JP2014081417A - Laser scanning microscope device - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a laser scanning microscope device which can measure or observe even a moving object, and enlarge and observe movements of a fine part of the moving object as well.SOLUTION: A laser light source 1 emits laser beam, and an acousto-optical element 3 modulates the laser beam to light of two frequencies respectively and emits them in mutually different directions. The light is two-dimensionally scanned by a two-dimensional scanning device 6, a part of the light is partially separated by a beam splitter 7, photoelectric conversion is performed by a light receiving element 8, and respective beat signals are sent out. Light from the laser light source 1 is emitted by an objective lens 11 to a sample S while it is brought closer by pupil transmission lens systems 5, 10, photoelectric conversion of transmission light from the sample S is performed by a light receiving element 9, and respective beat signals are sent out. A phase difference obtained on the basis of the beat signals from the light receiving elements 8, 9 is detected by a signal comparator 15, and a data processing control unit 16 performs data processing to obtain information about the sample S and matches a view point to an object in the sample S on the basis of the data processing.

Description

本発明は、レーザー光の走査によって測定対象物の表面形状のプロファイルや測定対象物である細胞等の表面状態の計測および観察を高速に行うレーザー走査顕微鏡装置に関するものである。   The present invention relates to a laser scanning microscope apparatus that performs high-speed measurement and observation of a surface shape profile of a measurement object and a surface state of a cell that is the measurement object by scanning with a laser beam.

微少なものを高精度に測定したり観察したりするものとして、光ヘテロダイン干渉法がよく知られている。これは、周波数の異なる2つのレーザー光を干渉させて、その差の周波数のビート信号を作成し、このビート信号の位相変化を検出することで、被測定物を測定や観察するものである。   Optical heterodyne interferometry is well known as a method for measuring and observing minute objects with high accuracy. In this method, two laser beams having different frequencies are caused to interfere with each other, a beat signal having a frequency difference between them is generated, and a change in the phase of the beat signal is detected to measure or observe the object to be measured.

そして、下記特許文献1の特開昭59−214706号公報には、音響光学素子を用いて異なる波長からなる2つのビームを隣接して発生させ、これら2ビーム間の位相変化を検出し、その位相変化を累積して表面プロファイルを得る方法が開示されている。しかし、この特許文献1の技術では、ビームプロファイル内の情報を引き出すことはできず、面内であるビームプロファイル内の分解能を高くすることは出来なかった。   In Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-214706 of Patent Document 1 below, two beams having different wavelengths are generated adjacent to each other using an acousto-optic device, and a phase change between these two beams is detected. A method for accumulating phase changes to obtain a surface profile is disclosed. However, in the technique of Patent Document 1, information in the beam profile cannot be extracted, and the resolution in the beam profile that is in the plane cannot be increased.

他方、従来よりDPC(Differential Phase Contrast)法と呼ばれる手法が知られている。これは、最初Dekkers and de Langにより電子顕微鏡に適用された技術であり、その後、Sheppard and Wilson等により光学的顕微鏡への拡張がなされた技術である。すなわち、このDPC法は、被測定物である対象物に照射された電磁波に対してファーフィールドであって、この電磁波の照射軸に対して対称に配置されたディテクタ同士の差動信号を検出することにより、対象物のプロファイル情報を得るものである。   On the other hand, a technique called a DPC (Differential Phase Contrast) method has been conventionally known. This is a technique that was first applied to an electron microscope by Dekkers and de Lang, and was later extended to an optical microscope by Sheppard and Wilson et al. That is, the DPC method detects a differential signal between detectors arranged in a far field with respect to an electromagnetic wave irradiated to an object to be measured and symmetrical with respect to an irradiation axis of the electromagnetic wave. Thus, the profile information of the object is obtained.

この一方、本発明者たちは、音響光学素子等を用いることで、相互にわずかに異なる周波数を有しつつ相互にわずかな照射位置ずれを生じさせた2つのビームを走査させ、ファーフィールドに配置した複数の受光素子で得たこれら2ビーム間の位相変化からの差動出力をヘテロダイン検波する方式を案出している。つまり、この手法は、DPC法とヘテロダイン法を融合させたような手法を用いたものともいえ、この手法により対象物の表面プロファイルを得るものであった。   On the other hand, using the acousto-optic device, the present inventors scan two beams that have slightly different frequencies and cause a slight misalignment between each other, and place them in the far field. A system has been devised for heterodyne detection of the differential output from the phase change between these two beams obtained by a plurality of light receiving elements. That is, this method can be said to be a method using a fusion of the DPC method and the heterodyne method, and the surface profile of the object is obtained by this method.

これらDPC法を用いた手法や、DPC法とヘテロダイン法を融合させた手法は、一走査にて3次元プロファイル情報を取得できるので、非常に高速な処理ができ、透明な細胞やプランクトンを生きたまましかも染色等の手段を用いることなく観察でき、またナノ粒子等の観察も可能であり、非常に有益な計測、観察手段といえる。   These methods using the DPC method and methods combining the DPC method and the heterodyne method can acquire three-dimensional profile information in one scan, so that very high-speed processing can be performed, and transparent cells and plankton lived. In addition, it can be observed without using means such as staining, and nanoparticles can be observed, which can be said to be a very useful measurement and observation means.

特開昭59−214706号公報JP 59-214706 A

しかしながら、プランクトンや細胞などは自発的に3次元的に移動するし、ナノ粒子等の計測においてもブラウン運動等で計測、観察したい測定対象物とされる対象物が動いてしまい十分な計測や観察はできなかった。さらにこれに伴って、対象物の細部の動きを特に拡大して見ることは、従来の手法であっても困難を極めていた。   However, plankton, cells, etc. move spontaneously in three dimensions, and even in the measurement of nanoparticles etc., the measurement object to be measured and observed by Brownian motion etc. moves, and sufficient measurement and observation I couldn't. Further, along with this, it is extremely difficult to see the detailed movement of the object in a particularly enlarged manner even with the conventional method.

本発明は上記背景に鑑みてなされたもので、移動する対象物でも計測や観察を可能とし、さらには移動する対象物の細部の動きを拡大して観察することをも可能とするレーザー走査顕微鏡装置を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above-described background, and enables a laser scanning microscope that enables measurement and observation of a moving object, and further enables observation of an enlarged movement of details of the moving object. An object is to provide an apparatus.

上記目的を達成させるために、本発明は、レーザー光を出射するレーザー光源と、
レーザー光を2次元走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、3次元的に移動し得る対称物を有した試料に対してレーザー光を出射する対物レンズと、
試料からの反射光あるいは透過光を受光する受光素子と、
前記受光素子からの出力差の情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置とされるものである。
In order to achieve the above object, the present invention provides a laser light source that emits laser light,
A scanning optical element for two-dimensionally scanning laser light;
An objective lens that emits laser light to a sample having a pupil position and a symmetrical object that can move three-dimensionally;
A light receiving element for receiving reflected light or transmitted light from the sample;
A data processing control unit that obtains information on an output difference from the light receiving element and performs data processing, and matches a viewpoint to an object in the sample based on the data processing,
It is set as the laser scanning microscope apparatus characterized by including.

さらに、本発明は、レーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ、相互に異なる方向に出射する光変調器と、
2つの光を2次元走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、3次元的に移動し得る対称物を有した試料に対して2つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器で相互に異なる方向に出射された各々の光を試料上で近接させる瞳伝達レンズ系と、
試料からの反射光あるいは透過光を受光し光電変換してビート信号を発生する受光素子と、
前記受光素子のビート信号に基づいて得られた2つの光同士の位相差およびビート信号自体の振幅を検出する信号比較器と、
前記信号比較器で検出された位相差による位相情報と振幅による強度情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置とされるものである。
Furthermore, the present invention provides a laser light source that emits laser light,
An optical modulator that emits light in different directions while modulating the laser light into two lights having different frequencies;
A scanning optical element for two-dimensionally scanning two lights;
An objective lens that emits two lights to a sample having a pupil position and a symmetrical object that can move three-dimensionally;
A pupil transfer lens system that is positioned between the light modulator and the objective lens and causes the light emitted in the mutually different directions by the light modulator to approach each other on the sample;
A light receiving element that receives reflected light or transmitted light from the sample and photoelectrically converts it to generate a beat signal; and
A signal comparator for detecting a phase difference between two lights obtained based on a beat signal of the light receiving element and an amplitude of the beat signal itself;
A data processing control unit that obtains phase information based on the phase difference detected by the signal comparator and intensity information based on the amplitude to perform data processing, and matches a viewpoint to an object in the sample based on the data processing,
It is set as the laser scanning microscope apparatus characterized by including.

