JP5431952B2

JP5431952B2 - 患者の個別化治療的ワクチン接種の主成分となる、腫瘍患者の腫瘍関連抗原（ｔａａ）に対する個々のｔ細胞反応パターンの検出

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Publication number: JP5431952B2
Application number: JP2009541805A
Authority: JP
Inventors: ファトー，マルティナ; ヴェサルグ，エマニュエル; レネルツ，ヴォルカー; デルブリュッヘン，ピエールヴァン; ヴェルフェル，トマス; デボ，セレナ
Original assignee: ヨハネスグーテンベルクウニベルジテートマインツ
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2014-03-05
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Description

本発明は以下の工程を含む腫瘍患者の抗腫瘍Ｔ細胞の選択的標的抗原を同定する方法に関する：ａ）少なくとも１人の腫瘍患者の血液由来の腫瘍細胞系とのインビトロでの接触により刺激を受けないＴ細胞を準備する工程、ｂ）前記腫瘍患者にとって自己由来であり、かつＴ細胞免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する、樹状細胞（ＤＣ）および／またはＢリンパ球（ＢＬＣ）を準備する工程であって、前記ＤＣおよびＢＬＣがＴ細胞免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする複数のｍＲＮＡの中から選択したものであらかじめトランスフェクトされた工程、ｃ）前記Ｔ細胞を前記ＤＣおよび／またはＢＬＣに接触させる工程、およびｄ）トランスフェクトしたＤＣおよび／またはＢＬＣにおいて、Ｔ細胞に認識されたＴＡＡを同定する工程。該方法はさらにＤＣおよび／またはＢＬＣの抗原を認識するＴ細胞を増殖させる工程も含み得る。さらに本発明は個別の腫瘍ワクチンまたは個別の腫瘍治療用物質の生成法、ならびにその個別の腫瘍ワクチンまたは個別の腫瘍治療用物質を用いる腫瘍性疾患治療のための対応する方法に関する。

癌細胞は多数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する。腫瘍反応性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によりＴＡＡ由来オリゴペプチドが認識されると腫瘍細胞が破壊されることがヒトのインビトロモデルで判明した。細胞質が分解されたタンパク質に由来し、細胞表面上の主要な組織適合性複合体（ＨＬＡクラスIおよびII）の分子によって提示される、オリゴペプチドをＣＴＬは認識する。

１つの特定アプローチは具体的な活性的免疫療法に代表され、該療法は腫瘍細胞上のＴＡＡに対する患者の免疫系を感作し、長期免疫を誘導するものである。従って、免疫療法の文脈上、ワクチンはそれぞれのＴＡＡを有する患者に適用する。これまで癌免疫療法のアプローチは、腫瘍組織に通常発現し、ここから集団に最も高頻度で発生するそれらのＨＬＡ対立遺伝子によりペプチドが提示される分化抗原および癌／生殖細胞系抗原（Ｃ／Ｇ抗原）のカテゴリーから２、３種のＴＡＡを使用することに限られていた。そのため研究対象の患者らがワクチン接種抗原に対する免疫応答を通常起こし得るか否かは分析しなかった（Rosenbergら、Nat. Med. 10: 909, 2004）。ＴＡＡ由来候補ペプチドに対する反応性についての末梢血リンパ球の発展試験により、肺癌患者および消化管腫瘍患者のＴＡＡ由来ペプチドでワクチン接種を個別化することが日本の研究グループにより試みられた。反応性が示されたペプチドのみワクチン接種に使用した（Mineら、Cancer Sci. 94: 548, 2003; Satoら、Cancer Sci. 94: 802, 2003）。ＴＡＡ由来候補ペプチドの選択はＨＬＡ‐Ａ２‐およびＨＬＡ‐Ａ２４‐結合ペプチドに限定されていた。実際、これらはアジア人集団群において最も高頻度で発生するＨＬＡ対立遺伝子であるが、それゆえにＨＬＡ‐Ａ２およびＨＬＡ‐Ａ２４陽性患者にしか利用できない。別のＨＬＡ対立遺伝子によって提示される同一のＴＡＡ由来のペプチドに対するＴ細胞応答は該方法では包含され得ない。さらに、該方法は候補ペプチドで患者の末梢Ｔ細胞を刺激することに基づいていた。一方、それらの方法は明らかにペプチド特異性Ｔ細胞を増殖させるが、該Ｔ細胞は腫瘍細胞を認識しないことが多いと示唆する研究もある。このことは、腫瘍細胞がＴＡＡ由来ペプチドを処理および提示しないという事実、あるいはＴ細胞が、刺激に使用される高ペプチド濃度にのみ反応し、腫瘍細胞に自然に提示される非常に低濃度のペプチドには反応しないという事実のいずれかに基づいている。

