JP5451385B2 - 自己組織化され、マイクロパターン化され、高周波（ｒｆ）遮断がなされたバイオコンテナと、遠隔から空間的に制御された薬品のデリバリーのためのその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、２００６年６月２３日出願の米国仮出願第６０／８１６０６３号の利益を主張するものである。さらに本出願は、２００５年７月２２日出願の米国仮出願第６０／７０１９０３号の優先権を主張する、２００６年７月２４日出願の米国第１１／４９１８２９号の一部継続出願である。これらの出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利
この研究は、部分的に米国国立衛生研究所によって支援された（ＮＩＨ Ｐ５０ ＣＡ １０３１７５）。米国政府は、本発明の権利を有することができる。
この研究は、部分的に米国国立衛生研究所によって支援された（ＮＩＨ Ｐ５０ ＣＡ １０３１７５）。米国政府は、本発明の権利を有することができる。
本発明は、マイクロ加工されたナノまたはマイクロスケール粒子であって、粒子内に含有される細胞、医薬品、組成物、薬物、組織、ゲル、およびポリマーを含んだ生物学的媒体を含むがこれらに限定するものではない材料または物質のカプセル化及びデリバリーと、それに続く治療材料のその位置での放出のための粒子と、この粒子の作製方法と、この粒子を生体内または生体外の応用で使用する方法とに関する。
近年、再生医療の進歩が、細胞レベルを目標とした療法に刺激を与えている。これらの療法は、細胞または細胞クラスターを移植し、細胞経路を操作し、薬物のデリバリーを目標にしようとしている。例えば広範な細胞系が、分子の両方向拡散および細胞放出を制御する半透性および生体適合性の固定化デバイス内に封入されている（R.P.Lanza、J.L.Hayes、W.L.Chick、Nat.Biotechnol. 14、1107 (1996); G.Drive、R.M.Hernandez、A.R.Gascon、M.Igartua、J.L.Pedraz、J.L.Trends、Biotechnol. 20、382 (2002); N.E.Simpson、S.C.Grant、S.J.Blackband、I.Constantinidis、Biomaterials 24、4941 (2003)）。マイクロテクノロジーの進歩と同時に、革新的な医療がもたらされ、新しい移植可能なデバイスとして、マイクロアレー、バイオカプセル、およびマイクロプローブが開発されている。これらのデバイスは、細胞のカプセル化、オンデマンド薬物放出、および疾患の早期診断を促進させた（J.T.Santini、M.J.Cima、R.Langer、Nature 397、335 (1999); J.Kost、R.Langer、Adv.Drug Delivery Rev. 6、19 (1991); L.Leoni、T.A.Desai、Adv.Drug Delivery Rev. 56、211 (2004); B.Ziaie、A.Baldi、M.Lei、Y.Gu、R.A.Siegel、Adv. Drug Delivery Rev. 56、145 (2004); T.A.Desai、T.West、M.Cohen、T.Boiarski、A.Rampersaud、Adv.Drug Delivery Rev. 56、1661 (2004); J.T.Santini、A.C.Richards、R.Scheidt、M.J.Cima、R.Langer、Angew. Chem. 39、2396 (2000); Z.Fireman、E.Mahajna、E.Broide、M.Shapiro、L.Fich、A.Sternberg、Y.Kopelman、E.Scapa、Gut 52、390 (2003)）。カプセル化およびデリバリーに使用されてきたポリマー、ヒドロゲルおよびゾルゲルベースのプロセスとは対照的に、従来のケイ素（Ｓｉ）ベースのマイクロ加工は、再現性が高く、機械的および化学的な安定性をもたらし、電子工学的および光学的モジュールをデバイス内に組み込むことが可能になり、それによって、生体内での無線遠隔測定、遠隔活性化、および通信を容易にする。しかし、Ｓｉベースのマイクロ加工は、もともと２次元（２Ｄ）プロセスであり、従来のマイクロ加工を使用して３次元（３Ｄ）システムを作製することは極めて難しい（M.Madou、Fundamentals of Microfabrication (CRC、Boca Raton、FL、1997)）。３Ｄ医療機器には、これに対応する２Ｄ機器に優るいくつかの利点があり、即ち、（ａ）外表面積と体積との比がより大きく、それによって、周囲を取り囲む媒体との相互作用が最大限になり、種々の診断またはデリバリーモジュールを取り付ける空間が得られ、（ｂ）有限な体積によって細胞および薬物のカプセル化が可能になり、（ｃ）デバイスが体内において不都合に停滞する機会を低減する幾何形状である。
R.P.Lanza、J.L.Hayes、W.L.Chick、Nat.Biotechnol. 14、1107 (1996)
G.Drive、R.M.Hernandez、A.R.Gascon、M.Igartua、J.L.Pedraz、J.L.Trends、Biotechnol. 20、382 (2002)
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J.T.Santini、M.J.Cima、R.Langer、Nature 397、335 (1999)
J.Kost、R.Langer、Adv.Drug Delivery Rev. 6、19 (1991)
L.Leoni、T.A.Desai、Adv.Drug Delivery Rev. 56、211 (2004)
B.Ziaie、A.Baldi、M.Lei、Y.Gu、R.A.Siegel、Adv.Drug Delivery Rev. 56、145 (2004)
T.A.Desai、T.West、M.Cohen、T.Boiarski、A.Rampersaud、Adv.Drug Delivery Rev. 56、1661 (2004)
J.T.Santini、A.C.Richards、R.Scheidt、M.J.Cima、R.Langer、Angew.Chem. 39、2396 (2000)
Z.Fireman、E.Mahajna、E.Broide、M.Shapiro、L.Fich、A.Sternberg、Y.Kopelman、E.Scapa、Gut 52、390 (2003)
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本発明の一態様では、ｉｎｓｉｔｕの治療薬のデリバリーを促進させるために、３次元性の利点と、Ｓｉベースのマイクロ加工の望ましい態様とを組み合わせるという計略によって、バイオコンテナ（即ち、ボックス、中空粒子）が作製されている。例えばこのコンテナには、マイクロビーズまたはゲルに埋め込まれた細胞が詰め込まれ、したがって、細胞カプセル化技術に使用される今日の固定化システムと併せて使用することができ、またはこれらを独立に使用することができる。別の態様では、バイオコンテナは、免疫抑制状態でまたは免疫抑制なしで治療薬の生体外および生体内放出を行うため、多孔質コンテナ内に機能細胞をカプセル化するのにも使用することができる。例えばコンテナは、糖尿病患者への移植のためにインスリン分泌細胞をカプセル化しデリバリーするために、小さな領域内に細胞を拘束する必要がある動物モデルに腫瘍接種材料を置くために、また、機能的神経ＰＣ１２細胞をデリバリーするために、使用することができる。いくつかの実施形態では、コンテナの面が、微小規模の穿孔によってパターニングされており、その内容物とこれを取り囲む媒体の、潅流および放出の制御が可能になる。コンテナの有利な属性は、多様なサイズおよび形状での並行作製プロセス；精密な単分散表面多孔率；および磁場を使用して遠隔ガイドができることである。別の態様では、本発明のコンテナは、従来の磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を使用して容易に検出され非侵襲的に追跡され、造影剤の存在を必要としない。
本発明は、粒子内に含有された細胞、薬物、組織、ゲル、およびポリマーを含むがこれらに限定するものではない材料または物質のカプセル化及びデリバリーと、それに続く治療用材料のその場での放出のためのナノスケールまたはマイクロスケール粒子と、２Ｄ前駆体を３Ｄ粒子に折り畳むことによってこの粒子を作製する方法と、生体内または生体外での応用におけるこの粒子の使用とを提供する。本発明の一実施形態では、３次元粒子が、中空多面体形状を形成する多数の２次元面を含み、充填可能な中心チャンバを含有し、この粒子のサイズはマイクロスケールまたはナノスケールである。別の実施形態では、粒子の２次元面が、穿孔または細孔によってパターニングされる。別の実施形態では、穿孔または細孔が、フォトリソグラフィによって生成される。別の実施形態では、穿孔または細孔は、約０．１ｎｍから約１００ミクロンのサイズを有する。別の実施形態では、粒子は、金属、ポリマー、ガラス、半導体、絶縁体、およびこれらの組合せからなる群から選択された少なくとも１種の材料から作製される。別の実施形態では、金属が銅またはニッケルである。別の実施形態では、粒子はファラデーケージである。別の実施形態では、粒子は生体適合性材料で被覆されている。別の実施形態では、生体適合性材料は、金属、ポリマー、またはこれらの組合せである。別の実施形態では、粒子の充填可能な中心チャンバには、粒子の内容物を含む少なくとも１種の物質が充填される。別の実施形態では、粒子の２次元面の穿孔または細孔によって、粒子の内容物の放出が可能になる。別の実施形態では、少なくとも１種の物質は治療薬である。別の実施形態では、治療薬は、細胞、医薬品、組成物、組織、ゲル、およびポリマーからなる群から選択される。別の実施形態では、粒子は対象に投与され、この対象における粒子の位置は、磁気共鳴映像法によって非侵襲的に追跡される。別の実施形態では、粒子は、バックグラウンドに対してネガティブ造影で、またはバックグラウンドに対してポジティブ造影で画像形成される。
本発明は、中空多面体形状を形成する多数の２次元面を含み、充填可能な中心チャンバを含有する、３次元粒子を作製する方法も提供し、この方法は、（ａ）多数の２次元面を作製する工程と、（ｂ）作製された２次元面をパターニングする工程と、（ｃ）パターニングされた２次元面に少なくとも１個のヒンジをパターニングして、ヒンジ付き縁部を形成する工程と、（ｄ）第１のパターニングされた２次元面のヒンジ付き縁部を、第２のパターニングされた２次元面のヒンジ付き縁部に接合して、ヒンジ付きジョイントを形成する工程と、（ｅ）工程（ｄ）を繰り返して、隣接する２次元面の間にヒンジ付きジョイントを有する２次元前駆体型板を形成する工程と、（ｆ）熱を使用して、２次元型板のヒンジを液化する工程と、（ｇ）３次元粒子を自己組織化する工程とを含む。別の実施形態では、この方法の工程（ｃ）のヒンジは、液化することができる材料を含む。別の実施形態では、材料ははんだ、金属合金、ポリマー、またはガラスである。別の実施形態では、この方法の工程（ａ）が、（ｉ）基板上に犠牲被膜をスピンコートして、第１の層を形成する工程と、（ｉｉ）第１の層上に導電性の第２の層を重ねる工程と、（ｉｉｉ）積層基板をフォトリソグラフィによってパターニングする工程とをさらに含む。別の実施形態では、粒子は、マイクロスケールまたはナノスケールのサイズを有する。別の実施形態において、この方法の工程（ｂ）で、２次元面が穿孔または細孔によってパターニングされる。穿孔または細孔は、フォトリソグラフィによって生成される。別の実施形態では、穿孔または細孔は、約０．１ｎｍから約１００ミクロンのサイズを有する。別の実施形態では、粒子はファラデーケージである。
本発明はさらに、中空多面体形状を形成する多数の２次元面を含み、充填可能な中心チャンバを含有する、対象に移植された３次元粒子の画像形成をする方法を提供し、この方法は、（ｉ）粒子の充填可能な中心チャンバに少なくとも１種の物質を充填して、充填済み粒子を形成する工程と、（ｉｉ）充填済み粒子を対象に投与する工程と、（ｉｉｉ）磁気共鳴映像によって対象体内で工程（ｉｉ）の粒子を非侵襲的に追跡する工程とを含む。別の実施形態では、粒子の２次元面の穿孔または細孔によって、充填可能な中心チャンバ内の物質の放出が可能になる。別の実施形態では、工程（ｉ）の少なくとも１種の物質は、治療薬である。別の実施形態では、治療薬は、細胞、医薬品、組成物、組織、ゲル、およびポリマーからなる群から選択される。
「粒子」、「中空粒子」、「ボックス」、「コンテナ」、および「バイオコンテナ」という用語は、中空の内部または物質を収容することが可能な内部を有する３次元物体、即ちレセプタクルを意味するために、本明細書では同義に使用される。
本明細書で使用される「コロイド」または「コロイド状」という用語は、連続媒体中に分散した粒子の系で構成された物質を指す。
材料は、外部磁場の存在下で、まったく異なる状態で反応させることができる。その反応は、材料の分子構造、その原子構造、および原子に関連した正味の磁場を含むがこれらに限定するものではない、いくつかの要因に依存する。ほとんどの材料は、強磁性、反磁性、または常磁性として分類することができる。
本明細書で使用される「反磁性」という用語は、外部磁場に起因した電子の軌道運動の変化によって生じる、外部磁場の存在下でのみ示される非常に弱い形の磁性を有する材料を指す。反磁性材料の誘導磁気モーメントは非常に小さく、印加された磁場とは反対の方向にある。反磁性材料の例には、銅、銀、および金が含まれるが、これらに限定するものではない。
「強磁性」という用語は、外部磁場に対して大きな正の磁化率を有する材料を指す。強磁性材料はいくつかの不対電子を有し、したがって、それらの原子は正味の磁気モーメントを有する。これらは磁場に対して強い引力を示し、外部の磁場が除去された後に、その磁気特性を保持することができる。強磁性材料の例には、鉄、ニッケル、およびコバルトが含まれるが、これらに限定するものではない。
「常磁性」という用語は、磁場に対して小さな正の磁化率を有する材料を指し、これは磁場によってわずかに引き付けられる。常磁性材料は、外部磁場が除去された場合に磁気特性を保持しない。これらの常磁性特性は、いくつかの不対電子の存在と、外部磁場によって引き起こされる電子軌道の再編成に起因する。常磁性材料の例には、マグネシウム、モリブデン、およびリチウムが含まれるが、これらに限定するものではない。
本明細書で使用される「ファラデーケージ」という用語は、磁場への自由な通過を可能にしながら電場の効果を遮断するように設計された、エンクロージャを指す（E.M.Purcell、Electricity and Magnetism、Berkeley Physics Course、第2巻（McGraw Hill、MA、1985）参照）。そのようなエンクロージャを、ファラデーシールド、ファラデーシールディング、ファラデースクリーン、ファラデー静電シールド、またはシールドルームとも呼ぶ。
本明細書で使用される「ゲル」という用語は、コロイド溶液から形成された、見掛けは固体のゼリー様材料を指す。重量でみれば、ゲルはほとんど液体であるが、固形分のような挙動をとる。「溶液」という用語は、別の物質（溶媒）に溶解した１種または複数の物質（溶質）の、均質な混合物を指す。
本明細書で使用される「誘導加熱」という用語は、金属内に渦電流を発生させ、抵抗により金属のジュール加熱をもたらす電磁誘導によって、金属物体を加熱するプロセスを指す。誘導加熱器（任意のプロセス用）は、高周波交流が内部を通過する電磁石からなる。熱は、磁気ヒステリシス損失によって発生させてもよい。
本明細書で使用される「磁場」という用語は、永久磁石や電流を伝える導体などの磁性を有する本体または実体を取り囲んだ、認め得る磁力が存在する空間内の領域を指す。そのような磁場は、磁力線によって表される。電磁場では、例えば、磁力が電場に対して直角である。
「磁場強度」または「磁場の強さ」（「Ｈ」）という用語は、所与の点での磁場の強さを指す。磁場強度は、通常はメートル当たりのアンペア数、またはエルステッドで表されるベクトル量である。
「磁気共鳴画像」または「ＭＲＩ」という用語は、高周波パルス、強力な磁場、および対象の間の相互作用を使用して、対象内部の水素原子から得られた核磁気共鳴（ＮＭＲ）シグナルから断層／平面で画像を構成する、非侵襲的撮像技法を指す。すべてのＭＲＩを支持する原理は、共鳴方程式である。
ｖ＝γＢ０
（方程式１）
（方程式１）
上式は、スピンの共鳴周波数υが磁場Ｂ０に比例することを示し、γが磁気回転比である場合に経験することである。
本明細書で使用される「マイクロスケール」という用語は、少なくとも１つの寸法が、約１μｍまたは１×１０−６メートルから約９９９μｍと測定される粒子を指す。本明細書で使用される「ナノスケール」という用語は、約１ナノメートルまたは１×１０−９メートルから約９９９ナノメートルと測定される粒子を指す。
「磁場勾配」という用語は、位置に対する磁場の変動を指す。１次元磁場勾配は、１つの方向に対する変動であり、それに対して２次元勾配は、２つの方向に対する変動である。磁気共鳴映像で最も有用なタイプの勾配は、１次元線形磁場勾配である。磁場Ｂ０でｘ軸に沿った１次元磁場勾配は、磁場がｘ方向に増大することを示す。ｘ、ｙ、およびｚ方向での磁場勾配の記号は、Ｇｘ、Ｇｙ、およびＧｚである。
物理学において、「磁気モーメント」または「双極子モーメント」という用語は、磁気源の極強度に極間の距離を乗じた値（μ＝ｐｄ）を指し、これは磁気源の強度の尺度である。磁場内の磁気モーメントは、磁場の電荷の旋回によって設定された磁束の尺度である。
本明細書で使用される「マイクロパターン」または「マイクロパターン化」という用語は、マイクロスケールの特徴を有する任意の２次元パターンを指す。本明細書で使用される「ナノパターン」または「ナノパターン化」という用語は、マイクロスケールの特徴を有する任意の２次元パターンを指す。本発明によれば、粒子は、約０．１ｎｍから約１００ミクロンのサイズに及ぶ穿孔または細孔によってパターニングされる。
「振動磁場」または「振動性磁場」という用語は、その強度ｍを定期的に増大し低下させる磁場を指し、そうでない場合には経時的に変化する磁場を指す。
本発明の粒子は、任意の多面体形状でよい。本明細書で使用される「多面体」という用語は、多面体を指し、または多面体に関係し、または多面体に似ているものを指す。「多面体」という用語は、平面多角形または面によって境界が定められた３次元物体を指す。「多角形」という用語は、三角形、四角形、五角形、六角形、七角形、および八角形などの多くの直線によって境界が定められた多面的な幾何学的図形を指す。例えば、本発明の粒子は、立方体または四面体でよい。
本明細書で使用される「高周波数」という用語は、通信に使用される電磁スペクトル内の周波数または周波数の間隔を指し、通常は、約３ｋＨｚから約３００ＧＨｚの範囲と定義され、これは、それぞれ約１００ｋｍから約１ｍｍの波長に相当する。
本明細書で使用される「高周波タグ」という用語は、高周波識別（ＲＦＩＤ）タグを含む。高周波識別（ＲＦＩＤ）は、ＲＦＩＤタグと呼ばれるデバイスを使用した、データの保存および遠隔的検索を利用する自動識別法である。ＲＦＩＤタグは、電波を使用した識別を目的として、物体に付着させまたは組み込むことができる。ＲＦＩＤタグは、３つの一般的な種類、即ち受動、半受動（バッテリー支援としても知られる）、または能動に分類される。受動タグは内部電源を必要とし、それに対して半受動および能動タグは、通常は小さいバッテリーである電源を必要とする。
「抵抗」という用語は、物体が電流の通過に対抗する程度の尺度を指し、方程式Ｒ＝Ｖ／Ｉによって表される（式中、Ｒは物体の抵抗であり（通常は、単位をオームとして測定され、Ｊｓ／Ｃ２に等しい）、Ｖは物体の端から端までの電位差であり、通常はボルトを単位として測定され、Ｉは物体内を通過する電流であり、通常はアンペアを単位として測定される）。
磁場内の任意の物質の存在は、その磁場をある程度変化させる。「磁化率効果」という用語は、磁場に置かれた場合に物質固有の磁気モーメントが極性を生み出す程度を指す。
「２次元」または「２Ｄ」という用語は、高さおよび幅を有するが深さを持たず、したがって平らなまたは平面状の図形、物体、または領域を指すために、本明細書では同義に使用される。
「３次元」または「３Ｄ」という用語は、高さ、幅、および深さを有する図形、物体、または領域を指すために、本明細書では同義に使用される。
