起光が走査され、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光が生成され、参照光の位相が、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、所定の角度ずつシフトされ、非線形物体光と参照光との第１の干渉光が検出され、第１の干渉光に基づく第１の画像が生成され、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅が計算され、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光が検出され、第２の干渉光に基づく第２の画像が生成され、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅が計算され、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相が補正される。 In the first aspect of the present invention, the excitation light is scanned on the observation surface of the sample, the reference light having the same angular frequency as the nonlinear object light is generated from the excitation light, and the phase of the reference light is the excitation light on the observation surface. Is shifted by a predetermined angle each time the position of is moved in a predetermined direction by a predetermined distance, the first interference light of the nonlinear object light and the reference light is detected, and the first interference light based on the first interference light is detected . An image is generated, a complex amplitude of the nonlinear object light is calculated based on the first image, a linear object light emitted by scanning an irradiation light having the same angular frequency as the reference light on the observation surface of the sample, and a reference Second interference light with the light is detected, a second image based on the second interference light is generated, a complex amplitude of the linear object light is calculated based on the second image, and a complex amplitude of the linear object light is calculated. The phase of the complex amplitude of the nonlinear object light is Is Tadashisa.

本発明の第２の側面の非線形顕微鏡は、励起光を試料に照射し、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡であって、試料の観察面において励起光を走査する走査手段と、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、非線形物体光と参照光との第１の干渉光を検出する検出手段と、第１の干渉光に基づく第１の画像を生成する画像生成手段と、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅を計算する計算手段と、非線形物体光の複素振幅の位相を補正する補正手段とを備え、検出手段は、観察面にわたる第１の干渉光を、３６０／ｎ度（ｎは３以上の整数）ずつ位相が異なるｎ種類の参照光を用いて少なくともｎ回検出し、走査手段、位相シフト手段、および、検出手段により、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光をさらに検出し、画像生成手段は、第２の干渉光に基づく第２の画像をさらに生成し、計算手段は、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅をさらに計算し、補正手段は、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相を補正することを特徴とする。 A nonlinear microscope according to a second aspect of the present invention is a nonlinear microscope that irradiates a sample with excitation light and observes nonlinear object light emitted from the sample by a nonlinear optical effect, and scans the excitation light on the observation surface of the sample. Scanning means; reference light generating means for generating reference light having the same angular frequency as that of the nonlinear object light from the excitation light ; phase shifting means for shifting the phase of the reference light; and a first of the nonlinear object light and the reference light. Detection means for detecting interference light, image generation means for generating a first image based on the first interference light, calculation means for calculating a complex amplitude of nonlinear object light based on the first image, and nonlinear object Correction means for correcting the phase of the complex amplitude of the light, and the detection means converts the first interference light over the observation surface into n types of reference lights having different phases by 360 / n degrees (n is an integer of 3 or more). at least n times detected using a The second interference light between the linear object light and the reference light emitted by scanning the irradiation light having the same angular frequency as the reference light on the observation surface of the sample by the scanning means, the phase shift means, and the detection means , The image generation means further generates a second image based on the second interference light, the calculation means further calculates a complex amplitude of the linear object light based on the second image, and a correction means Is characterized in that the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light is corrected based on the phase of the complex amplitude of the linear object light .

本発明の第２の側面においては、試料の観察面において励起光が走査され、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光が生成され、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光と同じ角振動数の参照光の位相がシフトされ、非線形物体光と参照光との第１の干渉光が検出されるとともに、観察面にわたる第１の干渉光が、３６０／ｎ度（ｎは３以上の整数）ずつ位相が異なるｎ種類の参照光を用いて少なくともｎ回検出され、第１の干渉光に基づく第１の画像が生成され、第１の画像に基づいて非線形物体光の複素振幅が計算され、角振動数が参照光と同じ照射光を試料の観察面において走査することにより発せられる線形物体光と、参照光との第２の干渉光が検出され、第２の干渉光に基づく第２の画像が生成され、第２の画像に基づいて線形物体光の複素振幅が計算され、線形物体光の複素振幅の位相に基づいて、非線形物体光の複素振幅の位相が補正される。
本発明の第３の側面の非線形顕微鏡は、励起光を試料に照射し、非線形光学効果により試料から発せられる非線形物体光を観察する非線形顕微鏡であって、試料の観察面において励起光を走査する走査手段と、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光を生成する参照光生成手段と、参照光の位相をシフトする位相シフト手段と、非線形物体光と参照光との第１の干渉光を検出する検出手段とを備え、走査手段は、試料が載置されているステージを移動させることにより観察面において励起光を走査し、位相シフト手段は、ステージとともに移動し、参照光が入射する位置によって検出手段までの参照光の光路長を変化させることにより、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、参照光の位相を所定の角度ずつシフトすることを特徴とする。
本発明の第３の側面の非線形顕微鏡においては、試料が載置されているステージを移動させることにより試料の観察面において励起光が走査され、励起光から非線形物体光と同じ角振動数の参照光が生成され、観察面における励起光の位置が所定の方向に所定の距離だけ移動する毎に、参照光の位相が所定の角度ずつシフトされ、非線形物体光と参照光との干渉光が検出される。 In the second aspect of the present invention, the excitation light is scanned on the observation surface of the sample, the reference light having the same angular frequency as the nonlinear object light is generated from the excitation light, and the nonlinear object light emitted from the sample by the nonlinear optical effect. The phase of the reference light having the same angular frequency is shifted, the first interference light of the nonlinear object light and the reference light is detected, and the first interference light over the observation surface is 360 / n degrees (n is A first image based on the first interference light is generated at least n times using n types of reference lights having different phases by an integer of 3 or more, and the complex of the nonlinear object light is generated based on the first image. The second interference light between the linear object light emitted by scanning the irradiation light having the same angular frequency as the reference light on the observation surface of the sample and the reference light is detected, and the second interference light is detected. A second image is generated based on the second Complex amplitude of the linear object light is calculated on the basis of the image, based on the complex amplitude of the phase of the linear object beam, the complex amplitude of the phase of the nonlinear object beam is corrected.
A nonlinear microscope according to a third aspect of the present invention is a nonlinear microscope that irradiates a sample with excitation light and observes nonlinear object light emitted from the sample by a nonlinear optical effect, and scans excitation light on the observation surface of the sample. Scanning means; reference light generating means for generating reference light having the same angular frequency as that of the nonlinear object light from the excitation light; phase shifting means for shifting the phase of the reference light; and a first of the nonlinear object light and the reference light. Detecting means for detecting interference light, the scanning means scans the excitation light on the observation surface by moving the stage on which the sample is placed, the phase shift means moves together with the stage, and the reference light is By changing the optical path length of the reference light to the detection means according to the incident position, the phase of the reference light is determined every time the position of the excitation light on the observation surface moves by a predetermined distance in a predetermined direction. Characterized in that it shifted by angle.
In the nonlinear microscope according to the third aspect of the present invention, the excitation light is scanned on the observation surface of the sample by moving the stage on which the sample is placed, and the same angular frequency as that of the nonlinear object light is referenced from the excitation light. Each time light is generated and the position of the excitation light on the observation surface moves in a predetermined direction by a predetermined distance, the phase of the reference light is shifted by a predetermined angle, and interference light between the nonlinear object light and the reference light is detected. Is done.

本発明の第１の側面乃至第３の側面によれば、非線形光学効果により試料から発せられる物体光の位相情報を取得することができる。 According to the first to third aspects of the present invention, the phase information of the object light emitted from the sample can be acquired by the nonlinear optical effect.