他のグループは、遺伝子の全体的な発現の差異、および腎摘出術後の腎癌患者におけるＭＨＣクラスIペプチドの提示の差異に関して、正常腎組織を腫瘍組織と比較した。「遺伝子プロファイリング」分析により、腫瘍特異的に発現した、または過剰発現した遺伝子が同定された。生化学的に精製されたＨＬＡペプチドの質量分析により、腫瘍特異性タンパク質または過剰発現タンパク質の天然ＨＬＡリガンドが単離された（Weinschenkら、Cancer Res. 62: 5818, 2002）。腫瘍組織と正常組織の天然ＨＬＡペプチドリガンドの比較「遺伝子プロファイリング」および比較分析には両組織が大量に必要である。従ってこの方法は数種の腫瘍、および進行性腫瘍性疾患にのみ適している。上述の論文の著者らは、実際の総説において、彼らの方法の感受性は、最大４%の天然ＨＬＡ‐リガンドを組織試料から同定できると推定している（Rammensee, Immunology and Cell Biology 84: 290, 2006）。また、この方法で同定されるペプチドのごくわずかしか、十分と思われる腫瘍特異性を実際に有しておらず、これらのペプチドがＴ細胞応答を誘発できるか否かは明らかではない。個々の特異的癌免疫療法のさらなる可能性は、患者自身の腫瘍細胞、または例えば熱ショックタンパク質／ペプチド複合体などの腫瘍細胞の生成物を用いて患者にワクチン接種することである（Srivastava, Curr. Opin Immunol. 18: 201, 2006）。腫瘍細胞は単独で、または樹状細胞と混合して注入可能である（O'Rourkeら、Cancer Immunol. Immunother. 52: 387, 2003）。さらに、遺伝子療法により適用するに先だって腫瘍細胞の免疫原性をより高め得る可能性が存在する。腫瘍細胞を単独で、または混合体で、またはＴＡＡペプチドをそれぞれ結合させた樹状細胞もしくは腫瘍熱ショックタンパク質に融合させて免疫化を行うことはワクチン調製に大量の腫瘍物質を必要とする。臨床ルーチンでは、このことがこのような戦略の制限要因になっていることが多い。それらが即時に数種のＴＡＡを発現することが癌の多くのタイプで示された。例えば、４０%の乳房腫瘍、６５%の悪性メラノーマおよび３７〜５７%の肺腫瘍において、数種のＣ／Ｇ抗原の同時発現が存在し得る（Simpsonら、Nat. Rev. Cancer 5: 615, 2005）。悪性メラノーマの場合、９０%を超える腫瘍が分化抗原を付加的に発現する（Boonら、Ann. Rev. Immunol. 24: 175, 2006）。従って一般的に、癌患者における腫瘍‐宿主相互作用の個々の性質を考慮しているワクチン接種研究はわずかしかない。

DE 10 2005 041 616には、ＣＤ８陽性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によりペプチド抗原として認識され、腫瘍細胞のＣＴＬ誘導溶解および／またはアポトーシスを引き起こす特定のメラノーマ関連オリゴペプチドが記述されている。さらに、本発明は癌治療におけるこれらのメラノーマ関連オリゴペプチドの使用に関連する。

DE 10 2005 013 846には、腫瘍に関連して発現した抗原およびこれらをコードする核酸を同定および提供するための戦略が記述されている。この戦略は、細胞表面に接触できる、潜在的癌特異性抗原に関する観点でのヒトタンパク質の分析および核酸データベースに基づいている。データマイニングにより、初めに、できる限り完全に既知の遺伝子すべてのリストを作成し、遺伝子からｍＲＮＡ、ｍＲＮＡからタンパク質といった基本原理に従って１つ以上の膜貫通ドメインの有無について試験する。この後、ホモロジー検索をし、検索でヒットしたものを組織特異的群（とりわけ腫瘍組織）に分類し、ｍＲＮＡの実在について調べる。最後に、このように同定されたタンパク質を、例えば発現分析およびタンパク質化学法により腫瘍中の異常な活性化について評価する。

患者の免疫系の選択的標的抗原についての知識は、効果的な治療ワクチン接種に使用可能な患者に合わせて作成するＴＡＡワクチンの生成をもたらし得る。従って本発明の目的は、個々の患者の末梢血からの腫瘍特異性Ｔ細胞応答およびその標的抗原を同定する方法を提供することである。この方法に基づいて、本発明の有利な実施態様もさらに提供する。

DE 10 2005 041 616 DE 10 2005 013 846

Rosenbergら、Nat. Med. 10: 909, 2004 Mineら、Cancer Sci. 94: 548, 2003 Satoら、Cancer Sci. 94: 802, 2003 Weinschenkら、Cancer Res. 62: 5818, 2002 Rammensee, Immunology and Cell Biology 84: 290, 2006 Srivastava, Curr. Opin Immunol. 18: 201, 2006 O'Rourkeら、Cancer Immunol. Immunother. 52: 387, 2003 Simpsonら、Nat. Rev. Cancer 5: 615, 2005 Boonら、Ann. Rev. Immunol. 24: 175, 2006

本発明の第１の態様では、Ｔ細胞免疫原性である腫瘍患者のそれらのＴＡＡを同定する方法により本課題は解決され、前記方法には、ａ）少なくとも１人の腫瘍患者の血液由来Ｔ細胞を準備する工程、ｂ）腫瘍患者にとって自己由来であり、かつＴ細胞免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する、樹状細胞（ＤＣ）および／またはＢリンパ球（ＢＬＣ）を準備する工程であって、該ＤＣおよびＢＬＣがＴ細胞免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする複数のｍＲＮＡの中から選択したものであらかじめトランスフェクトされた工程、ｃ）Ｔ細胞をＤＣおよび／またはＢＬＣと接触させる工程、ｄ）ＤＣおよび／またはＢＬＣの抗原を認識するそれらのＴ細胞を同定する工程、およびｅ）ＤＣおよび／またはＢＬＣの抗原を認識するそれらのＴ細胞に基づいて、少なくとも１人の腫瘍患者の抗原発現様式を同定する工程が含まれる。

MitchellおよびNair（MitchellおよびNair, RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J Clin Invest. 2000 Nov;106(9):1065-9）ならびにNair ら（Induction of tumour-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumour RNA-transfected dendritic cells. Ann Surg. 2002 Apr;235(4):540-9.）は腫瘍細胞の代用物として腫瘍（‐全体）‐ｍＲＮＡ（「腫瘍細胞の抗原性内容物をコードするｍＲＮＡ」）でトランスフェクトした樹状細胞を使用する可能性についてふれている。ワクチン接種、生じたＴ細胞応答のモニタリング、および新たなＴＡＡの同定にこれらの腫瘍細胞同等物を使用する。腫瘍患者のＴ細胞をエキソビボで刺激するため、ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣにより同一の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を使用する場合を除いて、本発明には公開されたこの方法と共通するところはない。転移悪性腫瘍の患者が血液中に抗腫瘍Ｔ細胞応答を示すことは一連の患者モデルから公知である。これらのＴ細胞は大抵、腫瘍により発現されたＴＡＡのうち非常に限られたサブセットしか認識せず、実際のペプチドエピトープおよびこれらのペプチドを認識するＨＬＡ対立遺伝子の観点では、認識は非常に個別特異的である。

