JP5345347B2

JP5345347B2 - 検体処理装置及び方法

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Publication number: JP5345347B2
Application number: JP2008183468A
Authority: JP
Inventors: 博樹齋藤; 達也 ▲高▼須
Original assignee: Hitachi Aloka Medical Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2028-07-15
Also published as: JP2010025564A

Description

本発明は検体処理装置及び方法に関し、特に、検体の分析のために検体に対して段階的に試薬処理を行う装置及び方法に関する。

ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)に代表されるノムノアッセイによる検体分析法の実行に当たっては、抗原・抗体が被覆された反応プレートが用いられる。かかる反応プレートは、一般に、上面に試薬としての抗体・抗原等のタンパク質（生体物質）が固相化されており、プレートの形状としては、上面が平坦な平形板プレートや、上面に凹部（ウェル）が形成されたものが挙げられる。それに対して滴下される検体は、例えば生体から抽出された血清、血漿、尿等のサンプルである。そのような検体に対して、反応処理が段階的に適用される。

上述した平板形プレート上において、滴下される検体等が展開する範囲を画定するために、親水性領域と疎水性領域との事前の区分け処理を施しておくことも考えられるが、それは反応プレートのコストアップという問題を生じさせる。反応プレートに浅い凹部（ウェル）を形成する場合にも同様の問題を指摘できる。

なお、特許文献１には微量分注用ノズル機構としてのインクジェット方式を利用したノズルが開示されている。特許文献２には固相上への溶液のスポッティング技術が開示されている。特許文献３にはキャプチャー溶液によるスポットの形成が開示されている。しかし、いずれの文献にも、スポットアレイを１つの区画として集団的に利用する考え方は開示されていない。

Yuki Kudo,Tatsuro Nakahara,Nobuko Seino,Masaki Shinoda,Katsumi Uchiyama,"Development of a surface-reaction system in a nanoliter droplet made by an ink-jet microdhip",ANALYTICAL SCIENCES,vol.23,Jan.2007 特開２００５−７４３１２号公報特許第３５９９３２９号公報

反応プレート上に検体等を吐出してそれを展開させる場合に、その展開範囲を操作することが必要となるが、反応プレートそれ自体に特別な工夫を事前に施しておく方法ではどうしてもコストアップが生じてしまう。また、展開形状や展開サイズを自在に定めることが困難となる。

本発明の目的は、検体処理に際して、ノズルによって吐出される検体等の展開範囲を自在に操作できるようにすることにある。

本発明の他の目的は、検体処理に際して、滴下された検体の濃度あるいは希釈率を簡便に調整できるようにすることにある。

本発明に係る装置は、反応プレートが有する反応層の上面における複数の地点に前処理液を吐出して、面状に広がる複数の液滴により構成される反応領域を形成する前処理手段と、前記反応領域に対して検体を吐出して、前記反応領域において前記検体を前記反応層と反応させる反応処理手段と、を含む。

上記構成によれば、前処理手段によって、反応プレートの反応層上に反応領域が形成される。反応領域は面状に広がる複数の液滴により構成されるものであり、その液滴は前処理液である。前処理液は希釈用のバッファ液であるのが望ましいが、試薬等であってもよい。いずれにしても、検体の吐出に先立って、それが展開する面状の領域を事前に画定しておけば、検体を確実かつ迅速に展開させることができ、しかも均等に展開させることができる。また、上記構成によれば、検体が広がる範囲及び形状を容易に調整することが可能となる。

反応プレートへ単純に検体を吐出した場合には、その性質あるいは粘性から、反応層上における接触角が垂直方向へ大きくなってしまうような場合であっても、前処理液の事前導入によれば、上記のように検体の展開を円滑に行うことができ、接触角を比較的容易に操作できるという利点を得られる。反応領域は完全な面領域であってもよいが、それに代えて複数の液滴の集合体として反応領域を構成するのが望ましく、そのような構成によれば前処理液を多量に用いなくても反応領域を形成できるという利点を得られる。