共鳴過程（CARS）と非共鳴過程について説明するための図である。It is a figure for demonstrating a resonance process (CARS) and a non-resonance process. 本発明を適用した非線形顕微鏡の第１の実施の形態を示すブロック図である。It is a block diagram which shows 1st Embodiment of the nonlinear microscope to which this invention is applied. 非線形顕微鏡により実行される観察処理を説明するためのフローチャートである。It is a flowchart for demonstrating the observation process performed with a nonlinear microscope. 非線形物体光の複素振幅の計算方法について説明するための図である。It is a figure for demonstrating the calculation method of the complex amplitude of nonlinear object light. 本発明を適用した非線形顕微鏡の第２の実施の形態を示すブロック図である。It is a block diagram which shows 2nd Embodiment of the nonlinear microscope to which this invention is applied. 本発明を適用した非線形顕微鏡の第３の実施の形態を示すブロック図である。It is a block diagram which shows 3rd Embodiment of the nonlinear microscope to which this invention is applied.

以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態
２．第２の実施の形態
３．第３の実施の形態
４．変形例 Hereinafter, modes for carrying out the present invention (hereinafter referred to as embodiments) will be described. The description will be given in the following order.
1. First Embodiment 2. FIG. Second Embodiment 3. FIG. Third embodiment 4. Modified example

＜１．第１の実施の形態＞
［非線形顕微鏡の構成例］
図２は、本発明の第１の実施の形態である非線形顕微鏡１の構成の例を示すブロック図である。なお、以下、紙面の左右方向をｘ軸方向とし、紙面の上下方向をｚ軸方向とし、紙面に垂直な方向をｙ軸方向とする。 <1. First Embodiment>
[Configuration example of nonlinear microscope]
FIG. 2 is a block diagram showing an example of the configuration of the nonlinear microscope 1 according to the first embodiment of the present invention. In the following description, the left-right direction of the paper surface is the x-axis direction, the vertical direction of the paper surface is the z-axis direction, and the direction perpendicular to the paper surface is the y-axis direction.

非線形顕微鏡１０１は、コヒーレントな非線形光学効果の一種であるCARS（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）により試料１０２から発せられる非線形物体光を観察するための非線形レーザ走査顕微鏡である。 The non-linear microscope 101 is a non-linear laser scanning microscope for observing non-linear object light emitted from a sample 102 by CARS (coherent anti-Stokes Raman scattering) which is a kind of coherent non-linear optical effect.

非線形顕微鏡１０１には、角振動数ω１のパルス状の励起光ω１、および、角振動数ω２（＜ω１）のパルス状の励起光ω２が入射される。例えば、図示せぬ光源から射出された角振動数ω１のレーザパルスをOPO（Optical Parametric Oscillator）に入射し、波長を変換して角振動数ω２のレーザパルスを生成した後、角振動数ω１のレーザパルスと角振動数ω２のレーザパルスを、遅延回路等を用いて時間的に合わせて導入することにより、励起光ω１，ω２が非線形顕微鏡１０１に入射される。非線形顕微鏡１０１に入射した励起光ω１，ω２は、同じ光路を進んでビームスプリッタ１１１に入射し、ビームスプリッタ１１１を透過して直進する光と、ビームスプリッタ１１１により反射される光に分かれる。 The nonlinear microscope 101 receives pulsed excitation light ω1 having an angular frequency ω1 and pulsed excitation light ω2 having an angular frequency ω2 (<ω1). For example, a laser pulse having an angular frequency ω1 emitted from a light source (not shown) is incident on an OPO (Optical Parametric Oscillator), a wavelength is converted to generate a laser pulse having an angular frequency ω2, and then an angular frequency ω1 is generated. By introducing a laser pulse and a laser pulse having an angular frequency ω2 in time using a delay circuit or the like, excitation light ω1 and ω2 are incident on the nonlinear microscope 101. The excitation lights ω 1 and ω 2 that have entered the nonlinear microscope 101 are divided into light that travels on the same optical path, enters the beam splitter 111, passes straight through the beam splitter 111, and is reflected by the beam splitter 111.

ビームスプリッタ１１１を透過した励起光ω１，ω２は、非線形結晶１１２に入射し、非線形結晶１１２おいて図１を参照して上述した非共鳴過程（４光波混合）により角振動数ωｒ（＝２ω１−ω２）のコヒーレント光（以下、参照光ωｒと称する）が生成され、射出される。非線形結晶１１２から射出された参照光ωｒは、励起光ω１，ω２を遮光するためのフィルタ１１３を透過し、ミラー１１４により遅延回路１１５の方向に反射され、遅延回路１１５内のミラー１３１およびミラー１３２、並びに、ミラー１１６により、位相シフタ１１７の方向に反射される。さらに、参照光ωｒは、位相シフタ１１７により位相が調整された後、ビームスプリッタ１１８により反射され、ガルバノミラー１１９に入射する。 The excitation lights ω1 and ω2 transmitted through the beam splitter 111 are incident on the nonlinear crystal 112, and the angular frequency ωr (= 2ω1−) in the nonlinear crystal 112 by the non-resonant process (four-wave mixing) described above with reference to FIG. ω2) coherent light (hereinafter referred to as reference light ωr) is generated and emitted. The reference light ωr emitted from the nonlinear crystal 112 is transmitted through the filter 113 for shielding the excitation light ω1 and ω2, reflected by the mirror 114 toward the delay circuit 115, and the mirror 131 and the mirror 132 in the delay circuit 115. And reflected by the mirror 116 in the direction of the phase shifter 117. Further, the phase of the reference light ωr is adjusted by the phase shifter 117, reflected by the beam splitter 118, and incident on the galvanometer mirror 119.

一方、ビームスプリッタ１１１により反射された励起光ω１，ω２は、ビームスプリッタ１１８を透過した後、参照光ωｒと同じ光路を進み、ガルバノミラー１１９に入射する。 On the other hand, the excitation lights ω 1 and ω 2 reflected by the beam splitter 111 pass through the beam splitter 118, travel on the same optical path as the reference light ωr, and enter the galvanometer mirror 119.

ガルバノミラー１１９に入射した励起光ω１，ω２および参照光ωｒは、ガルバノミラー１１９により進行方向が調整された後、倒立顕微鏡１２０のミラー１４１により対物レンズ１４２の方向に反射され、対物レンズ１４２を介して、試料１０２の所定の面（以下、観察面と称する）において集光する。そして、試料１０２の観察面の励起光ω１，ω２が集光した位置において、図１を参照して上述した共鳴過程および非共鳴過程が発生し、角振動数ωｒのCARS光および非共鳴光を含む非線形物体光が発せられる。一方、参照光ωｒは、その一部が試料１０２をそのまま透過する。 Excitation light ω 1, ω 2 and reference light ωr incident on the galvanometer mirror 119 are reflected in the direction of the objective lens 142 by the mirror 141 of the inverted microscope 120 after the traveling direction is adjusted by the galvanometer mirror 119 and passes through the objective lens 142. Then, the light is condensed on a predetermined surface (hereinafter referred to as an observation surface) of the sample 102. Then, the resonance process and the non-resonance process described above with reference to FIG. 1 occur at the position where the excitation lights ω1 and ω2 on the observation surface of the sample 102 are collected, and the CARS light and the non-resonance light having the angular frequency ωr are generated. Including nonlinear object light is emitted. On the other hand, a part of the reference light ωr passes through the sample 102 as it is.

試料１０２から発せられた非線形物体光および試料１０２を透過した参照光ωｒは、レンズ１２１により集光され、互いに干渉して検出器１２２に入射する。検出器１２２は、例えば、PMT（光電子倍増管）などの光検出器、A/D変換器などにより構成され、所定の間隔で入射光の強度を検出し、検出した強度を示すデジタルの電気信号を画像処理部１２４に供給する。なお、A/D変換器を検出器１２２とは別に設け、検出器１２２からはアナログの電気信号を出力し、外部のA/D変換器で所定の間隔で電気信号のサンプリングを行うようにしてもよい。 The nonlinear object light emitted from the sample 102 and the reference light ωr transmitted through the sample 102 are collected by the lens 121, interfere with each other, and enter the detector 122. The detector 122 includes, for example, a photodetector such as a PMT (photomultiplier tube), an A / D converter, and the like. The detector 122 detects the intensity of incident light at a predetermined interval, and a digital electric signal indicating the detected intensity. Is supplied to the image processing unit 124. In addition, an A / D converter is provided separately from the detector 122, an analog electric signal is output from the detector 122, and the electric signal is sampled at a predetermined interval by an external A / D converter. Also good.