最先端技術の方法（上述のMitchellおよびNairに記述したものも含む）の多くが、腫瘍に特異的に発現し、その後癌免疫療法にとって潜在的標的として働く、遺伝子の同定に関している。それにもかかわらず、腫瘍抗原の発現はそれが免疫原性でもあるということを意味するものではない。発現に加えて、その免疫原性は、ペプチドが前記ＴＡＡタンパク質から処理され各々の患者の個々のＨＬＡ分子に結合し得るか否か、ならびに患者のＴ細胞受容体がＨＬＡペプチド複合体を認識し得るか否かという事項に決定的に従属する。このことから当然に、少なくとも数十の（現在公知の）潜在的免疫原性ＴＡＡから、個々のＴＡＡ由来のほんの少数のペプチドのみしか実際に個々の患者のＴ細胞応答を誘起しないが、このことは不十分にしか予測できないということになる。この問題の解決策として、本発明は本発明にしたがった刺激および試験アッセイを提供する。それは腫瘍細胞との相互作用を介して患者に生じ、活性化され得るそれらのＴ細胞応答を同定する。反応性はその後に行われるＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、抗原接触に対するサイトカイン放出により確認する。その後、続いて検出可能Ｔ細胞応答がワクチン接種により特異的に増幅され得る。

このことによって、これまで行ってきたすべてのワクチン接種研究と比較して本質的差異が示される。これらワクチン接種研究は「所望の抗原」に対するそれぞれの応答の増幅および生成をターゲットにしたものであり、それぞれの腫瘍中で発現はその所望の抗原に対して実際に与えられたが、その所望の抗原がすべてワクチンを接種した患者に免疫原性であったか否かの証拠は無かった。上記の方法と対照的に、本発明にしたがった本方法は患者からの腫瘍細胞の生成には全く依存していない。

本発明にしたがった方法がＤＣおよび／またはＢＬＣの抗原を認識するＴ細胞の増殖をさらに含むことが好ましい。本発明にしたがった方法がＴＡＡに対するＴ細胞の反応性についての対照アッセイをさらに含むことが、なお一層好ましい。それぞれの方法は当業者に公知であり、以下の実施例に例示的に記述されている（例えばＩＦＮ‐ｇ‐ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）。本発明にしたがったなお一層好ましい方法は、認識されたものとしてＴＡＡを提示する再連結ＨＬＡ対立遺伝子の検出をさらに含む。好ましいＨＬＡ対立遺伝子はＣｗ１６；Ｃｗ６；Ｃｗ７；Ｃｗ２；Ｃｗ３；ＤＰ４；ＤＲ１；ＤＲ２；ＤＲ３；ＤＲ４；ＤＲ７；ＤＲ１１；ＤＲ１２；ＤＲ１３；ＤＲ１５；ＤＲ８；ＤＲ５２；Ａ１；Ａ２；Ａ３；Ａ２９；Ａ２４；Ａ３１；Ａ３４；Ｂ７；Ｂ１３；Ｂ１５；Ｂ３５；Ｂ３７；Ｂ５１；Ｂ５３；Ｂ５７；Ｂ３７；Ｂ１８；Ｂ４０；Ｂ４４；Ｂ５２；ＤＱ６；ＤＰ４；ＤＰ１；ＤＰ１０；およびＡ６８から選択される。それぞれの方法は当業者に公知であり、以下の実施例に例示的に記述されている。本発明にしたがった方法には利点がいくつかある：初期の方法と対照的に、本方法は、腫瘍特異性Ｔ細胞の増殖に初期に必要とされた安定的な腫瘍細胞系の生成には依存していない。その代わり、Ｔ細胞免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする複数のｍＲＮＡの中から選択したもの（「パネル」）であらかじめトランスフェクトしてある、好ましくは自己由来の樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球（ＢＬＣ）により、腫瘍患者の末梢血液由来細胞を刺激する。パネルはいくつかのカテゴリーの複数の抗原、特に、分化および癌／生殖細胞系タイプの抗原を含む。本発明の文脈では、短期刺激プロトコールにおいて、腫瘍患者の末梢血液由来Ｔ細胞は３５種以下の免疫原性ＴＡＡと個々に合わさって増殖した。それぞれの患者の樹状細胞またはＢ細胞を、抗原コードｍＲＮＡが付された抗原提示細胞として使用した。これらの刺激反応のレスポンダーリンパ球をこれらＴＡＡの認識について試験し、それらのＨＬＡ制限要素を測定した。

自己由来の腫瘍細胞の利便性に依存することなく、刺激および反応性アッセイにより抗腫瘍Ｔ細胞の標的抗原の個々のスペクトルを同定することが可能になる。これまでこれらの試験は少数の患者モデルでしか可能でなかった。それらのモデルでは、腫瘍反応性Ｔ細胞の刺激および増殖にその後使用されるそれぞれの腫瘍から安定増殖細胞系が確立され得る。このパネル由来のそれぞれの抗原を認識するＴ細胞を増殖することが好ましく、例えば本発明にしたがった付加的方法に、および／または薬剤療法に使用可能である。予想どおり、Ｔ細胞の認識パターンはほとんど個々の患者に特異的であり；個々の反応パターンは、個々の腫瘍の抗原発現パターン、個々のＨＬＡ表現型、およびそれぞれのＨＬＡ‐ペプチド複合体に対する抗原特異的応答を生じさせるための個々のＴ細胞レパートリーの能力によって左右される。本明細書に記述されているその後の反応アッセイにおいては、刺激抗原に対するＴ細胞の反応性が確認可能であり、認識されたものとしてＴＡＡペプチドを提示する再連結ＨＬＡ対立遺伝子が検出できた。

