JP5470648B2

JP5470648B2 - ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化剤

Info

Publication number: JP5470648B2
Application number: JP2009047755A
Authority: JP
Inventors: 信康松浦
Original assignee: Kake Educational Institution
Current assignee: Kake Educational Institution
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2029-03-02
Also published as: JP2010202540A

Description

本発明は、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化剤に関する。

ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（Peroxisome Proliferator Activated Receptor：以下「ＰＰＡＲ」と略すことがある）は、ステロイドホルモン受容体ファミリーに属し、糖・脂質代謝に関与する種々の標的遺伝子を調節している核内受容体である。その中でも、ＰＰＡＲβ／δは、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）の代謝や脂肪細胞の分化に関与し、活性化により脂肪燃焼が促進されることが報告されている。したがって、ＰＰＡＲβ／δ活性化剤は抗肥満薬開発のターゲットとなり得るものである。

非特許文献１及び２には、下記式（２）で表されるＧＷ５０１５１６という化合物が、ＰＰＡＲδの選択的で強力な作動薬であることが記載されている。ＧＷ５０１５１６を用いることによって、高脂肪食負荷マウスの体重増加が顕著に抑制され、耐糖能、インスリン抵抗性、高脂血症などメタボリックシンドロームのほぼ全ての症状が改善されることが見出されている。また、血中の善玉コレステロールである高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）を増加させることも報告されている。肥満抑制によって生活習慣病の発症を予防するためには、その効果を有する薬剤を長期間連用する必要があるけれども、ＧＷ５０１５１６は有機合成された化合物であることから、それを長期間連用することについては抵抗を感じる者も少なくない。

特許文献１には、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、フラバノノール類、イソフラボン類から選ばれる１種又は２種以上の化合物を有効成分とすることを特徴とするＰＰＡＲβ／δ活性化剤が記載されている。しかしながら、特許文献１中に列記された多数の化合物のほとんどにおいて、ＰＰＡＲβ／δ活性化効果が未だ不十分である。

下記式（１）で表される化合物は、バイオカニンＡと呼ばれていて、ハーブ素材であるアカツメクサから抽出単離することの可能な天然イソフラボンである。現在、婦人病治療効果があるとして健康食品等として用いられている。しかしながら、この化合物のＰＰＡＲβ／δ活性化効果については、これまで全く知られていなかった。

特許文献２には、ゲニステイン、ダイドゼイン、バイオカニンＡ、ホルモノネチンおよびこれらのグリコシドからなる群から選択される２種またはそれ以上の天然に存在するフィト−エストロゲンの健康補助量を、月経前症候、閉経期症候、良性（嚢胞性）、乳疾患、乳癌、子宮癌、前立腺癌、大腸癌、または高血中コレステロール症の症状の予防又は治療に用いるヒトの健康補助剤の製造のために使用する方法が記載されている。またその実施例には、アカツメクサ抽出液を投与することによって血清コレステロールレベルを低減できたことが記載されている。しかしながら、特許文献２に記載された化合物は、エストロゲン様活性を有するものとして捉えられているだけであって、そのＰＰＡＲβ／δ活性化効果については何ら記載されていない。

また、特許文献３には、動物における体重管理のために有効な量で、１種以上のイソフラボン類又はその代謝産物を含む組成物が記載されている。当該イソフラボン類としては、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）、バイオオカニンＡ、ホルムオノネチン、天然グリコシド、イソフラボン代謝産物、化学的に合成されたイソフラボン、及び化学的に合成されたイソフラボン類似体が例示されている。しかしながら、特許文献３の実施例においては、イヌの食餌に対して、イソフラボン類として大豆胚芽粗びき粉を配合した例が記載されているだけであって、具体的にどのイソフラボンが有効であるかが実証されているわけではない。しかも、特許文献３においては、イソフラボン類は植物エストロゲンとして捉えられているだけであって、そのＰＰＡＲβ／δ活性化効果については何ら記載されていない。

特開２００７−１１９４２９号公報特開２００４−２３０４号公報特表２００７−５２９２１１号公報

酒井寿郎、「核内受容体ＰＰＡＲδによる肥満と改善機構」、医学のあゆみ、２００７年、ｖｏｌ.２２０、Ｎｏ.１、ｐ．１０−２０田中十志也、酒井寿郎、「ＰＰＡＲと脂質代謝」、Ａｄｉｐｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、ｖｏｌ.３、Ｎｏ．１、ｐ．１７−２３

