JP5323680B2 - 結腸直腸細胞増殖性疾患を検出するための方法および核酸 - Google Patents
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Description
癌は、米国第2位の主たる死亡原因である。現在のスクリーニング法が、患者のコンプライアンス、感受性、およびスクリーニングの簡便性の点で改善されれば、死亡率を著しく改善できるであろう。現在推奨される癌診断法は、高価であることが多く、広範な国民スクリーニング検査としての適用には向いていない。
Surka, M.C., Tsang, C.W., and Trimble, W.S. Mol Biol Cell, 13: 3532-45 (2002) Osaka, M, Rowley, J.D. and Zeleznik-Le, N.J. PNAS, 96:6428-6433 (1999) Burrows, J. F., Chanduloyら, S.E.H. Journal of Pathology, 201:581-588 (2003) Scott, M., Hyland, P.L.ら, Oncogene, 24: 4688-4700 (2005)
「観察/推定割合」(「O/E割合」)という用語は、特定のDNA配列中のCpGジヌクレオチドの頻度をさし、[CpG部位数/(C塩基の数×G塩基の数)]/各フラグメントのバンド長に相当する。
レベル1:ポリープ頭部内で、筋粘膜を通り粘膜下層に至る悪性の腺の浸透、
レベル2:同じ粘膜下浸潤であるが頭部から茎部の連結部に見られる浸潤、
レベル3:茎部浸潤、および
レベル4:結腸壁に接続する茎基部浸潤(このレベルはDukes A期に対応する)。
本発明は、対象において、前癌性結腸直腸細胞増殖性疾患(例えば、新生物の腺腫)を検出する方法、または良性結腸直腸病変と前悪性結腸直腸病変とを区別する方法であって、該対象から単離した生物学的試料中のセプチン9(その全転写産物変異体を含む)およびALX4からなる群から選択された少なくとも一個の遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを決定するステップを含み、その際、低発現および/またはCpGメチル化が該疾病の存在を示す方法を提供する。好ましくは、セプチン9(その任意の転写産物変異体を含む)およびALX4の発現レベルを分析する。該マーカーは、直腸結腸癌の存在を検出し、および/または結腸直腸病変の良性と悪性形態の区別することによって、疾患の前癌性段階の直腸結腸癌を早期発見するために使用しうる。
様々なメチル化アッセイ手順が、当技術分野で公知であり、本発明と組み合わせて使用することができる。これらのアッセイによって、DNA配列中の一つ以上のCpGジヌクレオチド(例えば、CpGアイランド)のメチル化状態を決定できるようになる。そのようなアッセイには、他の技術の中でも、重亜硫酸塩処理したDNAのDNAシーケンシング、(配列特異的増幅用)PCR、サザンブロット分析、およびメチル化感受性制限酵素の使用が含まれる。
COBRA(商標)分析は、少量のゲノムDNAで特異的遺伝子座位でのDNAのメチル化レベルを決定するのに有用な定量メチル化アッセイである(Xiong and Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997)。手短に言えば、制限酵素消化産物を使用して、重亜硫酸ナトリウム処理したDNAのPCR生成物で、メチル化に依存する配列の差異を明らかにする。メチル化に依存する配列の差異は、まず、Frommerら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992)に記載している手順による標準的重亜硫酸塩処理によって、ゲノムDNAに導入される。次いで、対象となるCpGアイランドに特異的なプライマーを使用し、重亜硫酸塩で転換したDNAのPCR増幅を実施し、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、および特異的な標識したハイブリダイゼーションプローブを使用する検出を実施する。広範囲なDNAのメチル化レベルにわたって直線的定量方法で、元のDNA試料のメチル化レベルは、消化および未消化PCR生成物の相対量によって表す。さらに、この技術は、微細切開パラフィン包埋組織試料から得たDNAに確実に施用できる。