このとき、励起光ω１，ω２および参照光ωｒは、ガルバノミラー１１９により、試料１０２の観察面において、例えばラスタ順に走査される。そして、検出器１２２は、ガルバノミラー１１９による走査に同期して、試料１０２の観察面における励起光ω１，ω２および参照光ωｒの集光位置がｘ軸方向に所定の距離だけ移動する毎に、および、ｘ軸方向の１ライン分の走査が終わり、集光位置が次のラインの先頭に移動する毎に、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度を検出する。これにより、試料１０２の観察面にわたって、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度が検出器１２２により検出される。 At this time, the excitation light ω1 and ω2 and the reference light ωr are scanned by the galvanometer mirror 119 on the observation surface of the sample 102, for example, in raster order. The detector 122 is synchronized with the scanning by the galvanometer mirror 119 every time the condensing positions of the excitation light ω1 and ω2 and the reference light ωr on the observation surface of the sample 102 move by a predetermined distance in the x-axis direction. And every time scanning of one line in the x-axis direction is finished and the condensing position moves to the head of the next line, the intensity of the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr is detected. Thereby, the intensity of the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr is detected by the detector 122 over the observation surface of the sample 102.

また、位相シフタ１１７は、同期回路１２３の制御の基に、ガルバノミラー１１９の動きに同期して、参照光ωｒの位相を調整する。より具体的には、ガルバノミラー１１９が所定の角度だけ回転し、励起光ω１，ω２および参照光ωｒの集光位置がｘ軸方向に所定の距離だけ移動し、検出器１２２が干渉光の強度を検出する毎に、位相シフタ１１７は、参照光ωｒの位相を９０度ずつ進める（あるいは、遅らせる）。従って、検出器１２２が干渉光の強度を４回検出する毎に、換言すれば、検出器１２２がｘ軸方向の４画素分の干渉光の強度を検出する毎に、参照光ωｒの位相が１波長分シフトする。 The phase shifter 117 adjusts the phase of the reference light ωr in synchronization with the movement of the galvanometer mirror 119 under the control of the synchronization circuit 123. More specifically, the galvano mirror 119 rotates by a predetermined angle, the condensing positions of the excitation light ω1, ω2 and the reference light ωr move by a predetermined distance in the x-axis direction, and the detector 122 detects the intensity of the interference light. Is detected, the phase shifter 117 advances (or delays) the phase of the reference light ωr by 90 degrees. Therefore, every time the detector 122 detects the intensity of the interference light four times, in other words, every time the detector 122 detects the intensity of the interference light for four pixels in the x-axis direction, the phase of the reference light ωr changes. Shift by one wavelength.

画像処理部１２４は、例えば、コンピュータ、あるいは、CPU（Central Processing Unit）などのプロセッサなどからなり、観察画像生成部１５１、計算部１５２、補正部１５３、および、表示画像生成部１５４を含む機能を実現する。 The image processing unit 124 includes, for example, a computer or a processor such as a CPU (Central Processing Unit), and has functions including an observation image generation unit 151, a calculation unit 152, a correction unit 153, and a display image generation unit 154. Realize.

観察画像生成部１５１は、検出器１２２からの電気信号により示される、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度のサンプル値を、励起光ω１，ω２および参照光ωｒの走査順と同じ順序で１画素ずつ並べることにより、試料２の観察面の画像（以下、観察画像と称する）を生成する。上述したように、参照光ωｒの位相は、検出器１２２が干渉光の強度を検出する毎に９０度ずつシフトする。従って、非線形物体光と、非線形物体光の光軸に対してｘ軸方向に所定の角度だけ傾けて照射した参照光ωｒとが干渉し、干渉縞が発生した像と同等の像が、観察画像として得られる。すなわち、デジタルホログラフィの原理に基づいて、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光により得られる像と同等の像が、観察画像として得られる。 The observation image generation unit 151 uses the sample value of the intensity of the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr indicated by the electrical signal from the detector 122 in the same scanning order as the excitation light ω1 and ω2 and the reference light ωr. By arranging the pixels one by one in order, an image of the observation surface of the sample 2 (hereinafter referred to as an observation image) is generated. As described above, the phase of the reference light ωr is shifted by 90 degrees each time the detector 122 detects the intensity of the interference light. Accordingly, the non-linear object light interferes with the reference light ωr irradiated at a predetermined angle in the x-axis direction with respect to the optical axis of the non-linear object light, and an image equivalent to an image in which interference fringes are generated is an observation image. As obtained. That is, based on the principle of digital holography, an image equivalent to the image obtained by the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr is obtained as an observation image.

なお、励起光ω１，ω２の代わりに、所定の角振動数ωｘの照射光ωｘのみをビームスプリッタ１１１に入射し、照射光ωｘ、および、位相シフタ１１７により位相が制御された、角振動数ωｘの参照光ωｘを試料１０２に照射するようにして、非線形顕微鏡１０１を、走査型の線形ホログラフィック顕微鏡として使用することも可能である。この場合、試料１０２からは照射光ωｘの強度に比例した物体光（以下、線形物体光と称する）が発せられ、線形物体光と、線形物体光の光軸に対してｘ軸方向に所定の角度だけ傾けて照射した参照光ωｘとが干渉し、干渉縞が発生した像と同等の像が、観察画像として得られる。すなわし、デジタルホログラフィの原理に基づいて、線形物体光と参照光ωｘとの干渉光により得られる像と同等の像が、観察画像として得られる。 Instead of the excitation light ω1 and ω2, only the irradiation light ωx having a predetermined angular frequency ωx is incident on the beam splitter 111, and the phase is controlled by the irradiation light ωx and the phase shifter 117. It is possible to use the nonlinear microscope 101 as a scanning linear holographic microscope by irradiating the sample 102 with the reference light ωx. In this case, object light (hereinafter referred to as linear object light) proportional to the intensity of the irradiation light ωx is emitted from the sample 102, and the linear object light and a predetermined amount in the x-axis direction with respect to the optical axis of the linear object light. An image equivalent to an image in which interference fringes are generated by interference with the reference light ωx irradiated at an angle is obtained as an observation image. That is, based on the principle of digital holography, an image equivalent to the image obtained by the interference light between the linear object light and the reference light ωx is obtained as the observation image.

なお、以下、非線形物体光と参照光との干渉光による観察画像と、線形物体光と参照光との干渉光による観察画像とを区別する必要がある場合、前者を非線形観察画像と称し、後者を線形観察画像と称する。 Hereinafter, when it is necessary to distinguish between an observation image obtained by interference light between the nonlinear object light and the reference light and an observation image obtained by interference light between the linear object light and the reference light, the former is referred to as a nonlinear observation image and the latter. Is referred to as a linear observation image.

計算部１５２は、図３および図４を参照して後述するように、観察画像に基づいて非線形物体光および線形物体光の複素振幅を計算し、計算結果を示す情報を補正部１５３に供給する。 As will be described later with reference to FIGS. 3 and 4, the calculation unit 152 calculates the complex amplitude of the nonlinear object light and the linear object light based on the observation image, and supplies information indicating the calculation result to the correction unit 153. .

補正部１５３は、図３を参照して後述するように、計算部１５２により計算された非線形物体光の複素振幅の位相を補正し、補正した非線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を表示画像生成部１５４に供給する。 As will be described later with reference to FIG. 3, the correction unit 153 corrects the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light calculated by the calculation unit 152 and displays information indicating the calculation result of the corrected complex amplitude of the nonlinear object light. The image is supplied to the display image generation unit 154.

表示画像生成部１５４は、図３を参照して後述するように、非線形物体光の複素振幅の計算結果に基づいて、ユーザに提示するための表示画像を生成する。 As will be described later with reference to FIG. 3, the display image generation unit 154 generates a display image to be presented to the user based on the calculation result of the complex amplitude of the nonlinear object light.

