JP5470665B1

JP5470665B1 - 免疫抑制剤

Info

Publication number: JP5470665B1
Application number: JP2013170687A
Authority: JP
Inventors: 啓太朗林; 尚彦安西; 勲岡安; 仁遠藤
Original assignee: J-Pharma Co Ltd
Current assignee: J-Pharma Co Ltd
Priority date: 2013-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2033-08-20
Also published as: JP2015040179A

Abstract

【課題】自己免疫疾患（膠原病やリウマチ等）、アレルギー性疾患、臓器移植などに有用であり、優れた効果を有する新規な免疫抑制剤の提供。
【解決手段】Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含む免疫抑制剤。
【効果】本免疫抑制剤は、Ｔ細胞からのサイトカイン放出抑制及びＴ細胞の増殖抑制についても、優れた効果を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な免疫抑制剤に関する。

臨床においては、化学療法では治癒不可能と判断される疾病において、その原因となる臓器や組織（例えば、腎臓、肝臓、肺、腸管、心臓、膵臓、角膜、皮膚等）又はその一部分を他人から移植することにより、回復を目指す手法が選択され得るようになった。このような他人からの臓器や組織の移植に際して最も懸念されるのは、被移植者の免疫力に由来する拒絶反応である。そこで、移植臓器の永続的定着を目的に免疫抑制剤の研究が進められてきた。

更に、膠原病やリウマチ等、いわゆる自己免疫疾患においても、免疫抑制剤はその症状の緩和において重要な薬剤となり得る。

ここで、免疫抑制剤としては、副腎皮質ホルモン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アルカロイド、抗生物質、抗リンパ球グロブリン、抗ＣＤ３モノクローナル抗体等が知られており、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、臓器移植などの治療薬として用いられている。そして、近年、より一層優れた免疫抑制剤の開発が求められている。

特開２０１１−０１６８５１号公報特開２００７−０９１６４４号公報特開２００５−２８１２３５号公報特開２００５−１２６３４３号公報特開２００４−３０７４４２号公報

そこで、本発明は、より一層優れた免疫抑制剤を提供することを課題とする。

本発明は、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含む免疫抑制剤である。

本発明に係る免疫抑制剤は、Ｔ細胞からのサイトカイン放出抑制及びＴ細胞の増殖抑制についても優れた効果を有する。

図１Ａは、本発明に係る化合物の反応スキームを示した図である。図１Ｂは、本発明に係る化合物の反応スキームを示した図である。図１Ｃは、本発明に係る化合物の反応スキームを示した図である。図２は、CFSEを用いた細胞分裂の測定法の原理である。細胞内に取り込まれたCFSEの細胞一個あたりの蛍光強度は細胞分裂により約半分となる。蛍光減衰をFACSにより測定する事により、細胞分裂の回数を調べる事が出来る。図３は、本発明に係る化合物存在下でのT細胞刺激後の実際のCFSEの蛍光減衰を測定した図である。試験化合物の濃度が上昇するに従い、蛍光強度の低い集団が減少している（つまり、分裂した細胞が少ない）のがわかる。図４は、T細胞活性化のしくみである。T細胞は抗原提示細胞に取り込まれた外来異物を認識するT 細胞受容体の刺激とCD28からの共刺激により完全活性化される。それぞれの刺激は抗CD3抗体、抗CD28抗体により代替できる。完全活性化されたT細胞は、NF-kB, NFAT, AP1といった転写因子を活性化することで、盛んに増殖しながら様々なサイトカインを放出し、他の免疫担当細胞を活性化することで、個体免疫反応を促進する。図５は、ヒトのT細胞でのサイトカイン産生に及ぼす本発明に係る化合物の影響を調べたものである。本発明の化合物の濃度が上昇するに従い、サイトカイン産生が抑制されていることがわかる。

≪有効成分≫
本発明に係る免疫抑制剤は、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含む。

ここで、「薬理学的に許容しうる塩」とは、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルエチレンジアミンなど）との塩、有機酸（酢酸、安息香酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ギ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）との塩、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸など）との塩、アミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）との塩が挙げられる。また、当該化合物及びその塩は、水和物、エタノラートのような溶媒和物の形態であってもよい。加えて、水溶性を向上させるため、当該化合物又はその塩は、サイクロデキストリン（例えば、β−サイクロデキストリン）の包接体であることが好適である。ここで、当該化合物又はその塩：サイクロデキストリン（質量比）は、好適には１：１０〜７０、より好適には１：２０〜５０、特に好適には１：２５〜３５、である。