本発明にしたがった方法のさらなる態様では、Ｔ細胞は腫瘍患者の末梢血液から単離する。しかしＴ細胞の他の一般的な採取源もまた使用可能である。

本発明にしたがった好ましい、方法では、ＤＣまたはＢＬＣにトランスフェクトしたｍＲＮＡはいくつかのカテゴリーの抗原、すなわち分化抗原、Ｃ／Ｇ抗原、突然変異抗原および過剰発現抗原から選択される。本発明者らは抗原型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を選択した。ｍＲＮＡは多種の細胞の一時的なトランスフェクションに適しており、完全長の抗原をコードし、よって可能性あるエピトープの全体を包含している。初期のいくつかの研究では、Ｔ細胞応答の検出に対するｍＲＮＡトランスフェクトＤＣの適合性が分析された（Brittenら、J Immunol Methods 287:125, 2004; Brittenら、Immunol Methods 299:165, 2005）。計画した試験では、インビトロ転写（ＩＶＴ）ＴＡＡコードｍＲＮＡを、それぞれの患者の末梢血液由来ｍＤＣにトランスフェクトする。その後ＲＮＡトランスフェクトＤＣは刺激細胞として、ＴＡＡ反応性Ｔ細胞の増殖に役立つであろう。

それらの発現パターンに基づいて、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）はいくつかのカテゴリーに分類できる（これに関してはhttp://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htmも参照）：
ａ）分化抗原は、それらが生成される組織タイプの腫瘍および細胞にのみ発現する。例えば、悪性メラノーマ（ＭＭ）の分化抗原はチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質‐２（ＴＲＰ‐２）、ｇｐ１００およびｍｅｌａｎ‐Ａ／ＭＡＲＴ‐１などのメラニン細胞特異性タンパク質である。
ｂ）配偶子およびトロホブラスト細胞とは別に、「癌／生殖細胞系」抗原（Ｃ／Ｇ抗原、「共通して腫瘍特異的」）は他の分化組織のいずれにも発現しない。悪性形質転換に起因する後成的変化は癌細胞にＣ／Ｇ抗原の異常な発現を招く。ほとんどの腫瘍細胞はいくつかのＣ／Ｇ抗原を同時に発現し、それらの発現は腫瘍進行の過程で維持される。また、Ｃ／Ｇ抗原はいくつかの組織構造の多数の腫瘍で発現する。
ｃ）「ミスセンス」点突然変異のある抗原、および遺伝子断片の腫瘍特異的転座を経て生成される融合タンパク質は突然変異した抗原のカテゴリーに分類される。ごく小数の例外は別として、現在まで公知である点突然変異抗原は、それらが発見された個々の腫瘍に特異的である。対照的に、例えば（慢性骨髄性白血病の）ＢＣＲ／ＡＢＬなどの悪性腫瘍特異性融合タンパク質は血液癌性疾患に通常存在する。
ｄ）ＴＡＡの第４のカテゴリーとして、過剰発現抗原は腫瘍に存在し得る。これらは分化正常組織の細胞中で厳密に調整されて発現するタンパク質を含む。なぜなら、これらの多くが増殖、細胞周期、アポトーシス等の機能を自身で調整するからである。

チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質‐２（ＴＲＰ‐２）、ｇｐ１００およびｍｅｌａｎ‐Ａ／ＭＡＲＴ‐１などのメラニン細胞特異性タンパク質、またはＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥなどのＣ／Ｇ抗原から分化抗原が選択される本発明にしたがった方法が好ましい（これに関しては、図１も参照）。融合タンパク質、例えばＢＣＲ／ＡＢＬおよび他の公知の癌関連融合物から突然変異抗原が選択される本発明にしたがった方法がさらに好ましい。本発明にしたがった方法のさらなる態様では、上記の方法に基づいて、腫瘍患者のＴ細胞による個別のＴＡＡ認識パターンが同定される。本発明に従って、この個々の抗原発現パターンは、患者に特異的な（「個別の」）腫瘍ワクチンの生成に不可欠な主成分として働く。そのようなワクチンは、特定の腫瘍に罹患している腫瘍患者群から本発明に従って同定される抗原発現パターンに対しても生成可能である。従って、ある患者群では腫瘍の特定のタイプが選択的に治療可能となる。例えば、腎臓、乳房、膵臓、胃、精巣、前立腺、結腸および／または皮膚癌の腫瘍が好適な群とされる。

本発明のさらなる態様では、提示されたＴ細胞刺激アッセイにより、多人数の患者群において自己由来の抗腫瘍Ｔ細胞によって認識され得る構造的正常（「共通の」）抗原が検出可能となる。従って、個々のＨＬＡ対立遺伝子全体を考慮し、確定したＴＡＡの広範なスペクトルに対して試験を行う。これを介してのみ、これら抗原の十分な潜在力が活用される。患者の免疫系の選択的標的抗原についての知識によって、患者に対する治療的ワクチン接種に使用可能な、個々に合わせて作成するＴＡＡワクチンの生成が可能になり得た。それゆえ、腫瘍が構造的に正常な（「共通の」）ＴＡＡを発現する腫瘍患者群の抗原発現パターンが同定される本発明にしたがった方法が特に好ましい。

これらのＴＡＡは用語「共通の抗原」によって分類し、その発現は組織の同じ起源の異なる腫瘍（例えばメラノーマ中の「分化抗原」）で、または異なる組織構造の腫瘍で検出された。「過剰発現抗原」およびいわゆる「癌／生殖細胞系抗原」（後者は「共通腫瘍特異的」としても指定されている）は全く異なる腫瘍に発現するＴＡＡに属す。上述したように、用語「共通の」は異なる腫瘍に共通している抗原の発現にのみ関連し、それらの免疫原性には関連していない。異なるメラノーマ患者において、それらの腫瘍が４つのカテゴリー（癌／生殖細胞系抗原、分化抗原、過剰発現抗原および突然変異抗原）すべての多数の抗原を発現することが検出された。しかし、これらのうちのほんの一部、しかも全く異なるＴＡＡだけがそれぞれの患者でＴ細胞免疫原性であった。また、Ｔ細胞応答の特異性（どのＴＡＡ由来ペプチドがどのＨＬＡ分子によって提示され、認識されるか）はそれぞれの患者に非常に特異的であった。従って、目的とする試験では、「共通の」抗原すべては潜在的に免疫原性であることから、対象となる。