望ましくは、前記反応領域では前記複数の液滴が前記反応層上において相互に離間しつつ二次元に整列し、前記前処理液はバッファ液により構成される。複数の液滴が一部において相互に接触していてもよい。滴下時において滴下位置が相互に離間しており、結果として、およそ各液滴が独立して形成されていればよい。液滴の二次元配列としては各種のものが考えられる。縦横に完全に整列していてもよいし、ジグザグ状に整列していてもよい。反応領域の形状つまり液滴集団の形状としては円形であるのが望ましいが、それが楕円形、矩形等であってもよい。光学的な観測に適する形態（例えば受光面の形態に合致する形態）としてもよい。液滴間の距離あるいはピッチは検体粘性等の諸事情に応じて適宜定めることができる。

望ましくは、前記前処理手段が有する前処理液吐出用ノズルとして第１ノズルが用いられ、前記反応処理手段が有する検体吐出用ノズルとして第２ノズルが用いられ、前記第１ノズルは前記第２ノズルよりも微量吐出に適する機能をもったノズルである。微量吐出用のノズルとしては、電磁弁による微量吐出制御を行うもの、インクジェットプリンタで採用されているインクジェット方式を流用したもの、等があげられる。勿論、各液体を別々のノズルで分注する他、単一のノズルで分注することが考えられる。

望ましくは、前記反応領域のサイズを可変する制御部を有する。望ましくは、前記反応領域を構成する液滴数を可変する制御部を有する。検体の希釈率等の観点からサイズや液滴数を制御するのが望ましい。例えば、サイズを小さくしあるいは液滴数を少なくすれば希釈率を小さくできる（検体濃度を高められる）。

本発明に係る方法は、反応プレートの上面に形成された生体物質の固相上の複数の地点にバッファ液を吐出して、面状に広がる液滴アレイにより構成される反応領域を形成する前処理工程と、前記反応領域に対して、生体から採取された液状の検体を吐出して、前記反応領域において前記検体を前記固相と反応させる一次反応工程と、前記反応領域に対して反応液体を吐出して、前記反応領域において前記一次反応工程が終了した後の検体を前記反応液体と反応させる二次反応工程と、を含み、前記反応領域により前記一次反応工程及び前記二次反応工程が実行される領域が画定される、ことを特徴とする。この構成によれば、前処理により形成された反応領域をその後の数段階の反応処理でも有効に機能させることができる。検体が広がる領域を事前に画定できるので、定量分析を精度良く行うことができる。特に、光学的な観測に当たって、高濃度検体の場合には、その広がり範囲を拡大して、単位面積当たりの検体量を少なくして、測定値の飽和の問題を低減でき、一方、低濃度検体の場合には、その広がり範囲を狭くして、単位面積当たりの検体量を多くして、高感度の検出を行える。よって、蛍光、化学発光等の微弱発光を利用する場合にも有効となる。

以上説明したように、本発明によれば、検体処理に際して、ノズルによって吐出される検体等の展開範囲を自在に操作できる。あるいは、検体処理に際して、滴下された検体の濃度あるいは希釈率を簡便に調整できる。

以下、本発明の好適な実施形態を図面に基づいて説明する。

図１には、本発明に係る検体処理装置の好適な実施形態が示されており、図１はその全体構成を示す概念図である。本実施形態に係る検体処理装置において処理される検体は例えば血液、尿等の生体から採取された液体である。もちろん、検体としてはそれら以外にも各種のものが挙げられる。

反応プレート１０は、プレート本体１２とその上面に形成された反応層１４とで構成される。プレート本体１２はプラスチック、ガラス等からなる透明な板状の部材である。反応層１４は、抗原抗体反応を行うための固相であり、それは例えば抗原あるいは抗体となるタンパク質によって構成されるものである。ちなみに、プレート本体１２がプラスチック材料で構成される場合、その具体的な材料としてはポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。反応層１４は、後に説明するように、本実施形態において１次抗体（抗原）である。２次抗体（抗原）については、試薬として上方から滴下される。

反応プレート１０は、プレート搬送機構１６により水平方向に運動可能である。プレート搬送機構１６は、後に説明するノズル搬送機構２２,４０との協働により、検体等の滴下位置を定めるものである。また、プレート搬送機構１６は、一連の反応処理が終了した反応プレート１０を測光部４６へ搬送する機能も有している。