本発明の粒子は、金属（固体であり、金属光沢を有し、鍛造可能および延伸性があり、熱および電気の両方を伝達する元素を意味する）、ポリマー、ガラス（不規則な原子構造を有する脆弱で透明な固体を意味する）、半導体（導電性が導体と絶縁体の中間である、ケイ素などの元素であって、その内部での伝導が、正孔および電子を用いて引き起こされるものを意味する）、および絶縁体（熱エネルギーおよび電気の不十分な導体である材料を意味する）からなる群から選択された、少なくとも１種の材料を使用して作製される。これらは、ＭＲＩでの検出を促進させるために、小型のファラデーケージとして設計される。粒子は、一連の撮像での高周波（ＲＦ）パルスおよび磁場勾配から生ずるＭＭ内の振動磁場を遮蔽する（作用を防護し、スクリーニングし、遮断し、吸収し、回避し、またはその他の方法で防止することを意味する）。この遮蔽は、局所磁場を誘導する粒子のフレーム内で発生した渦電流（磁場内を移動しまたは変動する磁場にかけられた導体内に誘導された、循環電流を意味する）の結果として生じ、これが外部磁場を破壊的に妨害する。
一態様では、本発明は、２Ｄフォトリソグラフィまたはエレクトロリソグラフィによってマイクロパターン化された前駆体からの、３Ｄ金属粒子の自己組織化について記述する。「フォトリソグラフィ」、「フォト−リソグラフィ」、または「フォトリソグラフィプロセス」という用語は、写真技法によって生成されたマスクを使用することによって、金属や樹脂などの基板上に精密パターンが生成される、リソグラフィ技法を指す。典型的には、基板は、乾燥または硬化されたフォトレジスト被膜で被覆され、次いでフォトマスクを通して照射される、紫外線などの光による放射を通して露光される。次いで非保護領域が、通常はエッチングによって除去され、それによって所望のパターンが残る。穿孔または細孔を生成するために、電子線リソグラフィを使用してもよい。
本発明の粒子は、自己折畳みおよび自己組織化を行う。これらの構造の少なくとも１個のヒンジは、はんだ（金属を接合する際に使用される、特定の融点を有するように配合された合金を意味する）、金属合金（通常は一緒に融合しまたは融解したときに互いに溶解する、２種以上の金属元素または金属および非金属元素を含有する混合物を意味する）、ポリマー、または液化することができるガラスを含むがこれらに限定することのない材料を含む。液体ヒンジの表面張力は、２Ｄ型板を３Ｄ粒子に折り畳むのに必要な力を提供する。
別の態様では、自己組織化の後に、本発明の粒子の充填可能な中心チャンバが、治療薬をカプセル化するための容器として利用可能である。本明細書で使用される「治療薬」という用語は、疾患、病状、もしくは障害を治療し、制御しもしくは予防するのに使用される、任意の医薬品、組成物、遺伝子、タンパク質、細胞、分子、または物質を指す。「組成物」という用語は、成分の混合物を指す。本明細書で使用される「薬剤組成物」という用語は、連邦規制審査を受けた組成物を指す。「治療」または「治療する」という用語は、状態の進行を排除し、実質的に阻害し、遅延させ、または逆転させ、臨床状態または状態の症状を実質的に改善し、臨床状態または状態の症状の出現を実質的に予防すること含む。ヒトを含めた対象に投与した後に、その治療効果または有益な効果をもたらす治療薬の量は、「治療量」または「医薬品として有効な量」である。治療効果または有益な効果は、疾患または障害を治癒させ、最小限に抑え、予防し、または回復させることでよく、あるいは任意のその他の治療効果または医薬品として有益な効果を有することでもよい。本明細書で使用される「疾患」または「障害」という用語は、健康を損なうこと、または異常な機能状態を指す。本明細書で使用される「症候群」という用語は、いくつかの疾患または状態を示す症状のパターンを指す。本明細書で使用される「損傷」という用語は、物理的または化学的でよい外部の物質または力によって引き起こされた、本体の構造または機能に対する損害または危害を指す。本明細書で使用される「状態」という用語は、様々な健康状態を指し、任意のもととなるメカニズムまたは障害によって引き起こされた障害、疾患、または損傷を含むことを意味し、健康な組織および器官の促進を含む。
いくつかの実施形態では、粒子の充填可能な中心チャンバを、後にその場で放出されることになる、医薬品や薬物などの治療薬、生きている組織、ゲル、およびポリマーを、カプセル化するのに使用することができる。本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、モノマーと呼ばれる小さいサブユニットで構成された、長く繰り返され時には分岐した鎖からなる、天然のまたは合成の化合物を指す。天然のポリマーには、タンパク質（アミノ酸のポリマー）およびセルロース（糖分子のポリマー）が含まれる。合成ポリマーには多くの例がある。
いくつかの実施形態では、免疫抑制と共にまたは免疫抑制なしで、生体外および生体内放出するために、機能細胞（例えば、膵島細胞、神経ＰＣ１２細胞）をカプセル化することができる。そのような粒子は、単一のバイオコンテナまたは一群のバイオコンテナとして、微量注射によってその必要のある対象に投与することができ、撮像、診断、および治療に有用である。
例えば、一実施形態では、多数の粒子の内部に、ゲルに埋め込まれた細胞を充填した。これらの細胞は、バイオコンテナを適切な溶媒に浸漬することによって、放出することができた。流体媒体に埋め込まれた粒子の磁気共鳴（ＭＲ）画像は、ＲＦ遮蔽および磁化率効果を示唆しており、粒子内の特徴的な低強度（暗さ）をもたらし、それによって、粒子を容易に検出することが可能になる。この実証は、３Ｄのマイクロパターン化された、非侵襲的に追跡可能なカプセル化およびデリバリーデバイスの設計に向けた、第１の工程である。
本発明は、中空内部を形成するための自己折畳みが可能な、複数の２次元面を含む３次元粒子を提供し、この粒子のサイズは、マイクロスケールまたはナノスケールである。粒子は、そのサイズが１ｎｍから２ｍｍに及ぶことが好ましい。
粒子はさらに、任意の液化可能な材料からなる少なくとも１個のヒンジを含む。例えば、ヒンジはポリマー、ゲル、ガラス、または金属でよい。
本発明の粒子は、任意の形状を有するが、立方体などの多面体形状を形成する面を有することが好ましい。粒子の２次元面は、穿孔または細孔によってパターニングされる。これらの穿孔または細孔は、フォトリソグラフィによって、エレクトロリソグラフィによって、または電子線リソグラフィを使用して生成することができる。これらの穿孔または細孔は、約０．１ｎｍから約１ｃｍに及ぶサイズを有する。好ましくは、これらの穿孔または細孔は、約１０ｎｍから約１ｃｍのサイズを有する。
本発明の粒子（コンテナ）は、任意材料から作製することができるが、金属、ポリマー、ガラス、半導体、絶縁体、およびこれらの組合せからなる群から選択された少なくとも１種の材料が好ましい。粒子は、トランジスタ、センサ、アクチュエータ、発光ダイオード、フォトダイオードおよび太陽電池などの、能動的な電子または半導体構成要素を含んでもよい。粒子が金属である場合、そのような金属は、銅またはニッケルでよい。一実施形態では、粒子がファラデーケージである。別の実施形態では、粒子を、金属、ポリマー、またはこれらの組合せなどの、生体適合性材料で被覆してもよい。粒子はさらに、バイオセンサに結合されていてもよい。
粒子はさらに、この粒子内にカプセル化された治療薬などの、少なくとも１種の物質を含んでもよい。治療薬は、細胞、化学的または生物学的薬剤、医薬品、組成物、組織、ゲル、およびポリマーでよい。ある実施形態では、粒子の２次元面の穿孔または細孔によって、粒子の内容物を放出することが可能になる。
本発明の粒子は、対象に投与してもよい。そのような実施形態では、対象における粒子の位置を、磁気共鳴映像またはＣＡＴスキャン（ＣＴ）によって非侵襲的に追跡することができる。粒子は、バックグラウンドに対してネガティブ造影で、またはバックグラウンドに対してポジティブ造影で、画像形成がなされる。
本発明の別の実施形態では、粒子は、事前に選択された周波数にこの粒子が曝されると物質を放出することのできる高周波タグをさらに含む。
本発明の粒子の別の実施形態では、遠隔から誘発することのできる電磁放射線に粒子が曝されると、物質を放出することができる。電磁放射線は、１ＫＨｚから１ペタＨｚに及んでよい。
本発明の粒子の別の実施形態では、粒子を誘導加熱に曝すことによって物質を放出することができる。そのような誘導加熱は、遠隔から引き起こすことができる。
本発明は、中空多面体形状を形成する多数の２次元面を含み、充填可能な中心チャンバを含有する、３次元粒子を作製する方法も提供する。この方法は、（ａ）多数の２次元面を作製する工程と、（ｂ）作製された２次元面をパターニングする工程と、（ｃ）パターニングされた２次元面上に少なくとも１個のヒンジをパターニングして、ヒンジ付き縁部を形成する工程と、（ｄ）第１のパターニングされた２次元面のヒンジ付き縁部を、第２のパターニングされた２次元面のヒンジ付き縁部に接合して、ヒンジ付きジョイントを形成する工程と、（ｅ）工程（ｄ）を繰り返して、隣接する２次元面の間にヒンジ付きジョイントを有する２次元前駆体型板を形成する工程と、（ｆ）熱を使用して２次元型板のヒンジを液化することにより、自己折畳みを開始する工程とを含む。この方法により、粒子が自己組織化される。
この方法の一実施形態では、工程（ｃ）のヒンジは、液化することのできる材料を含む。材料は、はんだ、金属合金、ポリマー、またはガラスでよい。
この方法の別の実施形態では、工程（ａ）が、（ｉ）基板上に犠牲被膜をスピンコートして、第１の層を形成する工程と、（ｉｉ）第１の層上に導電性の第２の層を重ねる工程と、（ｉｉｉ）積層化した基板をフォトリソグラフィによってパターニングする工程とをさらに含む。
これらの方法では、粒子は、マイクロスケールまたはナノスケールのサイズを有し、フォトリソグラフィにより生成することができかつ約０．１ｎｍから約１００ミクロンのサイズまで様々でよい穿孔または細孔によってパターニングされた２次元面を有してよい。これらの方法の粒子は、ファラデーケージでよい。
本発明はさらに、対象に移植された本発明の粒子を撮像する方法を含み、この方法は、（ｉ）粒子の中空内部に少なくとも１種の物質を充填して、充填済み粒子を形成する工程と、（ｉｉ）充填済み粒子を対象に投与する工程と、（ｉｉｉ）磁気共鳴映像によって対象体内で工程（ｉｉ）の粒子を非侵襲的に追跡する工程を含む。一実施形態では、粒子は、その２次元面に、中空内部の物質を放出させる穿孔または細孔を有する。一実施形態では、工程（ｉ）の少なくとも１種の物質が、治療薬である。治療薬は、細胞、医薬品、組成物、組織、ゲル、およびポリマーでよい。
本発明の方法は、状態を治療する方法も含み、この方法は、組成物をカプセル化する本発明の少なくとも１種の粒子を、治療の必要がある動物に導入することを含み、この組成物が、状態を治療するのに十分な量で、粒子内の１個または複数の細孔を通して哺乳動物に放出される。薬剤組成物は、１個または複数のマイクロビーズ内に含有されていてもよい。この方法の一実施形態では、状態が糖尿病であり、組成物が１個または複数のインスリン分泌細胞である。
本発明はさらに、哺乳動物に導入された本発明の粒子を撮像するための方法を提供し、この方法は、磁気共鳴映像を使用することを含む。
本発明はさらに、請求項１の粒子を対象体内の細胞に送り込む方法を提供し、この方法は、ａ）細胞に特異的な抗原に対する抗体を粒子に付着させる工程と、ｂ）粒子を哺乳動物に導入する工程とを含み、粒子が細胞に送り込まれる。
別の態様では、移植片の効力およびカプセル化された細胞の状態を評価するために、本発明の移植された粒子内または移植された粒子に近い細胞を、ＭＲＩによって撮像することができる。
本発明は、本発明の１個または複数の粒子を対象にデリバリーする方法も提供し、この方法は、任意の特定の時間および任意の特定の空間部位で、１種または複数の試薬が遠隔から放出されるように、粒子がプログラムされている。この方法の一実施形態では、粒子は遠隔から導かれ、ＭＲＩまたはＣＴを使用して撮像される。
本発明の粒子から造影剤を放出し、またはその内容物もしくはその付近にある物質のＭＲＩもしくはＣＴ撮像が可能になるように造影を付与する方法も提供される。
非侵襲的生検またはマイクロサージェリーを実施するための方法も提供され、この方法は、遠隔手段を使用して、対象内の部位に粒子を導くこと、その部位の１種または複数の物質を粒子に捕捉させること、および物質をその粒子から得ることを含む。
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限と下限の間にある値のそれぞれは、文脈において他に特に明示されない限り下限の単位の１０分の１まで、また任意のその他の記述された値もしくはその記述された範囲の間にある値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、記述される範囲内に任意の特に除外される限度があるなら、このより小さい範囲に独立して含めてよく、やはり本発明に包含される。記述される範囲がこれらの極限値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる極限値のどちらも除外する範囲も、本発明に含まれる。
他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと類似しまたは均等な、任意の方法および材料も、本発明を実施しまたは試験する際に使用することができるが、好ましい方法および材料について、次に記述する。本明細書に記述されるすべての刊行物は、これらの刊行物が引用されるものと一緒に方法および／または材料を開示し記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付される特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「および」、および「ｔｈｅ」は、文脈において他に明示されない限り、複数表示を含むことに留意すべきである。本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、同じ意味を有する。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日に先行するその単なる開示を目的として提供される。本発明は、先行発明によってそのような刊行物に先行する権利が与えられない、と見なすように解釈されるものは、本明細書にはない。さらに、示される刊行日は実際の刊行日と異なっている可能性もあり、これは独立に確認する必要があると考えられるものである。
下記の実施例は、本発明をどのように作りかつ使用するかについての完全な開示および記述を当業者に提供するために示され、本発明者等が自身の発明であると見なす範囲を限定するものではなく、下記の実験がすべてでありまたは行われる唯一の実験であることを示すものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にするために努力がなされているが、いくらかの実験的な誤差およびずれについては、説明がなされるべきである。他に特に指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
コンテナ（粒子）の作製
図１は、本発明の３Ｄコンテナを作製するのに使用されるプロセスフローの概略図である。
図１は、本発明の３Ｄコンテナを作製するのに使用されるプロセスフローの概略図である。
まず、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、ＭＷ＝９９６Ｋ）の５μｍの厚さの犠牲層を、シリコン基板上にスピンコートした。本明細書で使用される「スピンコート」という用語は、回転する基板上に流体を滴下するプロセスを指す。クロム（Ｃｒ）の１５ｎｍ層および銅（Ｃｕ）の１００ｎｍ厚層を、ＰＭＭＡで被覆されたウェハの最上面に蒸着させた。Ｃｒ層は、接着促進剤として機能するが、Ｃｕ層は、後に行われる電着用の導電性シード層として機能する。プロセスでは、後にＣｒおよびＣｕをエッチングする必要があるので、迅速なエッチングが実現されるようにそれらの厚さを最小限に抑えることが必要である。しかし、電着中にウェハの端から端までの膜の電気抵抗を最小限に抑えるには、材料の厚さを増加させなければならない。１２５ｎｍの厚さが、本出願には最適と考えられる。薄膜堆積後、フォトリソグラフィを使用して基板をパターニングした。フォトレジストＳｈｉｐｌｅｙ ＳＰＲ２２０（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ．ｗｗｗ．ｒｏｈｍｈａａｓ．ｃｏｍ）を最初にウェハ基板上にスピンコートし、フォトレジストの厚さを、スピンコート速度および被覆数を変化させることによって制御した。ソフトベーク後、レジストを、マスクアライナを使用してＵＶ光で露光した。レジストをパターニングするのに使用されるフォトマスクは、２０ｐｍの間隔を空けて設けられた６個の２００ｎｍの正方形を有する透明マスクであった。露光後、ウェハを現像し、レジストの厚さを、Ａｌｐｈａ−Ｓｔｅｐ断面測定番を使用して測定した。次いで、選択された金属イオンを含有する市販の電解質溶液（Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ）を使用して、７〜１５ｐ．ｍ．の高さまで成型されたフォトレジストのコンテナの金属面にパターンを構成するために、電着を使用した。Ｃｕを電着し、その後、非磁性コンテナを形成する金（Ａｕ）の薄層（約１ｐｍ）および磁性コンテナを作製するニッケル（Ｎｉ）の薄層（約１ｐｍ）を電着した。Ａｕは、Ｃｕ表面を後続のエッチング工程から保護し、それを不活性にするのに使用した。
フォトリソグラフィの第２ラウンドは、ヒンジをパターニングするために行った。ＳＰＲ２００の第２の層を基板上にスピンコートし、ヒンジをパターニングするのにヒンジフォトマスクを使用した。ヒンジマスクは、２種類のヒンジ（５０×１６０μｍ２および２５×１６０μｍ２）からなるものであった。より幅の広いヒンジが隣接面の界面にあり、一方、より幅の狭いヒンジは面の縁部にあった。ヒンジと２Ｄ前駆体の面との完全なアライメントを確実にするために、アライメントマークを使用した。ヒンジの電着の前に、ヒンジ領域の露光済みＣｕおよびＣｒを、市販のエッチング剤（Ｃｕ用にＡＰＳ−１００、Ｃｒ用にＣＲＥ−４７３、Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ）を使用してエッチングした。エッチング剤は、ＮｉまたはＡｕに比べてＣｕまたはＣｒに対して高い選択性を有するが、エッチング時間は、コンテナのＮｉまたはＣｕ／Ａｕフレームへの損傷が最小限に抑えられるように最適化された。次いで純粋なスズ（ｍ．ｐ．２３２℃）またはスズ／鉛（Ｓｎ／Ｐｂ：ｍ．ｐ．１８３℃）はんだを、ヒンジ領域に電気めっきした。ヒンジの高さは、面パターンおよび使用される金属のタイプ（湿潤性かまたは非湿潤性か）に応じて、約５μｍから約１５μｍであった。電着後、当初のシード層をエッチングし、２Ｄ前駆体型板をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ、犠牲ＰＭＭＡ層を溶解する）の溶液に浸漬して、ウェハから前駆体を分離した。次いで約５０の前駆体を、ピペットを使用して小さな結晶化皿に分散させた。ＲＭＡ−２フラックスの非常に薄い層（Ｉｎｄｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｗｗｗ．ｉｎｄｉｕｍ．ｃｏｍ、はんだ上に形成された任意の酸化物を溶解するのに使用した）を、皿の中に注いだ。次いで皿を、約２分から約３分間１００℃に加熱し、次いで２０秒間で約２５０℃から約３００℃まで上昇させた。フラックスが低体積であるので、攪拌は、折畳みの欠陥を補正するのに十分であり、しかしクロスが互いに衝突して融合するほど十分に大きくはない。溶融はんだは、２Ｄ前駆体を３Ｄコンテナに折り畳むのに必要な力を発生させた。冷却すると、コンテナは、固体はんだヒンジによって一緒に永久に保持された。