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、天然物に由来する有効成分を含有し、優れたペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化効果を有する活性化剤を提供することを目的とするものである。

上記課題は、下記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化剤を提供することによって解決される。

本発明のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化剤は、天然物に由来する有効成分を含有し、優れたペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化効果を有する。

バイオカニンＡ及びＧＷ０７４２のＰＰＡＲβ／δアゴニスト活性に基づくルシフェラーゼ活性値を示したグラフである。

本発明のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化剤は、その有効成分として、下記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する。

上記式（１）で表される化合物は、バイオカニンＡと呼ばれていて、アカツメクサから抽出単離することができる天然イソフラボンである。アカツメクサは、ハーブ素材であって、食素材として既に安全性が確立されているものであるから、上記式（１）で表される化合物についても安全性が確立されているといえる。この点、前述のＧＷ５０１５１６など、既存のＰＰＡＲβ／δ活性化剤は、全て有機合成医薬品だったので、安全性の面で大きな意義がある。

ここで、上記化合物の塩としては、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えばアンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、モルホリン、ピペリジン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。

本発明のＰＰＡＲβ／δ活性化剤として用いられる上記式（１）で表される化合物又はその塩は、アカツメクサや他の天然素材から抽出し、必要に応じて精製したものであってもよいし、別途有機合成されたものであっても構わない。しかしながら、投与される者の心情や、安全性の観点からは、アカツメクサなどの天然素材から抽出したものであることが好ましい。

上記式（１）で表される化合物又はその塩は、そのままあるいは各種の医薬組成物として投与される。このような医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、糖衣剤、またはデボー剤にしてよく、普通の担体や希釈剤などの製剤助剤を用いて常法に従って製造する事ができる。また、ＰＰＡＲβ／δ活性化剤として用いられるのであれば、上記式（１）で表される化合物又はその塩を飲食品などに配合して用いても構わない。

製剤中における上記式（１）で表される化合物又はその塩の含有量は、剤形などにより適宜調整されるが、通常０．０１〜１００重量％である。好適な含有量は０．１重量％以上であり、より好適な含有量は１重量％以上である。一方、好適な含有量は９８重量％以下であり、より好適な含有量は９５重量％以下である。投与量は、患者の年令、性別、体重、症状、治療目的等により決定されるが、通常、経口投与で０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。

上記式（１）で表される化合物又はその塩は、ＰＰＡＲβ／δを活性化することができ、ＰＰＡＲβ／δアゴニストとしての効果を発揮することができる。したがって例えば、肥満抑制効果が期待できるので、抗肥満薬として有用であると考えられる。前述のように、上記式（１）で表される化合物は天然イソフラボンであって安全性が既に確立しているので、肥満患者が安心して長期連用することができ、メタボリックシンドロームに基づく様々な生活習慣病発症の予防が期待できる。

［上記式（１）で表される化合物の単離］
アカツメクサ（レッドクローバー）から、エタノールを用いて抽出することにより、アルコール抽出液を得た。得られたレッドクローバー抽出液に対し、有機溶媒分画操作及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返して、化合物を単離した。得られた化合物について、核磁気共鳴スペクトルを始めとする各種機器スペクトルを測定そして解析することにより、その化学構造が上記式（１）で表される化合物（バイオカニンＡ）であることを確認した。¹H-NMR（300MHz,d₆-DMSO）：3.78（3H,s,OMe）、6.22（1H,d,J=2Hz,H-6）、6.38（1H,d,J=2Hz,H-8）、7.00（2H,d,J=9Hz,H-2',6'）、7.50（2H,d,J=9Hz,H-3',5'）、8.37（1H,s,H-2）、10.93（1H,brs,7-OH）、12.91（1H,s,5-OH）。