ディスポーザブル型のノズルチップ１８は図示されていないノズル基部に装着される。ノズルチップ１８とノズル基部とでノズルユニットが構成され、そのノズルユニットはノズル搬送機構２２により上下方向及び水平方向に搬送される。ノズルユニットにはシリンジポンプ機構２０が接続されている。具体的には、エアチューブを介してノズルユニットとシリンジポンプ機構２０とが接続されており、シリンジポンプ機構２０において吸引力及び吐出力が生成されている。ノズルチップ１８は親検体容器２６に収容された検体を吸引し、それを反応プレート１０上へ吐出するためのものである。親検体容器２６はラック２４により保持されている。一般に、各検体の分注毎にノズルチップ１８が交換される。

ノズル２８は試薬を吐出するためのノズルであり、それに関する詳細な機構は図示省略されている。また、ノズル３０は洗浄用ノズルであり、そのノズル３０についてもそれに接続されている詳細な機構は図示省略されている。なお、図１に示される複数のノズルに代えて単一のノズルを切替え使用してもよい。その場合においては各ノズルに対する流路が電磁弁等によって切替えられる。また、それぞれのノズルが多連ノズルユニットを構成してもよい。すなわち、一度に複数の検体を処理する構成が採用されていてもよい。

ノズルユニット３２は、前処理液としてのバッファ液を吐出するためのノズルであり、具体的には、電磁弁機構３４と微量吐出用ノズル３６とで構成される。電磁弁機構３４の動作はコントローラ５２により制御されている。ノズルユニット３２にはバッファ液タンク３８が接続されており、そのバッファ液タンク３８から供給されたバッファ液が、電磁弁機構３４の作用により、ノズル３６を介して反応プレート１０上へ滴下される。本実施形態においては、後に説明するように反応プレート１０上に複数の液滴からなる反応領域（スポットアレイ）が形成される。

ノズルユニット３２は、ノズル搬送機構４０により上下方向及び水平方向に搬送される。ノズル搬送機構２２とノズル搬送機構４０とが単一の搬送機構を構成してもよい。それが符号４２で表されている。上記のノズルユニット３２としては本実施形態において電磁弁方式のユニットが利用されていたが、インクジェット方式のユニット等を利用するようにしてもよい。いずれにしても微量の液滴を吐出できる構成が採用されるのが望ましい。一滴の液量は、例えば、数百ｐｌ〜数ｎｌであり、本実施形態においては、１つの反応プレートあたり数十〜数千の液滴が吐出され、それらの液滴集団より反応領域が構成される。上記のバッファ液に代えてグリセリン溶液を用いることもできる。いずれにしても、長時間安定であり、かつ粘度の調整が容易な液体を利用するのが望ましい。ただし、一般に、純水よりもある程度粘度をもった液体の方が分注精度をよくすることができるので、そのような諸事情を勘案して事前に吐出する前処理液を定めるのが望ましい。また、そのような前処理液としてはその乾燥時に結晶が析出しないものを利用するのが望ましい。

コントローラ５２は、制御部及び演算処理部として機能するものであり、図１に示される各構成の動作制御がコントローラ５２によって行われている。コントローラ５２には測光部４６が接続されており、測光部４６は図示される例において発光部４８と受光部５０とで構成されている。発光部４８と受光部５０との間に反応プレート１０が差し込まれ、それに対して光を透過させることにより、あるいは反応領域において生じている光を受光部５０で検出することにより測光データが得られる。それによって、目的物質の定量化を行える。図示の例においては受光部５０が反応プレート１０の下側に設けられていたが、受光部５０を反応プレート１０の上側に設けるようにしてもよい。

コントローラ５２には入力部５４及び表示部５６が接続されている。その他、図示されていない記憶装置がコントローラ５２に接続されている。ユーザは、入力部５４を利用して、反応領域のサイズやそれを構成する液滴数を自在に設定することが可能である。そのような設定により検体の展開範囲あるいは希釈率を任意に定められるという利点がある。また、必要に応じて反応領域の形状をユーザにより任意に設定できるようにしてもよい。

図２には、反応領域６０が示されている。この反応領域６０は、上述したように、複数の液滴６２からなるものであり、すなわち反応領域６０は液滴集団に相当する。各液滴６２は前処理液としてのバッファ液である。図２に示される例では、反応プレート１０の反応層１２上に複数の液滴６２が形成され、それらは相互に離間している。相互の離間距離あるいはピッチについては任意に定めることができる。また、図２に示す例では、液滴集団が縦方向及び横方向に完全に直線的に並んでいるが、それらの方向においてジグザグに各液滴が並ぶパターンを採用するようにしてもよい。図２に示される例では、反応領域が実質的に円形の領域として構成されているが、それが楕円領域、矩形領域等であってもよい。例えば、反応プレート１０が矩形形態を有することに対応して、それと相似形の矩形形状をもって反応領域６０を形成することも可能である。あるいは、１つの反応プレート１０上に複数の反応領域６０を形成する場合において、それらの相互干渉を防止するために、それぞれの形状を適宜定めることも可能である。各液滴は上方から見て円形であり、各液滴の量についても自在に定めることも可能である。