反磁性銅（Ｃｕ）コンテナを、約２００ｐｍ（１ピコメートルは１０−１２メートル）の線形寸法で作製した。より小さいまたはより大きいサイズのバイオカプセルと比較すると、２００ｐｍサイズであることにより、最大限のカプセル化体積が得られ、その一方で、依然として細胞への酸素および栄養素の拡散が可能になる。細胞が、最も近い血管から約１５０μｍから約２００μｍ以上離れている場合、その環境は低酸素になることが知られている（R.H.ThomlinsonおよびL.H.Gray、Brit.J.Cancer Dec.9、539 (1955)）。原則として、本明細書に記述される作製計略は、その他の応用例でのコンテナの設計がより小さくまたはより大きなサイズスケールの場合にも、うまく働くと考えられる。コンテナの線形寸法は、本発明者等の磁気共鳴（ＭＲ）スキャナにおける最高動作周波数である、５００ＭＨｚの振動磁場の波長よりも何桁も小さかった。したがって、コンテナの面上の穿孔サイズは、コンテナの遮蔽特性に悪影響を及ぼさなかった。コンテナの面の厚さは、放射線の周波数で、導体表皮深さよりも大きくなるように設計された。「表皮深さ」という用語は、電磁場が材料に浸透する平均深さの尺度を指す。これは、一次電磁（ＥＭ）場が、表面で電磁場によって減衰し／電磁場の（ｌ／ｅ）に低下する深さと定義され、または、シールドの表面でその値の約３７％まで低下する深さと定義される（A.Tsaliovich、Electromagnetic Shielding Handbook for Wired and Wireless Applications (Kluwer Academic Publishers、MA、1999)）。より厚いコンテナは、より低い導体抵抗も有し、それによって渦電流は、画像獲得時間中に遮蔽効果が維持されるよう十分長くあり続けることが確実になる。５００ＭＨｚでのＣｕの表皮深さは、約２．９ｐｍであり（C.Kittel、Introduction to Solid State Physics、(Wiley、New York, ed.、at 7 (1995))）、したがってコンテナは、約７ｐｍから約１５ｐｍに及ぶ厚さのフレームを有するように設計された。
上述の反磁性Ｃｕコンテナに加え、強磁性ニッケル（Ｎｉ）コンテナを、このコンテナのＭＲ画像に対する磁気感受性の影響を調査するために作製した。物体とその周囲の媒体との間の磁気感受性の差から生ずる、形状、大きさ、および位相歪みを含むがこれらに限定するものではない磁場の歪みは、サンプルの磁化において位相コヒーレンスに損失を引き起こす。Ｃｕの磁気感受性は水の場合に匹敵し、一方、Ｎｉの磁気感受性は水の場合よりも何桁も高いので、より明らかな歪みが水性媒体中のＮｉコンテナで予測された（L.W.Bartels他、J.Vasc.Interv.Radiol. 12: 365 (2001)）。
ＣｕおよびＮｉコンテナの両方を作製するのに使用される計略は、毛管力を使用する２Ｄ金属前駆体の自動折畳みを含んでいた。細いチューブで液体を重力に対して上向きに引き出すことができることを指すための、本明細書で同義に使用される「毛管作用」、「毛管」、または毛管運動は、液体と固体との間の接着性分子間力が、液体中の凝集分子間力よりも強力である場合に生ずる。同じ作用は、多孔質材料によって液体が吸い上げられることである。自動折畳みの先の実証例は、マイクロメートルサイズの構成要素の動作と、３Ｄ複合構造のアセンブリを含む（E.Smela他、Science 268: 1735 (1995); P.W.Breen他、J.Microelectromech.Syst. 4: 170 (1995); K.F.Harsh他、Sens.Actuators A 3: 237 (1999); E.E.Hui他、IEEEE 13th Int.Conf.On Micro Electro Mechanical Systems、602 (2000); D.H.Gracias他、Adv.Mater. 14: 235 (2002)）。
本発明の一態様によれば、３Ｄの中空穿孔コンテナは、２Ｄ前駆体から作製された。実施例１に記載されるプロセスの延長である、２Ｄ前駆体を作製するのに使用されたプロセスは、いくつかの付加層、２つのフォトリソグラフィ工程、２つの電着工程、および正確な順序の減法プロセスを必要とした。手短かに言うと、このプロセスは、犠牲層の最上面に、フォトリソグラフィおよび電着を使用して金属２Ｄ面をパターニングすることを含んでいた。様々な計略は、面が２つの異なるパターン（即ち１つのパターンが開放面を有する四角形のフレームを含み、もう１つが各面の中心にあるマイクロスケールの十字形状からなる）を含有する前駆体を作製することによって、実証された。フォトレジストの第２の層では、ヒンジをフレーム縁部上にパターニングした。２つの隣接面の間のヒンジの幅は、縁部のヒンジの幅の２倍であり、したがってすべてのヒンジジョイントは、折畳み後に均等なはんだ体積を有しており、このはんだ体積は、折畳み角を確実に９０°にするのに極めて重要であった（R.R.A.Syms他、J.Microelectromech.Syst. 12: 387 (2003)）。ヒンジをパターニングした後、犠牲層を溶解することによって、２Ｄ前駆体をウェハから引き離した。はんだの融点よりも高く前駆体を加熱することによって、コンテナを自己組織化したが、この場合、高い表面張力を有する液体はんだは、前駆体の隣接面を折り畳むのに必要とされる力を発生した。
図２Ａは、上述のプロセスを使用して作製された、コンテナの集合体の光学画像を示す。この作製計略は、多数のコンテナを１回のプロセス実行で構成させる。主な歩留り制限要因は、各ヒンジに電着されることになるはんだの体積の、予測の誤差であった。隣接面間の間隔も極めて重要であり、面と面の間のギャップが大きすぎた場合、または面が融合した場合は、折畳みの歩留りが大幅に制限された。図２Ｂ〜２Ｄは、作製プロセスの種々の段階での、マイクロパターン化コンテナの光学およびＳＥＭ画像、即ち、電着された面を有する２Ｄ前駆体、面およびヒンジを有する前駆体、折り畳まれたコンテナを示す。
開放面コンテナはかなり漏れ易いので、カプセル化デバイスにとって理想的ではないが、開放面コンテナには、その内容物が容易に目に見えるように充填された。生体内応用例では、選択的に密封されまたはマイクロ／ナノ穿孔された面を有するコンテナを構成し、丸みのついた頂点を有するより複雑な多面体コンテナを作製するために、記述される計略を使用することが望ましいと考えられる。多くの細胞デリバリー技法では、マイクロビーズの表面に細胞が接着されているものが使用されるので、開放面コンテナ（図３Ａ）にはマイクロビーズを充填した。コンテナにマイクロビーズを充填するために、エタノール中のビーズの懸濁液をコンテナにピペットで付与した。懸濁液は、毛管力の結果、コンテナに進入した。エタノールが蒸発すると、弱いファンデルワールス力によってビーズが一まとめに保持され（双極子への所与の分子の一過性分極が生ずる弱い分子間力を意味する）（図３Ｂ）、ガラスビーズは、コンテナの攪拌によって放出することができた。
細胞カプセル化を実証するために、４℃の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）懸濁液中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、コンテナに充填した（図３Ｃ）。本明細書で使用される細胞外マトリックスという用語は、哺乳動物組織、並びに限定するものではないがコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンを含めたその構成要素の１種または複数の中に見い出される、細胞を取り囲み支持する複合構造体を指す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、素早く増殖する細胞および不死化細胞、例えばβＴＣ３細胞などであって、糖尿病治療に使用されるもの、および再生に使用される幹細胞を、代表するものである。３７℃で５分間インキュベーションして、ＥＣＭ懸濁液をゲル化し、細胞を、バイオコンテナ内に保持し、温かい細胞培地にコンテナを浸漬することによって放出することができた（図３Ｄ）。バイオコンテナには、アガロースキャビティ内に細胞−ＥＣＭ懸濁液を充填することも可能である。この場合、最初に５％アガロースゲルの懸濁液を、定位マニプレーターを使用してコンテナ内にマイクロピペット（６０μｍチップ）で付与した。ゲルがコンテナの側面に接着し、それによって面が密封され、コンテナの中心に空隙が残された。次いで細胞−ＥＣＭ懸濁液をこの空隙に微量注入し、次いでアガロースゲルの微小液滴で密封した。
細胞が、バイオコンテナ内および放出時に生存可能であることを実証するために、細胞を、生細胞をポジティブ染色する蛍光染料、カルセイン−ＡＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。図３Ｅは、バイオコンテナ内のカルセイン染色細胞を示し、図３Ｆは、温かい細胞培地に浸漬したときのコンテナからの生細胞の放出を示す。この実証例で使用されるバイオコンテナのフレームは、生体適合性を目的として内面に薄い金または白金コーティングを有していたが、それは金および白金が不活性または非反応性材料だからである。純粋なスズおよびスズ／鉛ベースのはんだは、コンテナを折り畳むのに使用した。生体適合性を高めるために、銀や金などの不活性金属を含有するその他のはんだを使用することが、必要と考えられる。折り畳まれたコンテナ全体を、不活性金属(電着による)またはポリマー（浸漬もしくは蒸気被覆による）の層で被覆することによって、コンテナの生体適合性を増大させることも可能である。
コンテナの非侵襲的検出は、５％アガロースゲルにコンテナを埋め込み、それらを５００ＭＨｚ垂直ボアＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅマイクロ撮像システムでＭＲＩにより撮像することによって実証した。ここに示される画像の場合、４〜６ｍｓの範囲のエコー時間（ＴＥ）、５０ｍｓの反復時間（ＴＲ）、３０°のフリップ角、および２５μｍ×２５μｍ×２０μｍの空間解像度を有する３Ｄ ＦＬＡＳＨシーケンスを使用した。コンテナは、標準的なスピンエコーシーケンス（磁気を励起するための９０°高周波パルス、および「スピンエコー」という名称のシグナルエコーが発生するようにスピンに再度焦点を集める１つまたは複数の１８０°パルスを使用する、スピンまたはＨａｈｎエコーの検出に基づく磁気共鳴映像で使用されたパルスシーケンスを意味する）も使用して撮像し、同様の結果であった。図４は、アガロースゲルに埋め込まれたＣｕ（図４Ａ）およびＮｉ（図４Ｂ）コンテナを含有する直径９００μｍの毛管のＭＲ画像を示す。特徴的サインが、ＣｕおよびＮｉコンテナの両方で観察され、各コンテナの領域には明らかな暗色が存在する。これらの低強度（暗）サインは、より大きなセンチメートルスケールの金属コイルのＭＲＩで、既に観察されている（A.Shenhav、H.Azhari、Magn.Reson.Med. 52: 1465 (2004)）。ＭＲ画像の低強度（暗色）の領域は、非磁性Ｃｕコンテナのサイズに匹敵するが、強磁性Ｎｉコンテナに関しては、明らかな磁化率効果によってさらに大きかった（L.H.Bennett他、J.Appl.Phys. 79: 4712 (1996); B.A.Schueler他、J.Magn.Reson.Imaging 9: 596 (1999)）。所与の材料で作製されたコンテナの画像は、開放面コンテナ並びに十字面コンテナの両方に関して同様であり、面のパターンがこのサイズスケールのＭＲサインにほとんど影響しないことを示している。
ＲＦ遮蔽を、線形分極電磁波によって励起された２００ｇｍスケールのワイヤフレームに関し、有限要素モデルの非磁性コンテナでシミュレートした。図４Ｃ〜４Ｄは、コンテナ付近の磁場の歪み、およびコンテナ内部の磁場の大きさが低下したことを示すシミュレーション結果である。
多くの生物医学的応用例では、カプセル化デバイスの非侵襲的追跡が必要である。本発明のＣｕコンテナは、Ｓ形の直径５００ｐｍの流体チャネルを通る流れにおいて、ＭＲＩにより空間的および時間的に追跡することができた。チャネルは、フォトリソグラフィを使用してパターニングされたＳＵ−８フォトレジスト型で、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を成型することによって作製した。チャネルは、第２の平らな酸素プラズマ処理したＰＤＭＳ層で密封した。ポリエチレンチューブをチャネルの入口および出口ポートに接続し、このチャネルをシリコーン油で一気に洗浄し、コンテナをチャネルに導入した。圧力で生じる流れの中で、コンテナはチャネル内を移動し、種々の位置で撮像されたが、この一連のＭＲＩ画像を図５に示す。造影剤を必要とせずに、非常に短いエコー時間でＭＲＩによって迅速に追跡できることにより、多くのその他のカプセル化システムに比べ、本発明の３Ｄ金属バイオコンテナの主な利点が強調される。
コンテナ領域の近磁場のシミュレーション
ＲＦ遮蔽効果を実証するために、コンテナ付近の近磁場応答を、有限要素電磁シミュレーションパッケージ、ＦＥＫＯ（ＥＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＆ Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＳＡ Ｌｔｄ．，ｗｗｗ．ｆｅｋｏ．ｉｎｆｏ／）を使用してシミュレートした。モーメントの全波法手法を使用して、半径８μｍのワイヤセグメントを有する２００μｍワイヤフレームの領域の近磁場をシミュレートしたが、このとき、銅で被覆された完全導電体（導電率＝５．８１３×１０７Ｓ．ｍ−１）を想定した。立法体ワイヤフレームモデルのシミュレーションは、５００ＭＨｚの線形分極平面波励起で行い、本発明者等は、ワイヤフレームに入射する１Ｖ／ｍの励起源を使用し、ｚ方向がＥであり、ｙ方向がＨであった（図４Ｃ）。銅ワイヤフレームに、相対透磁率Ｉを割り当て、それによって、磁化率効果ではなくＲＦ遮蔽効果のみシミュレートした。図４Ｃは、ｘ−ｙおよびｙ−ｚ中心平面の両方での近磁場応答を示す。
ＲＦ遮蔽効果を実証するために、コンテナ付近の近磁場応答を、有限要素電磁シミュレーションパッケージ、ＦＥＫＯ（ＥＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＆ Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＳＡ Ｌｔｄ．，ｗｗｗ．ｆｅｋｏ．ｉｎｆｏ／）を使用してシミュレートした。モーメントの全波法手法を使用して、半径８μｍのワイヤセグメントを有する２００μｍワイヤフレームの領域の近磁場をシミュレートしたが、このとき、銅で被覆された完全導電体（導電率＝５．８１３×１０７Ｓ．ｍ−１）を想定した。立法体ワイヤフレームモデルのシミュレーションは、５００ＭＨｚの線形分極平面波励起で行い、本発明者等は、ワイヤフレームに入射する１Ｖ／ｍの励起源を使用し、ｚ方向がＥであり、ｙ方向がＨであった（図４Ｃ）。銅ワイヤフレームに、相対透磁率Ｉを割り当て、それによって、磁化率効果ではなくＲＦ遮蔽効果のみシミュレートした。図４Ｃは、ｘ−ｙおよびｙ−ｚ中心平面の両方での近磁場応答を示す。
結論として、記述される計略は、３Ｄの任意にマイクロパターン化可能な非侵襲的に追跡可能であるバイオコンテナであって、このバイオコンテナの内容物とこれを取り囲む媒体との間での潅流が可能なバイオコンテナを作製するのに使用することができる。これらのバイオコンテナは、生物学的内容物が充填されたときに、その検出可能性を失わないカプセル化デバイスである。それらの強度および高い多孔率により、そのような金属バイオコンテナは、３Ｄ内で細胞の成長を導く足場の基本要素として、有用である。本明細書に記述される作製計略は、従来の２Ｄマイクロ加工と適合性であるので、医学的診断および治療が可能になるように、バイオコンテナの面に、遠隔活性化、無線通信、シグナル処理、および生物学的感知のための電気機械的モジュールを付加することも可能と考えられる。本発明は、小さいファラデーケージとして機能するような３Ｄコンテナが、小さい体積で電磁遮蔽を必要とするその他の応用例に用途を見い出すことになることも、想定する。
生物医学的応用例に関する３ｄマイクロボックスのマイクロ加工および自己組織化
実験方法および結果：
作製：
ボックスを作製するのに使用されるプロセスは、２Ｄ前駆体を作製し折り畳んで３Ｄ中空構造にするための、マイクロ加工および表面張力で促進される自己組織化からなる（K.F.Harsh、V.M.Bright、およびY.C.Lee、Sens.Actuators A、vol.77、237〜244、1999; E.E.Hui、R.T.Howe、およびM.S.Rodgers、IEEE 13th Int.Conf. on Microelectoromechanical Sys.、2002、第602〜607頁; R.R.A.Syms、E.M.Yeatman、V.M.Bright、およびG.M.Whitesides、J.Microelectromechanical Sys.、vol.12、第387〜417頁、2003）。作製プロセスは、（１）２Ｄ前駆体上に面をパターニングする工程と、（２）面と面との間にはんだヒンジをパターニングする工程と、（３）２Ｄ前駆体を自己組織化する工程（図６）の３つの工程を含んでいた。ボックスは、前駆体がはんだの融点よりも高く加熱されたときに、自己組織化し、このとき高い表面張力を有する液体はんだは、隣接する面を組織化するのに必要な力を発生させた。作製計略によって、多数のボックスが１回のプロセス実行で構成される。銅（Ｃｕ）およびニッケル（Ｎｉ）のボックスは、金（Ａｕ）で被覆された表面（生物不活性を増大させるため）と共に、またそのような表面なしで、作製されている。
実験方法および結果：
作製：
ボックスを作製するのに使用されるプロセスは、２Ｄ前駆体を作製し折り畳んで３Ｄ中空構造にするための、マイクロ加工および表面張力で促進される自己組織化からなる（K.F.Harsh、V.M.Bright、およびY.C.Lee、Sens.Actuators A、vol.77、237〜244、1999; E.E.Hui、R.T.Howe、およびM.S.Rodgers、IEEE 13th Int.Conf. on Microelectoromechanical Sys.、2002、第602〜607頁; R.R.A.Syms、E.M.Yeatman、V.M.Bright、およびG.M.Whitesides、J.Microelectromechanical Sys.、vol.12、第387〜417頁、2003）。作製プロセスは、（１）２Ｄ前駆体上に面をパターニングする工程と、（２）面と面との間にはんだヒンジをパターニングする工程と、（３）２Ｄ前駆体を自己組織化する工程（図６）の３つの工程を含んでいた。ボックスは、前駆体がはんだの融点よりも高く加熱されたときに、自己組織化し、このとき高い表面張力を有する液体はんだは、隣接する面を組織化するのに必要な力を発生させた。作製計略によって、多数のボックスが１回のプロセス実行で構成される。銅（Ｃｕ）およびニッケル（Ｎｉ）のボックスは、金（Ａｕ）で被覆された表面（生物不活性を増大させるため）と共に、またそのような表面なしで、作製されている。
欠陥モード：
いくつかの欠陥モードが観察され（図７）、しかしプロセスが最適化された場合、１枚のウェハから９０％程度に高い歩留りが得られた。面に溶け込む過剰な電着、面に対するヒンジのアライメント不良、およびシード層の過剰なまたは不完全なエッチングなどの明らかな欠陥モードとは別に、最大の欠陥制限要因は、ヒンジに電着されたはんだの高さであった。はんだの電着が多すぎまたは少なすぎる場合、構造は過剰にまたは不完全に折り畳まれる。９０°の折畳みに関して最適なはんだの高さを決定するために、公表された設計規則［R.R.A.Syms、E.M.Yeatman、V.M.Bright、およびG.M.Whitesides、J.Microelecromechanical Sys.、第12巻、第387〜417頁、2003年］を使用した。さらに、誤差の許容度を増大させるため、ヒンジは、隣接面間に、面の縁部に沿ってパターニングされた側方はんだ領域の幅の２倍になるように設計した。電着中、高温（２００℃）によって、前駆体が攪拌され（流体の対流に起因し、その中でボックスが自己組織化する）、この攪拌が、準安定な最小値（誤差）の補正を助け、熱力学的最小値へのボックスの折畳みを助けた。
