JP5341505B2 - 抗体及びその使用 - Google Patents
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Description
本願明細書は、特異的結合メンバー及び治療方法におけるその使用に関する。特に、本願明細書は、カテプシンSに対する特異的結合メンバー、好ましくはカテプシンSのタンパク質分解活性を阻害する特異的結合メンバーに関する。
プロテアーゼは、遺伝子産物全体の約2%を構成する、タンパク質の大きなグループである(Rawlings及びBarrett、1999年)。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、あらゆる細胞及び生物の適切な機能に不可欠である。タンパク質分解プロセッシング事象は、骨形成、創傷治癒、血管新生、及びアポトーシスを含む広範な細胞プロセスにおいて重要である。
プロテアーゼ制御の変化は、しばしば、多くのヒト病理学的プロセスの発端となる。リソソームシステインプロテアーゼのカテプシンSの無秩序な発現及び活性は、神経変性障害、自己免疫疾患、及びある種の悪性腫瘍を含む様々な状態に関係があるとされている。
プロテアーゼが過剰発現される場合、治療戦略は、これらの酵素の活性を妨害する阻害物質の開発に焦点をあわせてきた。カテプシンに対する特異的な小分子阻害物質の作製は、選択性及び特異性に伴う問題が原因で、これまでは困難とされてきた。WalkerらによってCatSに対する強力な可逆的阻害物質として開発されたジペプチドα−ケト−β−アルデヒドは、効率はより低いが、CatB及びCatLを阻害する能力を有し(Walkerら、2000年)、また、CatS阻害物質の4−モルホリン尿素−Leu−ホモPhe−ビニルスルホン(LHVS)も、より高い濃度で使用された場合に他のカテプシンを阻害することが示された(Palmerら、1995年)。
本明細書において記述するように、本発明者らは、カテプシンSのタンパク質分解活性を強力に阻害し、さらに腫瘍細胞の浸潤及び血管新生も阻害する、カテプシンSに対する特異性を有するモノクローナル抗体を開発した。本発明者らは、抗体のVHドメイン及びVLドメイン、並びにCDRを同定した。これは、カテプシンSのプロテアーゼ活性を直接阻害するカテプシンSに特異的な抗体を初めて実証するものであり、したがって、独自に、癌治療薬から抗炎症薬まで広範な用途を有する、特異性が高く、かつ毒性の低い活性な治療物質としてこのような抗体を使用することを可能にする。
配列番号1:
SYDMS
配列番号2:
YITTGGVNTYYPDTVRG
配列番号3
HSYFDY
配列番号4:
RSSQSLVHSNGNTYLH
配列番号5:
KVSNRFS
配列番号6:
SQTTHVPPT
VQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYITT
GGVNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSYFDY
WGQGTTVTVSS
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL
IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPPTFG
SGTKLEIKR
結合メンバー
本明細書の文脈において、“結合メンバー”は、別の分子に対する結合特異性を有する分子であり、これらの分子は、特異的結合メンバーの対を構成する。分子対の一方のメンバーは、この分子対のもう一方のメンバーの一部分又は全体に特異的に結合するか、又は相補的である領域を有し得る。本発明は、抗原−抗体タイプの反応に特に関係している。
本発明の特異的結合メンバー、及び本発明において使用するための特異的結合メンバーは、天然に又は合成によって、任意の適切な方法で作製することができる。このような方法としては、例えば、従来のハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein(1975年)Nature、256:495−499頁)、組換えDNA技術(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)、又は抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら(1991年)Nature、352:624−628頁、及びMarksら(1992年)Bio/Technology、10:779−783頁を参照されたい)を挙げることができる。他の抗体作製技術は、Antibodies:A Laboratory Manual、Harlowら編、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年に記載されている。
本発明の核酸及び本発明において使用するための核酸は、DNA又はRNAを含み得る。これは、組換えによって、合成によって、又は標準的技術を用いるクローニングを含む、当業者が利用可能な任意の手段によって作製され得る。
本発明の特異的結合メンバー及び核酸は、いくつかの医学的状態の治療において使用することができる。