本発明の意味合いにおいて特に好ましい「共通の」抗原は（括弧内に位置を示す）、ＢＡＧＥ‐１；ＧＡＧＥ‐１，２，８；ＧＡＧＥ‐３，４，５，６，７；ＧｎＴＶ（イントロン）；ＨＥＲＶ‐Ｋ‐ＭＥＬ；ＫＫ‐ＬＣ‐１；ＫＭ‐ＨＮ‐１；ＬＡＧＥ‐１；ＭＡＧＥ‐Ａ１；ＭＡＧＥ‐Ａ２；ＭＡＧＥ‐Ａ３；ＭＡＧＥ‐Ａ４；ＭＡＧＥ‐Ａ６；ＭＡＧＥ‐Ａ９；ＭＡＧＥ‐Ａ１０；ＭＡＧＥ‐Ａ１２；ＭＡＧＥ‐Ｃ２；ムチン；ＮＡ‐８８；ＮＹ‐ＥＳＯ‐１／ＬＡＧＥ‐２；ＳＡＧＥ；Ｓｐ１７；ＳＳＸ‐２、ＳＳＸ‐４；およびＴＲＰ２‐ＩＮＴ２（イントロン２）である。

本発明のさらなる態様では、それは上述した方法を含む患者の腫瘍を初めに同定する方法、および規定した腫瘍患者の抗原発現パターンに基づいて腫瘍を同定する方法に関する。本発明のさらなる態様では、それは上述した方法を含む個別の腫瘍ワクチンを生成する方法、および同定したＴＡＡ（単数）／ＴＡＡ（複数）を腫瘍ワクチン中に処方する方法に関する。本発明の別のさらなる態様では、それは上述した方法を含む個別の腫瘍治療用物質を生成する方法、および増殖させて同定した自己由来のＤＣおよび／またはＢＬＣを腫瘍治療用物質中に処方する方法に関する。原則として、免疫原性腫瘍抗原の選択から、特定の患者に免疫原性である抗原を選択的に取り除く。これらの抗原はその後それぞれの患者の治療的免疫化のための多エピトープワクチンに使用可能であることが好ましい。これらの抗原を用いた治療的ワクチン接種によって、個々のケースで免疫応答が仮にも可能であるか否かが明確ではない抗原を用いたワクチン接種よりも著しく良好な臨床成績が保証される。アッセイには腫瘍細胞は必要ないことから、そのアッセイはパネル抗原またはその一部を発現する腫瘍の患者すべてに広く利用可能である。腫瘍細胞に依存しなければ、腫瘍が臨床的にないが、腫瘍性疾患再発のリスクは高い患者にもそのアッセイが使用可能となる。特にこれらの患者は治療的ワクチン接種の理想的な対象と考えられる。

従って、治療すべき腫瘍性疾患には、例えば腎臓、乳、膵臓、胃、精巣および／または皮膚癌が含まれる。従って腫瘍性疾患の列挙は例示にすぎず、使用範囲を限定するわけではない。特定のペプチドに特異的である特別に生成されたＴ細胞は効果的かつ選択的に腫瘍細胞を死滅させ得ることは最先端技術では公知である。概して、いくつかの適用形態では腫瘍ワクチンに腫瘍関連抗原が使用可能である。このようにしてTigheら（Gene vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint, Immunol. Today 19(2):89-97, 1998）は、それぞれ好適なアジュバントもしくは担体系と結びついた組み換えタンパク質として、あるいはプラスミドベクター中で抗原をコードするｃＤＮＡとして抗原は投与可能であることを報告した。これらの場合、抗原は必ず患者の体内の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により処理され、提示され、それにより免疫応答を誘発する。Meliefら（Peptide-based cancer vaccines, Curr. Opin. Immunol. 8:651-657, 1996）はさらなる可能性、すなわち合成ペプチドをワクチンとして使用することを示した。また、（多エピトープ）ワクチンとしてＴ細胞により認識されたＴＡＡ‐ＲＮＡ（単数または複数）の投与も可能である。ＲＮＡは直接的に、またはトランスフェクトしたＤＣの形態で使用可能である。

従って、好ましい実施態様では、ＴＡＡ‐ＲＮＡまたはＴＡＡ‐ペプチドはアジュバントを添加して使用可能であるか、または単独でも使用可能である。アジュバントとして、例えば顆粒球‐マクロファージ‐コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）が使用可能である。さらにこのようなアジュバントの例には水酸化アルミニウム、例えばフロイントアジュバントなどの鉱油のエマルジョン、サポニンまたはシリコン化合物が含まれる。アジュバントと共に使用することにより、誘発された免疫応答が増幅可能になり、および／またはワクチンが安定化するという利点がもたらされる。

その付加的な態様における本発明は、同定された１種以上のＴＡＡ‐ＲＮＡまたはＴＡＡ‐ペプチドを含む医薬組成物にさらに関する。この組成物は、例えば非経口投与に、または例えば皮下、皮内もしくは筋肉内投与に、または経口投与に役立つ。従って、医薬的に許容でき、好ましくは水性である担体中にＲＮＡまたはペプチドを溶解または懸濁する。また、該組成物は例えばバッファー、結合剤、希釈剤等の賦形剤を含有することが可能である。

ＲＮＡまたはペプチドはまた、例えばサイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与が可能である。例えばA. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients、第３版、2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical pressではこのような組成物中に使用可能な助剤を包括的に示している。

従って該薬剤は腫瘍性疾患の防止、予防および／または治療に使用可能である。

従って、ペプチド（単数）またはペプチド（複数）またはＲＮＡ（単数または複数）はそれぞれ医薬組成物中に治療有効量で存在する。よって該組成物に含まれたＲＮＡによってコードされたペプチド（単数）またはペプチド（複数）は少なくとも２種の異なるタイプのＨＬＡに結合することもできる。