また、本発明においては、前記光変調器からの光を一部分離すると共に前記試料からの反射光を反射するビームスプリッターを有し、
前記受光素子が、
前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第1の受光素子と、
前記ビームスプリッターで反射した前記試料からの反射光を受光する第2の受光素子と、
を含み、
第1の受光素子で受光した変調信号と第2の受光素子で受光した出力信号とのビート信号を信号比較器で作成するものが好適である。
同じく、前記光変調器からの光を一部分離するビームスプリッターを有し、
前記受光素子が、
前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第1の受光素子と、
前記試料からの透過光を受光する第2の受光素子と、
を含み、
第1の受光素子で受光した変調信号と第2の受光素子で受光した出力信号とのビート信号を信号比較器で作成するものが好適である。
In the present invention, a beam splitter that partially separates the light from the light modulator and reflects the reflected light from the sample,
The light receiving element is
A first light receiving element for receiving the light separated by the beam splitter;
A second light receiving element for receiving reflected light from the sample reflected by the beam splitter;
Including
It is preferable to use a signal comparator to create a beat signal between the modulation signal received by the first light receiving element and the output signal received by the second light receiving element.
Similarly, having a beam splitter that partially separates the light from the light modulator,
The light receiving element is
A first light receiving element for receiving the light separated by the beam splitter;
A second light receiving element for receiving transmitted light from the sample;
Including
It is preferable to use a signal comparator to create a beat signal between the modulation signal received by the first light receiving element and the output signal received by the second light receiving element.

他方、本発明に係わる信号比較器が、前記光変調器に印加された変調信号と前記受光素子の出力信号とのビート信号を作成することで、該ビート信号に基づいて得られた2つの光同士の位相差とビート信号自体の振幅を検出することが好適である。また、本発明に係わる光変調器は、前記レーザー光源から出射されたレーザー光を入射させる音響光学素子と該音響光学素子にキャリア交流信号(fc)と正弦波信号(fm)を印加する信号発生器とを含むことが好適である。さらに、本発明に係わる走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーの1次元走査素子、2つの1次元走査デバイスと瞳伝達レンズ系よりなる2次元走査光学系、あるいは、1次元または2次元のマイクロミラーデバイスとされることが好適である。   On the other hand, the signal comparator according to the present invention creates a beat signal between the modulation signal applied to the optical modulator and the output signal of the light receiving element, so that two lights obtained based on the beat signal are obtained. It is preferable to detect the phase difference between each other and the amplitude of the beat signal itself. An optical modulator according to the present invention includes an acoustooptic device that makes the laser beam emitted from the laser light source incident thereon, and a signal generator that applies a carrier AC signal (fc) and a sine wave signal (fm) to the acoustooptic device. Is preferably included. Further, the scanning optical element according to the present invention includes a one-dimensional scanning element of a galvano mirror and a resonant mirror, a two-dimensional scanning optical system comprising two one-dimensional scanning devices and a pupil transfer lens system, or a one-dimensional or two-dimensional microscopic element. It is preferable to be a mirror device.

一方、本発明に係わる受光素子もしくは前記第2の受光素子は、前記光変調器で異なる方向に出射された光の分離方向に垂直な方向に少なくとも2分割された分割受光素子とされることが好適である。また、本発明に係わる受光素子の出力は、前記受光素子の2分割以上された分割受光素子のすべての分割受光素子の和信号、または2分割以上された分割受光素子の対応する位置にある分割受光素子同士の差信号より取得することが好適である。   On the other hand, the light receiving element according to the present invention or the second light receiving element may be a divided light receiving element that is divided into at least two parts in a direction perpendicular to a separation direction of light emitted in different directions by the light modulator. Is preferred. The output of the light receiving element according to the present invention is the sum signal of all the divided light receiving elements of the divided light receiving elements divided into two or more of the light receiving elements, or the division at the corresponding position of the divided light receiving elements divided into two or more. It is preferable to obtain from a difference signal between the light receiving elements.

さらに、本発明は、搭載台に前記試料が載せられたレーザー走査顕微鏡装置であって、
前記対象物の存在する対象領域を特定する第1の過程と、
該対象領域の強度情報を2値化して重心検出を行う第2の過程と、
前記強度情報のヒストグラムのばらつき程度を評価する第3の過程と、
該ばらつきの大きい方向を特定する第4の過程と、
よりなる各過程を有し、
搭載台を移動することで、第2の過程から算出された重心位置に前記試料内の対象物を動かし、
第4の過程により対物レンズをばらつきの大きい方向に動かすことが好適である。
また、本発明は、前記第4の過程において、対物レンズを微小振動させてばらつきの大きい方向に対物レンズを動かすことが好適である。
Furthermore, the present invention is a laser scanning microscope apparatus in which the sample is placed on a mounting table,
A first step of identifying a target area where the target object exists;
A second step of binarizing the intensity information of the target region to detect the center of gravity;
A third step of evaluating the degree of variation in the histogram of the intensity information;
A fourth process for identifying the direction in which the variation is large;
Each process consisting of
By moving the mounting table, the object in the sample is moved to the center of gravity calculated from the second process,
It is preferable to move the objective lens in the direction of large variation by the fourth process.
In the fourth process according to the present invention, it is preferable that in the fourth process, the objective lens is vibrated slightly to move the objective lens in a direction in which variation is large.

この他、本発明は、赤外光を出射する近赤外レーザー光源と、
該近赤外レーザー光源からの赤外光を平行光とするコリメーターレンズと、
前記瞳伝達レンズ系と前記対物レンズとの間もしくは前記瞳伝達レンズ系と前記2次元走査デバイスとの間の光軸上に配し、かつ赤外光を反射して試料側に送る副ビームスプリッターと、
を含むことが好適である。
また、本発明に係わる赤外カットフィルターが、前記受光素子と赤外光の導入光路との間に配置されたことが好適である。
In addition, the present invention provides a near-infrared laser light source that emits infrared light;
A collimator lens that collimates infrared light from the near-infrared laser light source;
A sub-beam splitter disposed on the optical axis between the pupil transmission lens system and the objective lens or between the pupil transmission lens system and the two-dimensional scanning device and reflecting infrared light to the sample side When,
Is preferably included.
In addition, it is preferable that the infrared cut filter according to the present invention is disposed between the light receiving element and an infrared light introducing optical path.

請求項に係る発明の作用を以下に説明する。
DPC法および、DPC法とヘテロダイン法の融合方法によれば、1走査で3次元プロファイル情報を取得できるので、その情報をもとにして以下の演算がおこなわれる。
具体的には、3次元的に移動し得る対称物を有した試料からの画像を経時的に連続して取得して画像データを各フレーム毎に得ると共に、この対象物の演算領域を特定し、対象物の観察から得られた情報の差動信号を2値化して、重心座標X、Yの検出を行う。
X=Σxnnx/Σnx
Y=Σynny/Σny
ここで、xn,ynは、2値化された画素に対応するx座標、y座標であり、nx,nyは、x,y座標を占める画素の個数である。
この演算により算出した重心座標X、Yに基づき、対物レンズや試料を載せている移動ステージのx、y値を変化させて対象物を光軸に対して移動させ、視野の中心に対象物が常時位置するように制御する。
The operation of the claimed invention will be described below.
According to the DPC method and the fusion method of the DPC method and the heterodyne method, three-dimensional profile information can be acquired in one scan, and the following calculation is performed based on the information.
Specifically, images from a sample having a symmetrical object that can move three-dimensionally are acquired continuously over time to obtain image data for each frame, and the calculation area of this object is specified. The differential signal of the information obtained from the observation of the object is binarized, and the barycentric coordinates X and Y are detected.
X = Σxnnx / Σnx
Y = Σynny / Σny
Here, xn, yn are the x coordinate and y coordinate corresponding to the binarized pixel, and nx, ny are the number of pixels occupying the x, y coordinate.
Based on the center-of-gravity coordinates X and Y calculated by this calculation, the x and y values of the moving stage on which the objective lens and the sample are placed are changed to move the object with respect to the optical axis so that the object is at the center of the field of view. Control so that it is always located.

一方、細胞やプランクトンなどの対象物は3次元的に移動するので、上記2次元的なトラキングに加え、対物レンズまたは移動ステージをフォーカス方向(Z軸方向)にも移動させないとぼやけた画像となる。
この際、対象物から検出された信号強度のコントラストのヒストグラムを重心座標X、Yのデータに基づき作成した場合、ばらつきの大きいものほど合焦点となる。特に、ヘテロダイン検波を用いた方法では、位相情報がプロファイルの傾きの方向を表しているので、合焦点付近では±90度程度の角度の値になる。例えば、信号強度のコントラストのヒストグラムは合焦点状態に対して鋭敏であり、これを使用するものの、位相情報を補足確認手段として使うこともできる。
On the other hand, since objects such as cells and plankton move three-dimensionally, a blurred image is obtained unless the objective lens or moving stage is moved in the focus direction (Z-axis direction) in addition to the two-dimensional tracking. .
At this time, when the histogram of the contrast of the signal intensity detected from the object is created based on the data of the barycentric coordinates X and Y, the larger the variation is, the more focused. In particular, in the method using heterodyne detection, since the phase information represents the direction of the inclination of the profile, an angle value of about ± 90 degrees is obtained in the vicinity of the focal point. For example, the contrast histogram of the signal intensity is sensitive to the in-focus state, and although this is used, the phase information can also be used as supplementary confirmation means.