［観察処理の説明］
次に、図３のフローチャートを参照して、非線形顕微鏡１０１により実行される観察処理について説明する。 [Explanation of observation process]
Next, the observation process executed by the nonlinear microscope 101 will be described with reference to the flowchart of FIG.

ステップＳ１において、非線形顕微鏡１０１は、図２を参照して上述したように、励起光ω１，ω２および参照光ωｒを用いて、非線形観察画像を生成する。生成された非線形観察画像は、観察画像生成部１５１から計算部１５２に供給される。 In step S1, the nonlinear microscope 101 generates a nonlinear observation image using the excitation lights ω1 and ω2 and the reference light ωr as described above with reference to FIG. The generated non-linear observation image is supplied from the observation image generation unit 151 to the calculation unit 152.

ステップＳ２において、計算部１５２は、非線形観察画像に基づいて、非線形物体光の複素振幅を計算する。ここで、図４を参照しながら、計算方法の具体例を説明する。 In step S2, the calculation unit 152 calculates the complex amplitude of the nonlinear object light based on the nonlinear observation image. Here, a specific example of the calculation method will be described with reference to FIG.

図４は、非線形観察画像１７１、および、非線形観察画像１７１を高速フーリエ変換（FFT）することにより得られる画像１７２の例を模式的に示した図である。なお、非線形観察画像１７１内の縦線は、干渉縞を模式的に示したものである。 FIG. 4 is a diagram schematically illustrating an example of the nonlinear observation image 171 and an image 172 obtained by performing fast Fourier transform (FFT) on the nonlinear observation image 171. Note that the vertical lines in the nonlinear observation image 171 schematically show the interference fringes.

非線形観察画像１７１をフーリエ変換することにより得られる画像１７２では、非線形観察画像１７１のDC成分による輝点１８１が中央に現れ、輝点１８１の左側に物体スペクトル１８２、右側に共役物体スペクトル１８３が出現する。このうち物体スペクトル１８２のみを抽出し、逆フーリエ変換（FFT^-1）することにより、観察画像の各画素における試料１０２の３次非線形感受率χ⁽³⁾の複素振幅、すなわち、非線形物体光の複素振幅を得ることができる。 In the image 172 obtained by Fourier transforming the nonlinear observation image 171, the bright spot 181 due to the DC component of the nonlinear observation image 171 appears in the center, the object spectrum 182 appears on the left side of the bright spot 181, and the conjugate object spectrum 183 appears on the right side. To do. By extracting only the object spectrum 182 and performing inverse Fourier transform (FFT ⁻¹ ⁾ , the complex amplitude of the third-order nonlinear susceptibility χ ⁽³⁾ of the sample 102 in each pixel of the observation image, that is, the nonlinear object light A complex amplitude can be obtained.

例えば、検出器１２２上での非線形物体光の複素振幅をO(x,y)、参照光ωｒの複素振幅をR・exp[-i2πx・sinθ/λ]とする。なお、λは、CARS光、非共鳴光および参照光ωｒの波長を示し、θは参照光ωｒの位相シフト量を示す。上述したように、参照光ωｒの位相シフト量θは、検出器１２２が干渉光の強度を４回検出する毎に１波長分シフトするように制御されるので、検出器１２２上における非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の複素振幅A(x,y)は、次式（１）により与えられる。 For example, the complex amplitude of the nonlinear object light on the detector 122 is O (x, y), and the complex amplitude of the reference light ωr is R · exp [−i2πx · sin θ / λ]. Note that λ represents the wavelengths of the CARS light, non-resonant light, and reference light ωr, and θ represents the phase shift amount of the reference light ωr. As described above, the phase shift amount θ of the reference light ωr is controlled to be shifted by one wavelength every time the detector 122 detects the intensity of the interference light four times. And the complex amplitude A (x, y) of the interference light between the reference light ωr and the reference light ωr is given by the following equation (1).

従って、干渉光の光強度I(x,y)は、次式（２）により求められる。 Therefore, the light intensity I (x, y) of the interference light is obtained by the following equation (2).

そして、式（２）をフーリエ変換することにより次式（３）が得られる。 And following Formula (3) is obtained by carrying out Fourier transform of Formula (2).

なお、~はフーリエ変換を表し、ACはオートコリレーションを表している。 Note that ~ represents Fourier transform, and AC represents autocorrelation.

ここで、式（３）の右辺の第２項が、中央の輝点１８１に対応し、第３項が物体スペクトル１８２に対応し、第４項が共役物体スペクトル１８３に対応する。なお、参照光ωｒの強度が、非線形物体光の強度に比べて十分強い場合は、式（３）の右辺の第１項は無視することができる。 Here, the second term on the right side of Equation (3) corresponds to the central bright spot 181, the third term corresponds to the object spectrum 182, and the fourth term corresponds to the conjugate object spectrum 183. When the intensity of the reference light ωr is sufficiently higher than the intensity of the nonlinear object light, the first term on the right side of the equation (3) can be ignored.

そして、式（３）の右辺の第３項を取り出し、逆フーリエ変換することにより、観察画像の各画素における非線形物体光の複素振幅、すなわち、試料１０２の３次非線形感受率χ⁽³⁾の複素振幅を得ることができる。 Then, by extracting the third term on the right side of Equation (3) and performing inverse Fourier transform, the complex amplitude of the nonlinear object light at each pixel of the observation image, that is, the third-order nonlinear susceptibility χ ⁽³⁾ of the sample 102 is obtained. A complex amplitude can be obtained.

なお、以上の計算方法は、従来のデジタルホログラフィで行われているのと同様の計算方法である。 In addition, the above calculation method is the same calculation method performed by the conventional digital holography.

なお、フーリエ変換した際に、物体スペクトル１８２と共役物体スペクトル１８３が重ならずに、物体スペクトル１８２だけを抽出できるようにするために、検出器１２２により点物体を測定したときの像（点像強度分布）を、数ピクセルにまたがって取得する程度に、集光点の走査間隔を十分細かく取ることが望ましい。 In addition, when Fourier transform is performed, the object spectrum 182 and the conjugate object spectrum 183 do not overlap with each other so that only the object spectrum 182 can be extracted. It is desirable that the scanning interval of the focal point is sufficiently fine so that the intensity distribution is acquired over several pixels.

計算部１５２は、以上の計算を行った後、非線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を補正部１５３に供給する。 After performing the above calculation, the calculation unit 152 supplies information indicating the calculation result of the complex amplitude of the nonlinear object light to the correction unit 153.

ステップＳ３において、非線形顕微鏡１０１は、照射光ωｒおよび参照光ωｒを用いて、線形観察画像を生成する。すなわち、非線形顕微鏡１０１は、上述したように、励起光ω１，ω２の代わりに、参照光ωｒと同じ角振動数ωｒの照射光ωｒのみをビームスプリッタ１１１に入射するようにして、照射光ωｒにより試料１０２から発せられる線形物体光と参照光ωｒとの干渉光による線形観察画像を生成する。生成された線形観察画像は、観察画像生成部１５１から計算部１５２に供給される。 In step S3, the nonlinear microscope 101 generates a linear observation image using the irradiation light ωr and the reference light ωr. That is, as described above, the nonlinear microscope 101 causes only the irradiation light ωr having the same angular frequency ωr as that of the reference light ωr to be incident on the beam splitter 111 instead of the excitation light ω1 and ω2, and the irradiation light ωr. A linear observation image is generated by interference light between the linear object light emitted from the sample 102 and the reference light ωr. The generated linear observation image is supplied from the observation image generation unit 151 to the calculation unit 152.

ステップＳ４において、計算部１５２は、ステップＳ２と同様の処理により、線形観察画像に基づいて、線形物体光の複素振幅を計算する。計算部１５２は、線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を補正部１５３に供給する。 In step S4, the calculation unit 152 calculates the complex amplitude of the linear object light based on the linear observation image by the same processing as in step S2. The calculation unit 152 supplies information indicating the calculation result of the complex amplitude of the linear object light to the correction unit 153.