いくつかの欠陥モードが観察され（図７）、しかしプロセスが最適化された場合、１枚のウェハから９０％程度に高い歩留りが得られた。面に溶け込む過剰な電着、面に対するヒンジのアライメント不良、およびシード層の過剰なまたは不完全なエッチングなどの明らかな欠陥モードとは別に、最大の欠陥制限要因は、ヒンジに電着されたはんだの高さであった。はんだの電着が多すぎまたは少なすぎる場合、構造は過剰にまたは不完全に折り畳まれる。９０°の折畳みに関して最適なはんだの高さを決定するために、公表された設計規則［R.R.A.Syms、E.M.Yeatman、V.M.Bright、およびG.M.Whitesides、J.Microelecromechanical Sys.、第12巻、第387〜417頁、2003年］を使用した。さらに、誤差の許容度を増大させるため、ヒンジは、隣接面間に、面の縁部に沿ってパターニングされた側方はんだ領域の幅の２倍になるように設計した。電着中、高温（２００℃）によって、前駆体が攪拌され（流体の対流に起因し、その中でボックスが自己組織化する）、この攪拌が、準安定な最小値（誤差）の補正を助け、熱力学的最小値へのボックスの折畳みを助けた。
充填：
ボックスがカプセル化デバイスとして機能できることを実証するために、このボックスに、ゲル、ビーズ、液体、および細胞（図８）を含めた様々な医学的に関連ある構成要素を充填した。容易に目に見えるようにするために、すべて開放面を有するボックスを使用した。しかし、実際の応用例では、充填用の１つの開放面のみ有し、その他は閉じたまたは多孔質の面を有するボックスが使用される。
ボックスがカプセル化デバイスとして機能できることを実証するために、このボックスに、ゲル、ビーズ、液体、および細胞（図８）を含めた様々な医学的に関連ある構成要素を充填した。容易に目に見えるようにするために、すべて開放面を有するボックスを使用した。しかし、実際の応用例では、充填用の１つの開放面のみ有し、その他は閉じたまたは多孔質の面を有するボックスが使用される。
ヒドロゲルプルロニックＦ１２７（２０％溶液）は、低温（４℃）の液体溶液から室温の規則的なミセル立方体相への熱可逆的転移を示す。この性質は、貯蔵および薬物デリバリーの際の放出に、非常に魅力的なものとなる。ヒドロゲルは、プルロニックＦ１２７（ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック−ポリ（エチレンオキシド）コポリマー）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ，ｗｗｗ．ｂａｓｆ．ｃｏｍ）を水に溶かした２０％ｗ／ｗ混合物からなるものであった。サンプルを、攪拌器を使用して振盪させて、混合プロセスを加速させ、使用するまで４℃で貯蔵した。ヒドロゲルをボックスに充填するために、１滴の液体溶液をボックス上に置いた。金属ボックスの親水性側壁により、この溶液は容易にボックスに進入した。ボックスには、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲルに埋め込まれたＭＤＡＭＢ−２３１乳癌細胞も充填した（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、素早く増殖しまたは不死化された細胞であって、βＴＣ３細胞などの糖尿病療法で使用されるもの、および再生で使用される幹細胞の代表例である）。図８Ｃは、４℃でＥＣＭゲルに一時的に懸濁させた癌細胞が充填されたボックスを示す。懸濁液をボックスに導入し、３７℃で１５分間保持することにより、ＥＣＭゲルを重合させた。細胞は、ボックス内で安定化し、ボックスの拍動性攪拌によって放出することができた（図８Ｄ）。これらの実験は、ボックスに様々な構成要素を充填することが、比較的簡単であることを実証している。
ＲＦ場との相互作用：
ボックスは金属であるので、ＲＦ場と相互に作用し、ファラデーケージとして振る舞う。この特徴は、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を使用してボックスを遠隔から検出し追跡するのに使用されている。特徴的サインが、ＣｕおよびＮｉボックスの両方で観察され、各ボックスの領域には明らかな暗色が存在した。この低強度サインは、造影剤なしで、短いエコー時間でのＭＲＩによる容易な追跡可能性を助長し、既存のポリマー系に比べてこれらのカプセル化デバイスの主な利点を強調させた。
ボックスは金属であるので、ＲＦ場と相互に作用し、ファラデーケージとして振る舞う。この特徴は、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を使用してボックスを遠隔から検出し追跡するのに使用されている。特徴的サインが、ＣｕおよびＮｉボックスの両方で観察され、各ボックスの領域には明らかな暗色が存在した。この低強度サインは、造影剤なしで、短いエコー時間でのＭＲＩによる容易な追跡可能性を助長し、既存のポリマー系に比べてこれらのカプセル化デバイスの主な利点を強調させた。
ボックスはＲＦ場と相互に作用するので、この特徴は、コイルに交流電流を通すことによって発生させた遠隔ＲＦ場を使用して、ボックスを誘導加熱する可能性を示唆している［E.J.W.Ter Maten、およびJ.B.M.Melissen、第28巻、no.2、第1287〜1290頁、1992年; C.K.Chou、5th IEEE Conf. Instrumentation and Measurement Tech.、1988年、第69〜77頁; J.S.CurranおよびA.M.Featherstone、Power Eng.J.、第2巻、no.3、第157〜160、1988年; K.Hamad-Schifferli、J.J.Schwartz、A.T.Santos、S.Zhang、およびJ.M.Jacobson、Nature、第415巻、第152〜155頁、2002年］。反磁性（Ｃｕ、Ａｕ）および強磁性（Ｎｉ）金属からなるボックスを作製した。ＡＣ電流が流れるコイル内にボックスを置くと、電磁力が誘導される。ファラデーおよびレンツの法則Ｅ＝−Ｎｄψ／ｄｔ（１）によれば、Ｅは、ボックス内で誘導された起電力（ＥＭＦ）であり、ψは、ＲＦコイル内で発生した磁束であり、Ｎは、コイルの巻数である。誘導ＥＭＦは、電流をボックス内に流し、それによって加熱を引き起こすことができる。発生した熱は、Ｐ＝Ｅ２／Ｒ（２）として計算することができ、但しＰは、電流によって発生した加熱電力であり、Ｒはサンプルの抵抗である。
ボックス内の交流電流は、表皮深さ現象に曝され、即ち電流密度が深さと共に低下する。ボックスの表面の厚さは、２Ｄ前駆体をパターニングするのに使用されるフォトリソグラフィのアスペクト比によってのみ制限される厚さの範囲で制御することができるので、ボックスは、電気抵抗を最小限に抑える表皮深さに匹敵する肉厚により作製することができる。さらに、ボックスが強磁性（例えば、Ｎｉ）である場合、加熱は、磁気ヒステリシスによって増大する。誘導加熱の主な目的は、ボックス内で発生した熱エネルギーを最大限にすることであるので、誘導加熱コイルのアパーチャは可能な限り小さく設計され、ボックスは、低抵抗および高透磁率を特徴とする材料で作製する必要がある。
２種類の構成について実証した。その１つの場合、ボックスをバイアルに導入し、その周りにワイヤコイルを巻き付け、そこにＡＣ電流を流した（２００ＭＨｚから１ＧＨｚ、０．１から１ワット）。ボックスの加熱を２Ｄマイクロ流体工学によって調整するために、かつ誘導結合を最大限にするために、２Ｄコイルも作製した。２Ｄコイルは、フォトリソグラフィによって作製し（図９）、様々な巻数および間隔で作製することができる。ボックスを、誘導加熱を最大限にするためにコイルの中心軸に沿って配置する。２Ｄコイルの巻数は３Ｄコイルの場合よりも少ないが、２Ｄコイルのキャビティは、誘導結合を最大限にするボックスのサイズと同等である。ボックスおよびコイルの誘導加熱特性は、測定されている。
加熱によるボックスからの化学物質の放出：
加熱によって、化学物質をボックスから放出することができることを実証するために、ボックスに、赤く染色したヒドロゲルを充填した。最初に、プルロニックＦ８８（分子量：１１４００；融点：５４℃；ＢＡＳＦから得られる）１ｇをアセトン１０ｍｌに溶解した。次いでサンプルを加熱し、超音波処理して溶解を支援した。数滴の染料エリトロシンを溶液に添加した。開放面ボックスに、注射器を使用して、染色したヒドロゲル溶液を充填し、このボックスを、アセトンが蒸発するまで静置した。ヒドロゲルは水に溶解するので、充填済みボックスをドデカンに浸漬し（ヒドロゲルはドデカンに溶解しない）、スライドガラス上に置いた。スライドを、ホットプレート上で７０℃に加熱し、光学写真を３分、７分、および１０分で撮った。ゲルが軟化し、染料がドデカン溶液中に放出された（図１０）。水中でのその他のヒドロゲルからの化学物質の放出については、充填されたボックスの誘導ＲＦ加熱の最適化と同様に、現在調査中である。生体内的用例の場合、人間の体温よりも約１０℃高く、ボックスを加熱することが必要になる可能性がある。
加熱によって、化学物質をボックスから放出することができることを実証するために、ボックスに、赤く染色したヒドロゲルを充填した。最初に、プルロニックＦ８８（分子量：１１４００；融点：５４℃；ＢＡＳＦから得られる）１ｇをアセトン１０ｍｌに溶解した。次いでサンプルを加熱し、超音波処理して溶解を支援した。数滴の染料エリトロシンを溶液に添加した。開放面ボックスに、注射器を使用して、染色したヒドロゲル溶液を充填し、このボックスを、アセトンが蒸発するまで静置した。ヒドロゲルは水に溶解するので、充填済みボックスをドデカンに浸漬し（ヒドロゲルはドデカンに溶解しない）、スライドガラス上に置いた。スライドを、ホットプレート上で７０℃に加熱し、光学写真を３分、７分、および１０分で撮った。ゲルが軟化し、染料がドデカン溶液中に放出された（図１０）。水中でのその他のヒドロゲルからの化学物質の放出については、充填されたボックスの誘導ＲＦ加熱の最適化と同様に、現在調査中である。生体内的用例の場合、人間の体温よりも約１０℃高く、ボックスを加熱することが必要になる可能性がある。
結論
まとめると、３次元性の好ましい側面とＳｉマイクロ加工とを組み合わせる新しいカプセル化デバイスプラットフォームが実証された。細胞カプセル化療法（免疫抑制なし）のためのナノポーラス面を有するデバイスの開発、および化学物質の遠隔放出のために最適化されたＲＦ加熱プロファイルを有するボックスの設計が、進行中である。
まとめると、３次元性の好ましい側面とＳｉマイクロ加工とを組み合わせる新しいカプセル化デバイスプラットフォームが実証された。細胞カプセル化療法（免疫抑制なし）のためのナノポーラス面を有するデバイスの開発、および化学物質の遠隔放出のために最適化されたＲＦ加熱プロファイルを有するボックスの設計が、進行中である。
遠隔高周波制御されたナノリットル化学および基質への化学物質デリバリー
コンテナは金属から作製されており、したがって、電磁源に遠隔から結合させることが可能である。この特徴は、空間的誘導（磁性コンテナを使用）並びにナノリットル体積の化学試薬のデリバリーの、無線制御を可能にするのに使用された。コンテナは、従来のマイクロ流体工学における流動プロファイルによって制限されない空間パターンに、即ち、チャネル入口から下流に導くことができる。遠隔制御されたナノリットルコンテナは、空間制御された化学反応、毛管内でのマイクロ加工、および培養細胞への化学物質のオンデマンド局在化デリバリーを可能にすることによって、今日のマイクロ流体工学の可能性を高める。
コンテナは金属から作製されており、したがって、電磁源に遠隔から結合させることが可能である。この特徴は、空間的誘導（磁性コンテナを使用）並びにナノリットル体積の化学試薬のデリバリーの、無線制御を可能にするのに使用された。コンテナは、従来のマイクロ流体工学における流動プロファイルによって制限されない空間パターンに、即ち、チャネル入口から下流に導くことができる。遠隔制御されたナノリットルコンテナは、空間制御された化学反応、毛管内でのマイクロ加工、および培養細胞への化学物質のオンデマンド局在化デリバリーを可能にすることによって、今日のマイクロ流体工学の可能性を高める。
従来のマイクロ加工および自己組織化の組合せ［T.G.Leong、Z.Gu、T.Koh、D.H.Gracias、J.Am.Chem.Soc. 2006、128、11336〜11337; B.Gimi、T.Leong、Z.Gu、M.Yang、D.Artemov、Z.M.Bhujawalla、D.H.Gracias、Biomed. Microdevices 2005、7、341〜345］を使用して、金で被覆されたニッケルのナノリットルコンテナを作製した（図１１ａ）。化学デリバリーを促進させるため、コンテナに、放出されることになる化学試薬に浸漬させたゲルを充填した（図１１ｂ）。２種のゲルを使用し、即ち、一般的な乾式放出実験に関してはプルロニック１５１を、水溶液中および生細胞への化学デリバリーに関してはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡｍ）［T.Hirokawa、T.Tanaka、J.Chem.Phys. 1984、81、6379〜6380; M.E.Islam、A.M.Alsayed、Z.Dogic、J.Zhang、T.C.Lubensky、A.G.Yodh、Phys.Rev.Lett. 2004、92、088303］を使用した。プルロニックは、５２℃で軟化する水溶性ブロックコポリマーヒドロゲルであり、広範囲にわたる化学物質に対して相溶性がある［P.Alexandridis、T.A.Hatton、Colloid Surf. Physicochem. Eng. Aspect. 1995、96、1〜46］。ＰＮＩＰＡｍ１６をベースにしたヒドロゲルは、人の体温の温度範囲付近で構造転移を受けるので、薬物デリバリーで広く使用されている熱応答性の材料である［H.Yu，D.W.Grainger、J.Controlled Release 1995、34、117〜127; K.S.Soppimath、T.M.Aminabhabi、A.M.Dave、S.G.Kumbar、W.E.Rudzinski、Drug Dev.Ind.Pharm. 2002、28、957〜974］。この転移温度、並びにＰＮＩＰＡｍの崩壊動特性は、コモノマーを添加し、架橋度を変化させることによって、変えることができる［R.A.Stile、W.R.Burghardt、K.E.Healy、Macromolecules 1999、32、7370〜7379］。このように、ＰＮＩＰＡｍは、生細胞へのおよび液体媒体中での、遠隔制御放出の理想的な候補である。
充填したら、コンテナを、選択された反応容器内に置き、磁性針を使用して任意の空間経路に導くことができた。所望の部位に導いた後、２Ｄマイクロコイルによって生成された高周波（ＲＦ）場をコンテナに向けた。ＲＦ場の電力を金属コンテナンに誘導結合し、それによってフレーム内に渦電流を生成させ、ジュール効果によってフレームを加熱した。誘導結合によって、非磁性金属コンテナも加熱することが可能であるが、この加熱メカニズムは、ポリマー磁気微小球を加熱するのに使用されるものとは異なっている。コンテナはマイクロ加工されるので、その電気特性は再現可能にすることができ、温度は、入射電力を変化させることによって精密に制御することができた。この再現性は、ポリマー磁気微小球から放出するのに必要とされる電力と対比されるべきであり、サイズの多分散性および異なる微小球内の磁性粒子の不均一分布によって大幅に変わる可能性がある。
コンテナを加熱することによって、その内部にカプセル化されたゲルは軟化し（または崩壊し）、標的とされる空間部位で化学物質を放出した（図１１ｃ）。金属コンテナは、使用される電力設定および周波数設定での加熱を得るのに不可欠である。対照実験（ＲＦ放射線への曝露であるが、コンテナは存在しない）では、使用される周波数設定および電力設定での無視できる程度の誘電加熱によって（裏付け情報参照）、ゲルからの放出が観察されなかった。
遠隔制御されたコンテナは、到達困難な領域での、先例のない空間制御による化学作用を可能にする。この特徴を強調するために、本発明者等は、毛管内に埋め込まれた２本の隣接するマイクロワイヤの一方で、破断ギャップを修復したが、この毛管は、入力および出力ポートによってのみ接触可能であった（図１２）。マイクロワイヤ１内のギャップは、コンテナを空気中のその部位に遠隔から導くことによって（図１２ａ、ｂ）、および最初に化学増感剤を遠隔から放出し次いで活性剤（２個の個別のコンテナを使用する）をギャップの部位に局所的に放出することによって（図１２ｃ）、修復した。増感剤および活性剤は、それぞれスズおよびパラジウム触媒であり、これらは銅の無電解堆積を促進させた。マイクロワイヤ１のみのギャップ内の空間領域を増感させかつ活性化させた後（図２ｄ）、毛管全体を、市販の硫酸銅溶液で一気に洗浄した（図２ｅ）。マイクロワイヤおよび毛管壁面の両方を硫酸銅溶液に曝したが、金属銅は、マイクロワイヤ１の化学的に増感され活性化されたギャップにのみ堆積した（図１２ｆ）。電気抵抗測定値によれば、ギャップの端から端までマイクロワイヤ１が電気的に連続であることが確認された。この結果は、コンテナが、毛管内およびその他の小空間内での局所的な化学物質のデリバリーおよび化学作用に有用であることを実証している。既に存在する毛管内でのマイクロ加工法と比較すると［J.C.McDonald、G.M.Whitesides、Acc.Chem.Res. 2002、35、491〜499; M.Madou、Fundamentals of Microfabrication、CRC、New York、1997; P.J.A.Kenis、R.Ismagilov、G.M.Whitesides、Science 1999、285、83〜85］、本発明の方法は、毛管の幾何形状または層流プロファイルにより制限されない。
第２の実証例は、基質上で培養された特定の細胞への、ナノリットルより少量の体積の化学物質の遠隔制御された局所的デリバリーにおける、ナノリットルコンテナの有用性を強調する。コンテナには、培養皿で局所的に細胞を染色するために、また、加熱［S.Corvin、S.Boexch、C.Maneschg、C.Radmayr、G.Bartsch、H.Klocker、Eur.UroL 2000、37、499〜504］またはＲＦ放射線への曝露の結果、化学物質放出中に細胞壊死が生じないことを検証するために、生／死（緑／赤）２色蛍光生存度染色剤［Invitrogen live/dead stain product guide http://probes.invitrogen.com/］に浸漬したＰＮＩＰＡｍを充填した。
Ｌ９２９マウス線維芽細胞を、ガラスインレイを有する３５ｍｍのウェルプレートで培養し、集密的に成長させた。遠隔放出実験の開始時に、成長培地を取り出し、細胞をリン酸緩衝生理食塩液で濯いで、血清エステラーゼ活性を希釈し、それによってバックグラウンド蛍光を最小限に抑えた。染色剤の遠隔放出を可能にするために、ＲＦコイルを、コンテナ直下のプレートの下に置き、このコイルの電力を１分間、２〜３Ｗで上昇させて、カプセル化されたＰＮＩＰＡｍを崩壊させ、染色剤を放出させた。蛍光画像は、染色剤を吸収するのに十分な時間が得られるように、放出から３０〜６０分後に得た。染色剤が局所的に、かつコンテナの中心から５００ｌｔｒｎ未満の半径以内に放出されたことは、共焦蛍光画像（図１３）から明らかである。染色剤に曝された細胞は緑色蛍光を有することもわかり、したがって細胞が生きていることが示され、赤色蛍光、即ち死亡細胞は観察されなかった。この結果は、温度がカプセル化ＰＮＩＰＡｍを崩壊するのに使用されず、ＲＦ放射線が細胞壊死を引き起こさなかったことも示す。漏れまたは自発的放出（即ち、細胞染色がない）は、ＲＦ場を印加しなかった実験では、コンテナから観察されなかったことに留意すべきである。生体適合性の研究は、４８時間にわたるコンテナの存在下で細胞壊死が生じなかったことを示す。
結論として、金属自己組織化ナノリットルコンテナは、到達しにくい場所の場合に、遠隔制御マイクロ加工および化学物質デリバリーに利用することができる。コンテナは、複雑で再構成可能な微量分析、マイクロ流体工学、マイクロ電気機械システムの作製に役立てることができる。細胞への化学物質の局在化遠隔デリバリーは、細胞エンジニアリング、組織エンジニアリング、および薬物開発で応用される化学的および生物学的微小環境を、遠隔から操作する方法を確立する。最後に、コンテナは、無線デバイスの（例えば、周波数選択的遠隔制御および遠隔通信）付加的特徴とナノリットル体積の化学物質のデリバリーとを統合するための、魅力的なプラットフォームを提供する。
実験の詳細
マイクロコンテナの作製：