以上の演算結果により対象物の合焦点位置の移動方向が分かるので、現フレーム情報と前フレーム情報との比較により、フォーカス移動方向を決められる。その移動方向に対物レンズを動かすか移動ステージを上下動することにより、合焦点状態を維持することができる。   Since the moving direction of the in-focus position of the object can be known from the above calculation results, the focus moving direction can be determined by comparing the current frame information and the previous frame information. The in-focus state can be maintained by moving the objective lens in the moving direction or moving the moving stage up and down.

他方、上記のDPC法および、DPC法とヘテロダイン法との融合方法において、走査光学系と対物レンズ間にビームスプリッターを介して信号検出用レーザーの波長とは異なる赤外線領域の波長の光を同軸上に入射させることが考えられる。つまり、この赤外線領域の波長の光を別の光学系にて合成して対象物に照射し、この赤外領域の光にてレーザートラップを行い、対象物を固定する。   On the other hand, in the above DPC method and the fusion method of the DPC method and the heterodyne method, light having a wavelength in the infrared region different from the wavelength of the signal detection laser is coaxially connected via a beam splitter between the scanning optical system and the objective lens. It is conceivable that the light is incident to That is, the light having the wavelength in the infrared region is synthesized by another optical system and irradiated on the target, and the target is fixed by performing laser trapping with the light in the infrared region.

ここで、赤外領域の光と使用しているレーザー波長の光との分離は、DPC法においては、色フィルターを用いる。但し、DPC法とヘテロダイン法との融合方法においては、この赤外領域の光は変調を受けず、検出信号には全く影響を与えることがないことから、色フィルター等を用いる必要性はない。従って、このように赤外線領域の波長の光を用いることで、画像処理に要する時間が不要となるので、より高速な走査が可能となる。   Here, in the DPC method, a color filter is used to separate the light in the infrared region from the light having the laser wavelength used. However, in the fusion method of the DPC method and the heterodyne method, the light in the infrared region is not modulated and does not affect the detection signal at all, so there is no need to use a color filter or the like. Therefore, by using light having a wavelength in the infrared region in this way, time required for image processing is not required, and thus higher-speed scanning is possible.

以上より、本発明のレーザー走査顕微鏡装置によれば、このように生きたままの細胞やナノ粒子をトラッキングし、観察、計測できるので、微細な状態変化などの情報をリアルタイムに取得できるなど、細胞等を不活性化して計測する電子顕微鏡にはない大きな特徴を有することになる。また、生物の微細な構造や動きなどをマイクロマシンに適用させる手法が提案され、実行されつつあるが、このような生物の微細な構造や動きなどの応用にも極めて有効な観察手段となる。   As described above, according to the laser scanning microscope apparatus of the present invention, since cells and nanoparticles can be tracked, observed and measured in this way, information such as minute state changes can be acquired in real time. It has the big characteristic which the electron microscope which inactivates etc. inactivate and measures. In addition, a technique for applying a fine structure and movement of a living organism to a micromachine has been proposed and is being implemented. However, it becomes an extremely effective observation means for application of such a fine structure and movement of a living organism.

上記のように、DPC法や、DPC法とヘテロダイン法とを融合した方法を用いれば、微弱な信号でも1走査で3次元プロファイル情報や屈折率分布情報を高精度に取得できるものの、動いている細胞や微小物体等では動きを抑制できないので、これらの対象物ではその観察、計測能力を十分に発揮することが困難であった。   As described above, if the DPC method or a method that combines the DPC method and the heterodyne method is used, even though a weak signal can be obtained with high accuracy, the three-dimensional profile information and the refractive index distribution information can be obtained in one scan. Since movement cannot be suppressed with cells, minute objects, etc., it has been difficult for these objects to fully demonstrate their observation and measurement capabilities.

しかしながら、本発明のレーザー走査顕微鏡装置によれば、2次元走査系と受光素子により取得した信号データを変換したデータとを用いて対象物を画像化し、画像処理することで位置情報と合焦点情報を取得することが可能となる。   However, according to the laser scanning microscope apparatus of the present invention, the position information and the in-focus information are obtained by imaging the object using the two-dimensional scanning system and the data obtained by converting the signal data acquired by the light receiving element, and performing image processing. Can be obtained.

これに伴って、これらの情報に基づき対象物を載せている移動ステージや対物レンズの位置を制御することで、動いている細胞や微生物等の移動する対象物でも高速な計測、観察を可能とし、さらには移動する対象物の細部の動きを拡大して観察可能として、レーザー走査顕微鏡装置の観察、計測能力を十分に発揮できるようになる。また、上記光学系に赤外レーザー光によるレーザートラップ光学系を併用することにより、画像処理に要する時間を省けるので、より高速な走査が可能となる。   Along with this, by controlling the position of the moving stage and objective lens on which the object is placed based on this information, high-speed measurement and observation are possible even for moving objects such as moving cells and microorganisms. In addition, the detailed movement of the moving object can be enlarged and observed, so that the observation and measurement ability of the laser scanning microscope apparatus can be fully exhibited. In addition, by combining the above optical system with a laser trap optical system using infrared laser light, the time required for image processing can be saved, so that higher-speed scanning is possible.

本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例1に係るDPC法における透過光学系のブロック図である。It is a block diagram of the transmission optical system in the DPC method which concerns on Example 1 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例1に係るDPC法における反射光学系のブロック図である。It is a block diagram of the reflective optical system in the DPC method which concerns on Example 1 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例1に係るDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系のブロック図である。It is a block diagram of the transmission optical system which combined DPC method and heterodyne method which concern on Example 1 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 図3の対物レンズおよび測定対象物周辺部分を拡大して示す図である。It is a figure which expands and shows the objective lens of FIG. 3, and a measurement object peripheral part. 実施例1に係るDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系による試料上の照射領域を表す説明図である。It is explanatory drawing showing the irradiation area | region on the sample by the transmission optical system which combined DPC method and heterodyne method based on Example 1. FIG. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例1に係るDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた反射光学系のブロック図である。It is a block diagram of the reflective optical system which combined DPC method and heterodyne method which concern on Example 1 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例2に係るDPC法における透過光学系のブロック図である。It is a block diagram of the transmission optical system in the DPC method which concerns on Example 2 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例2に係るDPC法における反射光学系のブロック図である。It is a block diagram of the reflective optical system in the DPC method which concerns on Example 2 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例2に係るDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系のブロック図である。It is a block diagram of the transmission optical system which combined DPC method and heterodyne method which concern on Example 2 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例2に係るDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた反射光学系のブロック図である。It is a block diagram of the reflective optical system which combined DPC method and heterodyne method which concern on Example 2 of the laser scanning microscope apparatus of this invention. 本発明に適用されるプレパラートの概略図である。It is the schematic of the preparation applied to this invention.

以下に、本発明に係るレーザー走査顕微鏡装置の実施例1及び実施例2を各図面に基づき、詳細に説明する。   Embodiments 1 and 2 of the laser scanning microscope apparatus according to the present invention will be described below in detail with reference to the drawings.

以下、上記光学系を具体的に適用して効果のあるDPC法の光学系および、DPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた光学系について述べる。ここで、本実施例に係るレーザー走査顕微鏡装置では、得られた差出力等の信号と走査信号とに基づいて対象物を画像化し、この画像信号により画像処理的な手法を用いて試料内で移動し得る対象物のトラッキングを行うものであり、以下に具体的に述べる。   Hereinafter, an optical system of the DPC method which is effective by specifically applying the above optical system and an optical system combining the DPC method and the heterodyne method will be described. Here, in the laser scanning microscope apparatus according to the present embodiment, an object is imaged based on the obtained signal such as the difference output and the scanning signal, and the image signal is used in the sample using an image processing technique. This is for tracking an object that can move, and will be specifically described below.

図1はDPC法における透過光学系のブロック図を示し、このブロック図に基づき以下に詳述する。この図1に示すように、レーザー光源1からの光束はコリメーターレンズ2により平行光とされ、2次元走査デバイス6に入射される。この2次元走査デバイス6は光を面上に2次元走査するデバイスであり、例えばMEMS、ガルバノミラー、レゾナントミラー等により構成されるものである。   FIG. 1 shows a block diagram of a transmission optical system in the DPC method, which will be described in detail below based on this block diagram. As shown in FIG. 1, the light beam from the laser light source 1 is collimated by the collimator lens 2 and is incident on the two-dimensional scanning device 6. The two-dimensional scanning device 6 is a device that two-dimensionally scans light on a surface, and includes, for example, a MEMS, a galvanometer mirror, a resonant mirror, and the like.