MSP(メチル化特異的PCR)によって、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、CpGアイランド内の実質的に任意の群のCpG部位のメチル化状態も評価できるようになる(Hermanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996;米国特許第5,786,146号)。手短に言えば、重亜硫酸ナトリウムによってDNAを改変して、全てのメチル化されていないシトシンをウラシルに転換するが、メチル化されているシトシンはウラシルに転換せず、続いてメチル化されていないDNAとは対比して、メチル化されたDNAに特異的なプライマーで増幅する。MSPは、ほんの少量のDNAを必要とし、所与のCpGアイランド座位の0.1%のメチル化した対立遺伝子に対して感受性があり、パラフィン包埋試料から抽出したDNAで実施することができる。MSP分析に典型的な試薬(例えば、典型的MSPに基づくキットに見られる試薬)には、それだけには限定されないが、特異的遺伝子(または、重亜硫酸塩処理したDNA配列もしくはCpGアイランド)用のメチル化されたPCRプライマーおよびメチル化されていないPCRプライマー、最適化したPCR緩衝液およびデオキシヌクレオチド、および特異的プローブが含まれうる。
MethyLight(商標)アッセイは、PCRステップ後、それ以上の操作を必要としない、蛍光に基づくリアルタイムPCR(TaqMan(登録商))技術を利用するハイスループット定量メチル化アッセイ(Eadsら, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999)である。手短に言えば、MethyLight(商標)法は、標準手順(重亜硫酸塩過程は、メチル化されていないシトシン残基をウラシルに転換する)に従って、重亜硫酸ナトリウム反応で、メチル化に依存する配列の差異の混合プールに転換されるゲノムDNAの混合試料から始まる。次いで、「偏った」(既知のCpGジヌクレオチドに重なるPCRプライマー)反応で蛍光に基づくPCRを実施する。配列の判別は、増幅過程レベルおよび蛍光検出過程レベルで行うことができる。
Ms-SNuPE(商標)技術は、DNAの重亜硫酸塩処理と、続く単一ヌクレオチドプライマー伸長に基づく、特異的CpG部位でのメチル化の差異を評価する定量法である(Gonzalgo and Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997)。手短に言えば、ゲノムDNAを重亜硫酸ナトリウムと反応させて、メチル化されていないシトシンをウラシルに転換するが、5−メチルシトシンは変化しないまま放置される。次いで、重亜硫酸塩で転換したDNAに特異的なPCRプライマーを使用して所望の標的配列増幅を実施し、得られた生成物を単離し、対象となるCpG部位でのメチル化分析の鋳型として使用する。少量のDNAは分析することができ(例えば、微細切開病理学断面)、CpG部位でのメチル化状態を決定するための制限酵素の利用は回避される。
本発明は、ゲノム配列の配列番号1〜配列番号2の新規な使用を提供する。別の実施形態は、配列番号1〜配列番号2の改変変異体、ならびに配列番号1〜配列番号2内のシトシンのメチル化パターンを分析するためのオリゴヌクレオチドおよび/またはPNAオリゴマーを提供する。
n〜(n+(X−1));
[式中、n=1、2、3、...(Y−(X−1))];
その場合Yは、配列番号1(52626)の長さ(ヌクレオチドまたは塩基対)に等しく、
その場合、Xは、そのセット中の各オリゴヌクレオチドの共通の(ヌクレオチド)長に等しく(例えば、X=20は連続して重複する20-mersのセットである)、
その場合、長さYの所与の配列番号に対して、連続して重複するX長のオリゴマーの数(Z)はY−(X−1)に等しい。例えば、Z=52626−19=52607は配列番号1のセンスまたはアンチセンスセットである(式中、X=20)。
1〜20、2〜21、3〜22、4〜23、5〜24、...および52607〜52626。
好ましくは、セットは、少なくとも一個のCpG、TpG、またはCpAジヌクレオチドを含むようなオリゴマーに限定される。
1〜25、2〜26、3〜27、4〜28、5〜29、...および52602〜52626。
本方法の最も好ましい実施形態では、前記本方法の最初の3ステップ、すなわち
a)対象から、対象のゲノムDNAを有する生物学的試料を得るステップ、
b)ゲノムDNAを抽出、または別の方法で単離するステップ、
c) b)のゲノムDNAまたはそのフラグメントを一種以上の試薬で処理し、その5位置のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシル、またはハイブリダイゼーション特性の点で検出可能にシトシンとは異なる別の塩基に転換するステップ
に従ってゲノム核酸を単離し処理するが、その場合
d) c)の処理に続いて増幅するステップをメチル化特異的方法で、すなわち、メチル化特異的プライマーの使用またはオリゴヌクレオチドのブロッキングにより実施し、さらに、その場合
