JP5359169B2 - セルラーゼ測定試薬およびセルラーゼの測定方法 - Google Patents

Description

本発明はセルラーゼ測定試薬およびセルラーゼの測定方法に関する。

バイオエネルギー関連技術において、セルロースを糖化させるセルラーゼに大きな注目が集まっている。現在は、サトウキビ、トウモロコシ等を主原料とする糖分からエタノール・メタノールへと変換されているが、穀物などの食資源にエネルギー源を依存することは望ましい姿とは言えない。そこで、近年、食資源の代替として、植物、木材、綿、紙などの主成分であるセルロースを利用することが考えられているが、工業化に至っていない。この理由として、高性能なセルラーゼ（セルロースを分解する酵素）を生産する微生物の発見に至っていないことがある。更に、この理由として、セルラーゼ測定技術が乏しいことが挙げられる。

従来、セルラーゼの測定方法の１つとして、セルロースを染色した後にセルラーゼで加水分解し、溶出してきた染色物について、光度法で測定する方法（非特許文献１）、フローインジェクション分析法（ＦＩＡ法）で測定する方法（非特許文献２）が知られている。

M.Leisola他、Anal.Biochem.,70,592-599(1976) P.J.Worsfold他、J.Biotechnol.,14,81-87(1990)

ところで、セルラーゼを生産する微生物のスクリーニングにおいては、有能な微生物を見落とさないようにするための観点から、特に、高感度でセルラーゼを測定することが重要であるが、光度法やＦＩＡ法を利用した上記の従来法は、セルラーゼの測定感度の点で不十分である。また、上記の方法においては、分解物が一定の化学種でないことや溶出した色素がセルラーゼと再会合して吸収波長がシフトするという問題がある。

本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、その目的は、高感度で迅速にセルラーゼを測定し得るセルラーゼ測定試薬およびセルラーゼの測定方法を提供することにある。

すなわち、本発明の第１の要旨は、セルロースの構成グルコースの水酸基に反応基を介して金属錯体を結合した金属錯体結合型セルロースから成ることを特徴とするセルラーゼ測定試薬に存する。

そして、本発明の第２の要旨は、上記のセルラーゼ測定試薬にセルラーゼを作用させてセルロースのグリコシド結合を加水分解し、生成する加水分解物に固定された金属錯体中の金属の濃度に基づき、セルラーゼの濃度を測定することを特徴とするセルラーゼの測定方法に存する。

本発明のセルラーゼ測定試薬およびセルラーゼの測定方法は、金属を指標として利用するため、例えばｐｐｂレベルでセルラーゼによるセルロースの加水分解物を測定することが出来る。

以下、本発明を詳細に説明する。

先ず、本発明のセルラーゼ測定試薬について説明する。本発明のセルラーゼ測定試薬は金属錯体結合型セルロースから成る。

セルロースは、β−１、４−グルカン構造を有する多糖類であり、その具体例としては、高等植物由来のセルロース［例えば、木材繊維（針葉樹、広葉樹などの木材パルプ等）、種子毛繊維（コットンリンター、ボンバックス綿、カポック等）、ジン皮繊維（例えば、麻、コウゾ、ミツマタ等）、葉繊維（例えば、マニラ麻、ニュージーランド麻など）等の天然セルロース繊維（パルプ繊維）等］、動物由来のセルロース（ホヤセルロース等）、バクテリア由来のセルロース、化学的に合成されたセルロース（再生セルロース（レーヨン、セロファン等））等が挙げられる。

本発明で使用するセルロースは、上記のようなセルロースに限定されず、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体であってもよい。また、取扱時の形状は、紙状、繊維状、綿状などの何れであってもよい。

金属錯体は、金属原子を中心として、周囲に配位子が結合した構造を持つ化合物であり、配位子としては、フタロシアニン、ポルフィリン、サレン、キノン、エチレンジアミン等の窒素を含む配位子が好ましく、金属としては、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｖから成る群より選択される少なくとも一種が好ましい。これらの中では、フタロシアニンブルーと呼ばれ、反応染料の１つとして知られている銅フタロシアニンが好ましい。