コリメーターレンズ2からの平行光束は、2次元走査デバイス6の瞳位置を対物レンズ11の瞳位置に伝達する瞳伝達レンズ系10を経て、対物レンズ11に入射された後、試料Sに収束される。試料Sに収束された光は透過光となり、受光素子9に入射される。そして、この受光素子9は、光電変換された各々のビート信号を作成する光電変換部(図示せず)を有した構造とされている。この受光素子9はデータ処理制御部14に接続されていて、受光素子9から送られる受光に関する情報に基づき、データ処理制御部14にてデータ処理されている。このとき、受光素子9は、試料Sから実質上ファーフィールドとなる位置に配置され、光軸Lに対して対称に2分割された分割受光素子9A、9Bとされている。但し、3分割以上としても良い。   The parallel luminous flux from the collimator lens 2 is incident on the objective lens 11 through the pupil transmission lens system 10 that transmits the pupil position of the two-dimensional scanning device 6 to the pupil position of the objective lens 11, and then converges on the sample S. The The light converged on the sample S becomes transmitted light and enters the light receiving element 9. The light receiving element 9 has a structure including a photoelectric conversion unit (not shown) that generates each beat signal subjected to photoelectric conversion. The light receiving element 9 is connected to the data processing control unit 14, and data processing is performed by the data processing control unit 14 based on information relating to light reception sent from the light receiving element 9. At this time, the light receiving element 9 is arranged at a position substantially becoming a far field from the sample S, and is divided light receiving elements 9A and 9B which are divided into two symmetrically with respect to the optical axis L. However, it may be divided into three or more.

この結果、光軸L上の平行光束が試料Sの屈折率分布や凸凹により0次回折光と±1次回折光とに分離され、分離されたこれらの光が干渉しつつ、受光素子9に受光される。これに伴い、試料Sの屈折率分布や凸凹の情報が、0次回折光と±1次回折光との干渉情報に変換される。このとき、光軸Lに対して対称な2つの分割受光素子9A、9B間の差出力に試料Sの上記情報が反映されて、データ処理制御部14に送られる。   As a result, the parallel light beam on the optical axis L is separated into 0th order diffracted light and ± 1st order diffracted light by the refractive index distribution and unevenness of the sample S, and these separated lights are received by the light receiving element 9 while interfering with each other. The Along with this, the refractive index distribution and unevenness information of the sample S are converted into interference information between the 0th-order diffracted light and the ± 1st-order diffracted light. At this time, the above information of the sample S is reflected on the difference output between the two divided light receiving elements 9A and 9B that are symmetrical with respect to the optical axis L, and sent to the data processing control unit 14.

他方、この試料Sは、光軸Lに対して直交し、かつ相互に直交するX軸方向やY軸方向に沿ってモータ等により移動可能とされている移動ステージ12に搭載されている。また、対物レンズ11も光軸Lに沿ってモータ等により上下動可能になっている。これら移動ステージ12及び対物レンズ11はそれぞれデータ処理制御部14に接続されていて、このデータ処理制御部14のデータ処理及び、データ処理制御部14からの2次元走査デバイス6に送り出される走査情報に基づき、データ処理制御部14はこれらの情報を画像やデータの形とすることができる。これに伴い、データ処理制御部14が試料S内の対象物に対してこのレーザー走査顕微鏡装置の視点に追従させて合致可能としている。   On the other hand, the sample S is mounted on a moving stage 12 that is orthogonal to the optical axis L and that can be moved by a motor or the like along the X-axis direction and the Y-axis direction orthogonal to each other. The objective lens 11 can also be moved up and down along the optical axis L by a motor or the like. The moving stage 12 and the objective lens 11 are respectively connected to the data processing control unit 14, and the data processing of the data processing control unit 14 and the scanning information sent to the two-dimensional scanning device 6 from the data processing control unit 14. Based on this, the data processing control unit 14 can make the information into the form of an image or data. Accordingly, the data processing control unit 14 can match the object in the sample S by following the viewpoint of the laser scanning microscope apparatus.

これに対して、図2はDPC法における反射光学系のブロック図であり、図1に示す透過光学系と異なるのは、コリメーターレンズ2と2次元走査デバイス6との間に配置されたビームスプリッター7により光束の一部を取り出し、この光束を少なくとも2分割された分割受光素子9A、9Bからなる受光素子9がそれぞれ受光することにより、これらの差出力を検出することである。この際、試料Sからの反射平行光は、実質上ファーフィールド情報であることになる。   On the other hand, FIG. 2 is a block diagram of a reflection optical system in the DPC method, and differs from the transmission optical system shown in FIG. 1 in that a beam disposed between the collimator lens 2 and the two-dimensional scanning device 6. A part of the light beam is taken out by the splitter 7, and the light receiving element 9 including the divided light receiving elements 9A and 9B divided into at least two parts respectively receives the light to detect the difference output therebetween. At this time, the reflected parallel light from the sample S is substantially far-field information.

次に、図3および図6に、発明者たちが提案するDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた光学系のブロック図を示し、これを以下に説明する。ここで、図3はこれらの方法を組み合わせた透過光学系のブロック図を示し、図6はこれらの方法を組み合わせた反射光学系のブロック図を示す。
これらの光学系が図1および図2に示す光学系と異なるのは、音響光学素子3によりきわめて接近した2つの光束を作成し、拡大率を適正にすることで、図4の実線で示すビームLAおよび点線で示すビームLBのように、非常に接近して相互に同一径とされる2つのビームとされて、試料Sに照射することができる。
Next, FIG. 3 and FIG. 6 show block diagrams of an optical system combining the DPC method and the heterodyne method proposed by the inventors, which will be described below. Here, FIG. 3 shows a block diagram of a transmission optical system that combines these methods, and FIG. 6 shows a block diagram of a reflection optical system that combines these methods.
These optical systems differ from the optical systems shown in FIGS. 1 and 2 by creating two light beams that are very close to the acoustooptic device 3 and making the magnification ratio appropriate so that the beam shown by the solid line in FIG. The sample S can be irradiated with two beams that are very close to each other and have the same diameter as a beam LB indicated by LA and a dotted line.

具体的には、この図3に示すように、レーザー光が出射されるレーザー光源1と、AODドライバー4が接続されて動作が制御される光変調器である音響光学素子(AOD)3との間に、コリメーターレンズ2が配置されている。また、この音響光学素子3に対して、2群のレンズからなる瞳伝達拡大レンズ系5、入力されたレーザー光を分離して出射するビームスプリッター7、入力されたレーザー光を2次元走査する2次元走査デバイス6が順に並んで配置されている。
さらに、このビームスプリッター7に隣り合って、2群のレンズからなる瞳伝達レンズ系10が位置し、この隣に対物レンズ11が試料Sと対向して配置されている。つまり、これら部材がレーザー光の光路とされる光軸Lに沿って並んでいることになる。
Specifically, as shown in FIG. 3, a laser light source 1 that emits laser light and an acousto-optic device (AOD) 3 that is an optical modulator to which the operation is controlled by connecting an AOD driver 4. A collimator lens 2 is arranged between them. Further, the acoustooptic device 3 includes a pupil transmission magnifying lens system 5 composed of two groups of lenses, a beam splitter 7 that separates and emits input laser light, and two-dimensionally scans the input laser light 2. The dimension scanning devices 6 are arranged in order.
Further, a pupil transmission lens system 10 composed of two groups of lenses is positioned adjacent to the beam splitter 7, and an objective lens 11 is disposed next to the objective lens 11 so as to face it. That is, these members are arranged along the optical axis L which is the optical path of the laser beam.

他方、光軸Lが通過する方向に対して直交する方向であってビームスプリッター7の右隣の位置には、光センサである受光素子8が配置されている。また、試料Sの背面側である下側には、同じく光センサである受光素子9が配置されている。そして、これら受光素子8、9は、それぞれ光軸Lに対して対称に2分割された分割受光素子8A、8B、9A、9Bにより構成されていている。なお、これら受光素子8、9は、光電変換された各々のビート信号を作成する光電変換部(図示せず)を有した構造とされている。   On the other hand, a light receiving element 8 that is an optical sensor is disposed at a position that is orthogonal to the direction in which the optical axis L passes and is adjacent to the right side of the beam splitter 7. A light receiving element 9 that is also an optical sensor is disposed on the lower side, which is the back side of the sample S. The light receiving elements 8 and 9 are constituted by divided light receiving elements 8A, 8B, 9A, and 9B that are divided into two symmetrically with respect to the optical axis L, respectively. The light receiving elements 8 and 9 have a structure including a photoelectric conversion unit (not shown) that creates each photoelectrically converted beat signal.

さらに、これら受光素子8、9が、これら受光素子8、9からの信号を比較する信号比較器13にそれぞれ接続され、音響光学素子3に印加された変調信号自体と受光素子9が作成する出力信号であるビート信号とから、この信号比較器13が、該ビート信号に基づいて得られた2つの光同士の位相差とビート信号自体の振幅を検出する。また、この信号比較器13は、最終的にデータを処理して試料Sのプロフィル等を得るデータ処理制御部14に繋がっている。   Further, these light receiving elements 8 and 9 are connected to a signal comparator 13 for comparing signals from these light receiving elements 8 and 9, respectively, and the modulation signal itself applied to the acoustooptic element 3 and the output generated by the light receiving element 9. The signal comparator 13 detects the phase difference between the two lights obtained based on the beat signal and the amplitude of the beat signal itself from the beat signal which is a signal. The signal comparator 13 is connected to a data processing control unit 14 that finally processes data to obtain a profile of the sample S and the like.