e)上記のように、リアルタイム検出プローブ手段によって増幅物の検出を実施する。
本発明によって、患者または個体にとって不利な症例の診断が可能になり、その際、セプチン9(その全転写産物変異体を含む)および/またはALX4からなる群から選択された少なくとも一個の遺伝子もしくはゲノム配列内の、重要な遺伝的パラメーターおよび/またはエピジェネティックパラメーターは、マーカーとして使用しうる。本発明によって得られた該パラメーターは、遺伝的パラメーターおよび/またはエピジェネティックパラメーターの別のセットと比較してよく、その差異は、患者または個体にとって不利な事象の診断および/または予後の基準として役立つ。
さらに、本発明の追加の態様は、セプチン9(その全転写産物変異体を含む)およびALX4からなる群から選択された少なくとも一個の遺伝子メチル化を決定するための手段を含むキットである。メチル化を決定するための手段は、好ましくは、重亜硫酸塩含有試薬;いずれの場合にも、その配列が、配列番号3〜配列番号10から選択された配列の9塩基長またはより好ましくは18塩基長までのセグメントと、同一であり、相補的であり、またはストリンジェントもしくは非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチド、および任意により記載のメチル化分析法を実施し評価するための使用説明書を含む。一実施形態では、該オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも一個のCpG、CpAまたはTpGジヌクレオチドを含む。
大部分は50歳以上である40〜80歳の男性および女性患者から試料を採取した。症例報告書式は内科医が再点検し、疾患重症度を決定した。全体では、腺腫性ポリープ患者36名(女性13名、男性23名、中央値年齢63.5歳、範囲24〜75歳)および過形成性ポリープ患者13名(女性5名、男性8名、中央値年齢58歳、範囲20〜73歳)から血清を採取した。結腸および直腸の腫瘍または前癌状態がなく、様々な他の理由で大腸内視鏡検査を受けた22名の個人(負の対照)、ならびに5名の直腸結腸癌患者からも血清を採取した。
全核酸DNA(Total Nucleic Acid DNA)抽出キット(Roche Applied Science)およびRoche MagNaPure器具を使用し、自由循環(free-Circulating)DNAの抽出によって血漿をまず処理した。各患者から溶出させたDNAをプールし、Microconフィルターで濃縮した。上記のように、重亜硫酸ナトリウムを使用し、メチル化されていないシトシンを脱アミノ化することによって、DNAのメチル化情報を保存した。β−アクチンについては非メチル化特異的アッセイを使用し、各試料の重亜硫酸塩処理した血漿DNAをRoche LC 2.0(商標)器具により数量化した。MSPアッセイによってALX4のメチル化を決定した。本出願人のHMリアルタイムPCR技術(Cottrell SE, Distler J,ら. NAR 2004; 32(1):e10を参照されたい)を基礎とするアッセイを使用し、セプチン9のメチル化を決定した。バックグラウンドが50ng血液DNA(RocheヒトゲノムDNA)である中、メチルされた(SSS1処理済み)DNAの希釈系列によって、21pgとして、セプチン9アッセイの90%検出限界が推定された。Roche LC 2.0も使用して、セプチン9増幅を測定した。各一PCR反応につき、DNAの血漿同等物1.6ml〜1.9mlを加え、各血漿試料を二つ組または三つ組で泳動させた。
当該ゲノムの領域:配列番号1;アッセイ型:MSP
プライマー:cgtcgcaacgcgtacg(配列番号11);cgcggtttcgattttaatgc(配列番号12)
Lightcyclerプローブ:actccgacttaacccgacgatcg−fluo(配列番号13);LC640−acgaaattcctaacgcaaccgct−p(配列番号14)
増幅物配列:
Cgtcgcaacgcgtacgactcaaaacttaataactccgacttaacccgacgatcgcgacgaaattcctaacgcaaccgcttaaaacttcgcattaaaatcgaaaccgcg(配列番号15)
温度サイクリングプログラム:
活性化: 95℃ 10min
55サイクル: 95℃ 15秒 (20℃/s)
60℃ 45秒 (20℃/s)
72℃ 15秒 (20℃/s)
当該ゲノムの領域:配列番号2;アッセイ型:HeavyMethyl
プライマー:GtAGtAGttAGtttAGtAtttAttTT(配列番号16);CCCACCAaCCATCATaT(配列番号17)