手短かに言うと、作製プロセスは、３Ｄ立方体コンテナへの２次元（２Ｄ）型板の自己組織化を含む。まず、６つの正方形の多孔質面からなる２Ｄ金属型板を、フォトリソグラフィによってパターニングした。フォトリソグラフィの第２の層を使用して、外縁と、面同士の間に、はんだヒンジをパターニングした。２Ｄ型板は、はんだヒンジの融点よりも高く加熱されたとき（流体中）に、自発的に３Ｄ立方体コンテナに折り畳まれるが、このとき、溶融はんだの表面張力が、自己組織化を促進させる力を提供する。３Ｄコンテナの最終的なサイズおよび多孔率は、２Ｄ型板を適切にパターニングすることによって変えられた。この実験では、遠隔誘導が可能になるように、コンテナを、ニッケル（Ｎｉ）、即ち磁性材料から作製した。コンテナの外面および内面は、生体適合性が増大するようにかつ電気抵抗が低下するように（電気抵抗が低いと、電磁波が透過するように表皮深さが増大する）、金（Ａｕ）で被覆した。作製プロセスは高度に並行しており、多数のコンテナを費用効果のある手法で作製することができた。
マイクロコンテナの作製：
手短かに言うと、作製プロセスは、３Ｄ立方体コンテナへの２次元（２Ｄ）型板の自己組織化を含む。まず、６つの正方形の多孔質面からなる２Ｄ金属型板を、フォトリソグラフィによってパターニングした。フォトリソグラフィの第２の層を使用して、外縁と、面同士の間に、はんだヒンジをパターニングした。２Ｄ型板は、はんだヒンジの融点よりも高く加熱されたとき（流体中）に、自発的に３Ｄ立方体コンテナに折り畳まれるが、このとき、溶融はんだの表面張力が、自己組織化を促進させる力を提供する。３Ｄコンテナの最終的なサイズおよび多孔率は、２Ｄ型板を適切にパターニングすることによって変えられた。この実験では、遠隔誘導が可能になるように、コンテナを、ニッケル（Ｎｉ）、即ち磁性材料から作製した。コンテナの外面および内面は、生体適合性が増大するようにかつ電気抵抗が低下するように（電気抵抗が低いと、電磁波が透過するように表皮深さが増大する）、金（Ａｕ）で被覆した。作製プロセスは高度に並行しており、多数のコンテナを費用効果のある手法で作製することができた。
ゲルの調製：
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）：ゲルは、Ｆ６８ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）０．５ｇと水０．５ｍＬとを合わせることによって作製した。混合物を、１０分間超音波処理して、確実に完全な混合を行った。ゲル化は、余分な水が蒸発した後に生じた。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）：ゲルは、Ｆ６８ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）０．５ｇと水０．５ｍＬとを合わせることによって作製した。混合物を、１０分間超音波処理して、確実に完全な混合を行った。ゲル化は、余分な水が蒸発した後に生じた。
ＰＮＩＰＡｍ：ＰＮＩＰＡｍゲルは、２種の原液、ＡおよびＢから作製した。溶液Ａは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）１．６７０１ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）０．００８３ｇ、および水１５ｍＬからなるものであった。溶液Ｂは、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．０１２９ｇおよび水１５ｍＬからなるものであった。両方の溶液を、溶質が溶解するまで攪拌した。ゲル化は、各溶液を等体積で、０．４％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）と共に混合することによって実現され、５分以内に生じた。
遠隔誘導：
遠隔誘導は、反応容器の下で磁性針を操作することによって実現された。コンテナと容器の表面との間の摩擦を低減するために、針を容器の基部に沿って回転させ、コンテナを表面に沿って揺動させた。
遠隔誘導は、反応容器の下で磁性針を操作することによって実現された。コンテナと容器の表面との間の摩擦を低減するために、針を容器の基部に沿って回転させ、コンテナを表面に沿って揺動させた。
２Ｄ ＲＦマイクロコイルの設定：
２Ｄマイクロコイルは、ＲＦ源として、プリント回路板（ＰＣＢ）上にフォトリソグラフィを使用して作製した。マイクロコイルをコンテナの下方または上方に、約１〜５ｍｍの分離距離で配置した。８００ＭＨｚ（ＲＦ）の電流をコイルに通して、コイルの表面と垂直な方向に交流磁場を発生させ、１〜７ワットの範囲内の入射電力を使用した。コイルの表面を空気で冷却して、コイル内に発生したジュール熱をすべて除去した。
２Ｄマイクロコイルは、ＲＦ源として、プリント回路板（ＰＣＢ）上にフォトリソグラフィを使用して作製した。マイクロコイルをコンテナの下方または上方に、約１〜５ｍｍの分離距離で配置した。８００ＭＨｚ（ＲＦ）の電流をコイルに通して、コイルの表面と垂直な方向に交流磁場を発生させ、１〜７ワットの範囲内の入射電力を使用した。コイルの表面を空気で冷却して、コイル内に発生したジュール熱をすべて除去した。
毛管内のマイクロワイヤの遠隔修復：
破断ギャップ５０μｍのマイクロワイヤ（厚さ１００μｍの銅線、２ｍｍの間隔を空ける）を、フォトリソグラフィを使用してスライドガラス上に作製した。毛管は、スライドガラス（ワイヤを含有する）および別のスライドガラス（毛管の屋根）に対して密封されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）壁を使用して形成した。密封は、ＰＤＭＳのプラズマ表面変性によって実現された。埋め込まれたワイヤを有する毛管（図１２Ａ）は、幅が約１ｍｍおよび長さ１．５ｃｍであり、その両端の入力および出力ポートによってのみ接触可能であった。
破断ギャップ５０μｍのマイクロワイヤ（厚さ１００μｍの銅線、２ｍｍの間隔を空ける）を、フォトリソグラフィを使用してスライドガラス上に作製した。毛管は、スライドガラス（ワイヤを含有する）および別のスライドガラス（毛管の屋根）に対して密封されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）壁を使用して形成した。密封は、ＰＤＭＳのプラズマ表面変性によって実現された。埋め込まれたワイヤを有する毛管（図１２Ａ）は、幅が約１ｍｍおよび長さ１．５ｃｍであり、その両端の入力および出力ポートによってのみ接触可能であった。
増感剤に浸漬したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ゲルは、増感剤溶液（Ｔｒａｎｓｅｎｅ）０．５ｍＬとＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＢＡＳＦ）０．５ｇとを合わせることによって調製した。活性剤に浸漬したＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ゲルは、活性化溶液（Ｔｒａｎｓｅｎｅ）０．５ｍＬとＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ ０．５ｇとを混合することによって調製した。充填前に、各混合物を５分間超音波処理して、確実に完全な混合を行った。混合物それぞれの１μＬの液滴を、２個の別個のコンテナに置き、溶液を一晩（約１４時間）ゲル化させた。次いでコンテナをゲルから切り取って、ゲルがコンテナ内部のみに確実に残るようにした。
コンテナを、マイクロワイヤ１内のギャップに導いた後、本発明者等はまず、ゲルが軟化して増感剤溶液がコンテナから放出されるまで、４ワットの電力を２Ｄコイルに加えた。次いで電力を、３．０ワットに１分間低下させて、溶液がゲルを通してギャップの表面に拡散するのに十分な時間が得られるようにした。次いでチャネルを水で一気に洗浄して、コンテナおよび過剰なゲルを除去した。次いでこのプロセスを、活性剤溶液が充填される第２のコンテナについて繰り返した。
無電解銅溶液を、市販の溶液、ＰＣ無電解銅溶液ＡおよびＰＣ無電解銅溶液Ｂ（どちらも、Ｔｒａｎｓｅｎｅ製）を等体積で混合することによって作製した。直径０．９ｍｍの注射器に、ＩＤが０．８ｍｍの管材を取り付けた。このチューブのもう一方の端部を、チャネルの１つの開口に配置した。シリンジポンプ（ＲＡＺＥＬ）を使用して、めっき溶液をチャネル内および破断したマイクロワイヤ上に流した。堆積するのに十分な時間を得ながら銅イオンの高い局所濃度を維持することにより、めっき反応が促進するように、拍動性の流れを使用した。実験中、銅めっき溶液を４５℃に保持した。
生細胞への遠隔制御デリバリー：
コンテナにＰＮＩＰＡｍを充填し、一晩静置した。実験の当日、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）２色蛍光染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．５μＭカルセインＡＭおよび１．０μＭエチジウムホモダイマー−１の濃度で調製した。ＰＮＩＰＡｍが生／死染色剤を再水和し吸収するのに十分な時間が得られるように、実験を開始する前に、ＰＮＩＰＡｍが充填されたコンテナを染色溶液に３．５時間浸漬した。
コンテナにＰＮＩＰＡｍを充填し、一晩静置した。実験の当日、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）２色蛍光染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．５μＭカルセインＡＭおよび１．０μＭエチジウムホモダイマー−１の濃度で調製した。ＰＮＩＰＡｍが生／死染色剤を再水和し吸収するのに十分な時間が得られるように、実験を開始する前に、ＰＮＩＰＡｍが充填されたコンテナを染色溶液に３．５時間浸漬した。
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ）を、標準的な細胞培養プロトコルに従って培養し、維持した。細胞は、Ｌ−グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含有し、１０％のウマ血清を有する８５％の最少必須培地イーグル中で、７５ｃｍ２の培養フラスコで培養され、そしてＭＥＭ非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムが補われた細胞を、水で飽和した５％ＣＯ２雰囲気を有する３７℃に設定したインキュベータ内で維持した。トリプシン−ＥＤＴＡを利用して、Ｌ９２９細胞を１週間に２〜３回継代培養し、新しいフラスコに３×１０４細胞／ｍＬの密度で播いた。播種密度は、トリプシン化細胞のサンプルを取り出し、細胞をトリパンブルーで染色し、血球計数器を使用して生存する細胞の数をカウントすることにより確認した。
遠隔放出実験は、最適な共焦顕微鏡法のため、ガラスインレイ（Ｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍ−ｄｉｓｈｅｓ ｉｎｃ．）を有する３５ｍｍのウェルプレートで実施した。手短かに言うと、細胞を、２×１０５細胞／ｍＬの２５０ｔＬの密度で、ガラスインレイ上に直接播き、接着が促進されるように３０分間静置した。次いで成長媒体２ｍＬを添加し、細胞を４８時間インキュベートして、集密な単層を実現した。
遠隔放出後、細胞を、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ共焦顕微鏡を使用して撮像した。手短かに言うと、顕微鏡には、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）アッセイプロトコルで推奨されるレーザおよびフィルタを設定した。カルセインＡＭを４８８ｎｍで励起し、エチジウムホモダイマー−１を５４３ｎｍで励起した。染料の吸収を、ＢＰ５０５−５３０（生細胞中のカルセイン用）およびＬＰ６５０（死亡細胞中のエチジウムホモダイマー用）フィルタキューブで検出した。
対照実験
加熱特性：
磁場発生器の入射電力によるナノリットルコンテナの加熱の制御を実証するために、温度制御実験を実施した。実験の装置は、本発明者等のその他のＲＦ制御放出実験と同様であった。唯一の違いは、良好な熱接触により加熱することができるような、ナノリットルコンテナ下での不可逆性ＯＭＥＧＡＬＡＢＥＬ標識（オメガＴＬ−Ｓシリーズ）の配置であった。コンテナ表面の温度は、３８℃、４９℃、６０℃、および７１℃でそれぞれ生ずる標識色変化によって、推定することができる。磁場の入射電力は、特定の標識が色を変えるまで（約３０秒間待った後）増大させた。図１４（ａ）は、コンテナが配置されている、標識の色の変化を示し、図１４（ｂ）は、標識によって測定された温度を入射電力に対してプロットした図を示す。このように、入射電力を変化させることによって、加熱を精密に制御することができた。正確さは、使用した特定のコンテナおよび実験に左右されることに留意すべきであり（即ち乾式であり、または色の変化が、加熱が局所を取り囲む湿式放出であることを示すコンテナ下でのみ生ずる）、（Ｂ）色の指標の標識環境を使用して測定された温度を入射ＲＦ電力に対してプロットした図である。
加熱特性：
磁場発生器の入射電力によるナノリットルコンテナの加熱の制御を実証するために、温度制御実験を実施した。実験の装置は、本発明者等のその他のＲＦ制御放出実験と同様であった。唯一の違いは、良好な熱接触により加熱することができるような、ナノリットルコンテナ下での不可逆性ＯＭＥＧＡＬＡＢＥＬ標識（オメガＴＬ−Ｓシリーズ）の配置であった。コンテナ表面の温度は、３８℃、４９℃、６０℃、および７１℃でそれぞれ生ずる標識色変化によって、推定することができる。磁場の入射電力は、特定の標識が色を変えるまで（約３０秒間待った後）増大させた。図１４（ａ）は、コンテナが配置されている、標識の色の変化を示し、図１４（ｂ）は、標識によって測定された温度を入射電力に対してプロットした図を示す。このように、入射電力を変化させることによって、加熱を精密に制御することができた。正確さは、使用した特定のコンテナおよび実験に左右されることに留意すべきであり（即ち乾式であり、または色の変化が、加熱が局所を取り囲む湿式放出であることを示すコンテナ下でのみ生ずる）、（Ｂ）色の指標の標識環境を使用して測定された温度を入射ＲＦ電力に対してプロットした図である。
コンテナからの遠隔放出の空間および材料の高選択性
材料および空間選択性を実証するために、下記の対照実験を行った。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ゲル（食物着色剤に浸漬した）を充填した２個のコンテナを、互いに３ｍｍの間隔を空けてペトリ皿に置いた。別の隔離されたゲルの小片（コンテナ内にカプセル化されていない）も、ペトリ皿に置いた。ペトリ皿を、この皿の平面内では隔離されたゲルの小片がコイルの中心に直接並べられるように、２Ｄマイクロコイル上に２ｍｍの距離で並べ；コンテナの一方は、コイルの周囲部内に並べたが中心から３００μｍずれており；第２のコンテナは外れて並べられ、２Ｄコイルの外側に置かれた。コイルに、８００ＭＨｚで電力を加えた。コイルの周囲部内に並べられたコンテナ内のゲルだけが、４．７ワットの力で加熱され、軟化した。電力が７ワットに上昇した場合であっても、最高磁場領域内に配置された隔離されたゲルの小片及び不適当に並べられたコンテナ内のゲルは、変化しないままであった。この対照実験は、誘導加熱が空間および材料の高い選択性を有したことを実証する。実験は、ナノリットルコンテナを作製するのに使用される金属が、誘導加熱を可能にするのに不可欠であることも示す。磁性材料は、遠隔加熱の促進に必要ではないことに留意すべきである（磁気特性は、空間的誘導のためのみ使用される）。Ｎｉを含まない、即ち銅／金からなるコンテナからの放出も実証された。
材料および空間選択性を実証するために、下記の対照実験を行った。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ゲル（食物着色剤に浸漬した）を充填した２個のコンテナを、互いに３ｍｍの間隔を空けてペトリ皿に置いた。別の隔離されたゲルの小片（コンテナ内にカプセル化されていない）も、ペトリ皿に置いた。ペトリ皿を、この皿の平面内では隔離されたゲルの小片がコイルの中心に直接並べられるように、２Ｄマイクロコイル上に２ｍｍの距離で並べ；コンテナの一方は、コイルの周囲部内に並べたが中心から３００μｍずれており；第２のコンテナは外れて並べられ、２Ｄコイルの外側に置かれた。コイルに、８００ＭＨｚで電力を加えた。コイルの周囲部内に並べられたコンテナ内のゲルだけが、４．７ワットの力で加熱され、軟化した。電力が７ワットに上昇した場合であっても、最高磁場領域内に配置された隔離されたゲルの小片及び不適当に並べられたコンテナ内のゲルは、変化しないままであった。この対照実験は、誘導加熱が空間および材料の高い選択性を有したことを実証する。実験は、ナノリットルコンテナを作製するのに使用される金属が、誘導加熱を可能にするのに不可欠であることも示す。磁性材料は、遠隔加熱の促進に必要ではないことに留意すべきである（磁気特性は、空間的誘導のためのみ使用される）。Ｎｉを含まない、即ち銅／金からなるコンテナからの放出も実証された。
ＲＦ放射線が存在しない状態での化学物質の不拡散：
ＲＦ放射線が存在しない状態で、充填されたナノリットルコンテナからの、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ°アッセイの拡散が存在しないことを実証するために（即ち、化学物質の自発的な漏れがないことを実証する）、対照実験を行った。実験は、ＲＦを起動しなかったこと以外、試験手順に従った。これは、曝露用の時間枠が同じであることを確実にするのを助けた。実験の時間スケールでは、ＲＦ放射線（遠隔加熱）が存在しない状態で、ＰＮＩＰＡｍからのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの漏れが生じなかったことを確認するために、共焦顕微鏡法を使用した（図１５）。
ＲＦ放射線が存在しない状態で、充填されたナノリットルコンテナからの、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ°アッセイの拡散が存在しないことを実証するために（即ち、化学物質の自発的な漏れがないことを実証する）、対照実験を行った。実験は、ＲＦを起動しなかったこと以外、試験手順に従った。これは、曝露用の時間枠が同じであることを確実にするのを助けた。実験の時間スケールでは、ＲＦ放射線（遠隔加熱）が存在しない状態で、ＰＮＩＰＡｍからのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの漏れが生じなかったことを確認するために、共焦顕微鏡法を使用した（図１５）。
表面張力で促進される自己折畳み多面体
パターニングされた多面体の作製：
このプロセスの第１の工程は、最終的には３Ｄ中空多面体に折り畳まれる、パターニングされた面およびはんだヒンジからなる２Ｄ型板の作製を含んでいた。ポリメチルメタクリレートで作製されたポリマー犠牲層を、シリコン（Ｓｉ）基板上にスピンコートして、後に続く２Ｄ型板の分離が促進されるようにした。次いで金属シード層を犠牲層上に蒸着させて、後に続く電着工程用のウェハ規模の電気コンタクトを生成した。これらの面を、フォトリソグラフィを使用してパターニングし、電着を使用して作製した。従来のフォトリソグラフィは、面をパターニングするのに使用されるので、いずれか任意のパターンを組み込むことができた。銅（Ｃｕ）またはニッケル（Ｎｉ）からなる面を作製し；金属の選択は、コスト、シード層に対するエッチング選択性、堆積の容易さ、および磁気機能性の必要性によって決定された。フォトリソグラフィの第２の層は、はんだヒンジ型板をパターニングするのに使用した。ヒンジのパターニング後、面によって境界が定められたヒンジ領域内の露出したシード層をエッチングして、面と面の間の下に存在するシード層のみ切り離し、面の角にある残りのシード層との電気的接続性は維持したままにした。はんだヒンジを電着し、次いで、残りのシード層をエッチングし、犠牲層を溶解することによって、２Ｄ型板を基板から分離した。６つの四角形の面からなり、十字型に並べられ、かつはんだヒンジによって一まとめに保持された型板を使用して、立方体を形成した。面と面との間のはんだを除けば、その他の接続部材は存在しない。自己折畳みは、高沸点溶媒、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で実施し、この溶媒を、はんだの融点（約１８８℃）よりも高く加熱した。少量の＃５ ＲＭＡ（ロジン、穏やかに活性化させた）フラックスを溶媒に添加して清浄化し、はんだ上の酸化物層すべてを溶解し、それによって良好なはんだリフローを確実にした。