個別の単一のワクチンまたは治療用物質である腫瘍ワクチンまたは腫瘍治療用物質が多エピトープワクチンまたは治療用物質である本発明にしたがった方法が特に好ましい。従って腫瘍ワクチンまたは腫瘍治療用物質は、患者中の腫瘍（単数）または腫瘍（複数）と効果的に闘うことができる患者または患者群に特異的に適応しているＴＡＡまたはＴ細胞を含む。従って、腫瘍治療の個別化におけるすべての形態と同様に、個々のケースにおいて治療が成功する機会が増える。

本発明のさらなる態様では、それは、上述した方法、および同定した抗原発現パターンに基づいた腫瘍性疾患の治療、を含む腫瘍性疾患の治療法に関している。最終的に、本発明は、上述した方法、および生成した腫瘍ワクチンまたは腫瘍治療用物質に基づいた腫瘍性疾患の治療、を含む腫瘍性疾患の治療法に関している。従って治療対象の腫瘍性疾患には、上述したように例えば腎臓、乳房、膵臓、胃、精巣および／または皮膚癌が含まれる。効果的な治療および投与経路に必要な有効量は患者特異的なパラメーターに基づいて担当医が容易に決定できる。

本発明はこれから添付の実施例に基づいて以下にさらに説明するがそれらに限定されない。本明細書で引用された参考文献すべては、本発明の目的のため、全体が参照により援用される。以下に図を説明する：
患者モデルＭＺ２で同定された腫瘍関連抗原の概略図。出典参考文献：ＭＡＧＥＡ‐１：Traversari Cら、J Exp Med 1992; 176: 1453-7、van der Bruggen Pら、Eur J Immunol 1994a; 24: 2134-40；ＭＡＧＥＡ‐３ Gaugler Bら、J Exp Med 1994; 179: 921-30；ＢＡＧＥ Boel Pら、Immunity 1995; 2: 167-75；ＧＡＧＥ１，２，８ Van den Eynde Bら、J Exp Med 1995; 182: 689-98；ＧＡＧＥ３，４，５，６，７ De Backer Oら、Cancer Res 1999; 59: 3157-65；チロシナーゼ Brichard VGら、Eur J Immunol 1996; 26: 224-230およびＭＡＧＥＡ‐６ Vantomme Vら、Cancer Immun ［serial online］2003; 3: 17 刺激アッセイの図式的概略図。腫瘍細胞（図３）、非トランスフェクトＤＣ（図３）およびＴＡＡ‐ＲＮＡトランスフェクトＤＣ（図４、５）で刺激された、患者ＭＺ２のＣＤ８＋Ｔ細胞の反応分析；腫瘍細胞で刺激されたＴ細胞はＭＡＧＥ‐Ａ１／ＨＬＡ‐Ｃｗ１６トランスフェクト体のみ認識した（図３、上図）；非トランスフェクトＤＣで刺激したＴ細胞はトランスフェクト体を何ら認識しなかった（図３、下図）；ＭＡＧＥ‐Ａ１をトランスフェクトしたＤＣで刺激したＴ細胞は反応アッセイ中、ＭＡＧＥ‐Ａ１／ＨＬＡ‐Ａ１トランスフェクト体およびＭＡＧＥ‐Ａ１／ＨＬＡ‐Ｃｗ１６トランスフェクト体を認識した（図４、左上図）；ＢＡＧＥをトランスフェクトしたＤＣで刺激したＴ細胞はＢＡＧＥ／ＨＬＡ‐Ｂ４４トランスフェクト体およびＢＡＧＥ／ＨＬＡ‐Ｃｗ１６トランスフェクト体を認識した（図４、右上図）；ＧＡＧＥ‐１をトランスフェクトしたＤＣで刺激したＴ細胞はＧＡＧＥ‐１／ＨＬＡ‐Ｃｗ６トランスフェクト体を認識した（図４、下図）；他の刺激Ｔ細胞は反応アッセイ中のＴＡＡ／ＨＬＡトランスフェクト体を何ら認識しなかった（図５）。同上同上

この数年、本発明者らは、メラノーマ患者のいくつかの腫瘍モデルにおいてＴ細胞で認識されたＴＡＡを発見し、その特徴を明らかにした。これについての前提条件は、各患者の安定増殖する腫瘍細胞系、および患者の末梢血液から単離したリンパ球であった。インビトロで自己由来の腫瘍細胞系でＴ細胞を刺激することにより、本発明者らは腫瘍反応性Ｔ細胞集団およびＴ細胞クローンを生成することができた。これらはＴＡＡの同定に使用した。このことにより、ＴＡＡ／ＨＬＡを組み合わせたものの個々のスペクトルが、試験した各患者の抗腫瘍Ｔ細胞により認識されることが分かった。あらゆるケースで、分化抗原、Ｃ／Ｇ抗原ならびに突然変異抗原の新たなペプチドエピトープが認識された。例外的なケースでのみ、文献からすでに公知のペプチド／ＨＬＡ複合体が確認された。明らかに、腫瘍特異的ＴＡＡ発現パターン、個々のＨＬＡタイプ、および所与の抗原を組み合わせたものに対して反応する高度に可変なＴ細胞レパートリーの能力を組み合わせると個々に特異的な反応パターンがもたらされる。現在、非常に少数の患者のみから得られた自己由来のＴ細胞をインビトロで刺激するための腫瘍細胞系を生成することが可能であることから、これらの腫瘍‐宿主相互作用の固有性は個々の患者モデルで分析のみ可能である。しかし、刺激なしには患者血液由来の腫瘍反応性Ｔ細胞は現行の方法で検出ができない。何故なら末梢血液でのそれら頻度は非常に小さいためである。そのため本発明者らは、腫瘍患者の末梢血液由来Ｔ細胞をＴＡＡで刺激するための腫瘍細胞系の代用品を探し始めた。未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）はインビトロで末梢血液単球から生成し、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）に分化させることが可能である。ｍＤＣは効果的にＴ細胞を刺激し得る専門的抗原提示細胞である。８種（モデルＭＺ２）および１３種（Ｄ０５‐ＧＳ）のＴ細胞認識抗原が公知である２つのメラノーマモデルにおいて、本発明者らは、それぞれの抗原および対照抗原（Ｄ０５‐ＧＳ）で患者のｍＤＣをトランスフェクトし、そのトランスフェクトＤＣで患者の末梢血液由来Ｔ細胞を刺激した。本発明者らは抗原型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を選択した。ｍＲＮＡは多種の細胞の一時的なトランスフェクションに適しており、抗原を完全長でコードしており、よって可能性あるエピトープ全体を含んでいる。初期のいくつかの研究では、ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣのＴ細胞応答検出への適合性を試験した（Brittenら、J Immunol Methods 287:125, 2004; Brittenら、J Immunol Methods 299:165, 2005）。計画したアッセイでは、インビトロで転写した（ＩＶＴ）ＴＡＡをコードするｍＲＮＡはそれぞれの患者の末梢血液由来ｍＤＣにトランスフェクトするはずである。ＲＮＡトランスフェクトＤＣはＴＡＡ反応性Ｔ細胞の増殖に刺激細胞として働くことが好ましい。後者はＩＦＮ‐γ‐ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで確認すべきである。原則として刺激アッセイを利用し、抗原が部分的に発現することが公知のある種の腫瘍を有する各患者中のＴＡＡに対するＴ細胞反応性を同定することが可能である。認識した抗原をその後使用し、例えば多エピトープワクチンの形態で患者に治療的免疫化を行うことができた。