Lightcyclerプローブ:Gtt cga aat gat ttt att tag ttg c−FL(配列番号18);LC−Red640−cgt tga tcg cgg ggt tc−PH(配列番号19)
ブロッカー配列:CATCATaTCAaACCCCACAaTCAACACACAaC−Inv3'(配列番号20)
温度サイクリングプログラム:
活性化: 95℃ 10min
55サイクル: 95℃ 10秒
56℃ 30秒
72℃ 10秒
冷却: 10℃ 30秒
4%を超えるメチル化が示された場合、陽性として反復を決定した。メチル化を示した反復回数によって、試料を陽性と断定した。
1cmより大きいポリープを検出するためのリアルタイムPCRアッセイの感受性は、23%であると決定された。本発明者らの結果は、セプチン9生物マーカーが、50歳を越える無症候個体でも非常に特異的(95%)であることを示している。
マーカーパネルでセプチン9とALX4を組み合わせた結果から、高い特異性を維持しながら、ポリープを検出する感受性を相当に改善できることが示唆される。マーカーパネルは、1cmを超えるポリープを67%の感受性で検出した。大きい腺腫(>1cm)またはIEN(上皮内異常増殖)がある腺腫の感受性は、さらに高く改善された(それぞれ100%、80%)。50歳を越える無症候個体でのパネル特異性は91%であった。患者のコンプライアンスおよび現在のスクリーニング戦略の性能は、今日市販されている試験の有効性を制限する。直腸結腸癌の早期発見のための管理が容易な血液に基づく検査と、続く陽性個体のための大腸内視鏡検査は、この疾患による死亡率を低減するのに非常に有効なツールである可能性がある。
Claims (30)
- 対象における結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および/または分類を補助する方法であって、前記対象から単離した生物学的試料中のセプチン9の発現レベルを決定するステップを含み、CpGメチル化が前癌性結腸直腸細胞増殖性疾患の存在の指標である、方法。
- 対象において結腸直腸細胞増殖性疾患を検出および/または分類するための判断材料を提供する方法であって、
前記対象から単離した生物学的試料を準備するステップ、
該生物学的試料のセプチン9の発現レベルを決定するステップを含むものであって、
セプチン9の低発現が前癌性結腸直腸細胞増殖性疾患の存在の指標である、方法。 - 悪性または前悪性細胞増殖性疾患と良性細胞増殖性疾患との識別を補助する方法であって、低発現および/またはCpGメチル化の存在が悪性または前悪性細胞増殖性疾患の存在を示し、かつそれらが存在しないことが良性細胞増殖性疾患の存在を示すことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 発現レベルが、遺伝子から転写されたmRNAの存在、非存在またはレベルを検出することによって決定される、請求項2または3に記載の方法。
- 発現レベルが、遺伝子またはその配列によってコードされたポリペプチドの存在、非存在またはレベルを検出することによって決定される、請求項2または3に記載の方法。
- ポリペプチドが、ウエスタンブロット分析、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、ELISAイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、抗体、およびそれらの組合せを含む群から選択された一つ以上の手段によって検出される、請求項5に記載の方法。
- 発現が、遺伝子内のCpGメチル化の存在または非存在を検出することによって決定され、メチル化の存在によって細胞増殖性疾患の存在が示される、請求項1または3に記載の方法。
- 対象における細胞増殖性疾患の検出および/または分類を補助する方法であって、
前記対象から得た生物学的試料から単離したゲノムDNAを、少なくとも一種の試薬または一連の試薬であって、前記ゲノムDNAの少なくとも一個の標的領域内で、メチル化されたCpGジヌクレオチドとメチル化されていないCpGジヌクレオチドとを識別する試薬と接触させるステップを含むものであって、
前記標的領域が、配列番号2の配列またはこれと相補的な配列の少なくとも16個の隣接配列を含み、
前記隣接ヌクレオチドは、配列番号2に特異的な配列であり、かつ、少なくとも一個のCpGジヌクレオチド配列を含み、
結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および/または分類が少なくとも部分的に可能になる、方法。 - 結腸直腸細胞増殖性疾患を検出かつ/または分類するための判断材料を提供する方法であって、
a)対象から得た生物学的試料からゲノムDNAを抽出またはそうでなければ単離するステップ、