パターニングされた多面体の作製：
このプロセスの第１の工程は、最終的には３Ｄ中空多面体に折り畳まれる、パターニングされた面およびはんだヒンジからなる２Ｄ型板の作製を含んでいた。ポリメチルメタクリレートで作製されたポリマー犠牲層を、シリコン（Ｓｉ）基板上にスピンコートして、後に続く２Ｄ型板の分離が促進されるようにした。次いで金属シード層を犠牲層上に蒸着させて、後に続く電着工程用のウェハ規模の電気コンタクトを生成した。これらの面を、フォトリソグラフィを使用してパターニングし、電着を使用して作製した。従来のフォトリソグラフィは、面をパターニングするのに使用されるので、いずれか任意のパターンを組み込むことができた。銅（Ｃｕ）またはニッケル（Ｎｉ）からなる面を作製し；金属の選択は、コスト、シード層に対するエッチング選択性、堆積の容易さ、および磁気機能性の必要性によって決定された。フォトリソグラフィの第２の層は、はんだヒンジ型板をパターニングするのに使用した。ヒンジのパターニング後、面によって境界が定められたヒンジ領域内の露出したシード層をエッチングして、面と面の間の下に存在するシード層のみ切り離し、面の角にある残りのシード層との電気的接続性は維持したままにした。はんだヒンジを電着し、次いで、残りのシード層をエッチングし、犠牲層を溶解することによって、２Ｄ型板を基板から分離した。６つの四角形の面からなり、十字型に並べられ、かつはんだヒンジによって一まとめに保持された型板を使用して、立方体を形成した。面と面との間のはんだを除けば、その他の接続部材は存在しない。自己折畳みは、高沸点溶媒、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で実施し、この溶媒を、はんだの融点（約１８８℃）よりも高く加熱した。少量の＃５ ＲＭＡ（ロジン、穏やかに活性化させた）フラックスを溶媒に添加して清浄化し、はんだ上の酸化物層すべてを溶解し、それによって良好なはんだリフローを確実にした。
設計上の考慮：
設計において、Ｎｉは、ヒンジに接触する面の最上表面層として常に使用した。Ｃｕ多面体の場合であっても、面の上面には、ヒンジを堆積する前にＮｉの薄層を被覆した。はんだは、Ｎｉ面を十分に濡らさず、したがってはんだは、電着された領域内に留まり、折畳み中に（はんだがＣｕに接触したときに生ずる）面の表面全体にわたって拡がらない。Ｎｉコーティングが存在しない場合、本発明者等はそれでも折畳みを観察したが、歩留りは不十分であった。この低い歩留りは、堆積された領域からはんだが移動して結果であり、それによって、面と面との間のヒンジ領域のはんだの体積を制御することが（結局、最終的な折畳み角度を決定する）、非常に難しくなった。
設計において、Ｎｉは、ヒンジに接触する面の最上表面層として常に使用した。Ｃｕ多面体の場合であっても、面の上面には、ヒンジを堆積する前にＮｉの薄層を被覆した。はんだは、Ｎｉ面を十分に濡らさず、したがってはんだは、電着された領域内に留まり、折畳み中に（はんだがＣｕに接触したときに生ずる）面の表面全体にわたって拡がらない。Ｎｉコーティングが存在しない場合、本発明者等はそれでも折畳みを観察したが、歩留りは不十分であった。この低い歩留りは、堆積された領域からはんだが移動して結果であり、それによって、面と面との間のヒンジ領域のはんだの体積を制御することが（結局、最終的な折畳み角度を決定する）、非常に難しくなった。
２Ｄ型板の設計は、多面体の最終的な形状および多孔率を、結局は決定する。図１Ａには、面およびヒンジの典型的な２Ｄレイアウトが示されている。Ａｕｔｏｄｅｓｋ（登録商標）ＡｕｔｏＣＡＤ ２００５を使用して、２つのフォトマスク（一方は面、他方はヒンジ）を作製するのに使用されるレイアウトファイルを生成した。立方体を作製するために、図１Ａにおける面の寸法Ｌの１０〜１５％のギャップｇだけ離された四角形の面を、典型的には使用した。溶融はんだは、折畳み中に互いに向かって横方向に面を引っ張る傾向があるので、ギャップ幅に若干の許容誤差が観察された。ギャップ幅は、Ｌの１０〜１５％であるので、例えば１５μｍの立方体に関しては、しばしばフォトマスクおよびリソグラフィプロセスの最小限のフィーチャサイズであり、必要とされる１．５〜２μｍのギャップ幅は、リソグラフィによってパターニングされた最小フィーチャを示したことにも留意すべきである。
先の表面張力をベースにした自己折畳み作用とは対照的に、２つのタイプのヒンジ、即ち面と面との間の内部ヒンジ（折畳みヒンジ）と、面の周辺での外部ヒンジ（ロッキングヒンジ）とを使用した。折畳みヒンジの幅（図１Ｂ中、Ｗで示される）はＬの２５％であり、ヒンジの長さはＬの８０〜９０％であった。折畳みヒンジの長さがより短い場合（＜８０％）、形成される立方体は、その角が完全に密封されなかった。隣り合うヒンジはその角で重なり合うので、より長いヒンジ長（＞９０％）は不要であった。さらに、１００％のヒンジ長は、作製プロセスに適合せず、これらのヒンジパターンは、面のフォトリソグラフィ後のエッチング工程中に、２Ｄ型板周辺でのシード層の完全な除去をもたらした。この除去は、電気的に不連続なシード層で形成され、その後にヒンジを電着することができなかった。折畳みヒンジのリフローは、隣接する面を回転させるトルクをもたらした。長さは折畳みヒンジと同じであるが幅はその半分であるロッキングヒンジは、２Ｄ型板の折畳みで２次的役割を演じ、即ちこれらは安定化ストッパとして機能し、折畳みの際の欠陥許容性を増大させ、最終的な折畳み角度を確実に９０°にした［Syms,R.R.A. J.Microelectromech.Syst. 1995, 4, 177〜184］。さらに、サイズが半分である２個のロッキングヒンジが融合し、等体積の折畳みヒンジを含有する単一のヒンジを形成した場合、そのロッキングヒンジは機械的強度を増大させ、多面体の縁部を密封した。折畳みは、ロッキングヒンジが接触し、互いに融合したときに、数秒以内で完了した。融合は、各面上の溶融ロッキングはんだヒンジとそれを取り囲む液体との間の界面自由エネルギーが、最小限に抑えられた結果として生じた。冷却すると、はんだヒンジは凝固し、多面体構造が所定の位置にロックされた。
有限要素シミュレーション：
自己組織化プロセスをより良く理解するために、本発明者等は、ソフトウェアプログラムＳｕｒｆａｃｅ Ｅｖｏｌｖｅｒを使用して有限要素シミュレーションを行った［Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｖｏｌｖｅｒは、サスケハナ大学数学科のＫｅｎ Ｂｒａｋｋｅによって開発された。２００５年９月１３日に更新された最新Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）版ｖ２．２６ｃを使用した。］。Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｖｏｌｖｅｒは、所与の初期表面および一組の物理的な拘束、例えば重力、密度、および表面張力などに関して、最小エネルギー表面を決定する。最小表面を生成するための反復は、使用者によって手動で制御される。スクリプトは、様々なパラメータおよび生成される多数の表面のタスクを自動化するために開発された。実施されたシミュレーションは、単一のはんだ折畳みヒンジによって一緒に保持された２つの隣接する四角形の面のみ含んでいたが、それは、十分折り畳まれた構造を形成する際に、極めて重要な役割を演ずる折畳みヒンジの本質的機能が獲得されたからである。一方の面は固定されると想定され、他方の面は、はんだヒンジの周りを自由に回転することが可能であったが、この想定は、実験で観察されたものと同様である。所与の幾何形状に関する平衡折畳み角度を決定するために、本発明者等は、下記の計略を使用し[Harsh,KおよびLee,Y.C.、Proceedings of SPIE; San Jose、USA、1998]、最小エネルギー面を、５°ずつ徐々に増やしていきながら０°（平ら）から１２０°（過度に折り曲げた）までの間の回転角（２Ｄ平面から）に関して生成した。次いで、全最小エネルギーに対応する平衡角を、特定の所与の面寸法に関して、角度に対する表面エネルギー傾向線のプロットの最小値から決定した。
自己組織化プロセスをより良く理解するために、本発明者等は、ソフトウェアプログラムＳｕｒｆａｃｅ Ｅｖｏｌｖｅｒを使用して有限要素シミュレーションを行った［Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｖｏｌｖｅｒは、サスケハナ大学数学科のＫｅｎ Ｂｒａｋｋｅによって開発された。２００５年９月１３日に更新された最新Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）版ｖ２．２６ｃを使用した。］。Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｖｏｌｖｅｒは、所与の初期表面および一組の物理的な拘束、例えば重力、密度、および表面張力などに関して、最小エネルギー表面を決定する。最小表面を生成するための反復は、使用者によって手動で制御される。スクリプトは、様々なパラメータおよび生成される多数の表面のタスクを自動化するために開発された。実施されたシミュレーションは、単一のはんだ折畳みヒンジによって一緒に保持された２つの隣接する四角形の面のみ含んでいたが、それは、十分折り畳まれた構造を形成する際に、極めて重要な役割を演ずる折畳みヒンジの本質的機能が獲得されたからである。一方の面は固定されると想定され、他方の面は、はんだヒンジの周りを自由に回転することが可能であったが、この想定は、実験で観察されたものと同様である。所与の幾何形状に関する平衡折畳み角度を決定するために、本発明者等は、下記の計略を使用し[Harsh,KおよびLee,Y.C.、Proceedings of SPIE; San Jose、USA、1998]、最小エネルギー面を、５°ずつ徐々に増やしていきながら０°（平ら）から１２０°（過度に折り曲げた）までの間の回転角（２Ｄ平面から）に関して生成した。次いで、全最小エネルギーに対応する平衡角を、特定の所与の面寸法に関して、角度に対する表面エネルギー傾向線のプロットの最小値から決定した。
図１６（Ｂ〜Ｆ）には、折畳みプロセスの有限要素シミュレーションが示されている。２Ｄ型板では、折畳みヒンジはんだが、Ｔ字形の直角柱の形をとっている。リフローでは、はんだが液化し、丸みのついた輪郭を形成する（図１６Ｃ）。液体はんだの高界面張力（約４８１ｍＪ／ｍ２）により［White,D.W.G. Metall.Trans. 1971、2、3067〜3070］、溶融はんだとそれを取り囲む流動性液体との間の露出界面領域を最小限に抑える強力な促進力が存在する。この促進力は、はんだを丸くし、その結果、隣接する面が回転する。折畳み角度は、主にはんだの体積によって制御される。本発明者等は、シミュレーションと実験観察との両方で、この制御に関する証拠を観察した。種々のはんだ体積によって、折畳み不十分（図１６Ｄ、Ｇ）、正しい折畳み（図１６Ｅ、Ｈ）、または過度の折畳み（図１６Ｆ、Ｉ）の構造が生成された。はんだ体積に対する折畳み角度の依存性を示したプロット（シミュレーションによって生成、図１７）は、はんだ体積が増大するにつれて折畳み角度が減少することを示す。実験では、平衡折畳み角度を決定するはんだ体積は、所与のヒンジ幾何形状に関して電着はんだの高さを制御することによって操作した。
プロセスのスケーリング特性が関心の対象であったので、はんだの界面表面エネルギーの他に、はんだと面との両方の重力による位置エネルギーを考慮に入れた。重量効果の大きさは、サイズが大きくなるまで（即ち、ｍｍ規模）界面表面エネルギーに比べて本質的に無視できることが、他者によって示されておりかつ本発明者等のシミュレーションによって確認されている。しかし、本発明者等の重力エネルギーの項目を含めることによって、本発明者等は、フィーチャサイズの規模が拡大または縮小されたときに、力のそれぞれの相対的な大きさを決定することが可能になった。表面力がサイズの縮小に好ましく対応するという点は、表面張力によって促進される自己組織化の魅力ある特徴であり、マイクロ加工したマイクロおよびナノスケール構造の組織化において、広範な有用性をもたらすという可能性がある。
折畳みプロセスに対するサイズスケーリングの効果を決定するために、２Ｄ型板のシミュレーションを、固定されたはんだ体積に関してｍｍ規模からｎｍ規模まで寸法決めされた面によって行った。いずれの場合も、すべての寸法（高さ、幅、および長さ）は同じ定数倍だけ線形的に拡大縮小された。折畳みプロセスを促進させ、種々の折畳み角度に関して種々のエネルギーが存在する（所与の幾何形状およびはんだ体積に関して）、エネルギー特性が観察された（図１８）。エネルギー曲線の初期勾配は、面の回転力の大きさを示し、折畳みプロセスが自発的か否かを決定する。負の初期勾配（図１８、５０ｎｍから２ｍｍ曲線）は、自発的な折畳みプロセスをもたらし、一方、正の初期勾配（図１８、４ｍｍから６ｍｍ曲線）は、自発的ではないプロセスを示す。１００°付近の曲線の最小値（図１８、５０ｎｍから４ｍｍ）は、安定な平衡折畳み構造を示す。６ｍｍの面に関する曲線に最小値が存在しない状態は、いかなる安定な折畳み構成も存在しないことを示唆し、即ち２つの面は、平らなままであることを好む。これらの結果は、面のサイズが増大するにつれて重量が増大し、かつｍｍサイズの規模では表面張力よりも重力が支配し始めることに留意することによって、説明することができる。このように、エネルギー特性の初期勾配は、ｍｍ範囲で正になり、プロセスは自発的ではなくなる。より小さいサイズでは、表面力が重力を克服し、プロセスは、最初から終わりまで、ナノスケールに至るまで自発的になる。シミュレーションでは、材料およびはんだのバルク特性が想定され、相分離、金属間形成、およびはんだ内への拡散などの作用が無視されることに留意すべきであり、これらの想定が保持される場合には、自己折畳みプロセスがナノスケールで働くように考えられる。本発明者等の標準的な幾何形状、材料密度、およびはんだの表面張力について、本発明者等のシミュレーションは、最大限の自発的な折畳みサイズＬが約１４００μｍになることを示している。シミュレーションは、ヒンジの表面エネルギーが低く（１０ダイン／ｃｍ、例えば液体ポリマー）かつ面が重い（２０ｇ／ｃｍ３、例えば稠密な金属）という極端な場合には、１６５μｍ程度の大きさの多面体に関して、折畳みが依然として自発的であることも示している。これは、本発明者等の特定の幾何形状に関する１６５μｍ程度のサイズスケールに至るまで、ほとんど任意の固体材料からなる面で、かつ事実上任意の液化可能な材料からなるヒンジで、構造を折り畳むことが可能であるべきことを示唆している。
実験結果：
実験では、サイズが１５μｍから２ｍｍに及ぶ立方体状の多面体を折り畳んだ（図１９）。本発明者等は、その他の形状の多面体を折り畳むこともできた（図１９Ｃ）。本発明者等は、より小さな多面体を作製することができると考えるが、本発明者等は、自らのフォトリソグラフィ能力によって制約を受けてきた。数十ミクロンよりも小さい値で、ヒンジのギャップ幅はサブミクロンのサイズスケールに近付き、２Ｄ型板を作製するには、電子線リソグラフィなどの代替のパターニング技法が必要になる。本発明者等の理論的なシミュレーションによれば、小さいサイズスケールでの表面力が大きいので、より小さい多面体の折畳みは自発的であることが示される。シミュレーションは、大きい面、即ち２ｍｍの面を有する多面体の折畳みが自発的なプロセスではないことを示すが、実験によれば、本発明者等は２ｍｍの立方体を折り畳むことができた。本発明者等は、２つの観察事項に基づいて、この結果を理論的に説明する。第１に、加熱された流体での対流性の流れに起因した攪拌が、実験によって生ずる。この攪拌は、折畳みのための活性化障壁上にわずかに面を持ち上げる、初期促進力をもたらすことができる。第２に、本発明者等は、シミュレーションにおいてすべてのサイズの変数を比例的に拡大縮小したが（例えば、２ｍｍの面は、８０μｍの厚さでシミュレートした）、実験ではそのようにできなかったことに留意すべきである。フォトレジストの高さおよび分割可能なアスペクト比に対する制約によって、本発明者等は、２ｍｍの立方体に関してわずか１２μｍの厚さを電着し、したがって実験型板の面は、かなり低い重量を有しており、折畳みが自発的ではなくなる閾値がより大きなサイズまで上昇した。本発明者等のシミュレーションにおける、この固定されたフレームの厚さについて説明すると、本発明者等は、自己折畳みプロセスが本発明者等のプロセスで使用される材料に対して作用する最も大きなサイズが、約７ｍｍであると決定した。本発明者等は、７ｍｍ程度の大きさの構造を作製するのにリソグラフィプロセスを使用することを期待しないが、自己折畳みのプロセスは、特に電子デバイスのパッケージにおいて、このサイズスケールで依然として妥当であると考えられる。
実験では、サイズが１５μｍから２ｍｍに及ぶ立方体状の多面体を折り畳んだ（図１９）。本発明者等は、その他の形状の多面体を折り畳むこともできた（図１９Ｃ）。本発明者等は、より小さな多面体を作製することができると考えるが、本発明者等は、自らのフォトリソグラフィ能力によって制約を受けてきた。数十ミクロンよりも小さい値で、ヒンジのギャップ幅はサブミクロンのサイズスケールに近付き、２Ｄ型板を作製するには、電子線リソグラフィなどの代替のパターニング技法が必要になる。本発明者等の理論的なシミュレーションによれば、小さいサイズスケールでの表面力が大きいので、より小さい多面体の折畳みは自発的であることが示される。シミュレーションは、大きい面、即ち２ｍｍの面を有する多面体の折畳みが自発的なプロセスではないことを示すが、実験によれば、本発明者等は２ｍｍの立方体を折り畳むことができた。本発明者等は、２つの観察事項に基づいて、この結果を理論的に説明する。第１に、加熱された流体での対流性の流れに起因した攪拌が、実験によって生ずる。この攪拌は、折畳みのための活性化障壁上にわずかに面を持ち上げる、初期促進力をもたらすことができる。第２に、本発明者等は、シミュレーションにおいてすべてのサイズの変数を比例的に拡大縮小したが（例えば、２ｍｍの面は、８０μｍの厚さでシミュレートした）、実験ではそのようにできなかったことに留意すべきである。フォトレジストの高さおよび分割可能なアスペクト比に対する制約によって、本発明者等は、２ｍｍの立方体に関してわずか１２μｍの厚さを電着し、したがって実験型板の面は、かなり低い重量を有しており、折畳みが自発的ではなくなる閾値がより大きなサイズまで上昇した。本発明者等のシミュレーションにおける、この固定されたフレームの厚さについて説明すると、本発明者等は、自己折畳みプロセスが本発明者等のプロセスで使用される材料に対して作用する最も大きなサイズが、約７ｍｍであると決定した。本発明者等は、７ｍｍ程度の大きさの構造を作製するのにリソグラフィプロセスを使用することを期待しないが、自己折畳みのプロセスは、特に電子デバイスのパッケージにおいて、このサイズスケールで依然として妥当であると考えられる。
プロセスの許容度：
２Ｄ型板のウェハスケールのパターニングは、非常に並行的であり、例えば本発明者等は、３”ウェハ上に、約１０００（Ｌ＝１００μｍ）および１０００００（Ｌ＝１５μｍ）２Ｄ十字型をパックする。折畳みプロセスも非常に並行的であり、多数の２Ｄ型板を同時に折り畳むことができる。実験によれば、折畳みプロセスも、かなりの欠陥許容性を有するようであり、本発明者等はしばしば、９０％を超える歩留りを実現し、かつ多数の多面体を作製することができている（図２０）。本発明者等は、ヒンジの位置合わせが、隣接する面を横断する中心に完全に一致していない場合であっても、折畳みが生ずることを観察した。実験によれば、欠陥許容性を増大させるため、本発明者等は、本発明者等のはんだ体積がわずかに過度な折畳みをもたらすことを目標にした（水平から約１００°の回転）。本発明者等は、ロッキングヒンジを使用したので、この過剰な折畳みによって面と面が確実に接触し、ロッキングヒンジを融合させることが可能であった。これは、プロセスの許容範囲を増大させ［Syms,RRA、J.Microelectromech.Syst. 1995、4、177〜184］、縁部および角で立方体を密封した。さらに、対流性の流れが、折畳みプロセス中の高温溶液中に存在した。これらの対流性の流れは、２Ｄ型板を攪拌し、面の縁部を接触させることによって折畳み角度の許容範囲を増大させたが、これにより、ロッキングはんだヒンジは融合して、かなりの強度で面を一まとめに保持することが可能になる［Jacobs,H.O.他、Science 2002、296、323〜325; Gracias,D.H.他、Science、2000、289、1170〜1172］。