≪投与方法≫
当該化合物及びその塩は、例えば、経口、経皮又は注射により投与することができる。

経口投与用の錠剤、顆粒及びカプセル剤は、慣用の添加剤、例えば、結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）；充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）；用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）；崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を含んでいてもよい。錠剤、顆粒及びカプセル剤は、通常の製剤の分野で公知の方法で被膜を形成してもよい。

経口投与用の液体製剤は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよく、使用前に水又は他の適切な溶剤に溶解する凍結乾燥製剤としてもよい。液体製剤は通常の添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂）；乳化剤（例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート又はアラビアゴム）；非水性賦形剤（例えばアーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールのような油性エステル）；保存剤（例えばメチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸塩又はソルビン酸）及び着香剤又は着色剤を含んでいてもよい。

経皮投与する場合、有効成分はクリーム、ローション又は軟膏の形態をとっていてもよい。薬剤として用いることができるクリーム又は軟膏製剤は、当該分野で周知の方法により調製することができる。

また、注射剤は、当該化合物又はその塩を適当な媒体に懸濁又は溶解させることにより製造することができる。注射剤には、局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤のようなアジュバント等を含んでいてもよい。

≪投与量≫
当該化合物及びその塩の投与量は、患者の年齢、体重、全身的な健康度、性別、投与時間、投与経路、疾患の重篤度を含む種々の要因によって適宜調整することができ、例えば、通常、成人１日あたり１０〜５０００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３０００ｍｇ程度を、１〜５回に分けて投与することが適当である。

以下に、当該化合物の製造法を製造例及び実施例により、また、免疫抑制剤としての作用等を試験例により詳細に説明する。

製造例
図１の反応スキームに従って、本発明に係るＯ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン・二塩酸塩のβ−シクロデキストリン包接体を調製した。当該塩は、淡黄色結晶又は結晶性の粉末であり、融点が１８０〜２００℃（分解）であった。