b)5位置のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシル、またはハイブリダイゼーション特性の点でシトシンと区別して検出可能な別の塩基に転換する一種以上の試薬で、a)のゲノムDNAまたはそのフラグメントを処理するステップ、
c)該処理済みゲノムDNAまたはフラグメントを、増幅酵素および配列番号5、6、9および10からなる群から選択される配列に特異的な配列と、同一または相補的な配列である少なくとも16ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも一個のプライマーと接触させるステップであって、
該処理済みゲノムDNAまたはそのフラグメントが、増幅されて少なくとも一個の増幅物を生成しているか、または増幅されていないステップ、および
d)前記増幅物の存在または非存在または特性に基づき、配列番号2の配列またはこれと相補的な配列の少なくとも一個のCpGジヌクレオチドのメチル化状態もしくはレベル、または配列番号2の配列またはこれと相補的な配列の複数のCpGジヌクレオチドのメチル化状態もしくはレベルの平均もしくは平均を反映する値を決定し、それによって結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および分類の少なくとも一つが、少なくとも部分的に可能になるステップ
を含む、方法。 - b)のゲノムDNAまたはそのフラグメントの処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せを含む群から選択される試薬の使用を含む、請求項9に記載の方法。
- c)の接触または増幅ステップが、増幅酵素として耐熱性DNAポリメラーゼの使用;5'−3'エクソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼの使用;ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用;検出可能標識を担持する増幅物核酸分子の発生;を含む群から選択される少なくとも一つの方法の使用を含む、請求項10に記載の方法。
- 対象から得た生物学的試料が、細胞系、組織切片、生検試料、パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出液、尿、血漿、血清、全血、単離血液細胞、血液から単離した細胞、およびそれらの組合せを含む群から選択される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- さらに、ステップd)で、配列番号5、6、9および10からなる群から選択された配列と同一または相補的な配列である少なくとも16ヌクレオチド長の隣接配列を含む、少なくとも一個の核酸分子もしくはペプチド核酸分子を使用するステップであって、前記核酸分子もしくはペプチド核酸分子が、ハイブリダイズする核酸の増幅を抑制するステップを含む、請求項12に記載の方法。
- d)の決定で、配列番号5、6、9および10からなる群から選択された配列と同一または相補的な配列である少なくとも16ヌクレオチド長の隣接配列を含む、少なくとも一個の核酸分子もしくはペプチド核酸分子のハイブリダイゼーションが含まれる、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも一個のハイブリダイズする核酸分子またはペプチド核酸分子が固相に結合している、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも一個のヌクレオチド塩基によって、少なくとも一個のハイブリダイズする核酸分子を伸長するステップをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- d)での決定が、増幅物のシーケンシングを含む、請求項11に記載の方法。
- c)での接触または増幅ステップが、メチル化特異的プライマーの使用を含む、請求項11に記載の方法。
- 結腸直腸細胞増殖性疾患を検出および/または分類するための判断材料を提供する方法であって、
a)対象から得た生物学的試料からゲノムDNAを抽出またはそうでなければ単離するステップ、
b)一種以上のメチル化感受性制限酵素で、a)のゲノムDNAまたはそのフラグメントを消化し、そのDNA制限酵素消化産物を、増幅酵素および配列番号2の配列に特異的な配列と同一またはこれと相補的な配列の少なくとも16個の隣接配列であり少なくとも一個のCpGジヌクレオチドを含む配列を増幅する少なくとも2個のプライマーと接触させるステップ、および
c)増幅物の存在または非存在に基づき、配列番号2の配列と同一またはこれと相補的な配列の少なくとも一個のCpGジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを決定し、それによって細胞増殖性疾患の検出および分類の少なくとも一つが、少なくとも部分的に可能になるステップ
