JP5404630B2 - ゾル−ゲル相可逆的ヒドロゲルテンプレート及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒドロゲルテンプレート、及び薬剤学的活性成分及び診断剤を含むナノ/マイクロ構造物を加工するためのヒドロゲルテンプレートの用途に関するものである。
シリコンウエハーマスターテンプレートは、確立されている後述の技術によって加工される。清潔で酸化された(5000Å)ケイ素(Si)ウエハー上にフォトレジスト(ポジティブ、AZ−1518)をスピンコーターで塗布する。ポジティブフォトレジスト工程後に、Siウエハーは、二酸化ケイ素をエッチングするために緩衝されたフッ化水素酸溶液に挿入される。フォトレジストを除去した後、ウエハーは、シリコンをエッチングするためにテトラメチルアンモニウムヒドロキシドに浸漬される。エッチングされたSiウエハーマスターテンプレートは、その後の工程で使用される。Siウエハー上にエッチングされた孔の規模は、異なる直径及び深さの孔を得るために変更される。孔の規模だけでなく、形状も多様にすることができる。円形、三角形、四角形、及び星形などの多様な形状は、形状に基づく差が重要な部分に適用する際に非常に有用である。
多様な大きさ及び形状(例えば円形、棒形、ダイヤモンド形、及び三角形)のフォトリソグラフィーマスクは、オートキャド2007プログラムで設計し、TRエレクトロマスクXX251機械で製造される。1μmの厚さのSiO2層(University Wafer)で覆われた4″のシリコンウエハーがヘキサメチルジシラジン(Mallinckrodt)で3,500rpmの速度で30秒間スピンコーティングされる(Specialty coating systemsのP6708 spin coater)。その後、シリコンウエハーは、均一な10μmの厚さのフォトレジスト膜を形成するためにフォトレジストAZ9260(Microchemicals GmbH)で1000rpmの速度で30秒間スピンコーティングされる。その後、ウエハーは、溶媒及び水分を除去するために90℃で10分間軽く焼成される。フォトレジストが塗布されたシリコンウエハーは、マスクアライナ(Karl Suss MJB−3)を使用してUV光(23mW/cm2)に26秒間露出され、続いてAZ400K現像液(Microchemicals GmbH)で2分間連続的に攪拌されて現像される。現像されたシリコンウエハーは水で洗浄され、窒素ガスによって乾燥される。
UVフォトリソグラフィーは1μmの大きさの解像度の制限があるため、1μm未満の構造物のナノ加工には有用でない。反面、電子ビームリソグラフィーは解像度の範囲が1μmから10nmの間である。電子ビームリソグラフィーは、非常に高い解像度で非常に精密な特性を記録することができる非常に高度に集束された電子ビームを算出するために、高電力電子ビームを使用する。電子ビームリソグラフィーを使用したシリコンマスターテンプレートの加工のために、後述の工程が使用される。1μmの厚さのSiO2層(University Wafer)で覆われた3″のシリコンウエハーが3,500rpmの速度で30秒間スピンコーターを使用して厚さが300nmの層のポリ(メチルメタクリレート(PMMA、Microchem)フォトレジストにスピンコーティングされる。コーティングされたPMMAフォトレジスト層は、ライカVB6超高解像度(Leica VB−6 Ultra−High Resolution)、超広角フィールド電子ビームリソグラフィーツール(Extra−Wide Field Electron Beam Lithography Tool)(100KV、伝送率25MHz、電流5nAで作動)を使用して、予めプログラムされたパターンで電子ビームに露出される。電子ビームリソグラフィー後に、シリコンウエハーは、3:1の混合比でイソプロパノール:メチルイソブチルケトンが混合された溶液内で現像される。5nmのCr(クロム)及び20nmのAu(金)がバリアン(Varian)電子ビーム蒸発器を使用して前記パターン上に塗布され、続いて還流アセトンによって残っているPMMA膜を除去する。前記パターンは、反応性イオンエッチング方法(STS Reactive Ion Etch(RIE) Systems)によって下部のシリコンオキシドに移動する。シリコンマスターテンプレートは、パターンの大きさ、形状、及び無欠性をテストするために、電界放出走査電子顕微鏡(FESEM、Hitachi S−4800)で検査する。