様々な眼の障害は、血管新生によって媒介され、かつ本明細書において説明する方法を用いて治療することができる。血管新生によって媒介される疾患の1つの例は、眼の血管新生疾患であり、これは、眼の構造体中への新しい血管の侵入を特徴とし、失明の最も一般的な原因である。加齢による黄斑変性症では、関連する視覚的問題は、網膜色素上皮の下の線維血管性組織の増殖を伴うブルッフ膜の欠陥による、脈絡膜毛細血管の内方成長によって引き起こされる。加齢黄斑変性症の最も重度の形態(“滲出型”ARMDとして公知)では、異常な血管新生が網膜の下で起こり、結果として不可逆的な視力の低下をもたらす。視力の低下は、新しい血管からの出血に続いて起こる網膜の瘢痕化が原因である。“滲出型”ARMDの現在の治療は、不都合な血管を破壊するためのレーザーを用いた治療法を利用している。しかし、レーザーは、上を覆っている網膜に永久に傷跡を残すことがあり、かつ不都合な血管が再び成長することがしばしばあるため、この治療は理想的ではない。黄斑変性症に対する代替の治療戦略は、黄斑変性症から最も重度の視力低下を引き起こす新しい血管の形成又は血管新生を阻害する、抗血管新生物質の使用である。
本発明の特異的結合メンバー及び方法は、炎症の治療において使用され得る。CatSの活性を妨害することにより、特異的結合メンバーは、“炎症を起こした”細胞における適切な抗原提示を妨げ、したがって、炎症性の作用を弱めることができる。
結合メンバー及び核酸は、薬剤組成物として投与され得る。本発明による薬剤組成物、及び本発明に従って使用するための薬剤組成物は、活性成分に加えて、製薬上許容される賦形剤、担体、緩衝安定剤、又は当業者に周知の他の物質を含んでよい(例えば、Remington:the Science and Practice of Pharmacy、第21版、Gennaro ARら編、Lippincott Williams&Wilkins、2005年を参照されたい)。このような物質としては、酢酸、Tris、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤;抗酸化剤;保存剤;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸;炭水化物;キレート剤;等張化剤(tonicifier);並びに界面活性剤を挙げることができる。
本発明の結合メンバー、核酸、又は組成物は、好ましくは、個体への利益を示すのに十分な量である“治療有効量”で個体に投与される。実際の投与計画は、治療される状態、その重症度、治療される患者、使用される作用物質を含むいくつもの因子に応じて変わり、かつ医師の裁量によると考えられる。
クローニング
成熟したCatSタンパク質をコードしているDNA配列を、BamH1及びSal1の制限部位(小文字によって示される)をコードする遺伝子特異的プライマーを用いて、脾臓のcDNAライブラリーからPCRによって増幅した(図1)。
アンチセンス: TTT TTT gtc gac CTA GAT TTC TGG GTA AGA GG
50μMアンピシリンを添加したルリア・ベルターニ(LB)ブロス5ml中で、37℃で一晩、陽性のクローンを増殖させた。この培養物の300μlのアリコートを二次培養物の接種のために確保し、試料の残りの部分は、Qiagenミニプレップキットを用いてミニプレップし、かつDNA配列決定によって配列を確認した。
誘導された組換えタンパク質を、50mlの8M尿素緩衝液(尿素480g、NaCl 29g、NaH2PO4(二水和物)3.12g、イミダゾール0.34g)中に一晩溶解させた。この溶液を6000rpmで1時間遠心分離し、その後、0.8μmのギロディスク(gyrodisc)フィルターを用いて上清をろ過した後、精製した。
リフォールディングされたタンパク質を免疫原として用いて、モノクローナル抗体を作製した。5匹のBALB/Cマウスを、3週間間隔で精製組換えタンパク質150μgで免疫化し、3回及び5回の追加免疫後に抗体力価を解析した。各動物から試験血液を採取し、抗原100ngに対して、ウェスタンブロット法において希釈率1:1000で試験した。(前述したように)3,3’−ジアミノベンジン(DAB)を用いてブロットを発色させた(図5)。
モノクローナル抗体をELISAによってスクリーニングして、どのクローンを増殖させるべきか決定した。スクリーニング抗原(100ng/ウェル)を含む、コーティング用緩衝液(緩衝液A:炭酸水素ナトリウム0.42g/H2O 100μl、緩衝液B:炭酸ナトリウム0.53g/H2O 100μl、pH9.5)100μlを各ウェルに添加することによって、組換え抗原でMaxi Sorb96ウェルプレートをコーティングした。非特異的なクローンを排除するために、対照の抗原も使用した。これらのプレートを37℃で1時間インキュベートして、抗原をウェルに結合させ、次いで、各ウェルに200μlのPBS/3%BSAを添加することにより、室温で1時間ブロッキングした。