２Ｄ型板のウェハスケールのパターニングは、非常に並行的であり、例えば本発明者等は、３”ウェハ上に、約１０００（Ｌ＝１００μｍ）および１０００００（Ｌ＝１５μｍ）２Ｄ十字型をパックする。折畳みプロセスも非常に並行的であり、多数の２Ｄ型板を同時に折り畳むことができる。実験によれば、折畳みプロセスも、かなりの欠陥許容性を有するようであり、本発明者等はしばしば、９０％を超える歩留りを実現し、かつ多数の多面体を作製することができている（図２０）。本発明者等は、ヒンジの位置合わせが、隣接する面を横断する中心に完全に一致していない場合であっても、折畳みが生ずることを観察した。実験によれば、欠陥許容性を増大させるため、本発明者等は、本発明者等のはんだ体積がわずかに過度な折畳みをもたらすことを目標にした（水平から約１００°の回転）。本発明者等は、ロッキングヒンジを使用したので、この過剰な折畳みによって面と面が確実に接触し、ロッキングヒンジを融合させることが可能であった。これは、プロセスの許容範囲を増大させ［Syms,RRA、J.Microelectromech.Syst. 1995、4、177〜184］、縁部および角で立方体を密封した。さらに、対流性の流れが、折畳みプロセス中の高温溶液中に存在した。これらの対流性の流れは、２Ｄ型板を攪拌し、面の縁部を接触させることによって折畳み角度の許容範囲を増大させたが、これにより、ロッキングはんだヒンジは融合して、かなりの強度で面を一まとめに保持することが可能になる［Jacobs,H.O.他、Science 2002、296、323〜325; Gracias,D.H.他、Science、2000、289、1170〜1172］。
結論：
まとめると、ｍｍからｎｍまでの広範なサイズを有する解放型中空パターニング多面体を作製するのに利用することができる、表面張力をベースにした折畳みプロセスについて示してきた。マイクロエレクトロニクスにおいて十分に確立されたリソグラフィ法を活用することによって、この作製プロセスは、「スマート粒子」を生成するための多面体に、精密に設計製作された単分散多孔性、トランジスタ、センサ、およびその他の情報処理デバイスを組み込む経路を提供する。シミュレーションを使用して、本発明者等は、広範な面材料および液化可能なヒンジについても折畳みが作用することを実証した。これは、小さいサイズで好ましく拡大縮小される界面張力の利用が、マイクロおよびナノ加工に有用なパラダイムであることも実証する。
まとめると、ｍｍからｎｍまでの広範なサイズを有する解放型中空パターニング多面体を作製するのに利用することができる、表面張力をベースにした折畳みプロセスについて示してきた。マイクロエレクトロニクスにおいて十分に確立されたリソグラフィ法を活用することによって、この作製プロセスは、「スマート粒子」を生成するための多面体に、精密に設計製作された単分散多孔性、トランジスタ、センサ、およびその他の情報処理デバイスを組み込む経路を提供する。シミュレーションを使用して、本発明者等は、広範な面材料および液化可能なヒンジについても折畳みが作用することを実証した。これは、小さいサイズで好ましく拡大縮小される界面張力の利用が、マイクロおよびナノ加工に有用なパラダイムであることも実証する。
遠隔誘導されたナノリットルスケールコンテナを使用した空間制御化学
従来のチャネルベースのマイクロ流体デバイスと共に、ポリマー、ゲル、および液滴をベースにしたものを含めたいくつかのナノリットルスケールの化学カプセル化材が開発されている［例えば、(a) Lim,F.、Sun, A. M. Science. 1980、210、908〜910、(b) Chang,T.M.S. Nat.Rev.Drug Discovery. 2005、4、221〜235、(c) Langer,R. Ace.Chem.Res. 1993、26、537〜42、(d) Tice,J.D.、Song,H.、Lyon,A.D.、lsmagilov, R.F.Langmuir 2003、19、9127〜9133、(e) Hammer.D.A.、Discher D.E.、Ann.Rev.Mater.Res、2001、31、387〜404］。上述の有機系とは対照的に、微細加工されたシリコンベースのデバイスは、極めて高い精度、高い再現性、優れた機械的強度、良好な化学的安定性並びに感知、シグナル調整、および作動機能を同じ基板に近接してまたは同じ基板上に組み込む能力を有することができる。しかし、従来のシリコンベースの微細加工で使用されるフォトリソグラフィプロセスの、固有の２次元性が原因となって、制御された多孔性を有する３Ｄ微細加工されたナノリットルスケールのリザーバシステムは、現在のところ存在しない。
従来のチャネルベースのマイクロ流体デバイスと共に、ポリマー、ゲル、および液滴をベースにしたものを含めたいくつかのナノリットルスケールの化学カプセル化材が開発されている［例えば、(a) Lim,F.、Sun, A. M. Science. 1980、210、908〜910、(b) Chang,T.M.S. Nat.Rev.Drug Discovery. 2005、4、221〜235、(c) Langer,R. Ace.Chem.Res. 1993、26、537〜42、(d) Tice,J.D.、Song,H.、Lyon,A.D.、lsmagilov, R.F.Langmuir 2003、19、9127〜9133、(e) Hammer.D.A.、Discher D.E.、Ann.Rev.Mater.Res、2001、31、387〜404］。上述の有機系とは対照的に、微細加工されたシリコンベースのデバイスは、極めて高い精度、高い再現性、優れた機械的強度、良好な化学的安定性並びに感知、シグナル調整、および作動機能を同じ基板に近接してまたは同じ基板上に組み込む能力を有することができる。しかし、従来のシリコンベースの微細加工で使用されるフォトリソグラフィプロセスの、固有の２次元性が原因となって、制御された多孔性を有する３Ｄ微細加工されたナノリットルスケールのリザーバシステムは、現在のところ存在しない。
本明細書では、精密に設計製作された表面多孔性を有する３Ｄコンテナの開発と、化学カプセル化、誘導デリバリー、および空間制御化学におけるその利用について示す。手短かに言うと、プロセスは、はんだヒンジを有する２Ｄ金属型板のフォトリソグラフィによる作製を含んでいた（図２２ａ）。２Ｄ型板は、はんだヒンジの融点よりも高く加熱されたときに３Ｄ中空多面体へと自己組織化し、この場合、溶融はんだの表面張力は、自己組織化を促進させる力を提供した［(a) Syms,R.R.A.、Yeatmant,E.M.、Bright,V.M.、Whitesides,G.M. J.MEMS 2003、12、387〜417、(b) Hui,E.E.、Howe,R.T.、Rodgers,M.R.、IEEE 13th Int.Conf.MEMS、2000、602〜607、(c) Gimi,B.、Leong,T.、Gu,Z.、Yang,M.、Artemov,D.、Bhujwalla, Z.、Gracias,D.H. Biomed.Microdevice 2005、7、341〜3］。コンテナは、種々の形状および２３０ピコリットルから８ナノリットルに及ぶ体積で作製されている（図２２ａ〜ｄ）。作製プロセスも非常に並行的であり、種々の形状およびサイズのコンテナを、１回のプロセス実行で作製することができた（即ち、１枚のウェハから、図２２ｅ〜ｇ）。プロセスが最適化された場合、歩留りは、３”ウェハに関して６０〜９０％に及んだ（歩留りは、面を折り畳む回数および対称性に応じて、種々の形状のコンテナごとに変化した）。作製プロセスにおける歩留りの主な制限因子は、面に対するヒンジの位置合わせでのフォトリソグラフィの精度、およびヒンジでのはんだの体積であった［Syms R.R.A. J.MEMS 1999、8、448〜455、(15) Deng,T.、Whitesides,G.M.、Radhakrishnan,M.、Zabow,G.、Prentiss,M.、Appl.Phys.Lett. 2001、78、1775〜1777］。フォトリソグラフィマイクロ加工は非常に精密であるので、単分散性細孔を有するコンテナの１つまたは複数の面を、パターニングすることも可能であった（図２２ｈ〜ｋ）。形成された細孔のサイズは、使用されたフォトマスク（この場合、３ミクロンの解像度を有していた）によって制限された。多孔性を制御することによって、図２３に示されるような試薬放出プロファイルを設計製作することが可能になった。
コンテナには、特定部位微量注入を使用して、ゲル（またはポリマー）の溶液および放出される化学物質を充填した。溶媒が蒸発すると、ゲルはコンテナ内に残されたままになった。充填されたコンテナを、ゲル（またはポリマー）を軟化しまたは溶解する溶液に浸漬することによって、化学物質を放出した。ゲル（およびポリマー）は、広範な溶解度および軟化温度で利用可能であるので、種々の溶媒および温度を使用して、化学物質の放出速度を操作することが可能であった。書面に示される画像は、ブロックコポリマーヒドロゲル（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））が充填されたコンテナを使用して得られた。放出実験は、水−アルコールベースの媒体中で行った（補遺セクションに詳述）。コンテナの種々の面上の相対多孔度を変化させることによって、等方性（図２３ａ）並びに異方性（図２３ｂ）の両方の化学物質放出プロファイルを得ることが可能になった。作製プロセスは、様々な動脈に適合したので、磁場を使用して遠隔から導くことができるニッケルベースのコンテナを作製することが可能であった。空間制御された（文字Ｇ−任意の経路が可能である）化学反応は、アルカリ溶液で満たされたマイクロウェルに、ｐＨ指示薬であるフェノールフタレインを直接放出する（書き込む）ことによって実証された（図２３ｃ）。直接的な書込みは、マイクロウェル下で移動する磁性針を使用して、フェノールフタレイン−プルロニックが充填されたコンテナを操作することによって可能になった。導かれた操作は、永久磁石を使用して行われたが、コンテナの動きを再現可能に制御するために、したがって任意のパターンを有する化学物質の空間放出を再現可能に制御するために、その他の上手くに開発されたマイクロコイルベースの磁気操作回路を使用することが可能であることに留意すべきである［Deng,T.、Whitesides,G.M.、Radhakrishnan.M.、Zabow,G.、Prentiss,M.Appl. Phys. Lett. 2001、78、1775〜1777］。
空間的に局在化した化学反応も、多数のナノリットルスケールのコンテナ間で実証された（図２４ａ〜ｃ）。硫酸銅および水酸化カリウムがそれぞれ充填された２個のコンテナを、水性媒体中で互いに近付けた場合、化学反応（水酸化銅を形成する）は、２つの拡散速度の間の中心線に沿ってのみ生じ、この反応は、化学物質の拡散が遅くなるほどコンテナの近くで生じた（図２４ｄ〜ｆ）。これらの実験はさらに、化学反応の空間制御を、多数のコンテナを含むより複雑な反応の先端にまで拡げることができることを実証する。
まとめると、すべての有機カプセル化材とは対照的に、コンテナは、形状およびサイズの多様性、異方性の面、単分散性の多孔性、および磁場を使用してマイクロ流体チャネル内で導くことができる能力によって、化学試薬の放出の先例のない空間制御を可能にする。さらに、金属コンテナは、それを容易に検出しかつ追跡することが可能である（磁気共鳴映像、ＭＲＩを使用する）遠隔電磁場と相互に作用する。このようにコンテナは、マイクロ流体工学システムにおいて、遠隔から導かれる、空間的に制御される化学反応を設計製作するための、魅力あるプラットフォームを提供する。
マイクロコンテナの作製：
厚さ５．５μｍのポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ、ＭＷ：９９６Ｋ）［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ］の犠牲層を、シリコンウェハ上にスピンコートした。ＰＭＭＡで被覆したウェハの上面に、１５ｎｍの接着促進クロム（Ｃｒ）層および１００ｎｍの導電性シード銅（Ｃｕ）層を蒸着した。薄膜を堆積した後、本発明者等は、Ｓｈｉｐｌｅｙ ＳＰＲ２２０ ７．０フォトレジスト［Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ，ｗｗｗ．ｒｏｈｍｈａａｓ．ｃｏｍ］の層をスピンコートした。フォトレジストの厚さは、スピン速度を介して、かつ付着させるコーティングの数を変化させることによって制御した。ソフトベークの後、ウルトラμラインシリーズＱｕｉｎｔｅｌマスクアライナ［Ｑｕｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐ．，ｗｗｗ．ｑｕｉｎｔｅｌｃｏｒｐ．ｃｏｍ］を使用して、レジストをＵＶ光で露光し、透過性マスクを使用してパターニングした。フォトレジストを現像した後、電着を使用して、フォトレジストの型の内部でマイクロコンテナの金属フレームを６〜１５μｍの高さに（様々な用途に必要とされる特性に左右される）成長させた。本発明者等は、種々の金属を電着させるため、選択された金属イオンを含有する市販の電解溶液［Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ］を使用した。非磁性コンテナの構造ではＣｕを電気めっきし、磁性コンテナではＮｉを使用した。ヒンジをパターニングするために、２回目のフォトリソグラフィを行った。ＳＰＲ２２０の層を基板上面にスピンコートし、ヒンジマスクに接触させた。幅が広くなるほど、内部ヒンジは隣接する面の間に位置付けられるようになるが、より狭くなるほど、外部ヒンジはフレームの外縁に存在するようになる。２Ｄ前駆体のフレームとのヒンジのアライメントを確実にするために、アライメントマークを使用した。ヒンジパターンを４５１現像液で現像した後、電着フレーム間の露光されたＣｕ（シード）およびＣｒ（接着）領域を、市販のエッチング液（Ｃｕに関してはＡＰＳ−１００、Ｃｒに関してはＣＲＥ−４７３［Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ］）を使用してエッチングした。次いでスズ／鉛（６０／４０、融点約１８３℃）はんだ［Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ］を、ヒンジ領域に電気めっきさせた。ヒンジの高さは約１６μｍであった。はんだの電着後、フォトレジスト層をアセトンで剥離し、残されたＣｕシードおよびＣｒ接着層をエッチングし、はんだヒンジに接続された金属フレームからなる２Ｄ前駆体型板を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）［Ｓｉｇｍａ−Ａｄｌｒｉｃｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ］に浸漬して、犠牲ＰＭＭＡ層を溶解し、ウェハから前駆体を分離した。ＮＭＰ中約５０の前駆体を、小さい結晶化皿全面に拡げ、少量の＃５ ＲＭＡフラックス［Ｉｎｄｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｗｗｗ．ｉｎｄｉｕｍ．ｃｏｍ］を添加して、形成された可能性のあるはんだ酸化物をすべて溶解した。皿を１００℃に３分間加熱し、次いではんだが溶融するまで、約９０秒で２５０℃まで上昇させた。リフロー中、はんだが２Ｄ前駆体上の金属の上層を濡らす場合、作製歩留りは不十分であった。はんだは銅を十分に濡らしたが、Ｎｉを十分には濡らさず、したがってＣｕフレームを有するコンテナでは、歩留りを改善するために薄いＮｉ層を付加する必要があった。はんだがリフローした場合、溶融はんだはヒンジにあり、２Ｄ前駆体を３Ｄマイクロコンテナに折り畳むためにトルクを発生させた。冷却すると、はんだは凝固し、永久的にコンテナフレームを一まとめに保持した。
厚さ５．５μｍのポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ、ＭＷ：９９６Ｋ）［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ］の犠牲層を、シリコンウェハ上にスピンコートした。ＰＭＭＡで被覆したウェハの上面に、１５ｎｍの接着促進クロム（Ｃｒ）層および１００ｎｍの導電性シード銅（Ｃｕ）層を蒸着した。薄膜を堆積した後、本発明者等は、Ｓｈｉｐｌｅｙ ＳＰＲ２２０ ７．０フォトレジスト［Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ，ｗｗｗ．ｒｏｈｍｈａａｓ．ｃｏｍ］の層をスピンコートした。フォトレジストの厚さは、スピン速度を介して、かつ付着させるコーティングの数を変化させることによって制御した。ソフトベークの後、ウルトラμラインシリーズＱｕｉｎｔｅｌマスクアライナ［Ｑｕｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐ．，ｗｗｗ．ｑｕｉｎｔｅｌｃｏｒｐ．ｃｏｍ］を使用して、レジストをＵＶ光で露光し、透過性マスクを使用してパターニングした。フォトレジストを現像した後、電着を使用して、フォトレジストの型の内部でマイクロコンテナの金属フレームを６〜１５μｍの高さに（様々な用途に必要とされる特性に左右される）成長させた。本発明者等は、種々の金属を電着させるため、選択された金属イオンを含有する市販の電解溶液［Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ］を使用した。非磁性コンテナの構造ではＣｕを電気めっきし、磁性コンテナではＮｉを使用した。ヒンジをパターニングするために、２回目のフォトリソグラフィを行った。ＳＰＲ２２０の層を基板上面にスピンコートし、ヒンジマスクに接触させた。幅が広くなるほど、内部ヒンジは隣接する面の間に位置付けられるようになるが、より狭くなるほど、外部ヒンジはフレームの外縁に存在するようになる。２Ｄ前駆体のフレームとのヒンジのアライメントを確実にするために、アライメントマークを使用した。ヒンジパターンを４５１現像液で現像した後、電着フレーム間の露光されたＣｕ（シード）およびＣｒ（接着）領域を、市販のエッチング液（Ｃｕに関してはＡＰＳ−１００、Ｃｒに関してはＣＲＥ−４７３［Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ］）を使用してエッチングした。次いでスズ／鉛（６０／４０、融点約１８３℃）はんだ［Ｔｅｃｈｎｉｃ，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｉｃ．ｃｏｍ］を、ヒンジ領域に電気めっきさせた。ヒンジの高さは約１６μｍであった。はんだの電着後、フォトレジスト層をアセトンで剥離し、残されたＣｕシードおよびＣｒ接着層をエッチングし、はんだヒンジに接続された金属フレームからなる２Ｄ前駆体型板を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）［Ｓｉｇｍａ−Ａｄｌｒｉｃｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ］に浸漬して、犠牲ＰＭＭＡ層を溶解し、ウェハから前駆体を分離した。ＮＭＰ中約５０の前駆体を、小さい結晶化皿全面に拡げ、少量の＃５ ＲＭＡフラックス［Ｉｎｄｉｕｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｗｗｗ．ｉｎｄｉｕｍ．ｃｏｍ］を添加して、形成された可能性のあるはんだ酸化物をすべて溶解した。皿を１００℃に３分間加熱し、次いではんだが溶融するまで、約９０秒で２５０℃まで上昇させた。リフロー中、はんだが２Ｄ前駆体上の金属の上層を濡らす場合、作製歩留りは不十分であった。はんだは銅を十分に濡らしたが、Ｎｉを十分には濡らさず、したがってＣｕフレームを有するコンテナでは、歩留りを改善するために薄いＮｉ層を付加する必要があった。はんだがリフローした場合、溶融はんだはヒンジにあり、２Ｄ前駆体を３Ｄマイクロコンテナに折り畳むためにトルクを発生させた。冷却すると、はんだは凝固し、永久的にコンテナフレームを一まとめに保持した。