１）ベンゾオキサゾール誘導体の合成
（２）の合成
３−ニトロサリチル酸（１）（２０１ｇ、１．０９ｍｏｌ）のメタノール（１６００ｍｌ）溶液に室温で９６％硫酸（６０．６ｍｌ）を滴下し、その後２３時間還流した。反応液を約１／３になるまで減圧濃縮した後氷浴にて冷却した。生成した固体を濾取、冷メタノール（６００ｍｌ）、冷水（６００ｍｌ）にて洗浄、減圧下４０℃にて乾燥することにより３−ニトロサリチル酸メチル（２）を２０９．７ｇ（９７％）黄色固体として得た。
（３）の合成
３−ニトロサリチル酸メチル（２）（１０８．２ｇ、０．５４９ｍｏｌ）のＴＨＦ（１１４０ｍｌ）／ＭｅＯＨ（８１０ｍｌ）溶液に１０％Ｐｄ−Ｃ（１５．２ｇ）を加え、水素１気圧下室温にて２時間接触還元した。触媒を濾別し、ＴＨＦで洗浄した後溶媒留去した。残渣をジイソプロピルエーテルにて洗浄することにより３−アミノサリチル酸メチル（３）を１６６．７ｇ（９５％）褐色固体として得た。
（４）の合成
３−アミノサリチル酸メチル（３）（７４．８ｇ、０．４４７ｍｏｌ）のＴＨＦ（１１３０ｍｌ）溶液に５℃でＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（１０８．７ｇ、０．８９７ｍｏｌ）を４０分で滴下した。反応液を１５分間撹拌した後ベンゾイルクロリド（７５．７ｇ、０．５３８ｍｏｌ）のＴＨＦ（５７０ｍｌ）溶液を１時間かけて滴下した。同温で１時間撹拌した後、水（１００ｍｌ）を加え、ＴＨＦを留去した。残渣に水（９００ｍｌ）を加え、酢酸エチルにて抽出し、有機層を１０％塩酸、水、飽和食塩水で洗浄、亡硝にて乾燥し、溶媒を留去した。得られた粗結晶とアミノ体（３）（９０．１６ｇ）より同様の操作で得られた結晶を合わせ酢酸エチルより再結晶することにより３−ベンゾイルアミノサリチル酸メチル（４）を２４７．１ｇ（９２％）無色固体として得た。
（５）の合成
３−ベンゾイルアミノサリチル酸メチル（４）（８３．２ｇ、０．２９６ｍｏｌ）の酢酸（１４８０ｍｌ）溶液に内温１５℃で６９％硝酸（ｄ＝１．４２）（９５ｍｌ、１．４５８ｍｏｌ）を滴下した。反応液を室温で３時間撹拌した後、氷水（３００ｍｌ）に注ぎ１０分間撹拌した。生成した固体を濾過し、水（３回）、エーテルで洗浄した後風乾することにより３−ベンゾイルアミノ−５−ニトロサリチル酸メチル（５）を９３．４ｇ（９６％）黄色固体として得た。
（６）の合成
３−ベンゾイルアミノ−５−ニトロサリチル酸メチル（５）（７２．２ｇ、０．２６０ｍｏｌ）とＰＰＳＥの１，２−ジクロロベンゼン溶液（７８０ｍｌ）の混合物を１５０℃で４時間撹拌した。反応液を氷冷し、析出した結晶を濾取、ｎ−ヘキサン、冷メタノールで洗浄、減圧で乾燥することにより、５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−カルボン酸メチルエステル（６）を６１．２ｇ（９０％）淡黄色固体として得た。
（７）の合成
５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−カルボン酸メチルエステル（６）（５９．２ｇ、０．１９８ｍｏｌ）のメタノール（９９０ｍｌ）懸濁液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２９７ｍｌ、０．２９７ｍｏｌ）を滴下し、その後室温にて１９時間撹拌した。氷冷下に１０％塩酸にて反応液を酸性とし数分間撹拌した。生成した固体を濾取、水、メタノールで洗浄した後減圧乾燥することにより５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−カルボン酸（７）を５４．２ｇ（９６％）無色固体として得た。
（９）の合成
５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−カルボン酸（７）（２６．４ｇ、０．０９３１ｍｏｌ）のＴＨＦ（４７０ｍｌ）懸濁液にトリエチルアミン（１５．５７ｍｌ、０．１１２ｍｏｌ）を加え室温で３０分間撹拌した。反応液を−１０℃に冷却し、クロロ炭酸エチル（１０．６８ｍｌ、０．１１２ｍｏｌ）を加え同温で３０分撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム（８．８４ｇ、２３３．７ｍｍｏｌ）を加え３０分撹拌した後、ＴＨＦ／水（３１７ｍｌ／６４ｍｌ）を３時間かけて−１０〜−６℃にて滴下した。反応液をさらに２時間撹拌し、その後に氷水を注ぎ、析出した固体を濾取、水で洗浄した。５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−カルボン酸（７）（１４．６ｇ）より同様の操作により得られた固体を合わせ、ＴＨＦ（６００ｍｌ）／メタノール（６００ｍｌ）に懸濁し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１１５ｍｌ）を加えた後室温で４．５時間撹拌した。反応液を氷水にあけ、析出した固体を濾過した後風乾することにより７−ヒドロキシメチル−５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール（９）を２４．４ｇ（６３％）ほぼ無色の固体として得た。
（１０）の合成
７−ヒドロキシメチル−５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール（９）（４６．２ｇ、０．１７１ｍｏｌ）のＴＨＦ（１１５０ｍｌ）懸濁液に氷冷下トリエチルアミン（３４．９ｍｌ、０．２５０ｍｏｌ）を加えた。メタンスルホニルクロリド（２３．１ｇ、０．２００ｍｏｌ）を滴下し、氷冷下で３０分その後室温にて３時間撹拌した。トリエチルアミン（４．５５ｍｌ、０．０３３ｍｏｌ）、メタンスルホニルクロリド（１．２９ｍｌ、０．０１７ｍｏｌ）を追加しさらに３０分撹拌した。反応液を氷水に注ぎ析出した固体を濾過した。得られた固体を水、ジイソプロピルエーテルで洗浄した後４０℃で減圧乾燥することにより５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−イルメチルメタンスルホネート（１０）を５９．１ｇ（９９％）淡黄色固体として得た。
２）ジクロロチロシン誘導体の合成
（１２）の合成
（Ｓ）−チロシンメチルエステル塩酸塩（１１）（６０．１５ｇ、０．２６ｍｏｌ）の酢酸（２９４ｍｌ）懸濁液に室温にてスルフリルクロリド（５２．２２ｍｌ、０．６５ｍｏｌ）を滴下し、その後３．５時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をエーテルにて充分に洗浄、乾燥することにより（Ｓ）−ジクロロチロシンメチルエステル塩酸塩（１２）を７２．７０ｇ（９３％）無色固体として得た。
（１３）の合成