ハイブリドーマ細胞株から得た上清をウェスタンブロット法によって解析して、モノクローナル抗体が、CatSが高発現されるグレードIVの星状細胞腫細胞株U251mg中の内在性の天然CatSタンパク質を検出する能力を判定した。U251mg細胞全体の溶解物の30μg/mlのアリコートをSDS−PAGEによって分離し、Hybond−C Extraニトロセルロースメンブレン(Amersham Biosciences社)上に移した。室温で1時間、PBS/5%マーベル(marvel)中でインキュベーションすることによってメンブレンをブロッキングし、その後PBS中で手短にゆすいだ。モノクローナル抗体は、PBS中で1:500に希釈して使用し、4℃で一晩、穏やかに揺り動かしながらメンブレン上でインキュベートした。次いで、PBS/1%マーベル及び0.1%Tween−20でブロットを3回ゆすぎ、次いで、希釈率1:3000のヤギ抗マウスHRP結合二次抗体と共に、振とうしながら室温で1時間インキュベートした。次いで、PBS/1%マーベル及び0.1%Tween−20溶液でブロットを3回ゆすぎ、続いてPBS中で軽くゆすいだ。ブロットをECLプラス基質(Amersham Biosciences社)と共に室温で5分間インキュベートした後、安全な光条件下でコダック(Kodak)社製写真フィルムを用いて現像した(図7)。
モノクローナル抗体の阻害効果を、CatS合成基質Z−Val−Val−Arg−AMC(Bachem社)及び組換えヒトCatS(Calbiochem社)を用いて、蛍光分析により決定した。アッセイの前に、37℃で30分間、酢酸ナトリウム緩衝液(100mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、0.1%Brij90、pH5.5)及び2mMジチオトレイトール(DTT)中で組換えCatS酵素を活性化させた。アッセイは、酢酸ナトリウム/DTT緩衝液(90:1)190μl、活性化CatS 1μl、10mM Cbz−Val−Val−Arg−AMC基質12.5μl、及び未精製のモノクローナル抗体上清50μlを用いて実施した。蛍光は、励起波長375nm及び励起光波長460nmにて、5分毎に4時間、測定した(図8)。これから、5つのモノクローナル抗体分泌細胞株を大規模な増殖、精製のために選択した。(アイソタイプ決定の結果に応じて)プロテインGカラム又はプロテインMカラムのいずれかを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、ハイブリドーマ上清を精製した(代表図9)。
精製する前に、Pierce社製のImmunoPure(登録商標)モノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて、大規模増殖のために選択したモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。96ウェルプレート上のウェル10個をヤギ抗マウスコーティング抗体50μlでコーティングし、かつ室温で2時間インキュベートした。これらのウェルを、ブロッキング溶液125μlを用いて室温で1時間インキュベートし、非特異的結合を防止するためにブロッキングした。次いで、洗浄緩衝液125μlでウェルを4回洗浄した。ウェル10個のうちウェル9個はハイブリドーマ上清50μlと共にインキュベートし、10番目のウェルには陽性の対照溶液50μlを添加し、室温で1時間インキュベートした。これらのウェルを洗浄緩衝液125μlでもう一度洗浄した後、サブクラスに特異的な抗マウス免疫グロブリン及び対照50μlを10個の個々のウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。これらのウェルを洗浄緩衝液125μlで4回洗浄した後、ABTS基質溶液100μlを各ウェルに添加して、室温で30分間反応させた。結果は、分光光度計を用いて405nmで読み取った(図10)。
精製したモノクローナル抗体を、CatSの活性を阻害する能力を定量するために、蛍光分析によって解析した。このアッセイの原理は、以前に使用したものと同じである。蛍光は、励起波長375nm及び励起波長460nmにて、1分毎に1時間、測定した(図11)。これらの進行曲線は、緩徐な結合の可逆的阻害物質の作用を示している。次いで、得られた見かけの一次反応速度曲線(first order rate order curves)を、図に示したように(図12)、GraFitソフトウェアを用いた非線形回帰解析(Morrison及びWalsh、1988年)に供して、Kiを533nMと算出した。カテプシンL及びカテプシンKを用いた対照の蛍光分析を、50μMの蛍光発生基質(fluorogenic substrate)Cbz−Phe−Arg−AMCを用いて前述したように実施して(図14及び図15)、CatSに対する阻害活性が実際に特異的であることを実証した。
前述したようにウェスタンブロットを実施して、CatB、CatL、及びCatKに対してではなくCatSに対する抗体結合の特異性を示した。手短に言えば、組換えCatS、CatK、CatL、及びCatB 100ngをSDS−PAGEゲル上に添加し、次いでHybond−C Extraニトロセルロースメンブレン(Amersham Biosciences社)上に移した。室温で1時間、PBS/5%マーベル中でインキュベーションすることによってメンブレンをブロッキングし、その後PBS中で手短にゆすいだ。モノクローナル抗体は、PBS中で1:500に希釈して使用し、4℃で一晩、穏やかに揺り動かしながらメンブレン上でインキュベートした。次いで、PBS/1%マーベル及び0.1%Tween−20でブロットを3回ゆすぎ、希釈率1:3000のヤギ抗マウスHRP結合二次抗体と共に、振とうしながら室温で1時間インキュベートした。次いで、PBS/1%マーベル及び0.1%Tween−20溶液でブロットを3回ゆすぎ、続いてPBS中で軽くゆすいだ。ブロットをECLプラス基質(Amersham Biosciences社)と共に室温で5分間インキュベートした後、安全な光条件下でコダック社製写真フィルムを用いて現像した(図15)。