本発明において、金属錯体結合型セルロースは、セルロースの構成グルコースの水酸基に反応基を介して金属錯体を結合した構造を有し、次のようにして得られる。

すなわち、金属錯体にグルコースの水酸基と反応し得る官能基を有する反応基を導入し、当該金属錯体とセルロースとを反応させる。従来よりセルロース用反応染料は数多く知れており、本発明においては、セルロース用反応染料として使用されている反応基と同様の反応基を制限なく使用することが出来る。例えば、セルロースのヒドロキシル基と共有化学結合の形成下に反応し得る基として、特開平８−４８８９７号公報の段落番号００２３に記載されている基を何れも使用し得る。金属錯体に導入する前記の反応基の数は、１つに限定されず、複数個であってもよい。反応基の道入は、金属錯体および反応基の種類に従い、従来公知の方法に準拠して容易に行うことが出来る。銅フタロシアニン反応染料の一例としては、銅フタロシアニンテトラスルホン酸ナトリウム、銅フタロシアニントリスルホン酸ナトリウム、銅フタロシアニンジスルホン酸ナトリウム、銅フタロシアニンモノスルホン酸ナトリウム及びこれらの混合物などが挙げられる。

本発明のセルラーゼ測定試薬（金属錯体結合型セルロース）において、金属錯体の割合は、金属錯体結合型セルロース１．０ｇ当たり通常１０〜５０μｍｏｌであり、セルロースのグルコース４００〜８００個当たり通常１個である。

本発明において、金属錯体として銅フタロシアニンを使用する場合は、セルロース用反応染料として既に市販されているフタロシアニンブルー（Ｃ．Ｉ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ ２１）を利用することが出来る。フタロシアニンブルーで染色された綿は「青綿（ブルーコットン）」と呼ばれて市販されている。

次に、本発明に係るセルラーゼの測定方法について説明する。本発明の測定方法は、セルラーゼ測定試薬にセルラーゼを作用させてセルロースのグリコシド結合を加水分解し、生成する加水分解物に固定された金属錯体中の金属の濃度に基づき、セルラーゼの濃度を測定することを特徴とする。

セルラーゼによるセルロースそれ自体の加水分解は周知であり、主としてグルコース２分子がβ−１、４−結合でつながったセロビオースが生成する。加水分解の条件、すなわち、基質（セルラーゼ測定試薬）及びセルラーゼの濃度、反応温度などは、特に制限されず、セルロースそれ自体の加水分解と同様の条件を採用することが出来る。

本発明のセルラーゼ測定試薬（金属錯体結合型セルロース）の加水分解は、基質の初めの濃度を種々に設定してそれぞれについての初期反応速度を求め、基質初濃度に対してプロットすると、ミカエル・メンテンの式に従って、飽和曲線が得られる。このことから、本発明のセルラーゼ測定試薬（金属錯体結合型セルロース）の加水分解は酵素反応によって支配されていることを確認することが出来る。

本発明に係るセルラーゼの測定方法はセルラーゼによるセルロースの加水分解物を測定するという間接法であり、その際に加水分解物に固定された金属を指標として利用する。上記の金属は金属錯体の形で存在するため、塩として存在する金属と異なり、加水分解物から溶出する恐れは全くない。また、金属錯体は、セルロースの構成グルコースの水酸基に反応基を介して結合しているため、加水分解物に強固に固定されており、加水分解物の濃度測定の指標として完全に利用することが出来る。

次に、加水分解物に固定された金属錯体中の金属の濃度分析について説明する。一般に、ＩＣＰ法やフレームレス原子吸光法は元素分析に利用され、その際、分析試料の溶液化のため、高温に加熱して試料を灰化し（試料中から有機化合物等の主成分を除去し）、硝酸溶液に溶解するという前処理を行う。このことから、ＩＣＰ法やフレームレス原子吸光法は無機イオンの分析に使用する分析手段であるという先入観がある。

しかしながら、本発明者らが加水分解物に固定された金属錯体中の金属の濃度測定にＩＣＰ法やフレームレス原子吸光法を利用したところ、酵素を含む試料であっても、何ら問題なく、ｐｐｂレベルでの金属の測定が可能であった。従って、加水分解物に固定された金属錯体中の金属の濃度分析法としては、ＩＣＰ法やフレームレス原子吸光法が推奨される。また、本発明において、測定試料は、加水分解物の水溶液として得られるため、そのまま使用することが出来、ＩＣＰ法やフレームレス原子吸光法を採用しながら試料の前処理を必要としない利点がある。