（Ｓ）−ジクロロチロシンメチルエステル塩酸塩（１２）（７２．４２ｇ、０．２４ｍｏｌ）の水（１．４ｌ）懸濁液に氷冷下で２Ｍ炭酸カリウム水溶液（１２０．５ｍｌ）を滴下した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（５８．１ｍｌ、０．２５ｍｏｌ）のジクロロメタン（１．４ｌ）溶液を加え氷冷下で１．５時間、室温にて４０時間撹拌した。反応液をセライトを用いて濾過した後、濾液をクロロホルムで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄、亡硝乾燥し、溶媒を留去した。残渣をｎ−ヘキサンで洗浄することにより（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−ジクロロチロシンメチルエステル（１３）を７６．９５ｇ（８８％）無色固体として得た。
３）本発明に係る化合物塩の合成
（１４）の合成
５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−イルメチルメタンスルホネート（１０）（２９．１１ｇ、８３．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８２０ｍｌ）に溶解し、アセトン（８２０ｍｌ）を加えた。（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−ジクロロチロシンメチルエステル（１３）（３６．５４ｇ、１００ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（１２．５３ｇ、８３．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１７．３７ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２１時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を約１／２まで濃縮した。酢酸エチル、水を加え分液した後、有機層を水、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、亡硝乾燥溶媒留去した。５−ニトロ−２−フェニルベンゾオキサゾール−７−イルメチルメタンスルホネート（１０）（３０．０６ｇ）、（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−ジクロロチロシンメチルエステル（１３）（３７．６６ｇ）より同様の操作によって得られた生成物を加え、計１１６．２ｇの粗生成物をジイソプロピルエーテルにて洗浄した後乾燥することによりニトロ体（１４）を９８．４３ｇ（９４％）淡黄色固体として得た。
（１５）の合成
ニトロ体（１４）（５７．０４ｇ、９２．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３４０ｍｌ）に溶解し、イソプロパノール（１３４０ｍｌ）を加え内温６０℃に加熱した。５Ｍ塩化アンモニウム水溶液（２７８ｍｌ、１．３９ｍｏｌ）、続いて鉄粉（１０３．３２ｇ、１．８５ｍｏｌ）を加え、６０℃にて３時間撹拌した。反応液をセライトを用いて濾過し、濾液を約１／３まで濃縮した。セライト上の不要物は熱酢酸エチルにて３回洗浄し、濾液と合わせて水、飽和食塩水で洗浄した後亡硝にて乾燥した。溶媒を留去し、得られた固体をジイソプロピルエーテルにて洗浄、乾燥することによりアミノ体（１５）を５３．０３ｇ（９８％）黄色固体として得た。
（１６）の合成
アミノ体（１５）（８６．９１ｇ、０．１４８ｍｏｌ）をＴＨＦ（１４３０ｍｌ）に溶解し、内温が約１０℃になるように氷浴で冷却しつつ０．５Ｍ水酸化リチウム水溶液（４４４ｍｌ、０．２２２ｍｏｌ）を滴下し、さらに氷浴中で１時間撹拌した。反応液を約１／２になるまで濃縮し、水（６００ｍｌ）を加え、さらに１０％クエン酸水溶液にてｐＨを約４とした後酢酸エチル−ＴＨＦ（１０：１）にて抽出した。抽出液を水、飽和食塩水で洗浄し、亡硝乾燥、溶媒留去した。得られた残渣を酢酸エチル−ＴＨＦ（１０：１）より再結晶し、ほぼ無色の固体（７２．９４ｇ、粗収率８６％）を得た。この固体（１０．０３ｇ）をクロロホルム−メタノール（１０：１）より再結晶し、カルボン酸（１６）を８．６３ｇ（回収率８６％）ほぼ無色の固体として得た。
（１７）本発明に係る化合物塩の合成
氷冷下カルボン酸（１６）（８５．２３ｇ、０．１４９ｍｏｌ）のＴＨＦ（７５０ｍｌ）溶液に５〜１０℃で４Ｍ塩化水素−ジオキサン（１１１７ｍｌ、４．４７ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。反応液を同温で１時間撹拌した後、徐々に昇温し室温にて２０時間撹拌した。ジイソプロピルエーテルを加え固体を濾取し、ジイソプロピルエーテルにて洗浄した。得られた固体を３ロットに分けてエタノール（計２３００ｍｌ）に溶解し、不溶物を濾別した。濾液を室温、減圧にて約１０００ｍｌにまで濃縮し、得られた溶液を室温にて撹拌した。生成した結晶を濾過し、乾燥することにより本発明に係る化合物塩（１７）を６６．１１ｇ（８１％）淡黄色固体として得た。
４）サイクロデキストリン包接体の合成
（１）Sulfobutyl ether-β-cyclodextrin (SBE-CDと略す：商品名Captisol)を1000 g秤量し、細胞培養用の無菌フード内で、5 Lの容器に取り、HPLC用グレードの純水1800 mlを加えて、一晩撹拌して澄んだ溶液を得た（約36 重量％となる）。
（２）翌朝、水槽中で32-36℃に加温し、この温度を保持して、本発明に係る化合物のHCl塩を45.5 g; free baseとして35.5 g相当に100 mlのエタノール、200 mlの純水、そして300 mlの上記SBE-CD溶液を添加し、化合物溶液を得た。この溶液のpHが3〜4であることを確認した。
（３）3.4 ｇの苛性ソーダを200 mlの純水に溶解し、上記溶液を撹拌しながらこの苛性ソーダ水を加えて、pHを6.5に調製した。
（４）この暖かい状態で、溶液を真空ポンプを用いて、0.4 μmのフィルターで滅菌ろ過した。ろ液は滅菌済の5 Lの容器に取り、（１）で調製したSBE-CD溶液で希釈し、最終容量を2800 mlに調整した。
（５）更に5分間撹拌後に、pHを測定し、~6.5であることを確認した。滅菌分注器を用いて、30 mlバイアル瓶に各15 mlづつ分注した。最終化合物濃度は10 mg/mlとなった。各バイアルは1週間にわたり凍結乾燥機（Lyostar3, FTS Systems SP Scientific）で処理された。
（６）凍結乾燥後のバイアル瓶はゴム栓で密封し、金属ヒダ留めをし、冷蔵庫で保存した。
（７）再溶液化には14.1 mlの注射用蒸留水を加えて5-10 分間のvoltex mixerにより15 mlの淡黄色の溶液になった。