ＴＡＡをコードするｍＲＮＡを有する患者由来成熟樹状細胞の生成およびトランスフェクション：
「従来の」成熟ＤＣ（成熟ＤＣはｍＤＣ）ならびにいわゆるｆａｓｔＤＣの両方（ｍｆＤＣ；成熟短期培養ＤＣ）を使用し、ＲＮＡトランスフェクトＤＣでＴ細胞を刺激した。ｍＤＣをJonuleitら（Eur. J. Immunol. 1997; 27 (12): 3135-42）の方法に記載の患者のＰＢＭＣの単球、およびDauerら（J. Immunol. 2003; 170 (8): 4069-76）の方法に記載のｍｆＤＣから生成した。ＴＡＡ‐ＲＮＡによるトランスフェクションでは、transmessenger‐RNA‐トランスフェクション試薬（Qiagen, Hilden）を用いて、２ｘ１０^５個のＤＣを反応ごとに０．８μgのインビトロ転写ＲＮＡでトランスフェクトした。その後その細胞をインキュベーター中で３時間インキュベートした。

トランスフェクトしたＤＣによる患者のＴ細胞の刺激：
インキュベーター中で３時間インキュベートした直後、トランスフェクトしたＤＣを使用し、事前に単離した患者のＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激した。これにより２４ウェル細胞培養プレートの培養単位（ＣＵ）ごとに、１ｘ１０^５個のトランスフェクトＤＣおよび２ｘ１０^５個のＣＤ８陰性細胞（いわゆる「支持細胞」、１００グレイで照射）により１〜１．５ｘ１０^６個のＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激した。ヒト組み換えインターロイキン‐２（ＩＬ‐２；２５IU/ml）をＴ細胞成長因子として添加した。１０%のヒト血清（健常ドナーのプール血清）を追加したAIM-V培地（Invitrogen, Karlsruhe）を培地として使用した。対照実験では、自己由来のメラノーマ細胞（１ｘ１０^５）ならびに非トランスフェクトＤＣでＴ細胞を刺激した。実験開始後７日目に、同じプロトコールに従ってＴ細胞を再度刺激し、その後の４〜５日目にＴＡＡの認識について分析した。

刺激に使用したＴＡＡに対するＴ細胞の反応性の判定：
実験の１１日目または１２日目にＣＤ８^＋Ｔ細胞を、刺激ＴＡＡに対するそれらの反応性および認識におけるＨＬＡ制限について試験した。例えばＤＣに対する自己反応性Ｔ細胞の非特異的反応性を排除するため、反応アッセイ用の抗原提示細胞として２９３Ｔ細胞またはＣＯＳ７細胞を使用した。これらはＴＡＡをコードするｃＤＮＡを含む真核細胞発現ベクターでトランスフェクトした。個々の反応中、各ＴＡＡ‐ｃＤＮＡは患者の各ＨＬＡ対立遺伝子のｃＤＮＡで同時トランスフェクトし、２４時間後、ＩＦＮ‐γ‐ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＴ細胞によるトランスフェクト体の認識を試験した。トランスフェクションのためLipofectamine 2000（Invitrogen, Karlsruhe）を使用した。Lennerzら（PNAS 2005; 102 (44): 16013-16018）が報告したプロトコールに従ってアッセイを行った。提示した方法を２つの良好に特徴付けた患者モデルで試験した：