ステップＳ５において、補正部１５３は、非線形物体光の複素振幅の位相を補正する。具体的には、ステップＳ２の処理で計算された非線形物体光の複素振幅の位相には、非線形物体光に含まれるCARS光と非共鳴光との位相差に加えて、試料１０２の屈折率や厚みの分布などにより生じる位相差が反映されている。一方、線形物体光の複素振幅の位相には、CARS光と非共鳴光との位相差以外の、試料１０２の屈折率や厚みの分布などにより生じる位相差が反映されている。従って、非線形物体光の複素振幅の位相から、線形物体光の複素振幅の位相を差し引くことにより、CARS光と非共鳴光との位相差のみに基づいた非線形物体光の複素振幅の位相を得ることができる。補正部１５３は、このようにして非線形物体光の複素振幅の位相を補正し、位相を補正した非線形物体光の複素振幅の計算結果を示す情報を表示画像生成部１５４に供給する。 In step S5, the correction unit 153 corrects the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light. Specifically, the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light calculated in step S2 includes the refractive index of the sample 102, in addition to the phase difference between the CARS light and the non-resonant light included in the nonlinear object light. The phase difference caused by the thickness distribution is reflected. On the other hand, the phase difference caused by the refractive index and thickness distribution of the sample 102 other than the phase difference between the CARS light and the non-resonant light is reflected in the phase of the complex amplitude of the linear object light. Therefore, by subtracting the complex amplitude phase of the linear object light from the complex amplitude phase of the nonlinear object light, the complex amplitude phase of the nonlinear object light based only on the phase difference between the CARS light and the non-resonant light is obtained. Can do. The correction unit 153 corrects the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light in this way, and supplies the display image generation unit 154 with information indicating the calculation result of the complex amplitude of the nonlinear object light whose phase is corrected.

ステップＳ６において、画像処理部１２４は、全ての観察面の処理が終了したか否かを判定する。画像処理部１２４は、予め設定されている試料１０２の奥行き方向（ｚ軸方向）の複数の観察面のうち、まだステップＳ１乃至Ｓ６の処理を行ってない観察面が残っている場合、まだ全ての観察面の処理が終了していないと判定し、処理はステップＳ７に進む。 In step S 6, the image processing unit 124 determines whether or not all the observation planes have been processed. The image processing unit 124, when there are still observation planes that have not been processed in steps S1 to S6 among a plurality of preset observation planes in the depth direction (z-axis direction) of the sample 102, are all. It is determined that the processing of the observation surface is not completed, and the process proceeds to step S7.

ステップＳ７において、非線形顕微鏡１０１は、観察面をシフトする。すなわち、非線形顕微鏡１０１は、図示せぬ制御部の制御の基に、例えば、試料１０２が載置されているステージ(不図示)または対物レンズ１４２をｚ軸方向に移動させて、励起光ω１，ω２および参照光ωｒの集光位置をｚ軸方向にシフトすることにより、観察面をｚ軸方向にシフトする。 In step S7, the nonlinear microscope 101 shifts the observation surface. In other words, the nonlinear microscope 101 moves, for example, a stage (not shown) on which the sample 102 is placed or the objective lens 142 in the z-axis direction based on the control of a control unit (not shown) to generate excitation light ω1, The observation plane is shifted in the z-axis direction by shifting the condensing positions of ω2 and the reference light ωr in the z-axis direction.

その後、処理はステップＳ１に戻り、ステップＳ６において、全ての観察面の処理が終了したと判定されるまで、ステップＳ１乃至Ｓ７の処理が繰返し実行される。これにより、表示画像生成部１５４は、各観察面における非線形物体光の複素振幅の計算結果を取得し、蓄積する。 Thereafter, the process returns to step S1, and the processes of steps S1 to S7 are repeatedly executed until it is determined in step S6 that all the observation planes have been processed. Thereby, the display image generation unit 154 acquires and accumulates the calculation result of the complex amplitude of the nonlinear object light on each observation plane.

一方、ステップＳ６において、全ての観察面の処理が終了したと判定された場合、処理はステップＳ７に進む。 On the other hand, if it is determined in step S6 that all the observation planes have been processed, the process proceeds to step S7.

ステップＳ７において、表示画像生成部１５４は、表示画像を生成する。例えば、表示画像生成部１５４は、非線形物体光の複素振幅の位相情報に基づいて、CARS光と非共鳴光とを分離し、それぞれを画像化する。あるいは、例えば、表示画像生成部１５４は、非線形物体光の強度分布を画像化したり、非線形物体光の位相分布を画像化したりする。さらに、例えば、表示画像生成部１５４は、試料１０２の奥行き方向（ｚ軸方向）の各観察面に対して上記の画像が得られるので、得られた画像を重ね合わせて、３次元の画像を生成する。表示画像生成部１５４は、例えば、生成した表示画像を図示せぬ表示手段に供給し表示させたり、図示せぬ記憶手段に供給し、記憶させたりする。 In step S7, the display image generation unit 154 generates a display image. For example, the display image generation unit 154 separates the CARS light and the non-resonant light based on the complex amplitude phase information of the nonlinear object light, and images each of them. Alternatively, for example, the display image generation unit 154 images the intensity distribution of the nonlinear object light or images the phase distribution of the nonlinear object light. Further, for example, the display image generation unit 154 obtains the above-described image for each observation surface in the depth direction (z-axis direction) of the sample 102, and thus superimposes the obtained images to form a three-dimensional image. Generate. For example, the display image generation unit 154 supplies the generated display image to a display unit (not shown) and displays it, or supplies the display image to a storage unit (not shown) and stores it.

その後、観察処理は終了する。 Thereafter, the observation process ends.

このようにして、試料１０２の観察面において励起光ω１，ω２および参照光を１回走査するだけで、当該観察面における非線形物体光の強度だけでなく、位相情報も簡単に取得することができる。また、非線形物体光の位相情報を利用して、CARS光のみの画像、非線形物体光の位相分布の画像など、種々の画像を得ることができる。 In this way, by scanning the excitation light ω1 and ω2 and the reference light once on the observation surface of the sample 102, not only the intensity of the nonlinear object light on the observation surface but also phase information can be easily obtained. . In addition, using the phase information of the nonlinear object light, various images such as an image of only CARS light and an image of the phase distribution of the nonlinear object light can be obtained.

＜２．第２の実施の形態＞
［非線形顕微鏡の構成例］
図５は、本発明の第２の実施の形態である非線形顕微鏡２０１の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図２と対応する部分には、同じ符合を付してあり、その説明は適宜省略する。 <2. Second Embodiment>
[Configuration example of nonlinear microscope]
FIG. 5 is a block diagram showing an example of the configuration of the nonlinear microscope 201 according to the second embodiment of the present invention. In the figure, the same reference numerals are given to portions corresponding to those in FIG. 2, and the description thereof will be omitted as appropriate.

非線形顕微鏡２０１は、図２の非線形顕微鏡１０１と比較して、ミラー１１６、位相シフタ１１７、ビームスプリッタ１１８、ガルバノミラー１１９、検出器１２２が設けられておらず、ミラー２１１、ステージ２１２、ミラー２１３、レンズ２１４、ミラー２１５、レンズ２１６、ビームスプリッタ２１７、ピンホール２１８、および、検出器２１９が設けられている点が異なる。 Compared with the nonlinear microscope 101 of FIG. 2, the nonlinear microscope 201 is not provided with the mirror 116, the phase shifter 117, the beam splitter 118, the galvano mirror 119, and the detector 122, and the mirror 211, the stage 212, the mirror 213, The difference is that a lens 214, a mirror 215, a lens 216, a beam splitter 217, a pinhole 218, and a detector 219 are provided.

非線形顕微鏡２０１に入射した励起光ω１，ω２は、同じ光路を進んでビームスプリッタ１１１に入射し、ビームスプリッタ１１１を透過して直進する光と、ビームスプリッタ１１１により反射される光に分かれる。 The excitation lights ω 1 and ω 2 that have entered the nonlinear microscope 201 are divided into light that travels on the same optical path, enters the beam splitter 111, passes straight through the beam splitter 111, and is reflected by the beam splitter 111.