試験例１
（ヒトＴ細胞の調製）
１）健常人から書面での同意を得て、肘静脈から血液を採取し、等量のリン酸緩衝液に懸濁後、histpaque（Sigma社）の上部に重層し、遠心分離（2000rpm, １０分、室温）後、中間層の細胞を採取する事で末梢血単核球細胞（PBMCs）を単離した。
２）PBMCsを蛍光標識された抗CD4抗体及び抗CD25抗体で染色し、FACSAria（BD社）を用いてCD4陽性でCD25陰性のヒトT細胞を単離した。
試験例２
（ヒトT細胞の活性化方法と増殖の測定）
１）１ｘ10⁵個のT細胞に抗CD28抗体（クローンCD28.2、2μg/ml）を添加し、抗CD3抗体（クローンOKT3、 5μg/ml）で被覆したシャーレ上に加え、10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地1ml中で培養を継続し３日間活性化した。
２）細胞の増殖の測定はCFSE法により行った。精製したT細胞にcarboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester（CFSE）を最終濃度0.7μg/mlになるように混ぜ、１０分放置して細胞内にCFSEを取り込ませた。細胞洗浄後、３日間活性化しCFSEの蛍光強度減衰をFACSCalibur（BD社）により測定し分裂回数を調べた。
その原理と結果を図２と図３に示す。
試験例３
（試験化合物の調製）
秤量した試験化合物に、それぞれDMSOを添加し、100 mMの溶液又は懸濁液を調製してDMSOストックとした。アッセイ時には本ストックをDMSOで希釈して、各試験化合物の終濃度の1000倍濃度の溶液を調製し、各溶液を培地にて希釈してDMSOの最終濃度を全て0.5％に調整した。
試験例４
（活性化ヒトT細胞からのサイトカインの放出量の測定法）
１）ヒトT細胞からのサイトカイン放出機序の概要を図４に要約する。
２）上記、試験例2の1)で述べたT細胞活性化を3日間継続し、培地内に放出されるサイトカイン（インターフェロンーガンマ（INFγ）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン４（IL-4）、インターロイキン１７（IL-17））を測定した。
３）各サイトカインの測定は、サイトメトリックビーズアレイキット（BD社）による抗体サンドイッチ法により行った。各サイトカインの抗体が結合したビーズと細胞培養液を混合し、２時間放置した後、蛍光標識されたサイトカイン抗体を混合し1時間放置した。洗浄後ビーズの蛍光強度をFACSCaliburにて測定し、各サイトカイン定量分析を行った。
４）化合物の非存在下での各サイトカインの放出量と、具体例として、各種濃度の化合物6の存在下での結果を図５に示す。

Claims

Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含む免疫抑制剤。