Ｉ：モデルＭＺ２‐ＭＥＬ
初期に、８種のＴ細胞認識ＴＡＡ／ＨＬＡを組み合わせたものをモデルＭＺ２で同定した（図１）：ＭＡＧＥ‐Ａ１／ＨＬＡ‐Ａ１（Traversari C.ら、J. Exp. Med. 1992; 176: 1453-7）、ＭＡＧＥ‐Ａ３／ＨＬＡ‐Ａ１（Gaugler B.ら、J. Exp. Med. 1994; 179: 921-30）、ＭＡＧＥ‐Ａ１／ＨＬＡ‐Ｃｗ１６（van der Bruggen P.ら、Eur. J. Immunol. 1994a; 24: 2134-4）、ＢＡＧＥ‐１／ＨＬＡ‐Ｃｗ１６（Boel P.ら、Immunity 1995; 2: 167-75）、ＧＡＧＥ‐１，２，８／ＨＬＡ‐Ｃｗ６（Van den Eynde B.ら、J. Exp. Med. 1995; 182: 689-98）、チロシナーゼ／ＨＬＡ‐Ｂ４４（Brichard V.G.ら、Eur. J. Immunol. 1996; 26: 224-230）、ＧＡＧＥ‐３，４，５，６，７／ＨＬＡ‐Ａ２９（De Backer O.ら、Cancer Res. 1999; 59: 3157-65）、およびＭＡＧＥ‐Ａ６／ＨＬＡ‐Ｃｗ１６（Vantomme V.ら、Cancer Immun. ［serial online］2003; 3: 17）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を患者のＰＢＭＣから単離し、上述の方法に従って各々８種のＴＡＡでトランスフェクトしたＤＣで刺激した（図２）。次の反応アッセイでは、４／８Ｔ細胞特異性が検出できた（図４〜５）。また、未だ発見されていなかったある種のＴＡＡが同定された：ＢＡＧＥ‐１／ＨＬＡＢ４４（図４）。非トランスフェクトＤＣならびに自己由来のメラノーマ細胞でもＴ細胞を同時に刺激した。しかし非トランスフェクトＤＣによる刺激ではＴＡＡ特異的Ｔ細胞応答は増幅せず、メラノーマ細胞による刺激ではＲＮＡ‐ＤＣによる刺激と同一のＴＡＡスペクトルが認識された。

ＩＩ：モデルＤ０５‐ＧＳ
刺激アッセイ時、このモデルで１６種のＴ細胞認識ＴＡＡが同定された。上述の方法から転用して、実験では、事前に単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞の代わりにＰＢＭＣを使用した。このこと以外では上述のプロトコールに従って実験を行った：一定量のＰＢＭＣ（１．２ｘ１０^６／反応）を、各ＴＡＡ‐ＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣ、ならびに非トランスフェクトＤＣ、およびメラノーマ細胞で刺激した。７日目に再度刺激した後、１２日目に反応アッセイにてＴ細胞を使用した。メラノーマ細胞で刺激したＴ細胞は１６種の公知の抗原中、１１種を認識した。非トランスフェクトＤＣで刺激したＴ細胞は抗原を全く認識しなかった。このことから非特異的ＴＡＡ反応性は生じないことが分かる。ＴＡＡ‐ＲＮＡ刺激Ｔ細胞により４つの公知の反応性が再度認識された。また、ある種の特異性が新たに発見され（ＭＡＧＥ‐Ｃ２／ＨＬＡ‐Ａ２）、この特異性は、追加実験で分かるように、腫瘍クローンはＭＡＧＥ‐Ｃ２を発現しないためメラノーマ刺激アプローチで使用された腫瘍細胞クローン（クローン６）による刺激で検出できた。しかし、クローン６が単離され、患者Ｄ０５‐ＧＳにワクチン接種するために長年使用されたメラノーマ細胞系にＭＡＧＥ‐Ｃ２は発現する。このことにより、患者の末梢血液のＭＡＧＥ‐Ｃ２反応性Ｔ細胞の存在が明らかになり得る。これらＴ細胞がＭＡＧＥ‐Ｃ２‐ＲＮＡトランスフェクトＤＣによる刺激を経て検出され得るという事実により、刺激アッセイの効率および特異性が明確に示されている。

Claims

腫瘍患者の抗腫瘍Ｔ細胞の選択的標的抗原を同定する方法であって：
ａ）少なくとも１人の腫瘍患者の血液から得られたＴ細胞を準備する工程であって、該Ｔ細胞は腫瘍細胞系とのインビトロでの接触により刺激をされてないものであり、
ｂ）前記腫瘍患者から得られた自己由来のＴ細胞免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する、樹状細胞（ＤＣ）および／またはＢリンパ球（ＢＬＣ）を準備する工程であって、前記ＤＣおよびＢＬＣはＴＡＡをコードする複数のｍＲＮＡの中から選択したものであらかじめトランスフェクトされたものであり、
ｃ）前記ａ）のＴ細胞を前記ｂ）のＤＣおよび／またはＢＬＣと接触させる工程、および
ｄ）前記ＴＡＡがトランスフェクトされたＤＣおよび／またはＢＬＣにおいて、Ｔ細胞によって認識されたＴＡＡを同定する工程
を含む方法。
ＤＣおよび／またはＢＬＣの抗原を認識するＴ細胞を増殖させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
ＤＣおよび／またはＢＬＣの抗原を認識するＴ細胞に基づいて、少なくとも１人の腫瘍患者の抗腫瘍Ｔ細胞の選択的標的抗原を同定する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
ＴＡＡに対するＴ細胞の反応性についての対照アッセイをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
認識されたＴＡＡが提示されるための再連結ＨＬＡ対立遺伝子を判定する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
Ｔ細胞が腫瘍患者から得られた末梢血液から単離されたものである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
ｍＲＮＡがいくつかのカテゴリーの抗原、分化抗原、Ｃ／Ｇ抗原、突然変異抗原および過剰発現抗原から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
抗原がチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質‐２（ＴＲＰ‐２）、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびｍｅｌａｎ‐ＮＭＡＲＴ‐Ｉなどのメラニン細胞特異性タンパク質またはＣ／Ｇタンパク質から選択される、請求項７に記載の方法。
突然変異抗原が融合タンパク質から選択される、請求項７に記載の方法。
腫瘍患者の個々の抗原発現パターンが同定される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
特定の腫瘍に罹患している腫瘍患者群の抗原発現パターンが同定される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
検出された腫瘍が悪性メラノーマである、請求項１１に記載の方法。
構造的に正常なＴＡＡもしくは共通のＴＡＡを発現する腫瘍患者群の抗原発現パターンが同定される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
請求項１〜９のいずれかに記載の方法、および同定された腫瘍患者群の抗原発現パターンを腫瘍の診断の材料とする工程、を含む患者の腫瘍の診断材料を提供する方法。