ビームスプリッタ１１１を透過した励起光ω１，ω２は、非線形結晶１１２に入射し、非線形結晶１１２おいて参照光ωｒが生成され、射出される。非線形結晶１１２から射出された参照光ωｒは、フィルタ１１３を透過し、ミラー１１４、遅延回路１１５内のミラー１３１およびミラー１３２、並びに、ミラー２１１により、試料１０２が載置されているステージ２１２に設けられているミラー２１３に入射する。さらに、参照光ωｒは、ミラー２１３によりレンズ２１４の方向に反射され、レンズ２１４を透過し、ミラー２１５により反射され、レンズ２１６を透過し、ビームスプリッタ２１７により反射され、ピンホール２１８を通過して、PMT（光電子倍増管）などの光検出器、A/D変換器などから構成される検出器２１９に入射する。 The excitation lights ω 1 and ω 2 that have passed through the beam splitter 111 are incident on the nonlinear crystal 112, and the reference light ωr is generated and emitted from the nonlinear crystal 112. The reference light ωr emitted from the nonlinear crystal 112 passes through the filter 113 and is provided on the stage 212 on which the sample 102 is placed by the mirror 114, the mirror 131 and the mirror 132 in the delay circuit 115, and the mirror 211. Is incident on the mirror 213. Further, the reference light ωr is reflected in the direction of the lens 214 by the mirror 213, transmitted through the lens 214, reflected by the mirror 215, transmitted through the lens 216, reflected by the beam splitter 217, and passed through the pinhole 218. , PMT (photomultiplier tube) and other detectors, and an A / D converter.

一方、ビームスプリッタ１１１により反射された励起光ω１，ω２は、倒立顕微鏡１２０のミラー１４１により対物レンズ１４２の方向に反射され、対物レンズ１４２を介して、試料１０２の観察面において集光する。そして、試料１０２の観察面の励起光ω１，ω２が集光した位置において、図１を参照して上述した共鳴過程および非共鳴過程が起こり、角振動数ωｒのCARS光および非共鳴光を含む非線形物体光が発せられる。試料１０２から発せられた非線形物体光は、レンズ１２１により集光され、ピンホール２１８を通過し、検出器２１９に入射する。 On the other hand, the excitation light ω 1 and ω 2 reflected by the beam splitter 111 are reflected in the direction of the objective lens 142 by the mirror 141 of the inverted microscope 120 and are condensed on the observation surface of the sample 102 via the objective lens 142. Then, the resonance process and the non-resonance process described above with reference to FIG. 1 occur at the position where the excitation lights ω1 and ω2 on the observation surface of the sample 102 are collected, and the CARS light and the non-resonance light having the angular frequency ωr are included. Non-linear object light is emitted. The nonlinear object light emitted from the sample 102 is collected by the lens 121, passes through the pinhole 218, and enters the detector 219.

検出器２１９は、所定の間隔で入射光の強度を検出し、検出した強度を示すデジタルの電気信号を画像処理部１２４に供給する。 The detector 219 detects the intensity of incident light at a predetermined interval, and supplies a digital electric signal indicating the detected intensity to the image processing unit 124.

このとき、図示せぬ制御部の制御の基に、ステージ２１２がｘ軸およびｙ軸方向に移動することにより、励起光ω１，ω２が、試料１０２の観察面上において、例えばラスタ順に走査される。そして、検出器１２２は、ステージ２１２がｘ軸方向に所定の距離だけ移動し、励起光ω１，ω２の集光位置がｘ軸方向に所定の距離だけ移動する毎に、および、ｘ軸方向の１ライン分の走査が終わり、集光位置が次のラインの先頭に移動する毎に、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度を検出する。これにより、試料１０２の観察面にわたって、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の強度が検出器２１９により検出される。 At this time, the stage 212 moves in the x-axis and y-axis directions under the control of a control unit (not shown), so that the excitation light ω1 and ω2 are scanned on the observation surface of the sample 102, for example, in raster order. . The detector 122 moves each time the stage 212 moves by a predetermined distance in the x-axis direction, and whenever the condensing position of the excitation light ω1 and ω2 moves by a predetermined distance in the x-axis direction, and in the x-axis direction. Every time the scanning for one line is completed and the condensing position moves to the head of the next line, the intensity of the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr is detected. Thereby, the intensity of the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr is detected by the detector 219 over the observation surface of the sample 102.

また、ステージ２１２がｘ軸およびｙ軸方向に移動するのに合わせて、ステージ２１２に設けられているミラー２１３も移動する。さらに、ミラー２１３の反射面は、ステージ２１２の面に対してｙ軸回りに角度θだけ傾けて設置されている。従って、ステージ２１２のｘ軸方向の位置により、参照光ωｒのミラー２１３へのｘ軸およびｚ軸方向の入射位置が異なり、その結果、ミラー２１１から検出器２１９までの参照光ωｒの光路長が変化する。 As the stage 212 moves in the x-axis and y-axis directions, the mirror 213 provided on the stage 212 also moves. Further, the reflecting surface of the mirror 213 is installed with an angle θ around the y axis with respect to the surface of the stage 212. Therefore, the incident position of the reference light ωr on the mirror 213 in the x-axis and z-axis directions differs depending on the position of the stage 212 in the x-axis direction. As a result, the optical path length of the reference light ωr from the mirror 211 to the detector 219 is Change.

例えば、検出器２１９が干渉光を検出してから次に検出するまでの間にステージ２１２およびミラー２１３がｘ軸方向に移動する距離をΔｘとすると、ステージ２１２のｘ軸方向の位置がＸのときに干渉光が検出され、次にステージ２１２が位置Ｘ＋Δｘのときに干渉光が検出された場合、この２点間における参照光ωｒの光路長の差は、Δｘ・sin2θとなる。そして、この光路長の差により、検出器２１９における参照光ωｒの位相が９０度ずれ、非線形顕微鏡１０１と同様に、検出器２１９が干渉光の強度を４回検出する毎に参照光ωｒの位相が１波長分シフトするように、角度θが調整される。 For example, if the distance that the stage 212 and the mirror 213 move in the x-axis direction after the detector 219 detects the interference light until the next detection is Δx, the position of the stage 212 in the x-axis direction is X When the interference light is sometimes detected, and then when the stage 212 is at the position X + Δx, the difference in the optical path length of the reference light ωr between the two points is Δx · sin 2θ. Then, due to the difference in optical path length, the phase of the reference light ωr in the detector 219 is shifted by 90 degrees. Similarly to the nonlinear microscope 101, the phase of the reference light ωr is detected every time the detector 219 detects the intensity of the interference light four times. Is adjusted to shift by one wavelength.

これにより、位相シフタ１１７を用いずに、観察画像生成部１５１において、非線形顕微鏡１０１で得られた観察画像とほぼ同等の観察画像を得ることができる。 As a result, the observation image generation unit 151 can obtain an observation image substantially equivalent to the observation image obtained by the nonlinear microscope 101 without using the phase shifter 117.

また、非線形顕微鏡２０１は、非線形顕微鏡１０１と同様に、参照光と同じ角振動数の照射光を試料１０２に照射するようにして、走査型の線形ホログラフィック顕微鏡として使用することも可能である。 Further, similarly to the nonlinear microscope 101, the nonlinear microscope 201 can be used as a scanning linear holographic microscope by irradiating the sample 102 with irradiation light having the same angular frequency as the reference light.

なお、画像処理部１２４の処理は、非線形顕微鏡１０１の場合と同様であり、その説明は繰返しになるので省略する。 Note that the processing of the image processing unit 124 is the same as in the case of the nonlinear microscope 101, and a description thereof will be omitted because it will be repeated.