本発明の重要な様態は、マイクロ構造物を製造するためのゾル−ゲル相可逆的ヒドロゲルテンプレートを活用することである。製造されたマイクロ構造物の容易な獲得のためのヒドロゲルテンプレートの製造の概括的な工程が図1に模式的に例示される。A〜F段階は、ヒドロゲルテンプレートを使用してマスターテンプレートからマイクロ粒子をマイクロ加工する工程を示す:(A)シリコンウエハーマスターテンプレート上にパターンが形成される;(B)ヒドロゲルインプリントを形成するために、ゼラチン溶液をマスターテンプレートの上部に位置させ、温度を低くする。(ゾルからゲルへ相転移が起こる);(C)ゼラチン層が固形化された後で空洞を露出させ、ゼラチン鋳型が剥がされる;(D)ヒドロゲル鋳型内の空洞がブレード(blade)で薬物/PLGA溶液またはペーストを塗抹して充填される;(E)恒温水槽内で温度を上昇させることによってゼラチン鋳型が溶解する(ゲルからゾルへ相転移が起こる);そして(F)遠心分離によって各々の粒子が収集される。
蛋白質薬物、酵素、DNA、及びsiRNAなどの親水性巨大分子薬物を含むマイクロ構造物の大量生産は、前記生体分子が例えば高温または有機溶媒に長期間露出されるなどの製造条件に高度に敏感であるため、非常に難しい。本ヒドロゲルテンプレート戦略は、精密で完璧にこのような争点に対応し、敏感な生体分子のマイクロ粒子の大量生産のために、それらを変性させずにそのまま使用することができる。ヒドロゲル形成ゼラチン溶液に何らかの無機塩、合成重合体、または生体分子を微量添加することによって、特定のマイクロ粒子の生産要求に適合するようにゼラチンテンプレートの融点を調節することができる。さらに、粒子収得段階は、水または水性緩衝溶液で行われるので、マイクロ粒子内の敏感な生体分子の変性を最小化または防止して、生物学的活性を保有することができる。ヒドロゲル形成溶液に他の物質を微量添加することによって、ゼラチンヒドロゲルテンプレートの融点を低くすることができる。したがって、無機塩(LiCl、NaCl、KCl、CaCl2、及びMgCl2など)、合成重合体(PVA、PEG、ポリエチレンイミン、及びポリ(アクリル酸)など)、並びに生体分子(ウシ血清アルブミン及びヒスチジンなど)は、下記の例に示されたようにゼラチンテンプレートの融点を低くすることができる。
薬物伝達適用に対するマイクロ加工技術の成功的な転換は、温和な工程条件のみを利用し、生体に適した物質を使用して、スケールアップ生産のために十分に簡単な新たな方法の開発を必要とする。前記方法は、また、薬物積載効率が高くなければならず、薬物放出特性を調節する能力がなければならない。生理活性剤は、約1乃至80wt%、好ましくは約5乃至50wt%の範囲内でマイクロ粒子内に積載される。本発明は、予め定められた大きさ及び形状の重合体マイクロ構造物の加工のために、予想外に簡単で安価で効果的なヒドロゲルテンプレート戦略を提供する。ヒドロゲル形成物質は、均一な大きさ及び形状の各々のマイクロ構造物の加工のためのインプリントされたテンプレートの製造に初めて使用された。