［ＰＰＡＲβ／δ活性評価方法］
１．COS-1細胞の形質転換
COS-1細胞をトリプシン処理により回収し、４℃で遠心分離（1000rpm、３分間）した後、上清を除去し、2mlの培地で細胞を分散して60mm培養シャーレ（Corning社製）に5×105cell/wellの密度で播いた後、５％CO₂存在下に37℃で24時間培養した。形質転換にはEffectene Transfection Reagent（QIAGEN社製）を使用した。1.5ml tubeにBuffer ECを150μl、pPPARδ-Gal4を0.25μg、pGal4-Lucを1μg、pSEAP-control vectorを1μg入れ、最後にEnhancerを18μl入れ、vortexで１秒間攪拌した。25℃で３分間放置した後、Effecteneを25μl加え、vortexで10秒間攪拌して25℃で７分間放置した。この間に、60mm培養シャーレの培地を除去し、新しく培地を4ml入れて培地交換をした。７分後、1.5ml tubeに培地を1ml加え、2回、ピペッティングにより懸濁して60mm培養シャーレに全量を滴下し、５％CO₂存在下に37℃で16時間培養した。

２．COS-1細胞への被検試料添加
形質転換した細胞をトリプシン処理により回収し、４℃で遠心分離（1000rpm、３分間）した後、上清を除去し、10mlの培地に懸濁して96 well plate（NUNC）に125μl/well播き、５％CO₂存在下に37℃で１〜２時間培養した。その後、被検試料を1.25μl/well添加し、穏やかに攪拌して５％CO₂存在下に37℃で24時間培養した。

３．Luciferase活性測定
被検試料添加から24時間後、96 well plateから培地を25μl/well回収し、96 well white plateに移した。その後、残りの100μl/wellに、37℃にて融解したluciferase活性測定用溶液を100μl/well添加し、暗所にて35分間反応させた後、それぞれの発光強度を測定した。

４．secreted alkaline phosphatase（SEAP）活性の測定
96 well plateから回収した培地25μl/wellに、1 x Dilution Buffer 25μl/wellを添加し、セロハンテープで蓋をした後、穏やかに攪拌し、65℃で 30分間放置した。その後、4℃に冷却し、25℃に戻してからAssay Buffer 90μl/wellを添加して穏やかに攪拌した。25℃で5分間放置し、MUP solution 10μl/well添加して穏やかに攪拌した。暗所にて25℃で60分間反応させた後、4-methylumbelliferoneに基づく蛍光強度（Ex=360nm、Em=460nm）を測定した。

［被検試料］
下記試料１〜４の４種類の試料について、ＰＰＡＲβ／δ活性を評価した。ここで、下記式（３）で表されるＧＷ０７４２は合成化合物であり、コントロールアゴニストとして用いた。ＧＷ０７４２は、非特許文献１及び２に記載されているＧＷ５０１５１６と比べてベンゼン環の水素原子が１個フッ素原子に置換されているものであって、ＧＷ５０１５１６と生物学的活性は同じであることが知られている化合物である。
・試料１：バイオカニンＡ 10μg/ml DMSO溶液
・試料２：バイオカニンＡ 1μg/ml DMSO溶液
・試料３：ＧＷ０７４２ 0.1nM DMSO溶液
・試料４：ジメチルスルホキシド（DMSO）のみ

［試験結果］
ＰＰＡＲβ／δアゴニスト活性に基づく、ルシフェラーゼ活性値を、well間データ補正のため測定したSEAP活性値にて除することにより補正し、アゴニスト活性を算出した。各試料での結果をまとめて図１のグラフに示す。棒グラフの上に付されているバーは、標準偏差を示すものである。

バイオカニンＡは、10μg/mlの濃度において、コントロールアゴニストであるＧＷ０７４２と同等の活性を示し、1μg/mlの低濃度においても、ＧＷ０７４２と比較して３０％程度のアゴニスト活性を示した。ここで、コントロールとして評価したＧＷ０７４２の濃度は０．１ｎＭであってバイオカニンＡの濃度に比べてかなり低いけれども、ＧＷ０７４２の濃度をさらに上昇させても、必ずしもそれ以上活性は上昇しない。したがって、バイオカニンＡを用いることによって、有機合成化合物であるＧＷ０７４２を用いて得られる効果と同等の効果が得られることが明らかになった。天然物であるバイオカニンＡの安全性は確立しているので、安全かつ高活性のＰＰＡＲβ／δ活性化剤であることが明らかになった。

Claims

下記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体β／δ活性化剤。