＜３．第３の実施の形態＞
［非線形顕微鏡の構成例］
図６は、本発明の第３の実施の形態である非線形顕微鏡３０１の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図５と対応する部分には、同じ符合を付してあり、その説明は適宜省略する。 <3. Third Embodiment>
[Configuration example of nonlinear microscope]
FIG. 6 is a block diagram showing an example of the configuration of the nonlinear microscope 301 according to the third embodiment of the present invention. In the figure, the same reference numerals are given to portions corresponding to those in FIG. 5, and the description thereof will be omitted as appropriate.

非線形顕微鏡３０１は、図５の非線形顕微鏡２０１と比較して、遅延回路１１５、ミラー２１１、ステージ２１２、ミラー２１３、レンズ２１４、ミラー２１５、レンズ２１６、および、画像処理部１２４が設けられておらず、遅延回路３１１、ミラー３１２、ステージ３１３、および、画像処理部３１４が設けられている点が異なる。また、画像処理部３１４と、図５の画像処理部１２４とは、計算部１５２の代わりに計算部３５１が設けられている点が異なる。 Compared with the nonlinear microscope 201 in FIG. 5, the nonlinear microscope 301 is not provided with the delay circuit 115, the mirror 211, the stage 212, the mirror 213, the lens 214, the mirror 215, the lens 216, and the image processing unit 124. The delay circuit 311, the mirror 312, the stage 313, and the image processing unit 314 are provided. Further, the image processing unit 314 and the image processing unit 124 of FIG. 5 are different in that a calculation unit 351 is provided instead of the calculation unit 152.

非線形顕微鏡３０１において、励起光ω１，ω２、および、励起光ω１，ω２により試料１０２から発せられる非線形物体光は、非線形顕微鏡２０１と同じ光路を進む。一方、参照光ωｒは、非線形結晶１１２で生成された後、フィルタ１１３を透過し、遅延回路３１１内のミラー３３１およびミラー３３２、並びに、ミラー３１２により、ビームスプリッタ２１７の方向に反射される。さらに、参照光ωｒは、ビームスプリッタ２１７により反射され、ピンホール２１８を通過し、検出器２１９に入射する。 In the nonlinear microscope 301, the excitation light ω 1 and ω 2 and the nonlinear object light emitted from the sample 102 by the excitation light ω 1 and ω 2 travel on the same optical path as the nonlinear microscope 201. On the other hand, the reference light ωr is generated by the nonlinear crystal 112, then passes through the filter 113, and is reflected in the direction of the beam splitter 217 by the mirror 331 and the mirror 332 and the mirror 312 in the delay circuit 311. Further, the reference light ωr is reflected by the beam splitter 217, passes through the pinhole 218, and enters the detector 219.

また、非線形顕微鏡３０１では、非線形顕微鏡２０１と同様に、図示せぬ制御部の制御の基に、ステージ３１３がｘ軸およびｙ軸方向に移動することにより、励起光ω１，ω２が、試料１０２の観察面上において、例えばラスタ順に走査される。 Further, in the nonlinear microscope 301, similarly to the nonlinear microscope 201, the stage 313 moves in the x-axis and y-axis directions under the control of a control unit (not shown), so that the excitation light ω 1 and ω 2 On the observation surface, scanning is performed, for example, in raster order.

さらに、非線形顕微鏡３０１では、非線形顕微鏡１０１および非線形顕微鏡２０１と観察画像の生成方法（図３のステップＳ１およびステップＳ３の処理）、および、物体光の複素振幅の計算方法（図３のステップＳ２およびステップＳ４の処理）が異なる。 Further, in the nonlinear microscope 301, the nonlinear microscope 101 and the nonlinear microscope 201 and an observation image generation method (processing in step S1 and step S3 in FIG. 3), and a complex amplitude calculation method for object light (step S2 in FIG. 3 and Step S4 is different).

具体的には、非線形顕微鏡３０１は、参照光ωｒの位相を固定したまま、観察面にわたって、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光を検出器２１９により検出し、非線形観察画像を生成する。また、非線形顕微鏡３０１は、１つの観察面につき、遅延回路３１１により参照光ωｒの位相を９０度ずつ４回変化させて、位相が異なる４種類の参照光ωｒを用いて、観察面にわたる非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光を検出し、４種類の非線形観察画像を生成する。 Specifically, the nonlinear microscope 301 detects the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr across the observation surface with the phase of the reference light ωr fixed, and generates a nonlinear observation image. In addition, the nonlinear microscope 301 changes the phase of the reference light ωr four times by 90 degrees by the delay circuit 311 for each observation surface, and uses four types of reference light ωr having different phases, so that a nonlinear object over the observation surface is obtained. The interference light between the light and the reference light ωr is detected, and four types of nonlinear observation images are generated.

そして、計算部３５１は、得られた４種類の観察画像に基づいて、以下の方法で非線形物体光の複素振幅を計算する。 And the calculation part 351 calculates the complex amplitude of nonlinear object light with the following method based on the obtained four types of observation images.

例えば、検出器２１９上での非線形物体光の複素振幅U(x,y)＝A(x,y)exp[iφ(x,y)]、参照光ωｒの複素振幅をU_R(φ)＝A_Rexp(iφ_R)とすると、非線形物体光と参照光ωｒとの干渉光の光強度I(x,y;φ_R)は、次式（４）で与えられる。 For example, the complex amplitude U (x, y) = A (x, y) exp [iφ (x, y)] of the nonlinear object light on the detector 219, and the complex amplitude of the reference light ωr is represented by U _R (φ) = If A _R exp (iφ _R ), the light intensity I (x, y; φ _R ) of the interference light between the nonlinear object light and the reference light ωr is given by the following equation (4).

例えば、上述したように、１つの観察面に対して、参照光ωｒの位相を９０度（π／２ラジアン）ずつ変化させ、４種類の非線形観察画像を取得したとすると、非線形物体光の位相φ(x,y)は、次式（５）により計算される。 For example, as described above, assuming that four types of nonlinear observation images are acquired by changing the phase of the reference light ωr by 90 degrees (π / 2 radians) with respect to one observation plane, the phase of the nonlinear object light is obtained. φ (x, y) is calculated by the following equation (5).

一方、非線形物体光の複素振幅の絶対値｜A(x,y)｜は、参照光ωｒをブロックすることにより得られる。従って、非線形物体光の複素振幅を得ることができる。 On the other hand, the absolute value | A (x, y) | of the complex amplitude of the nonlinear object light is obtained by blocking the reference light ωr. Therefore, the complex amplitude of the nonlinear object light can be obtained.

なお、線形物体光の複素振幅についても、同様の処理に得ることができる。 The complex amplitude of the linear object light can be obtained by the same process.

なお、以上の計算方法も、従来のデジタルホログラフィで行われているのと同様の計算方法である。 The above calculation method is also the same calculation method as that performed in the conventional digital holography.

このように、非線形顕微鏡３０１では、励起光ω１，ω２の走査に同期して、参照光ωｒの位相をシフトする制御を行わずに、非線形物体光および線形物体光の複素振幅を得ることができる。そして、非線形顕微鏡１０１および非線形顕微鏡２０１と同様の表示画像を得ることができる。 As described above, the nonlinear microscope 301 can obtain the complex amplitudes of the nonlinear object light and the linear object light without performing control to shift the phase of the reference light ωr in synchronization with the scanning of the excitation lights ω1 and ω2. . A display image similar to that of the nonlinear microscope 101 and the nonlinear microscope 201 can be obtained.

＜４．変形例＞
なお、以上の説明では、透過型の照明を用いる例を示したが、本発明は、落射型の照明を用いる場合にも適用できる。 <4. Modification>
In the above description, an example in which transmissive illumination is used has been described, but the present invention can also be applied to the case of using epi-illumination.

また、図３のステップＳ３乃至Ｓ５の処理は必ずしも行う必要はなく、省略することが可能である。さらに、３次元の表示画像を取得する必要がない場合は、図３のステップＳ６およびステップＳ７の処理を省略することが可能である。 Further, the processes in steps S3 to S5 in FIG. 3 are not necessarily performed and can be omitted. Furthermore, when it is not necessary to acquire a three-dimensional display image, the processes in steps S6 and S7 in FIG. 3 can be omitted.