阻害性モノクローナル抗体の配列決定のために、ハイブリドーマ細胞株からRNAを抽出し、RT−PCRによってVH領域及びVL領域を増幅した(図18)。Invitrogen社製のTOPO TAキットを用いてPCR生成物をクローニングし、ベクターに特異的なプライマーを用いたコロニーPCRによって陽性のコロニーを確認し(図19)、また、DNA配列決定により、阻害性モノクローナル抗体のVH領域及びVL領域のコンセンサス配列を導き出した(図20)。
製造業者の取扱い説明書に従ってAbsolutely RNA(商標)RT−PCR Miniprepキット(Stratagene社)を用いて、U251mg、MCF7、HCT116、及びPC3細胞株からRNAを抽出し、かつ分光光度計によって定量した。RT−PCRは、以下の条件下で、ワンステップRT−PCRキット(Qiagen社)を用いて実施した:50℃で30分間、95℃で15分間、並びに94℃で1分間、55℃で1分30秒間、及び72℃で1分間を40サイクル、続いて最後に72℃で10分間。CatSに対するプライマー配列は以下のとおりであった。CatS F:GGGTACCTCATGTGACAAG、CatS R:TCACTTCTTCACTGGTCATG。β−アクチン遺伝子の増幅を内部対照として用いて、等量のローディングを示した。アクチン F:ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG。アクチン R:CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC。RT−PCR生成物をアガロースゲル電気泳動によって解析した(図21)。
細孔サイズ12μmのメンブレン(Costar Transwellプレート、Corning Costar社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)を付けた改良型ボイデンチャンバーを用いて、in vitroの浸潤アッセイを実施した。メンブレンをマトリゲル(100μg/cm2)(Becton Dickinson社、オックスフォード、英国)でコーティングし、層流フード中で一晩乾燥させた。所定の濃度のCatS阻害抗体又は対照抗体の存在下で、各ウェルの無血清培地500μl中に細胞を添加した。アッセイはすべてトリプリケートで実施し、浸潤プレートを37℃、5%CO2で24時間インキュベートした後、メンブレンの上側の面に残っている細胞を除去し、かつ浸潤した細胞をカルノア固定液中で15分間固定した。乾燥させた後、浸潤した細胞の核を、室温で30分間、PBS中ヘキスト(Hoechst)33258(50ng/ml)で染色した。チャンバーインサートをPBS中で2回洗浄し、シチフルオル(Citifluor)中にマウントし、また、Nikon Eclipse TE300蛍光顕微鏡を用いて浸潤細胞を観察した。Nikon DXM1200デジタルカメラを拡大率20倍で用いて、3つのメンブレンのそれぞれの代表的な領域のデジタル画像10枚を撮影した。これらの結果を、Laboratory Imaging社のLucia GF 4.60を用いて解析し、浸潤細胞のパーセンテージとして表した(図22−26)。
CatS mAbの抗血管新生特性を、HUVEC細胞を用いた微小管形成アッセイ(microtuble formation assay)によって評価した。内皮細胞の管形成に対する抗体の影響を以下のようにして評価した:マトリゲル(10mg/ml)200μlを、予冷しておいた48ウェルプレートに添加し、4℃で10分間インキュベートし、次いで37℃で1時間、重合させた。200nMの適切な抗体を含む、内皮細胞増殖培地MV(Promocell社)中に細胞を懸濁させた。500μl(1×105細胞)を各ウェルに添加した。対照として、適切な体積のPBSを含む、ビヒクル(vehicle)のみの対照培地と共に細胞をインキュベートした。37℃及び5%CO2で24時間インキュベーションした後、Nikon Eclipse TE300顕微鏡を用いて細胞を観察した。
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Claims (21)
- カテプシンSに結合し、かつカテプシンSのタンパク質分解活性を阻害する特異的結合メンバーであって、血管新生を阻害する能力を有し、(i)配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR、及び配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR、及び(ii)配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR、配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR、及び配列番号6のアミノ酸配列を有するCDRを含む抗原結合ドメインを含む、特異的結合メンバー。