セルラーゼを生産する微生物のスクリーニングにおいては、高感度でセルラーゼを測定することが重要であり、相対的な濃度で足り、絶対的な濃度は必ずしも必要ではない。しかしながら、検量線法を採用し、その際、検量線の作成および試料の実測について、金属錯体とセルロースとを一定の条件下で反応して得られたセルラーゼ測定試薬（金属錯体結合型セルロース）を使用し、セルラーゼによるセルラーゼ測定試薬の加水分解を一定の条件下で行うならば、高い定量性でセルラーゼの絶対濃度を容易に測定することが出来る。

本発明は、セルラーゼによる加水分解の基質として、例えば、従来公知の材料である「青綿」を利用することにより、セルロースの加水分解物（セルラーゼ）の濃度の高感度で測定法を達成したものである。酵素は選択的な触媒作用を持つタンパク質を主成分とする生体高分子物質であるため、銅のような重金属によって酵素活性が阻害されるのではないかとの危惧がある。また、安定した加水分解物は得られないのではないかとの危惧や金属錯体はセルラーゼに結合するのではないかといった危惧もある。斯かる観点からすれば、本発明は極めて意外とも言える発明であり、本発明の工業的価値は顕著である。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例により限定されるものではない。

実施例１：
（１）セルラーゼ測定試薬（金属錯体結合型セルロース）の調製：
炭酸ナトリウム：２．０ｇ、硫酸ナトリウム：５．０ｇ、Ｃ．Ｉ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ：２１：０．６ｇを溶かした水溶液１００ｍＬに脱脂綿５．０ｇを添加し、攪拌しながら３０℃で３５分反応させた。その後、７０℃にて６０分間で反応させ、反応の後、ジメチルスルホキシド、メタノール-アンモニア（５０：１ｖ／ｖ）混合溶液で洗浄し、乾燥させて金属錯体結合型セルロースを得た。この金属錯体結合型セルロースにおいて、金属錯体の割合は、金属錯体結合型セルロース１．０ｇ当たり３０μｍｏｌであり、セルロースのグルコース約６００個当たり１個であった。

（２）セルラーゼの測定方法：
濃度の異なる複数のセルラーゼ水溶液を調製して試料とした。２０ｍＬサンプル管に各１０ｍＬを加え、恒温槽にて４５℃の一定温度に保持した。その後、上記のセルラーゼ測定試薬０．０２ｇを加え、1時間振とうした。振とうの後、上澄み溶液を分取し、フレームレス原子吸光光度計（日立ハイテクノロジー社製「 Ｚ−２０００型」）にて、試料溶液を２０μＬ注入し、銅の分析を行った。

上記の測定結果に基づき、セルラーゼ濃度と放出された銅濃度との関係をプロットし第１図に示す結果を得た。セルラーゼ濃度と放出された銅濃度には明確な相関性が見られた。

実施例２：
実施例１における銅の分析において、フレームレス原子吸光光度計に代えてＩＣＰ発光分光分析装置（パーキンエルマー社製 「Ｏｐｔｉｍａ５３００ＤＶ型」）を使用した他は、実施例１と同様に行った。その結果、銅の分析値は、フレームレス原子吸光光度計を使用した実施例１と同様の値であった。なお、ＩＣＰ発光分光分析装置における測定条件は次の通りである。すなわち、試料溶液と８０ｐｐｂイットリウム内標準溶液（５％硝酸溶液）をオンライン内標準添加法にて流路内にて混合した。その際の吸引流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。

セルラーゼ濃度と放出された銅濃度との関係示すグラフの一例

Claims (3)

1. セルロースの構成グルコースの水酸基に反応基を介して金属錯体を結合した金属錯体結合型セルロースから成ることを特徴とするセルラーゼ測定試薬。
2. 金属錯体が金属フタロシアニンである請求項１に記載のセルラーゼ測定試薬。
3. 請求項１又は２に記載のセルラーゼ測定試薬にセルラーゼを作用させてセルロースのグリコシド結合を加水分解し、生成する加水分解物に固定された金属錯体中の金属の濃度に基づき、セルラーゼの濃度を測定することを特徴とするセルラーゼの測定方法。

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