一般的なヒドロゲルテンプレートの加工において、ゼラチン(電気泳動タイプ1のために豚の皮膚から得たもの、300 Bloom、Sigma)30gを総量100mlの超純水(nanopure water)(150ml Pyrex瓶に入ったもの)に溶解して、ゼラチン溶液(30重量%)を製造して完全に混合した。蒸発を防止するために前記瓶を覆って、2時間または透明な溶液が形成されるまで65℃のオーブンにおいた。透明なゼラチン溶液は、ヒドロゲルテンプレートを製造するのに使用された。この温かくて透明なゼラチン溶液(10ml)をピペットで50μmの直径及び50μmの高さの円形ピラーを含むマイクロ加工されたシリコンウエハー(3″直径)上に移動させた(図1A)。ゼラチン溶液は、ウエハーを完全に覆う薄膜を形成するために均等に塗り広げた。このゼラチン膜を含むシリコンウエハーは、冷却装置内におくことによって5分間4℃で冷却した。冷却は、弾性があって機械的に剛健なゼラチンテンプレートの形成をもたらした。冷却後に、ゼラチンヒドロゲルテンプレートをシリコンウエハーから剥がした(図1B)。3″の直径のヒドロゲルテンプレートは、50μmの直径及び50μmの深さの円形ウェルを含む。ゼラチンヒドロゲルテンプレートの構造の健全性を糾明するために、ゼラチンヒドロゲルテンプレートを明視野反射顕微鏡下で測定した(図1C)。それによって、製造されたゼラチンヒドロゲルテンプレートは45℃で溶解する。
2gのPLGAを10mlのジクロロメタンに溶解して、20%のPLGA(MW 60,000;IV 0.8、Birmingham Polymers)溶液を製造した。50μmの直径及び50μmの深さの円形ウェルを含む3″直径のヒドロゲルテンプレート上に、20%のPLGA溶液200μlをピペットを使用して移動させた。前記PLGA溶液を45°の角度でかみそりで削って、ヒドロゲルテンプレート上に均等に塗り広げた。PLGA溶液がヒドロゲルテンプレートを変形させずに完全にウェルを充填させるように力を加えるために、軽い圧力を加えた(図1D)。かみそりで削るのは、ヒドロゲルテンプレートの表面上へのPLGA膜の形成を最小化するためである。PLGA溶液で円形のウェルが完全に充填されたもの及び分離されたマイクロ粒子を明視野及び蛍光顕微鏡(Olympus BX51 Microscope)下で観測した。
PLGAマイクロ粒子からジクロロメタンを除去するために、20%のPLGA溶液で充填されたヒドロゲルテンプレートを25℃で10分間露出させた。その後、45℃で25mlの超純水を含む50mlのビーカー内にゼラチンヒドロゲルテンプレートをおいて、ヒドロゲルテンプレートを完全に溶解するために2分間軽く振った(図1E)。ゼラチンヒドロゲルテンプレートを溶解するための温度は、KClなどの多様な物質を微量添加することによって低くすることができた。この段階は、各々のマイクロ粒子の完全な放出をもたらした。溶液を円錘形遠心分離用チューブ内に移動させて、5分間遠心分離し(Eppendorf Centrifuge 5804、Rotor A−4−44、at5,000rpm、19.1RCF)、上澄液を捨てて、ペレット(pellet)を収集した。遠心分離で得られたペレットは、凍結乾燥して冷却装置に保管した。1mlの超純水内の再懸濁上のペレットは、立体反発力によるコロイド安定剤として作用する表面吸着されたゼラチン分子の存在に起因した自由で分離されたマイクロ粒子の分散を形成した(図1F)。
図2に示されているように、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)(SYLGARD(登録商標)184 silicone elastomer)インプリント鋳型をSiウエハーマスターテンプレートの上部に準備する。10:1(w/w)の比率でエラストマー単量体及び硬化剤(Sylgard 184 Silicone Elastomer、DowCorning)の混合物を完全に混合する。前記混合物は、ペトリ皿内でSiウエハーマスターテンプレートの上部に注ぐ(図2A)。気泡を除去するためにペトリ皿を10分間真空室においた後、30分間硬化のために70℃チャンバーに移動させる。PDMSインプリント鋳型をSiマスターテンプレートから剥がして(図2B)、前記PDMSインプリント鋳型を実施例1乃至3に記載されたようなナノ/マイクロ粒子の製造に使用されるヒドロゲルテンプレートを製造するためのテンプレートとして使用する(図2C)。