コンテナの充填：
コンテナに対する化学試薬の濡れ性に応じて、コンテナに試薬を充填するのに２つの方法を使用した。化学物質がコンテナを十分に濡らす場合、いくつかのボックスは、これらを１滴の化学試薬に浸漬することによって同時に充填された。溶媒を、蒸発によって除去した。これにより、化学試薬を染み込ませたポリマー［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８，ＢＡＳＦ，ｗｗｗ．ｂａｓｆ．ｃｏｍ］が残された。
コンテナに対する化学試薬の濡れ性に応じて、コンテナに試薬を充填するのに２つの方法を使用した。化学物質がコンテナを十分に濡らす場合、いくつかのボックスは、これらを１滴の化学試薬に浸漬することによって同時に充填された。溶媒を、蒸発によって除去した。これにより、化学試薬を染み込ませたポリマー［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８，ＢＡＳＦ，ｗｗｗ．ｂａｓｆ．ｃｏｍ］が残された。
第２の方法は、マイクロコンテナおよび注射器［Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．ＮａｎｏｆｉｌＴＭ Ｓｙｒｉｎｇｅ，ｗｗｗ．ｗｐｉｉｎｃ．ｃｏｍ］の位置を独立して制御するために、２つの３軸Ｎｅｗｐｏｒｔマイクロマニピュレータ［Ｍｏｄｅｌｓ ４６０Ａ ＆ Ｍ４６２，ｗｗｗ．ｎｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍ］を利用した。注射器には、マイクロコンテナの充填を促進させるために、３６ゲージ針［ＷＰＩＩ ３６ Ｇａｕｇｅ Ｎｅｅｄｌｅ，ｗｗｗ．ｗｐｉｉｎｃ．ｃｏｍ］を装備した。
化学物質の放出および反応の詳細：
赤色染料拡散実験（図２３ａ〜ｂ）：コンテナに、１．６ｍＬ（０．２６１ｇ）のＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ ４０［ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ．ｃｏｍ］と、１．０ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を水１０ｍＬ（１８．４ＭΩ）に溶解した水性ポリマー溶液とからなる混合物を充填した。グリセロール：エタノール：水が２：１：２（体積による）の混合物を拡散媒体として使用し、この媒体を、充填済みマイクロコンテナを含む小さなチャンバに添加した。拡散プロファイルを、ステレオズーム単対物双眼顕微鏡を使用して撮像した。
赤色染料拡散実験（図２３ａ〜ｂ）：コンテナに、１．６ｍＬ（０．２６１ｇ）のＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ ４０［ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ．ｃｏｍ］と、１．０ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を水１０ｍＬ（１８．４ＭΩ）に溶解した水性ポリマー溶液とからなる混合物を充填した。グリセロール：エタノール：水が２：１：２（体積による）の混合物を拡散媒体として使用し、この媒体を、充填済みマイクロコンテナを含む小さなチャンバに添加した。拡散プロファイルを、ステレオズーム単対物双眼顕微鏡を使用して撮像した。
磁気により導かれたフェノールフタレイン−ＫＯＨ反応（図２３ｃ）：フェノールフタレイン溶液０．２５ｍＬ（フェノールフタレイン［Ｆｒｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｗｗｗ．ｆｒｅｙｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．ｃｏｍ］０．５ｇを９５％エタノール１００ｍＬに溶かしたもの）を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを水１０ｍＬに溶解したものからなる水性ポリマー溶液に添加することによって、フェノールフタレイン−ＫＯＨ反応に関する指示薬混合物を調製し、これをニッケルベースのマイクロコンテナに充填した。マイクロコンテナを、組織培養プレート［Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）ＭｕｌｔｉｗｅｌｌＴＭ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ，２４ Ｗｅｌｌ，ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ］のウェル内に置き、１：１：１（体積による）のグリセロール：水：１Ｍ ＫＯＨ（ａｑ）媒体をチャンバに導入した。マイクロコンテナを、引力０．３５ｌｂ、直径１／８”のＡｌＮｉＣｏ丸棒磁石［ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ，ｗｗｗ．ｍｃｍａｓｔｅｒ．ｃｏｍ］を使用して誘導し制御した。
硫酸銅（ＩＩ）５水和物−ＫＯＨ反応（図２４ａ〜ｃ）：
ＣｕＳＯ４（ａｑ）＋２ＫＯＨ（ａｑ）→Ｋ２ＳＯ４（ａｑ）＋Ｃｕ（ＯＨ）２（ｓ）
硫酸銅反応体混合物を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを０．５Ｍ Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４水溶液１０ｍＬ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｊｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ］に溶解することによって調製し、これをマイクロコンテナに充填した。水酸化カリウム反応体混合物を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを１．０Ｍ ＫＯＨ（ａｑ）１０ｍＬに溶解することによって調製し、これを第２のマイクロコンテナに充填した。マイクロコンテナを、ポリ（ジメチルシロキサン）［ＰＤＭＳ，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４，ｗｗｗ．ｄｏｗｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ］マイクロウェル内に近接して配置した。マイクロウェルは、ＳＵ−８フォトレジストマスターに対してＰＤＭＳを成型することによって作製した。拡散および反応媒体は水であった。
フェノールフタレイン−ＫＯＨ反応（図２４ｄ〜ｆ）：フェノールフタレイン溶液０．２５ｍＬを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを水１０ｍＬに溶解したものからなる水性ポリマー溶液に添加することによって、フェノールフタレイン−ＫＯＨ反応の指示薬混合物を調製した。アルカリ混合物は、４Ｍ ＫＯＨ（ａｑ）０．５ｍＬ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ］を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇおよび水１０ｍＬからなる水性ポリマー溶液に添加することによって調製した。２個のコンテナに、フェノールフタレイン溶液を充填し、さらに１個のコンテナにはＫＯＨ溶液を充填した。次いで３個のコンテナを、拡散および反応媒体としての水と共に、ＰＤＭＳマイクロウェル内に置いた。この反応も、ステレオズーム単対物双眼顕微鏡を使用して撮像した。
ＣｕＳＯ４（ａｑ）＋２ＫＯＨ（ａｑ）→Ｋ２ＳＯ４（ａｑ）＋Ｃｕ（ＯＨ）２（ｓ）
硫酸銅反応体混合物を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを０．５Ｍ Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４水溶液１０ｍＬ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｊｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ］に溶解することによって調製し、これをマイクロコンテナに充填した。水酸化カリウム反応体混合物を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを１．０Ｍ ＫＯＨ（ａｑ）１０ｍＬに溶解することによって調製し、これを第２のマイクロコンテナに充填した。マイクロコンテナを、ポリ（ジメチルシロキサン）［ＰＤＭＳ，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４，ｗｗｗ．ｄｏｗｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ］マイクロウェル内に近接して配置した。マイクロウェルは、ＳＵ−８フォトレジストマスターに対してＰＤＭＳを成型することによって作製した。拡散および反応媒体は水であった。
フェノールフタレイン−ＫＯＨ反応（図２４ｄ〜ｆ）：フェノールフタレイン溶液０．２５ｍＬを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇを水１０ｍＬに溶解したものからなる水性ポリマー溶液に添加することによって、フェノールフタレイン−ＫＯＨ反応の指示薬混合物を調製した。アルカリ混合物は、４Ｍ ＫＯＨ（ａｑ）０．５ｍＬ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ］を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ １．０ｇおよび水１０ｍＬからなる水性ポリマー溶液に添加することによって調製した。２個のコンテナに、フェノールフタレイン溶液を充填し、さらに１個のコンテナにはＫＯＨ溶液を充填した。次いで３個のコンテナを、拡散および反応媒体としての水と共に、ＰＤＭＳマイクロウェル内に置いた。この反応も、ステレオズーム単対物双眼顕微鏡を使用して撮像した。
本発明について、その特定の実施形態を参照しながら述べてきたが、当業者なら、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができかつ均等物に置き換えることができることを理解すべきである。さらに、本発明の目的とする精神および範囲に合わせて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、１つまたは複数のプロセス工程を採用するために、多くの修正を行うことができる。そのようなすべての修正例は、本明細書に添付される特許請求の範囲内にあるものとする。
Claims (45)
- 中空内部を形成するために自己折畳みが可能な複数の２次元面を含む３次元粒子であって、サイズがマイクロスケールまたはナノスケールであり、前記複数の２次元面が、２つの隣接する面の間の折畳みヒンジと２次元面の縁部のロッキングヒンジとを含み、前記折畳みヒンジおよび前記ロッキングヒンジが、はんだからなり、２つの隣接する面の間の前記折畳みヒンジの幅が、縁部の前記ロッキングヒンジの幅の２倍であり、前記３次元粒子を構成する前記複数の２次元面が、固体ヒンジによって一緒に永久に保持され、前記粒子が、（ｉ）能動的な電子または半導体構成要素、および（ｉｉ）前記粒子内にカプセル化された少なくとも１種の物質、の少なくとも１つをさらに含む、３次元粒子。
３次元粒子。 - 前記粒子のサイズが１ｎｍから２ｍｍに及ぶ、請求項１に記載の粒子。
- 前記形状が、多面体形状を形成する表面を有する、請求項１に記載の粒子。
- 前記形状が立方体である、請求項３に記載の粒子。
- 前記２次元面が、穿孔または細孔によりパターニングされる、請求項１に記載の粒子。
- 前記穿孔または細孔が、フォトリソグラフィによって、電解によって、または電子線リソグラフィを使用することによって生成される、請求項５に記載の粒子。
- 前記穿孔または細孔が、０．１ｎｍから１００ミクロンのサイズを有する、請求項５に記載の粒子。
- 前記穿孔または細孔が、１０ｎｍから１００ミクロンのサイズを有する、請求項７に記載の粒子。
- 前記粒子が、金属、ポリマー、ガラス、半導体、絶縁体、およびこれらの組合せからなる群から選択された少なくとも１種の材料から作製される、請求項１に記載の粒子。
- 前記能動的な電子または半導体構成要素が、トランジスタ、センサ、アクチュエータ、発光ダイオード、フォトダイオード、および太陽電池からなる群より選ばれる、請求項１に記載の粒子。
- 前記金属が銅またはニッケルである、請求項９に記載の粒子。
- 前記粒子がファラデーケージである、請求項１に記載の粒子。
- 前記粒子が生体適合性材料で被覆されている、請求項１に記載の粒子。
- 前記粒子がバイオセンサに結合されている、請求項１３に記載の粒子。
- 前記生体適合性材料が、金属、ポリマー、またはこれらの組合せである、請求項１３に記載の粒子。
- 前記粒子が、前記粒子の２次元面に穿孔または細孔を有し、前記粒子内にカプセル化された前記少なくとも１種の物質の放出を可能とする、請求項１に記載の粒子。
- 前記物質が治療薬である、請求項１に記載の粒子。
- 前記治療薬が、細胞、化学的または生物学的物質、医薬品、組成物、組織、ゲル、およびポリマーからなる群から選択される、請求項１７に記載の粒子。
- 前記粒子が対象に投与され、前記対象体内での前記粒子の位置が、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）またはＣＡＴスキャン（ＣＴ）によって非侵襲的に追跡される、請求項１に記載の粒子。
- 前記粒子が、バックグラウンドに対してネガティブ造影で、またはバックグラウンドに対してポジティブ造影で撮像される、請求項１９に記載の粒子。
- 高周波タグをさらに含む、請求項１７に記載の粒子。
- 事前に選択された周波数に前記粒子を曝すと、前記物質を放出することができる、請求項２１に記載の粒子。
- 電磁放射線に前記粒子を曝すと、前記物質を放出することができる、請求項１０に記載の粒子。
- 前記電磁放射線が遠隔から誘起される、請求項２３に記載の粒子。
- 前記電磁放射線が１ＫＨｚから１ペタＨｚに及ぶ、請求項２３に記載の粒子。
- 誘導加熱に前記粒子を曝すと、前記物質を放出することができる、請求項１７に記載の粒子。
- 前記誘導加熱が遠隔から誘起される、請求項２６に記載の粒子。
- 中空内部を形成するために自己折畳みが可能な複数の２次元面を含む３次元粒子であって、サイズがマイクロスケールまたはナノスケールであり、前記複数の２次元面が、２つの隣接する面の間の折畳みヒンジと２次元面の縁部のロッキングヒンジとを含み、前記折畳みヒンジおよび前記ロッキングヒンジが、はんだからなり、２つの隣接する面の間の前記折畳みヒンジの幅が、縁部の前記ロッキングヒンジの幅の２倍であり、前記３次元粒子を構成する前記複数の２次元面が、固体ヒンジによって一緒に永久に保持され、前記粒子が、（ｉ）能動的な電子または半導体構成要素、および（ｉｉ）前記粒子内にカプセル化された少なくとも１種の物質、の少なくとも１つをさらに含む、３次元粒子の作製方法であって、
（ａ）犠牲層を基板の上に堆積させて第１の層を形成する工程と、
（ｂ）導電性の第２の層を前記第１の層の上に堆積させて積層化した基板を形成する工程と、
（ｃ）前記積層化した基板をパターニングして多数のパターニングされた２次元面を作製する工程と、
（ｄ）隣接するパターニングされた２次元面の間の界面にヒンジをパターニングする工程と、
（ｅ）前記パターニングされた２次元面の縁部にヒンジをパターニングする工程（ただし２つの隣接する面の間の前記ヒンジの幅が、縁部の前記ヒンジの幅の２倍である）と、
（ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）においてパターニングされた各ヒンジにはんだを堆積させる工程と、
（ｇ）前記犠牲層を溶解して前記パターニングされた２次元面を分離する工程と、
（ｈ）前記分離したパターニングされた２次元面を加熱して各ヒンジに堆積させたはんだを液化して、充填可能な中心チャンバを含む３次元コンテナを自己組織化する工程と、
を含み、冷却によって、前記自己組織化した３次元コンテナが、固体ヒンジによって一緒に永久に保持された多数の２次元面を有する３次元コンテナを形成する、方法。 - 工程（ｂ）で、２次元面が穿孔または細孔によってパターニングされる、請求項２８に記載の方法。
- 前記穿孔または細孔がフォトリソグラフィによって生成される、請求項２９に記載の方法。
- 前記穿孔または細孔が、０．１ｎｍから１００ミクロンのサイズを有する、請求項２９に記載の方法。
- 前記粒子がファラデーケージである、請求項２８に記載の方法。
- 対象（ただし、ヒトを除く）に移植された請求項１に記載の粒子の撮像方法であって、
（ｉ）前記粒子の中空内部に少なくとも１種の物質を充填して、充填済み粒子を形成する工程と、
（ｉｉ）充填済み粒子を前記対象に投与する工程と、
（ｉｉｉ）磁気共鳴映像によって前記対象体内の工程（ｉｉ）の粒子を非侵襲的に追跡する工程と
を含む方法。 - 前記粒子の２次元面の穿孔または細孔によって、中空内部の前記物質の放出が可能になる、請求項３３に記載の方法。
- 工程（ｉ）の少なくとも１種の物質が治療薬である、請求項３３に記載の方法。
- 前記治療薬が、細胞、医薬品、組成物、組織、ゲル、およびポリマーからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
- 状態を治療する方法であって、組成物をカプセル化する請求項１に記載の少なくとも１種の粒子を、治療の必要がある哺乳動物（ただし、ヒトを除く）に導入することを含み、前記組成物が、前記状態を治療するのに十分な量で、前記粒子内の１つまたは複数の細孔を通して前記哺乳動物体内に放出される方法。
- 薬剤組成物が、１つまたは複数のマイクロビーズ内に含有される、請求項３７に記載の方法。
- 前記状態が糖尿病であり、前記組成物が１個または複数のインスリン分泌細胞である、請求項３７に記載の方法。
- 哺乳動物（ただし、ヒトを除く）に導入された請求項１に記載の粒子を撮像するための方法であって、磁気共鳴映像を使用することを含む方法。
- 請求項１に記載の粒子を対象体内の細胞に送り込むための方法であって、
ａ）細胞に特異的な抗原に対する抗体を粒子に付着させる工程と、
ｂ）粒子を哺乳動物（ただし、ヒトを除く）に導入する工程と
を含み、前記粒子が前記細胞に送り込まれる方法。 - 前記粒子が、特定の時間および特定の部位で１種または複数の試薬を遠隔から放出するようにプログラムされている、請求項１８に記載の１個または複数の粒子を対象（ただし、ヒトを除く）にデリバリーする方法。
- 前記粒子が、ＭＲＩまたはＣＴを使用して遠隔から導かれ撮像される、請求項４２に記載の方法。
- 前記粒子が、造影剤を放出すること、または造影を付与することが可能であり、その近傍内にある物質の内容物のＭＲＩまたはＣＴ撮像提供することが可能である、請求項４３に記載の方法。
- 非侵襲的生検またはマイクロサージェリーを実施する方法であって、遠隔手段を使用して、対象（ただし、ヒトを除く）の体内の部位に請求項１に記載の粒子を導くこと、前記部位から１種または複数の物質を前記粒子に捕捉させること、および前記物質を前記粒子から得ることを含み、それにより生検またはマイクロサージェリーを非侵襲的に実施する方法。
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| US11/491,829 US8236259B2 (en) | 2005-07-22 | 2006-07-24 | Self-assembled, micropatterned, and radio frequency (RF) shielded biocontainers |
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