以上に伴い、キャリア周波数fcと変調周波数fmの2つのDSB変調された信号を外部からAODドライバー4を経て、音響光学素子3に入力することで、きわめて接近したこれら2つの光束を作成することができる。これらきわめて接近した2方向に出射された光束は、音響光学素子3の実質的な瞳位置を2次元走査デバイス6の瞳位置に伝達する瞳伝達レンズ系5、光を面上に走査する2次元走査デバイス6および、2次元走査デバイス6の瞳位置を対物レンズ11の瞳に伝達するための瞳伝達レンズ系10を経て、対物レンズ11に入射される。   Accordingly, two DSB-modulated signals having the carrier frequency fc and the modulation frequency fm are input from the outside to the acoustooptic device 3 via the AOD driver 4 to create these two light beams that are very close to each other. it can. The light beams emitted in two very close directions are transmitted through the pupil transfer lens system 5 that transmits the substantial pupil position of the acoustooptic device 3 to the pupil position of the two-dimensional scanning device 6, and the two-dimensional light is scanned on the surface. The light enters the objective lens 11 through the pupil transmission lens system 10 for transmitting the scanning device 6 and the pupil position of the two-dimensional scanning device 6 to the pupil of the objective lens 11.

前述と同様に、この試料Sは、光軸Lに対して直交し、かつ相互に直交するX軸方向やY軸方向に沿ってモータ等により移動可能とされている移動ステージ12に搭載されている。また、対物レンズ11も光軸Lに沿ってモータ等により上下動可能になっている。これら移動ステージ12及び対物レンズ11はそれぞれデータ処理制御部14に接続されていて、このデータ処理制御部14のデータ処理に基づき、試料S内の対象物S1に対してこのレーザー走査顕微鏡装置の視点に追従させて合致可能になっている。   Similar to the above, this sample S is mounted on a moving stage 12 that is orthogonal to the optical axis L and that can be moved by a motor or the like along the X-axis direction or the Y-axis direction orthogonal to each other. Yes. The objective lens 11 can also be moved up and down along the optical axis L by a motor or the like. The moving stage 12 and the objective lens 11 are respectively connected to the data processing control unit 14, and based on the data processing of the data processing control unit 14, the viewpoint of the laser scanning microscope apparatus with respect to the object S1 in the sample S. It is possible to match by following.

以上の結果として、対物レンズ11で収束された光束は、図4に示す光軸Lを境界線Cとして、きわめて接近された2つのスポットとして試料Sを面上に走査することになる。また、これら2つのビームLA、LBの有する周波数は、「光の振動数+キャリア周波数fc±変調周波数fm」となり、この2つのスポットは周波数fc+fmと周波数fc−fmの2つの信号となるので、これらの信号をヘテロダイン検波することにより、試料Sの凸凹情報、屈折率分布を反映した信号が得られる。   As a result of the above, the light beam converged by the objective lens 11 scans the surface of the sample S as two very close spots with the optical axis L shown in FIG. The frequency of these two beams LA and LB is “light frequency + carrier frequency fc ± modulation frequency fm”, and these two spots are two signals of frequency fc + fm and frequency fc−fm. By heterodyne detection of these signals, a signal reflecting the unevenness information and refractive index distribution of the sample S can be obtained.

これに伴って、中心距離Δxだけ離れた2点をそれぞれ中心とする2つのビームLA、LBの重なっている照射領域A,Bのほぼ中心を図5の境界線Cとし、この境界線Cを挟んだ2つのビームLA、LBが試料Sに照射されて、対象物S1の位置が検出されることから、試料S内で移動し得る対象物S1を追従可能とすることができる。   Accordingly, the approximate center of the irradiation areas A and B where the two beams LA and LB centered at two points separated by the center distance Δx are defined as a boundary line C in FIG. Since the sandwiched two beams LA and LB are irradiated onto the sample S and the position of the object S1 is detected, the object S1 that can move within the sample S can be followed.

本実施例において、具体的にヘテロダイン検波を行うには、照射された変調信号の一部をビームスプリッター7で取り出して受光素子8でレファランス信号を得て、このレファランス信号と2分割された受光素子9で検出された信号とで差動出力を求め、信号比較器13により位相差情報および強度情報を取得し、データ処理制御部14に送る。データ処理制御部14では、2次元走査デバイス6に送り出される走査情報とともに取得された位相差情報や強度情報を画像やデータの形として、図示しないディスプレイに表示したり、メモリにデータとして蓄積したりする。   In the present embodiment, in order to specifically perform heterodyne detection, a part of the irradiated modulation signal is extracted by the beam splitter 7, a reference signal is obtained by the light receiving element 8, and the reference signal and the light receiving element divided into two are obtained. A differential output is obtained from the signal detected at 9, phase difference information and intensity information are acquired by the signal comparator 13, and sent to the data processing control unit 14. The data processing control unit 14 displays the phase difference information and intensity information acquired together with the scanning information sent to the two-dimensional scanning device 6 as an image or data form on a display (not shown) or accumulates it as data in a memory. To do.

ただし、受光素子8は必ずしも必要ではなく、音響光学素子3に出力する信号、 すなわち音響光学素子3に印加される変調信号自体と比較してもよい。この場合、回路系や音響光学素子等による遅延が発生するが、予め補正するなどしておけば、位相差検出等に大きな影響を与えることはない。   However, the light receiving element 8 is not necessarily required, and may be compared with a signal output to the acoustooptic element 3, that is, a modulation signal itself applied to the acoustooptic element 3. In this case, a delay occurs due to a circuit system, an acoustooptic device, or the like. However, if it is corrected in advance, it does not have a great influence on phase difference detection or the like.

また、試料Sの表面を面上に走査する極めて接近した2つのスポット光は、相互に周波数の異なる光となるが、実質上、瞳伝達レンズ系5、10等の拡大光学系を使用することにより、高い周波数でも極めて接近させたスポットにすることができる。これにより高速な走査により高速な情報取得ができることになる。   In addition, two very close spot lights that scan the surface of the sample S on the surface are lights having different frequencies from each other. However, a magnification optical system such as the pupil transfer lens system 5 or 10 is substantially used. This makes it possible to make the spot very close even at a high frequency. Thus, high-speed information acquisition can be performed by high-speed scanning.

これに対して、図6はDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた反射光学系のブロック図であり、図3に示す透過光学系と異なるのは、試料Sから反射して戻ってきた光束をビームスプリッター7により取り出し、この光束を2分割された分割受光素子9A、9Bからなる受光素子9によりそれぞれ受光することで、これらの差出力を検出することである。この際、試料Sからの反射平行光は、実質上ファーフィールド情報であることになる。   On the other hand, FIG. 6 is a block diagram of a reflection optical system combining the DPC method and the heterodyne method. The difference from the transmission optical system shown in FIG. The difference output is detected by taking out the light beam by the splitter 7 and receiving the light beam by the light receiving element 9 including the divided light receiving elements 9A and 9B divided into two. At this time, the reflected parallel light from the sample S is substantially far-field information.

この一方、このようにして得られた2つの光は、上記手法により分離度を非常に小さくすることができ、実質上1つのビームで走査した情報と変わらない。これに対し、一つのビームで走査し、ファーフィールドに配置した少なくとも2分割された受光素子の差動出力を得る方法が、前記したDPC法である。   On the other hand, the two lights obtained in this way can have a very low degree of separation by the above-described method, and are substantially the same as the information scanned with one beam. On the other hand, the DPC method described above is a method of scanning with one beam and obtaining a differential output of at least two divided light receiving elements arranged in the far field.

つまり、DPC法に比較すると、このような本ヘテロダイン法をさらに使用した方法では、ヘテロダイン検出することにより、位相変化および強度変化をきわめて精度よく検出できる点と、受光素子9で受光される光が非常に微弱でも検出回路系のゲインを高くすることで、高精度に検出できる点と、検出される信号は変調信号だけなので、外乱光の影響を受けることもなくなる点とを有することから、さらに高精度な検出ができることになる。   That is, in comparison with the DPC method, in the method further using the present heterodyne method, the phase change and the intensity change can be detected with high accuracy by detecting the heterodyne, and the light received by the light receiving element 9 is reduced. Even if it is very weak, it can be detected with high accuracy by increasing the gain of the detection circuit system, and since the detected signal is only the modulation signal, it is not affected by disturbance light. High-precision detection can be performed.

また、上記のような光学系の受光素子部分に、0次回折光と±1次回折光とに一旦分離するような光学系を用いることで、さらに空間周波数の高い情報、すなわち横分解能の大幅な向上が図れるようになる。   In addition, by using an optical system that once separates the 0th-order diffracted light and ± 1st-order diffracted light in the light receiving element portion of the optical system as described above, information with a higher spatial frequency, that is, a significant improvement in lateral resolution Can be planned.