次に、図３乃至図５を用いて検体処理の例を説明する。まず、図３に示されるように、反応プレート１０上に反応領域６０が形成される。反応領域６０の形成にあたっては、ノズルユニット３２が利用され、ノズルユニット３２及び反応プレート１０の一方又は相互を相対的に位置決めることにより、反応領域６０を構成する各液滴（スポット）の位置を自在に定めることが可能である。

次に、図４に示されるように、反応プレート１０上に、より詳しくは反応領域６０の中央に、ノズルチップ１８を利用して検体が吐出され、その吐出された検体が符号６２で表されている。

上記吐出後に、その検体は複数の液滴の作用によって吐出位置（滴下位置）から直ちに面状に広がり、図５において符号６４で示されるように、反応領域６０に合致する形態をもった面状に広がる検体領域が構成される。すなわち、その大きく広がった面状の領域において検体と反応層との間において反応（抗体抗原反応）が遂行される。

したがって、以上のプロセスによれば、反応層に対して直接的に検体を吐出するのではなく、それに先立って、反応領域を事前に形成した上で、反応領域の上に検体を吐出することにより、検体を速やかに面状に広がらせることができ、しかもその分布を均一にできるという利点がある。この場合において反応領域を構成する複数の液滴の総量を適宜定めておけば、検体の希釈率を任意に定めることが可能である。上記実施形態では、検体が反応領域に相当する円形の領域に展開しているが、もちろん反応領域の形状を他のものに定めておけば、それにしたがって検体の展開範囲を画定することが可能である。なお、反応領域の形成にあたって、前処理液を単純に面状に広がらせるならば、どうしても前処理液の総量が多くなってしまうが、本実施形態では、反応領域を複数の液滴の集合体として構成したため、すなわち反応領域内に格子状の複数の露出領域が存在しているため、単位面積あたりの前処理液の量を少なくして、必要以上に検体が薄められてしまうという問題を回避することができる。

なお、図４に示した検体の吐出時において、複数滴の検体を吐出する場合には、ノズルチップ１８の位置を異ならせて複数回の吐出動作を行わせればよい。ただし、本実施形態においては、上記の前処理の適用により、通常、反応領域の中央に検体を吐出するだけで、その吐出された検体を速やかに反応領域の全体に進展させることが可能である。

次に、図６を用いて、図１に示した装置の動作例を説明する。まず、Ｓ１０１では、反応プレート１０がプレート搬送機構１６上にセットされる。そして、Ｓ１０２では、プレート搬送機構１６の作用により、反応プレート１０が所定の分注／洗浄位置に位置決めされる。

Ｓ１０３では、ノズルユニット３２が用いられ、バッファ液が反応プレート１０上に段階的に吐出され、これによって複数の液滴からなる反応領域が所望の形状をもって構成される。Ｓ１０４では、Ｓ１０３における前処理の実行の後、ノズルチップ１８を用いて検体が反応領域の中央に分注される。これにより、Ｓ１０５において一次抗体と抗原との反応が実行されることになる。なお、この段階において必要に応じてノズルチップが新しいものに交換される。

Ｓ１０６では、洗浄ノズル３０が利用されて、反応処理後におけるプレート洗浄が実行される。そしてＳ１０７において、試薬ノズル２８が用いられ、酵素による標識がなされた２次抗体試薬が反応領域の中央へ分注される。これによりＳ１０８において、抗原と２次抗体との反応処理が実行される。また、必要に応じて試薬ノズルが洗浄される。

Ｓ１０９では、Ｓ１０８の反応処理後における反応プレートが洗浄ノズル３０を利用して洗浄され、Ｓ１１０においては試薬ノズル２８を利用して、反応領域の中央へ基質液が分注される。この基質液は発光試薬に相当するものである。Ｓ１１１においては、酵素と基質との反応処理が実行される。また、試薬ノズルの洗浄が実行される。