生物分解性がある重合体膜で水性液滴を被覆して、水性単核中心部を有するナノ/マイクロカプセルを形成する。図3を参照してみれば、PLGAが代表的な重合体として使用される。PLGAを有機溶媒で溶解させ、その溶液をスピンコーターまたは超音波噴霧器を使用してヒドロゲル鋳型上に噴霧する(図3B)。PLGA溶液は、ヒドロゲル鋳型上に薄膜を形成する。水及び有機溶媒間の界面張力のために、大部分の有機溶媒がヒドロゲルの表面上に広がる。この工程に使用することができる溶媒は多数あるため、PLGA膜の形成に最も好ましい溶媒を見つけるために多くの溶媒を検査した。PLGA共重合体(75/25)を合成して、2%の溶液を製造するために多様な有機溶媒内で溶解した。ヒドロゲル鋳型は30%の濃度のゼラチンで製造する。
ゼラチンゲルの融点を変化させることができる物質が添加されたゼラチンテンプレートの一般的な加工において、150mlのパイレックス(Pyrex)(登録商標)瓶内に含まれている超純水100mlに他の無機塩及び生物学的物質を溶解した。表1に他の物質を記載する。この溶液に30gのゼラチン(電気泳動タイプ1のために豚の皮膚から得たもの、300 Bloom、Sigma)を追加して完全に混合した。その瓶を蒸発を防止するために覆って、2時間または透明な溶液が形成されるまで55℃のオーブンにおいた。透明なゼラチン溶液は、ヒドロゲルテンプレートを製造するのに使用した。温かくて透明なゼラチン溶液(10ml)をピペットで50μmの直径及び50μmの高さの円形ピラーを含むマイクロ加工されたシリコンウエハー(3″直径)上に移動させた。ウエハーを完全に覆う薄膜を形成するために、前記ゼラチン溶液を均等に塗り広げた。ゼラチン膜を含むシリコンウエハーを冷却装置内におくことによって5分間4℃で冷却した。冷却は、弾性があって機械的に剛健なゼラチンテンプレートの形成をもたらした。冷却後、ゼラチンヒドロゲルテンプレートをシリコンウエハーから剥がした。3″直径のヒドロゲルテンプレートは、50μmの直径及び50μmの深さの円形ウェルを含む。ゼラチンヒドロゲルテンプレートの構造健全性を糾明するために、ゼラチンヒドロゲルテンプレートを明視野反射顕微鏡下で測定した。他の物質の存在下で製造されたゼラチンヒドロゲルテンプレートは、表1に示されているように45℃より低い温度で溶解した。
多様な形状のマイクロ粒子を製造し、形状の好ましい例を図4に示した。図示されているように、環、パックマン(pacman)、三角形、星、十字架、及びダイヤモンド形状のマイクロ粒子を容易に製造することができた。このような形状だけでなく、通常の円形及び四角形などの他の形状のマイクロ粒子も容易に製造することができる。
2gのPCLを10mlのジクロロメタンに溶解して、20%のPCL(d 1.145、Aldrich)溶液を製造した。マイクロ粒子の製造のために、実施例1乃至3に記載されたような工程を適用した。
単純にシリコンマスターテンプレートのマイクロ構造物の大きさを変化させることによって、マイクロ粒子の大きさが1.2μmから50μmより大きいものに至るまで変化した。大きさを1.2μmからより大きいものに至るまで変化させることはUVフォトリソグラフィーを使用して容易にしたが、1.2μmより小さい大きさは電子ビームリソグラフィーを使用して形成した。
2gのPLGAを10mlのジクロロメタンに溶解して、20%のPLGA(MW 60,000;IV 0.8、Birmingham Polymers)溶液を製造した。この溶液に1mlのフェロジピンを添加して(CH2Cl2内 1g/ml)、フェロジピン/PLGA溶液(1:2w/w)を得るために、ボルテキシング(vortexing)して完全に混合した。50μmの直径及び50μmの深さの円形ウェルを含む3″直径のヒドロゲルテンプレート上にフェロジピン/PLGA溶液200μlをピペットを使用して移動させた。フェロジピン/PLGA溶液をかみそりで削って、ヒドロゲルテンプレート上に均等に塗り広げた。PLGA溶液がヒドロゲルテンプレートを変形させずにウェルを完全に充填させるように力を加えるために、軽い圧力を加えた。フェロジピンだけでなく、プロゲステロン、グリセオフルビン、プロブコール、及びパクリタキセルなどの他の薬物も、マイクロ構造物内に含ませることができた。