以上の光学系を用いて得られる信号は、微分干渉光学系のバイアスのない信号であり、対象物S1の図5のXY軸で形成される平面に対する傾き等を反映して、差動出力の正負が決まる。さらに、レーザー光は、2次元走査デバイス6により2次元走査されて、試料S側に送られるが、この試料Sからの光を受光素子9により受光して、信号比較器13で位相差情報および強度情報を取得してこれらがデータ処理制御部14に送られる。そして、上記差動出力からの差動信号に基づくデータと2次元走査の際の走査情報とを合成することにより、対象物S1の画像情報をデータ処理制御部14で得ることができる。   The signal obtained using the above optical system is a signal having no bias of the differential interference optical system, and reflects the inclination of the object S1 with respect to the plane formed by the XY axes in FIG. Positive and negative are determined. Further, the laser light is two-dimensionally scanned by the two-dimensional scanning device 6 and sent to the sample S side. The light from the sample S is received by the light receiving element 9 and the signal comparator 13 receives the phase difference information and The intensity information is acquired and sent to the data processing control unit 14. Then, by combining the data based on the differential signal from the differential output and the scanning information at the time of two-dimensional scanning, the data processing control unit 14 can obtain the image information of the object S1.

この画像情報を取得するときに、DPC法では、予めバイアスを与えて差動出力をかさ上げして表示することができる。また、DPC法とヘテロダイン法との融合方法では、強度情報と位相情報に分けられるので、傾き情報を位相情報として表記し、強度情報を差動出力信号の絶対値のように表示することができる。   When acquiring this image information, in the DPC method, a differential output can be raised and displayed in advance by applying a bias. Further, in the fusion method of the DPC method and the heterodyne method, since the intensity information and the phase information can be divided, the inclination information can be expressed as phase information, and the intensity information can be displayed as the absolute value of the differential output signal. .

このようなデータ処理により、画像情報を何種類かの情報に変換することができるが、光学的には、ジャストフォーカスの状態において試料S中の対象物S1の有する空間周波数が最大になる。したがって、ジャストフォーカスであるほど、強度のコントラス変化が大きくなる。つまり、強度のコントラストのヒストグラムは、ジャストフォーカスであるほどばらつきが大きくなるので、このばらつき具合を数値化し、フォーカス度合いの評価量とすることもできる。   By such data processing, the image information can be converted into several types of information, but optically, the spatial frequency of the object S1 in the sample S is maximized in the just focus state. Therefore, the contrast change of intensity increases as the just focus is achieved. In other words, the intensity contrast histogram increases in variation as the focus is adjusted. Therefore, the degree of variation can be quantified and used as an evaluation amount of the focus degree.

ここで、DPC法および、DPC法とヘテロダイン法の融合方法によれば、1走査で3次元プロファイル情報を取得できるので、その情報をもとにして以下のような処理が考えられる。
まず、上記した光学系によれば、3次元情報をリアルタイムに取得できるので、画像情報を構成するビデオ信号のフレーム間で動きのある物体と静止している背景とを容易に分離可能となる。たとえば、データ処理制御部14にてフレーム間での差算を行い、変化のある画素を残し、ある大きさ以上の領域を動いている物体の領域として同定することができる。この様にして第1の過程でまず、試料S中にいくつかある領域のうちの対象物S1の存在する対象領域を選択する。
Here, according to the DPC method and the fusion method of the DPC method and the heterodyne method, three-dimensional profile information can be acquired by one scan, and the following processing can be considered based on the information.
First, according to the optical system described above, three-dimensional information can be acquired in real time, so that a moving object and a stationary background can be easily separated between frames of a video signal constituting image information. For example, the data processing control unit 14 can perform a difference between frames, leave a pixel having a change, and identify an area of a certain size or more as a moving object area. In this way, in the first process, first, a target area where the target object S1 is present is selected from among several areas in the sample S.

次に、上記のように対象物S1の演算領域を特定した後、データ処理制御部14において第2の過程で対象領域の差動出力に基づき対象物S1の観察から得られた強度情報を2値化して、光軸Lに対して直交しかつ相互に直交するX軸方向やY軸方向における重心位置である、重心座標X、Yの検出を下記の簡単な演算により行う。
X=Σxnnx/Σnx
Y=Σynny/Σny
ここで、xn,ynは、2値化された画素に対応するx座標、y座標であり、nx,nyは、x,y座標を占める画素の個数である。
この演算をフレームごとに行い、各フレームの各演算により算出した重心座標X、Yの値に基づき、試料Sを載せている搭載台である移動ステージ12のx、y値を変化させて対象物S1を光軸Lに対して移動させることができる。そして、例えば視野の中心である光軸L上に対象物S1が常時位置するように制御すれば、対象物S1を視野の中心である視点にほぼ制止している状態にできる。
Next, after specifying the calculation area of the object S1 as described above, the data processing control unit 14 obtains 2 pieces of intensity information obtained from observation of the object S1 based on the differential output of the object area in the second process. The centroid coordinates X and Y, which are centroid positions in the X-axis direction and the Y-axis direction orthogonal to the optical axis L and orthogonal to each other, are detected by the following simple calculation.
X = Σxnnx / Σnx
Y = Σynny / Σny
Here, xn, yn are the x coordinate and y coordinate corresponding to the binarized pixel, and nx, ny are the number of pixels occupying the x, y coordinate.
This calculation is performed for each frame, and based on the values of the center of gravity coordinates X and Y calculated by the calculation of each frame, the x and y values of the moving stage 12 that is the mounting stage on which the sample S is placed are changed to change the object. S1 can be moved with respect to the optical axis L. For example, if the object S1 is controlled so as to be always positioned on the optical axis L which is the center of the visual field, the object S1 can be almost stopped at the viewpoint which is the center of the visual field.

一方、細胞やプランクトンなどの対象物S1は3次元的に移動するので、上記2次元的なトラキングに加え、対物レンズ11または移動ステージ12をフォーカス方向(図4のZ軸方向)にも移動させないとぼやけた画像となる。このため、フレーム毎に上記したフォーカス度合いの評価パラメーターである強度情報のヒストグラムのばらつき量を取得し、データ処理制御部14において第3の過程でこのばらつき程度を評価して、このばらつき量が大きくなる方へ対物レンズ11または移動ステージ12を上下動し、合焦点状態を維持するように制御する。   On the other hand, since the object S1 such as a cell or plankton moves three-dimensionally, in addition to the two-dimensional tracking, the objective lens 11 or the moving stage 12 is not moved in the focus direction (Z-axis direction in FIG. 4). And a blurred image. For this reason, the variation amount of the histogram of the intensity information, which is the above-described evaluation parameter of the focus degree, is acquired for each frame, the data processing control unit 14 evaluates this variation degree in the third process, and this variation amount is large. Then, the objective lens 11 or the moving stage 12 is moved up and down, and control is performed so as to maintain the in-focus state.

例えば、対象物S1から検出された信号強度のコントラストのヒストグラムを作成した場合、ばらつきの大きいものほど合焦点となる。特に、ヘテロダイン検波を用いる方法では、位相情報がプロファイルの傾きの方向を表しているので、合焦点付近では±90度付近の角度の値になる。従って、信号強度のコントラストのヒストグラムが合焦点状態に関して鋭敏であり、これを使用するものの、位相情報を補足確認手段として使うこともできる。   For example, when a contrast histogram of the signal intensity detected from the object S1 is created, the larger the variation, the better the focus. In particular, in the method using heterodyne detection, since the phase information represents the direction of the inclination of the profile, an angle value near ± 90 degrees is obtained near the focal point. Accordingly, the contrast histogram of the signal intensity is sensitive with respect to the in-focus state, and although this is used, the phase information can also be used as supplementary confirmation means.

このとき、このばらつきの大きい方向を特定するために、第4の過程にて対物レンズ11を常に上下方向に微小振動させて、いわゆるウォブリング状態にしておき、上記ばらつき量が大きくなる方向に対物レンズ11を動かすようにすることが考えられる。このような画像情報に基づく合焦状態の実現については、この他にいろいろな方法が存在するので、それらを適用してもよい。 たとえば、一つの方法としては、合焦状態ほど、はっきりした画像になるので、実質的な空間周波数が高くなる。このために受光素子の光軸から離れた受光素子上の出力自体が大きくなる。この情報を取得することで、合焦状態の程度の判断を行うことが可能となる。また、合焦状態ほど、傾き情報が大きくなるので、上記したヘテロダイン検波した強度情報が大きくなるので、合焦状態の程度の判定に使用することができる。   At this time, in order to specify the direction in which the variation is large, the objective lens 11 is always finely oscillated in the vertical direction in the fourth process so as to be in a so-called wobbling state. It is possible to move 11. Since there are various other methods for realizing the in-focus state based on such image information, they may be applied. For example, as one method, the more in-focus state, the clearer the image becomes, and the substantial spatial frequency becomes higher. For this reason, the output itself on the light receiving element away from the optical axis of the light receiving element becomes large. By acquiring this information, it is possible to determine the degree of the in-focus state. Further, since the tilt information becomes larger in the focused state, the intensity information obtained by the above heterodyne detection becomes larger, so that it can be used to determine the degree of the focused state.

以上のようにして、得られた信号出力からの画像処理の手法により3次元的なトラッキングを実施すれば、比較的簡単に対象物S1を視野のほぼ中央に位置させ、かつ合焦点状態にさせることができる。このようにすれば、微生物や細胞の動きを3次元的に直接観察でき、細胞内の器官と動きとの関連や様々な情報を取得することが可能となる。   As described above, if the three-dimensional tracking is performed by the image processing method from the obtained signal output, the object S1 is relatively easily positioned at the center of the field of view and is brought into a focused state. be able to. In this way, the movements of microorganisms and cells can be directly observed three-dimensionally, and it is possible to acquire the relationship between the organs and movements in the cells and various information.