Ｓ１１２においては、Ｓ１１１の反応処理後に、反応プレートが測光部４６へ搬送され、Ｓ１１３において、測光部４６により反応領域で生じる光が測定される。その測定データはコントローラ５２において処理される。Ｓ１１４では、反応プレートが廃棄される。

以上のように、本実施形態においては、予め反応領域を画定しておくことにより、検体を利用した１次反応処理が行われる範囲を定めることができ、更に、それに続いて行われる２次反応処理についてもそれが行われる範囲を画定することができるという利点がある。上記実施形態においてはバッファ液用のノズルと試薬ノズルとが別々に構成されていたが、それらが同一のノズルで構成されていてもよい。更に、このことは洗浄液ノズルについても同様である。

上記実施形態において、同じ検体量であれば、反応領域の面積を広げることにより反応時間をより早められるという利点がある。また高濃度検体であっても反応領域を広げれば測定値が飽和しないという利点がある。一方、低濃度検体の場合には反応領域を小さくすれば高感度測定を行うことができる。よって、蛍光や化学発光を検出する場合においても、必要な感度を自在に実現できるという利点がある。また、反応領域を構成するバッファ液の量を調整することにより検体の希釈率を任意に定めることができるという利点がある。更に、従来、反応プレート表面上に浸水性／疎水性の処理を施したりあるいは凹部の形成を行ったりする必要があったが、上記構成によれば上述の前処理だけでそれらに相当する領域を形成できるので簡便であり、しかも領域の形状やその機能を自在に定められるので極めて実用性が高まる。

本発明に係る検体処理装置の好適な実施形態を示す概念図である。反応領域の一例を示す図である。ノズルユニットを利用した反応領域の形成を説明するための図である。ノズルチップによる検体の滴下を説明するための図である。滴下された検体の展開を説明するための図である。図１に示した装置の動作例を示すフローチャートである。

符号の説明

１０反応プレート、１２プレート本体、１４反応層（固相）、１６プレート搬送機構、１８ノズルチップ、２０シリンジポンプ機構、２２ノズル搬送機構、２８試薬ノズル、３０洗浄ノズル、３２ノズルユニット、３４電磁弁機構、３６微量吐出用ノズル、３８バッファ液タンク、４０ノズル搬送機構、４６測光部、５２コントローラ。

Claims

反応層を有する反応プレートと、
前記反応プレートが有する前記反応層の上面における複数の地点に前処理液を吐出して、面状に広がる複数の液滴により構成される反応領域を形成する前処理手段と、
前記反応領域に対して検体を吐出して、前記反応領域において前記検体を前記反応層と反応させる反応処理手段と、
を含み、
前記反応領域では前記複数の液滴が前記反応層上において相互に離間しつつ二次元に整列し、
前記反応領域への検体の吐出時にその検体が前記反応領域内の複数の液滴によって吐出位置から前記反応領域全体に面状に展開する、
ことを特徴とする検体処理装置。
請求項１記載の装置において、
前記前処理液はバッファ液により構成される、ことを特徴とする検体処理装置。
請求項１又は２記載の装置において、
前記前処理手段が有する前処理液吐出用ノズルとして第１ノズルが用いられ、
前記反応処理手段が有する検体吐出用ノズルとして第２ノズルが用いられ、
前記第１ノズルには電磁弁機構が設けられた、ことを特徴とする検体処理装置。
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置において、
前記反応領域のサイズを可変する制御部を有する、ことを特徴とする検体処理装置。
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置において、
前記反応領域を構成する液滴数を可変する制御部を有する、ことを特徴とする検体処理装置。
反応プレートの上面に形成された生体物質の固相上の複数の地点にバッファ液を吐出して、互いに離間しつつ面状に広がる複数の液滴からなる液滴アレイにより構成される反応領域を形成する前処理工程と、
前記反応領域に対して、生体から採取された液状の検体を吐出して、前記反応領域において前記検体を前記液滴アレイによって吐出位置から面状に展開させて前記固相と反応させる一次反応工程と、
前記反応領域に対して反応液体を吐出して、前記反応領域において前記一次反応工程が終了した後の検体を前記反応液体と反応させる二次反応工程と、
を含み、
前記反応領域により前記一次反応工程及び前記二次反応工程が実行される領域が画定される、ことを特徴とする検体処理方法。