- 前記抗体VHドメインが、それぞれCDR1、CDR2、及びCDR3として、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3のアミノ酸配列を有するCDRを含む、請求項1に記載の特異的結合メンバー。
- 前記抗体VHドメインが、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の特異的結合メンバー。
- 前記抗体VLドメインが、それぞれCDR1、CDR2、及びCDR3として、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6のアミノ酸配列を有するCDRを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
- 前記抗体VLドメインが、配列番号8のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の特異的結合メンバー。
- 配列番号7のアミノ酸配列を有する抗体VHドメイン及び配列番号8のアミノ酸配列を有する抗体VLドメインを含む抗体の効力の少なくとも25%の効力で、カテプシンSのタンパク質分解活性を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
- 全長抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
- scFv抗体分子を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の特異的結合メンバーをコードする核酸。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は請求項9に記載の核酸を含む薬剤組成物。
- 医薬品中で使用するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は請求項9に記載の核酸。
- カテプシンSに結合することができる特異的結合メンバーを作製する方法であって、請求項9に記載の核酸を宿主細胞中で発現させるステップと、前記特異的結合メンバーを前記細胞から単離するステップとを含む方法。
- 血管新生に関連した状態を治療するための医薬品を調製する際の、抗体若しくは抗体の断片、又は前記抗体若しくは抗体の断片をコードする核酸の使用であって、前記抗体若しくは抗体の断片がカテプシンSに結合し、カテプシンSのタンパク質分解活性を阻害し、 前記血管新生に関連した状態が、癌、関節リウマチ、変形性関節症、潰瘍性大腸炎、クローン病、バルトネラ症、アテローム性動脈硬化症、血管腫、充実性腫瘍、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋の血管形成、プラークの新血管新生、冠状動脈側枝、大脳側枝、動静脈奇形、虚血肢血管新生、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、眼の血管新生疾患、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、アトピー性角膜炎、上方輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、類天疱瘡放射状角膜切開術、推測される近視、視窩、慢性の網膜剥離、過粘稠度症候群、外傷及びレーザー処置後の合併症、ルベオーシス又は増殖性硝子体網膜症であり、
抗体若しくは抗体の断片が、請求項1〜8のいずれか一項に記載の特異的結合メンバーである、使用。 - 前記状態が、肉腫、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、前立腺、子宮頸部、及び卵巣の癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、リンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、白血病、星状細胞腫、神経膠腫、又は網膜芽細胞腫である、請求項13に記載の使用。
- 前記状態が黄斑変性症である、請求項13に記載の使用。
- 前記状態が乳癌である、請求項13又は14に記載の使用。
- 前記状態が前立腺癌である、請求項13又は14に記載の使用。
- 前記状態が結腸直腸癌である、請求項13又は14に記載の使用。
- 前記状態が星状細胞腫である、請求項13又は14に記載の使用。
- 前記状態が関節リウマチ又は変形性関節症である、請求項13に記載の使用。
- 前記状態が、潰瘍性大腸炎、クローン病、バルトネラ症、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項13に記載の使用。
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