本実施例は、実施例1と異なって対象物S1を物理的にトラップすることで、観察や計測をし易くするものである。本実施例では、実施例1に示した光学系の他に、いわゆるレーザートラップを行う光学系を付加している。
ここで、図7はDPC法における透過光学系のブロック図を示し、図8はDPC法における反射光学系のブロック図を示し、図9はDPC法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系のブロック図を示し、図10はDPC法とヘテロダイン法とを方法を組み合わせた反射光学系のブロック図を示す。これら光学系は、実施例1で説明したものとほぼ同様であり、実施例1と異なる点を以下に述べる。
In this embodiment, unlike the first embodiment, the object S1 is physically trapped to facilitate observation and measurement. In this embodiment, in addition to the optical system shown in the first embodiment, an optical system that performs so-called laser trapping is added.
7 shows a block diagram of the transmission optical system in the DPC method, FIG. 8 shows a block diagram of the reflection optical system in the DPC method, and FIG. 9 shows a block of the transmission optical system in which the DPC method and the heterodyne method are combined. FIG. 10 shows a block diagram of a reflection optical system in which the DPC method and the heterodyne method are combined. These optical systems are substantially the same as those described in the first embodiment, and differences from the first embodiment will be described below.

本実施例の各光学系では、レーザー光である赤外光を出射する近赤外レーザー光源15および、この近赤外レーザー光源15からの赤外光を平行光とするコリメーターレンズ16を有している。さらに、このコリメーターレンズ16を通過して平行光とされた赤外光をレーザー光源1からの信号光と共に対物レンズ11に入射するための副ビームスプリッター17が、瞳伝達レンズ系10と対物レンズ11との間に配置されている。このため、この副ビームスプリッター17により前記した各光学系の光軸Lに同軸入射されたこの赤外光で対象物S1をスポット状に照射する。この結果として、周知の光圧により対象物S1を移動ステージ12上でトラップして固定できる。   Each optical system of the present embodiment has a near-infrared laser light source 15 that emits infrared light, which is laser light, and a collimator lens 16 that collimates the infrared light from the near-infrared laser light source 15. doing. Further, a sub beam splitter 17 for making the infrared light that has passed through the collimator lens 16 and converted into parallel light incident on the objective lens 11 together with the signal light from the laser light source 1 includes the pupil transfer lens system 10 and the objective lens. 11. For this reason, this sub beam splitter 17 irradiates the object S1 in a spot shape with this infrared light that is coaxially incident on the optical axis L of each optical system. As a result, the object S1 can be trapped and fixed on the moving stage 12 by a known light pressure.

ここで、信号を得るための信号光と赤外光とを分離するために、図7および図8に示すDPC法では、赤外カットフィルターであるカラーフィルター18が、受光素子9と赤外光の導入光路との間とされる受光素子9の手前の位置に配置されていて、信号光だけがカラーフィルター18を通過するようにする。   Here, in order to separate the signal light and the infrared light for obtaining the signal, in the DPC method shown in FIGS. 7 and 8, the color filter 18 that is an infrared cut filter includes the light receiving element 9 and the infrared light. It is arranged at a position in front of the light receiving element 9 which is between the light introduction optical path and only the signal light passes through the color filter 18.

この一方、図9および図10に示すDPC法とヘテロダイン法との融合方法では、信号光が電気的に変調されるのに対して、赤外光は変調されないので、電気的なヘテロダイン検波により自動的に信号光しか検出されないことになる。このため、DPC法とヘテロダイン法との融合方法では、カラーフィルター18等の特別な光学素子を用いる必要性がなくなる。   On the other hand, in the fusion method of the DPC method and the heterodyne method shown in FIGS. 9 and 10, the signal light is electrically modulated, whereas the infrared light is not modulated. Therefore, automatic detection by electrical heterodyne detection is performed. Therefore, only signal light is detected. For this reason, in the fusion method of the DPC method and the heterodyne method, there is no need to use a special optical element such as the color filter 18.

以上より、本実施例によれば、赤外光でトラップできる対象物S1は、小型の細胞や液体中にあるナノ粒子とかポリマーとされる。通常は自発的に動くかブラウン運動により動いて観察しづらいものの、以上述べた手法を用いれば、簡単に対象物S1を捕捉することができる。   As described above, according to the present embodiment, the object S1 that can be trapped with infrared light is a small cell or a nanoparticle or polymer in a liquid. Normally, it is difficult to observe by moving spontaneously or by Brownian motion, but the object S1 can be easily captured by using the method described above.

また、本実施例によれば、画像処理に要する時間が不要となるので、より高速な走査が可能となる。さらに、信号光と反対方向から低NAの対物レンズで赤外光を導入し、信号光をNAの高い対物レンズで導入した場合、高い分解能で対象物S1を補足しながら観察、測定することもできる。   In addition, according to the present embodiment, time required for image processing is not required, so that higher-speed scanning is possible. Further, when infrared light is introduced from an objective lens having a low NA from the opposite direction to the signal light and signal light is introduced by an objective lens having a high NA, observation and measurement may be performed while capturing the object S1 with high resolution. it can.

次に、上記各実施例における移動ステージ12上に対象物S1を固定するためのプレパラート21の一例を図11に基づき説明する。
具体的には、ガラスやシリコン等の複屈折性の少ない素材を用いて、図11に示すように先端21Aが球状で伸縮素材になっているプレパラート21を採用する。このプレパラート21を図示しないカバーガラスに吸盤のように軟かく吸着するようにしておき、対象物S1の大きさよりも大きい径と深さの異なる数種の凹凸部22を先端21A間に設けた構造とする。
Next, an example of the preparation 21 for fixing the object S1 on the moving stage 12 in each of the above embodiments will be described with reference to FIG.
Specifically, using a material with low birefringence such as glass or silicon, a preparation 21 having a spherical tip 21A and a stretchable material as shown in FIG. 11 is employed. A structure in which the preparation 21 is softly adsorbed to a cover glass (not shown) like a suction cup, and several uneven portions 22 having a diameter and depth different from the size of the object S1 are provided between the tips 21A. And

つまり、このプレパラート21は、対象物S1を含む溶液をカバーガラスとの間に大まかに閉じ込めるような役割をする。このようにすると、対象物S1の範囲を最初からある程度制限することができるので、対象物S1を同定しやすいし、演算速度の向上や光トラップ圧の効率を向上させることができる。   That is, the preparation 21 serves to roughly confine the solution containing the object S1 between the cover glass and the cover glass. In this way, since the range of the object S1 can be limited to some extent from the beginning, the object S1 can be easily identified, the calculation speed can be improved, and the efficiency of the optical trap pressure can be improved.

尚、上記実施例のように対物レンズをZ軸方向に移動させる替わりに、移動ステージ12でXYZの3軸方向にそれぞれ移動するようにしても良い。また、この移動ステージ12の支持面とされるテーブルは、透過系光学で有れば当然に透明なガラス材等により形成されている。
以上、本発明に係る実施の形態を説明したが、本発明は前述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。
Instead of moving the objective lens in the Z-axis direction as in the above embodiment, the objective lens may be moved in the XYZ three-axis directions by the moving stage 12. Moreover, the table used as the support surface of the moving stage 12 is naturally formed of a transparent glass material or the like if it is a transmission system optical.
The embodiments according to the present invention have been described above, but the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.

本発明は、レーザー光の走査によって不透明物体の表面形状の観察及び計測、透明物体の表面または内部構造の観察及び計測を高速に行うレーザー走査顕微鏡装置だけでなく、さまざまな種類の顕微鏡に好適なものである。   The present invention is suitable for various types of microscopes as well as laser scanning microscope apparatuses that perform observation and measurement of the surface shape of an opaque object by scanning with laser light, and observation and measurement of the surface or internal structure of a transparent object at high speed. Is.