ゼラチンヒドロゲルテンプレートは、また、二つの異なる薬物、または一つの薬物及び一つの色素、または二つの異なる色素からなる二つの区別された層を有する二重層マイクロ構造物を加工するために使用された。フェロジピン薬物及びナイルレッド色素の二重層PLGAマイクロディスクを製造するために、実施例1乃至3に記載されたような方法を適用した。二重層マイクロ粒子は、現在使用可能な方法では製造するのが非常に難しいため、ヒドロゲルテンプレート接近方法の固有の特徴である。図5で蛍光及び明視野イメージが二つの鮮明に区別されるフェロジピン(青)及びナイルレッド(赤)層の存在を鮮明に示す。
ゼラチン(電気泳動タイプ1のために豚の皮膚から得たもの、300 Bloom、Sigma)30gを100mlの超純水(150ml Pyrex(登録商標)瓶に入ったもの)に溶解して、ゼラチン溶液(30重量%)を製造して完全に混合した。この瓶を蒸発を防止するために覆って、2時間または透明な溶液が形成されるまで65℃のオーブンにおいた。それによって製造された透明なゼラチン溶液を薄層クロマトグラフィープレートコーター(Camag)内に充填させた。ゼラチンが充填されたプレートコーターを使用して、親水性プラスチックシート(20cm×20cm;3M Corporation)を300μmの厚さのゼラチン層でコーティングした。50μmの直径及び50μmの高さの円形ピラーを含むマイクロ加工されたシリコンウエハー(3″直径)をゼラチン膜内に圧着し、冷却装置内におくことによって5分間4℃で冷却した。冷却は、弾性があって機械的に剛健なゼラチンテンプレートの形成をもたらした。冷却後、シリコンウエハーからゼラチンヒドロゲルテンプレートを剥がした。それによって得られたヒドロゲルテンプレートは、大きさが20cm×20cmであり、50μmの直径及び50μmの高さの円形ウェルを含む。したがって、製造されたヒドロゲルテンプレートは重合体溶液で充填され、その後製造されたマイクロ粒子を収集するためにヒドロゲルテンプレートを溶解させた。
Claims (28)
- (a)ナノ粒子またはマイクロ粒子の製造のために予め定められた大きさと形状の複数のマイクロ構造物を含むマスターテンプレートを形成し;
(b)選択的に前記マスターテンプレートの陰画として重合体テンプレートを形成し、マスターテンプレートから重合体テンプレートを分離し;
(c)ゾル層で前記マスターテンプレートまたは選択的に重合体テンプレートをコーティングし;
(d)前記ゾルをゲルに転換させてヒドロゲルテンプレートを形成し;
(e)前記マスターテンプレートまたは選択的に重合体テンプレートからヒドロゲルテンプレートを分離して、複数のマイクロ構造物を含むゾル−ゲル相可逆的ヒドロゲルテンプレートを収得する;段階を含み、
前記ゾルは、塩の付加、蛋白質の付加、または塩の原子価の変化、又は乾燥によって相転移を誘導してゲルに転換されるものである、
ナノ粒子またはマイクロ粒子の製造用の複数のマイクロ構造物を含むゾル−ゲル相可逆的ヒドロゲルテンプレートの製造方法。 - 前記マスターテンプレートはシリコンウエハーを含み、フォトリソグラフィーまたは電子ビームエッチングによって形成される、請求項1に記載の製造方法。
- 前記重合体テンプレートはポリ(ジメチルシロキサン)を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ゾルは、温度変化によって相転移を誘導してゲルに転換される、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ヒドロゲルはゼラチンまたはその誘導体を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ヒドロゲルはアガロース、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、またはこれらの誘導体を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