さらに、以上の説明では、CARSを利用する顕微鏡の例を示したが、本発明は、例えば、SHG、THG、4光波混合、和周波発生などのコヒーレントな非線形光学効果を利用する顕微鏡に適用することができる。 Further, in the above description, an example of a microscope using CARS has been shown. However, the present invention is applied to a microscope using a coherent nonlinear optical effect such as SHG, THG, four-wave mixing, and sum frequency generation. be able to.

また、以上の説明では、非線形顕微鏡１０１および非線形顕微鏡２０１において、参照光ωｒの位相シフト量を９０度に設定する例を示したが、提示した例に限定されるものではない。ただし、９０度前後が望ましい。例えば、９０度±３０度の範囲である。なお、観察画像において干渉縞が明確に現れるように、位相シフト量を小さくしすぎないようにすることが望ましい。 In the above description, the example in which the phase shift amount of the reference light ωr is set to 90 degrees in the nonlinear microscope 101 and the nonlinear microscope 201 is shown, but the present invention is not limited to the presented example. However, around 90 degrees is desirable. For example, the range is 90 degrees ± 30 degrees. Note that it is desirable not to make the phase shift amount too small so that interference fringes appear clearly in the observed image.

さらに、以上の説明では、非線形顕微鏡３０１において、参照光ωｒの位相シフト量を９０度に設定する例を示したが、提示した例に限定されるものではなく、３６０／ｎ（ｎは３以上の整数）度に設定することが可能である。なお、スキャン回数を減らし、処理時間を短縮するために、ｎの値を大きくしすぎないようにすることが望ましい。 Further, in the above description, an example in which the phase shift amount of the reference light ωr is set to 90 degrees in the nonlinear microscope 301 is shown, but the present invention is not limited to the presented example, and 360 / n (n is 3 or more) Integer) degrees. In order to reduce the number of scans and shorten the processing time, it is desirable not to make the value of n too large.

また、非線形顕微鏡２０１において、ミラー２１３の代わりに、ステージ２１２とともに移動し、参照光ωｒの入射位置によって検出器２１９までの光路長を変化させる部材を設けるようにしてもよい。 Further, in the nonlinear microscope 201, a member that moves with the stage 212 instead of the mirror 213 and changes the optical path length to the detector 219 depending on the incident position of the reference light ωr may be provided.

さらに、画像処理部１２４または画像処理部３１４を、非線形顕微鏡とは別に設けるようにしてもよい。 Furthermore, the image processing unit 124 or the image processing unit 314 may be provided separately from the nonlinear microscope.

また、本明細書において、フローチャートに記述されたステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる場合はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列に、あるいは呼び出しが行われたとき等の必要なタイミングで実行されてもよい。 In addition, in this specification, the steps described in the flowcharts are performed in parallel or in a call even if they are not necessarily processed in chronological order, as well as performed in chronological order according to the described order. It may be executed at a necessary timing such as when.

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明
の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。 The embodiment of the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made without departing from the gist of the present invention.

１０１非線形顕微鏡，１０２試料，１１１ビームスプリッタ，１１２非線形結晶，１１７位相シフタ，１１８ビームスプリッタ，１１９ガルバノミラー，１２０倒立顕微鏡，１２１レンズ，１２２検出器，１２３同期回路，１２４画像処理部，１４２対物レンズ，１５１観察画像生成部，１５２計算部，１５３補正部，１５４表示画像生成部，２０１非線形顕微鏡，２１２ステージ，２１３ミラー，２１４，２１６レンズ，２１７ビームスプリッタ，２１８ピンホール，２１９検出器，３０１非線形顕微鏡，３１１遅延回路，３１３ステージ，３１４画像処理部，３５１計算部 101 nonlinear microscope, 102 sample, 111 beam splitter, 112 nonlinear crystal, 117 phase shifter, 118 beam splitter, 119 galvanometer mirror, 120 inverted microscope, 121 lens, 122 detector, 123 synchronization circuit, 124 image processing unit, 142 objective lens , 151 Observation image generation unit, 152 calculation unit, 153 correction unit, 154 display image generation unit, 201 nonlinear microscope, 212 stage, 213 mirror, 214, 216 lens, 217 beam splitter, 218 pinhole, 219 detector, 301 nonlinear Microscope, 311 delay circuit, 313 stage, 314 image processing unit, 351 calculation unit

Claims

In a nonlinear microscope that irradiates a sample with excitation light and observes a nonlinear object light emitted from the sample by a nonlinear optical effect,
Scanning means for scanning the excitation light on the observation surface of the sample;
Reference light generating means for generating reference light having the same angular frequency as that of the nonlinear object light from the excitation light;
And phase shifting means for shifting the phase of the reference light,
Detecting means for detecting first interference light between the nonlinear object light and the reference light ;
Image generating means for generating a first image based on the first interference light;
Calculating means for calculating a complex amplitude of the nonlinear object light based on the first image;
Correction means for correcting the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light ,
The phase shift means shifts the phase of the reference light by a predetermined angle each time the position of the excitation light on the observation surface moves by a predetermined distance in a predetermined direction ,
Linear object light emitted by scanning the observation surface of the sample with irradiation light having the same angular frequency as the reference light by the scanning means, the phase shift means, and the detection means, and the reference light Further detecting the second interference light of
The image generation means further generates a second image based on the second interference light,
The calculating means further calculates a complex amplitude of the linear object light based on the second image;
The nonlinear microscope characterized in that the correcting means corrects the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light based on the phase of the complex amplitude of the linear object light .

The scanning means scans the excitation light on the observation surface by changing a traveling direction of the excitation light,
The nonlinear microscope according to claim 1, wherein the phase shift unit shifts the phase of the reference light in synchronization with the movement of the scanning unit.

The scanning means scans the excitation light on the observation surface by moving a stage on which the sample is placed,
The phase shift means moves with the stage and shifts the phase of the reference light by changing an optical path length of the reference light to the detection means depending on a position where the reference light is incident. The nonlinear microscope according to claim 1.

In a nonlinear microscope that irradiates a sample with excitation light and observes a nonlinear object light emitted from the sample by a nonlinear optical effect,
Scanning means for scanning the excitation light on the observation surface of the sample;
Reference light generating means for generating reference light having the same angular frequency as that of the nonlinear object light from the excitation light;
And phase shifting means for shifting the phase of the reference light,
Detecting means for detecting first interference light between the nonlinear object light and the reference light ;
Image generating means for generating a first image based on the first interference light;
Calculating means for calculating a complex amplitude of the nonlinear object light based on the first image;
Correction means for correcting the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light ,
The detection means detects the first interference light over the observation surface at least n times using the n types of the reference lights having phases different by 360 / n degrees (n is an integer of 3 or more) ,
Linear object light emitted by scanning the observation surface of the sample with irradiation light having the same angular frequency as the reference light by the scanning means, the phase shift means, and the detection means, and the reference light Further detecting the second interference light of
The image generation means further generates a second image based on the second interference light,
The calculating means further calculates a complex amplitude of the linear object light based on the second image;
The nonlinear microscope characterized in that the correcting means corrects the phase of the complex amplitude of the nonlinear object light based on the phase of the complex amplitude of the linear object light .

In a nonlinear microscope that irradiates a sample with excitation light and observes a nonlinear object light emitted from the sample by a nonlinear optical effect,
Scanning means for scanning the excitation light on the observation surface of the sample;
Reference light generating means for generating reference light having the same angular frequency as that of the nonlinear object light from the excitation light;
Phase shift means for shifting the phase of the reference light;
Detecting means for detecting interference light between the nonlinear object light and the reference light;
With
The scanning means scans the excitation light on the observation surface by moving a stage on which the sample is placed,
The phase shift means moves with the stage, and changes the optical path length of the reference light to the detection means according to the position where the reference light is incident, whereby the position of the excitation light on the observation surface is in a predetermined direction. Every time a predetermined distance moves, the phase of the reference light is shifted by a predetermined angle.
A nonlinear microscope characterized by this.