1 レーザー光源
2 コリメーターレンズ
3 音響光学素子
4 AODドライバー
5 瞳伝達レンズ系
6 2次元走査デバイス
7 ビームスプリッター
8、9 受光素子
10 瞳伝達レンズ系
11 対物レンズ
12 移動ステージ
13 信号比較器
14 データ処理制御部
15 近赤外レーザー光源
16 コリメーターレンズ
17 副ビームスプリッター
18 カラーフィルター
21 プレパラート
22 凹凸部
S 試料
S1 対象物
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Laser light source 2 Collimator lens 3 Acousto-optic device 4 AOD driver 5 Pupil transmission lens system 6 Two-dimensional scanning device 7 Beam splitter 8, 9 Light receiving element 10 Pupil transmission lens system 11 Objective lens 12 Moving stage 13 Signal comparator 14 Data processing Control unit 15 Near-infrared laser light source 16 Collimator lens 17 Sub beam splitter 18 Color filter 21 Preparation 22 Concavity and convexity S Sample S1 Object

Claims (13)

レーザー光を出射するレーザー光源と、
レーザー光を2次元走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、3次元的に移動し得る対称物を有した試料に対してレーザー光を出射する対物レンズと、
試料からの反射光あるいは透過光を受光する受光素子と、
前記受光素子からの出力差の情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置。
A laser light source that emits laser light;
A scanning optical element for two-dimensionally scanning laser light;
An objective lens that emits laser light to a sample having a pupil position and a symmetrical object that can move three-dimensionally;
A light receiving element for receiving reflected light or transmitted light from the sample;
A data processing control unit that obtains information on an output difference from the light receiving element and performs data processing, and matches a viewpoint to an object in the sample based on the data processing,
A laser scanning microscope apparatus comprising:
レーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の2つの光に変調させつつ、相互に異なる方向に出射する光変調器と、
2つの光を2次元走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、3次元的に移動し得る対称物を有した試料に対して2つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器で相互に異なる方向に出射された各々の光を試料上で近接させる瞳伝達レンズ系と、
試料からの反射光あるいは透過光を受光し光電変換してビート信号を発生する受光素子と、
前記受光素子のビート信号に基づいて得られた2つの光同士の位相差およびビート信号自体の振幅を検出する信号比較器と、
前記信号比較器で検出された位相差による位相情報と振幅による強度情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置。
A laser light source that emits laser light;
An optical modulator that emits light in different directions while modulating the laser light into two lights having different frequencies;
A scanning optical element for two-dimensionally scanning two lights;
An objective lens that emits two lights to a sample having a pupil position and a symmetrical object that can move three-dimensionally;
A pupil transfer lens system that is positioned between the light modulator and the objective lens and causes the light emitted in the mutually different directions by the light modulator to approach each other on the sample;
A light receiving element that receives reflected light or transmitted light from the sample and photoelectrically converts it to generate a beat signal; and
A signal comparator for detecting a phase difference between two lights obtained based on a beat signal of the light receiving element and an amplitude of the beat signal itself;
A data processing control unit that obtains phase information based on the phase difference detected by the signal comparator and intensity information based on the amplitude to perform data processing, and matches a viewpoint to an object in the sample based on the data processing,
A laser scanning microscope apparatus comprising:
前記光変調器からの光を一部分離すると共に前記試料からの反射光を反射するビームスプリッターを有し、
前記受光素子が、
前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第1の受光素子と、
前記ビームスプリッターで反射した前記試料からの反射光を受光する第2の受光素子と、
を含み、
第1の受光素子で受光した変調信号と第2の受光素子で受光した出力信号とのビート信号を信号比較器で作成することを特徴とする請求項2記載のレーザー走査顕微鏡装置。
A beam splitter that partially separates light from the light modulator and reflects reflected light from the sample;
The light receiving element is
A first light receiving element for receiving the light separated by the beam splitter;
A second light receiving element for receiving reflected light from the sample reflected by the beam splitter;
Including
3. The laser scanning microscope apparatus according to claim 2, wherein a beat signal between the modulation signal received by the first light receiving element and the output signal received by the second light receiving element is created by a signal comparator.
前記光変調器からの光を一部分離するビームスプリッターを有し、
前記受光素子が、
前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第1の受光素子と、
前記試料からの透過光を受光する第2の受光素子と、
を含み、
第1の受光素子で受光した変調信号と第2の受光素子で受光した出力信号とのビート信号を信号比較器で作成することを特徴とする請求項2記載のレーザー走査顕微鏡装置。
A beam splitter for partially separating light from the light modulator;
The light receiving element is
A first light receiving element for receiving the light separated by the beam splitter;
A second light receiving element for receiving transmitted light from the sample;
Including
3. The laser scanning microscope apparatus according to claim 2, wherein a beat signal between the modulation signal received by the first light receiving element and the output signal received by the second light receiving element is created by a signal comparator.
前記信号比較器が、
前記光変調器に印加された変調信号と前記受光素子の出力信号とのビート信号を作成することで、該ビート信号に基づいて得られた2つの光同士の位相差とビート信号自体の振幅を検出することを特徴とする請求項2記載のレーザー走査顕微鏡装置。
The signal comparator is
By creating a beat signal between the modulation signal applied to the optical modulator and the output signal of the light receiving element, the phase difference between the two lights obtained based on the beat signal and the amplitude of the beat signal itself are obtained. The laser scanning microscope apparatus according to claim 2, wherein the laser scanning microscope apparatus is detected.
前記光変調器は、前記レーザー光源から出射されたレーザー光を入射させる音響光学素子と該音響光学素子にキャリア交流信号(fc)と正弦波信号(fm)を印加する信号発生器とを含むことを特徴とする請求項2から5のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。   The optical modulator includes an acousto-optic device that makes the laser beam emitted from the laser light source incident, and a signal generator that applies a carrier AC signal (fc) and a sine wave signal (fm) to the acousto-optic device. The laser scanning microscope apparatus according to claim 2, wherein: 前記走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーの1次元走査素子、2つの1次元走査デバイスと瞳伝達レンズ系よりなる2次元走査光学系、あるいは、1次元または2次元のマイクロミラーデバイスとされることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。   The scanning optical element is a one-dimensional scanning element of a galvanometer mirror or a resonant mirror, a two-dimensional scanning optical system comprising two one-dimensional scanning devices and a pupil transfer lens system, or a one-dimensional or two-dimensional micromirror device. The laser scanning microscope apparatus according to claim 1, wherein the laser scanning microscope apparatus is provided. 前記受光素子もしくは前記第2の受光素子は、前記光変調器で異なる方向に出射された光の分離方向に垂直な方向に少なくとも2分割された分割受光素子とされることを特徴とする請求項3から7のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。   The light-receiving element or the second light-receiving element is a divided light-receiving element that is divided into at least two parts in a direction perpendicular to a separation direction of light emitted in different directions by the light modulator. The laser scanning microscope apparatus according to any one of 3 to 7. 前記受光素子の出力は、前記受光素子の2分割以上された分割受光素子のすべての分割受光素子の和信号、または2分割以上された分割受光素子の対応する位置にある分割受光素子同士の差信号より取得することを特徴とする請求項1から8のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。   The output of the light receiving element is the sum signal of all the divided light receiving elements of the divided light receiving elements divided into two or more of the light receiving elements, or the difference between the divided light receiving elements at the corresponding positions of the divided light receiving elements divided into two or more. The laser scanning microscope apparatus according to claim 1, wherein the laser scanning microscope apparatus is obtained from a signal. 搭載台に前記試料が載せられたレーザー走査顕微鏡装置であって、
前記対象物の存在する対象領域を特定する第1の過程と、
該対象領域の強度情報を2値化して重心検出を行う第2の過程と、
前記強度情報のヒストグラムのばらつき程度を評価する第3の過程と、
該ばらつきの大きい方向を特定する第4の過程と、
を含む各過程を有し、
搭載台を移動することで、第2の過程から算出された重心位置に前記試料内の対象物を動かし、
第4の過程により対物レンズを該ばらつきの大きい方向に動かすことを特徴とする請求項1から9のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。
A laser scanning microscope apparatus in which the sample is mounted on a mounting table,
A first step of identifying a target area where the target object exists;
A second step of binarizing the intensity information of the target region to detect the center of gravity;
A third step of evaluating the degree of variation in the histogram of the intensity information;
A fourth process for identifying the direction in which the variation is large;
Each process including
By moving the mounting table, the object in the sample is moved to the center of gravity calculated from the second process,
10. The laser scanning microscope apparatus according to claim 1, wherein the objective lens is moved in a direction in which the variation is large by a fourth process.
前記第4の過程において、対物レンズを微小振動させて前記ヒストグラムのばらつきの大きい方向に対物レンズを動かすことを特徴とする請求項10記載のレーザー走査顕微鏡装置。   The laser scanning microscope apparatus according to claim 10, wherein in the fourth step, the objective lens is moved in a direction in which variation of the histogram is large by minutely vibrating the objective lens. 赤外光を出射する近赤外レーザー光源と、
該近赤外レーザー光源からの赤外光を平行光とするコリメーターレンズと、
前記瞳伝達レンズ系と前記対物レンズとの間もしくは前記瞳伝達レンズ系と前記2次元走査デバイスとの間の光軸上に配し、かつ赤外光を反射して試料側に送る副ビームスプリッターと、
を含むことを特徴とする請求項1から11のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。
A near-infrared laser light source that emits infrared light; and
A collimator lens that collimates infrared light from the near-infrared laser light source;
A sub-beam splitter disposed on the optical axis between the pupil transmission lens system and the objective lens or between the pupil transmission lens system and the two-dimensional scanning device and reflecting infrared light to the sample side When,
The laser scanning microscope apparatus according to claim 1, comprising:
赤外カットフィルターが、前記受光素子と赤外光の導入光路との間に配置されたことを特徴とする請求項12記載のレーザー走査顕微鏡装置。   13. The laser scanning microscope apparatus according to claim 12, wherein an infrared cut filter is disposed between the light receiving element and an infrared light introduction optical path.
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