ヒドロゲルはアルギネート(alginate)またはその誘導体を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ヒドロゲルテンプレート内に形成されたマイクロ構造物は3次元構造である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ヒドロゲルテンプレートのマイクロ構造物は、直径が100nm乃至1000μmの範囲である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記マイクロ構造物は、直径が200nm乃至200μmの範囲である、請求項9に記載の製造方法。
- 前記マイクロ構造物は、直径が500nm乃至100μmの範囲である、請求項10に記載の製造方法。
- 前記マイクロ構造物は、直径が1μl乃至50μmの範囲である、請求項11に記載の製造方法。
- (a)非水溶性重合体が溶解されている非水溶液で請求項1に記載のヒドロゲルテンプレート内の複数のウェルを充填し;
(b)前記非水溶液から溶媒を蒸発させて、ウェル内の非水溶性重合体を固形化し;
(c)前記ヒドロゲルテンプレートからナノ粒子またはマイクロ粒子を得る;段階を含むナノ粒子またはマイクロ粒子の製造方法。 - 前記非水溶液は、溶液内に溶解されている少なくとも一つの生理活性剤を含む、請求項13に記載の製造方法。
- 前記生理活性剤は、1乃至80wt%の範囲でナノ粒子またはマイクロ粒子内に存在する、請求項14に記載の製造方法。
- 前記生理活性剤は、5乃至50wt%の範囲でナノ粒子またはマイクロ粒子内に存在する、請求項14に記載の製造方法。
- 前記非水溶性重合体はPLGAである、請求項13に記載の製造方法。
- 前記非水溶液は、溶液内に溶解されている低分子量薬物または溶液内に分散している高分子量薬物を含む、請求項13に記載の製造方法。
- 前記薬物は、パクリタキセル(paclitaxel)、シロリムス(sirolimus)、プロブコール(probucol)、グリセオフルビン(griseofulvin)、免疫グロブリン、成長因子、インシュリン、インターフェロン(interferon)、またはエリスロポエチン(erythropoietin)から選択される、請求項18に記載の製造方法。
- 前記ナノ粒子またはマイクロ粒子は、水溶液にヒドロゲルテンプレートを溶解したり、または容器内でヒドロゲルテンプレートを凍結乾燥して得られる、請求項13に記載の製造方法。
- (a)非水溶性重合体が溶解されている非水溶液で請求項1に記載のヒドロゲルテンプレート内の複数のウェル壁をコーティングし;
(b)前記コーティングされたウェルに水性液滴を添加し;
(c)前記水性液滴を非水溶性重合体が溶解されている非水溶液で覆い;
(d)前記ヒドロゲルテンプレートからナノ粒子またはマイクロ粒子を得る;段階を含むナノ粒子またはマイクロ粒子の製造方法。 - 前記非水溶液は、溶液内に溶解されている少なくとも一つの生理活性剤を含む、請求項21に記載の製造方法。
- 前記生理活性剤は、1乃至80wt%の範囲でナノ粒子またはマイクロ粒子内に存在する、請求項22に記載の製造方法。
- 前記生理活性剤は、5乃至50wt%の範囲でナノ粒子またはマイクロ粒子内に存在する、請求項22に記載の製造方法。
- 前記非水溶性重合体はPLGAである、請求項21に記載の製造方法。
- 前記水溶液は、溶液内に溶解されている低分子量薬物または溶液内に分散している高分子量薬物を含む、請求項21に記載の製造方法。
- 前記薬物は、パクリタキセル、シロリムス、プロブコール、グリセオフルビン、免疫グロブリン、成長因子、インシュリン、インターフェロン、またはエリスロポエチンから選択される、請求項26に記載の製造方法。
- 前記ナノ粒子またはマイクロ粒子は、水溶液内でヒドロゲルテンプレートを溶解して回収される、請求項21に記載の方法。
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