を含む、方法。 - 増幅物の存在または非存在が、配列番号2の配列と同一またはこれと相補的な配列の少なくとも16塩基長の隣接配列を含む少なくとも一個の核酸またはペプチド核酸とのハイブリダイゼーションによって決定される、請求項19に記載の方法。
- 処理が、ゲノムDNA配列の少なくとも一個のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリダイゼーションの点でシトシンと区別して検出可能な別の塩基に転換するのに適したものであり、
該処理がなされた配列番号2のゲノム由来処理済み核酸を結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および/または分類の判断材料提供のために使用する方法。 - 処理が、ゲノムDNA配列の少なくとも一個のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリダイゼーションの点でシトシンと区別して検出可能な別の塩基に転換するのに適したものであり、
該処理がなされた配列番号5、6、9および10からなる群から選択される配列と同一または相補的な配列の少なくとも16個の隣接配列を含むゲノム由来処理済みセプチン9特異的な核酸を結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および/または分類の判断材料提供のために使用する方法。 - 配列番号5、6、9および10からなる群から選択される配列と同一または相補的な配列の少なくとも50個の隣接配列を含む、請求項22に記載のゲノム由来処理済み核酸を結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および/または分類の判断材料提供のために使用する方法。
- 配列番号5、6、9および10からなる群から選択される配列と同一または相補的な配列の少なくとも16個の隣接配列を含む、請求項22に記載のゲノム由来処理済みセプチン9特異的な核酸を結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および/または分類の判断材料提供のために使用する方法。
- 隣接配列が、少なくとも一個のCpG、TpG、またはCpAジヌクレオチド配列を含む、請求項23又は24のいずれかに記載の方法。
- 請求項4に記載の方法を実施するのに適切なキットであって、
(a)セプチン9遺伝子の転写産物に特異的であり、セプチン9遺伝子の転写産物と同一または相補的な少なくとも18個の隣接配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、
(b)該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および該転写産物を含む患者の生物学的試料を入れるのに適切な容器であって、ストリンジェントな条件下で、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、該転写産物とハイブリダイズできる容器、
(c)(b)のハイブリダイゼーションを検出する手段、および
任意により、
(d)使用説明書および該キットの結果の解釈書
を含む、キット。 - (a)セプチン9ポリペプチドを検出する手段、
(b)前記手段および該ポリペプチドを含む患者の生物学的試料を入れるのに適切な容器であって、
該手段によって、該ポリペプチドとの複合体が形成できる容器、
(c)(b)の複合体を検出する手段、
を含む、請求項5に記載の方法を実施するのに適切なキット。 - (a)重亜硫酸塩試薬、
(b)前記重亜硫酸塩試薬および患者から得られた生物学的試料を入れるのに適切な容器、
(c)配列番号5、6、9および10からなる群から選択される1つの配列と同一または相補的な配列の少なくとも18塩基長の隣接配列を含む、2個のセプチン9に特異的なオリゴヌクレオチドを含む少なくとも一セットのオリゴヌクレオチド
を含む、請求項8に記載の方法を実施するのに適切なキット。 - (a)メチル化感受性制限酵素試薬、
(b)前記試薬および患者の生物学的試料を入れるのに適切な容器、
(c)配列番号2の配列と同一または相補的な配列の少なくとも18塩基長の隣接配列を含む、少なくとも一セットのセプチン9に特異的なオリゴヌクレオチド、一つ以上のセプチン9に特異的な核酸もしくはペプチド核酸、および任意で
(d)使用説明書およびキットの結果の解釈書
を含む、請求項8に記載の方法を実施するのに適切なキット。 - 結腸直腸細胞増殖性疾患の診断および/または分類するための判断材料の提供における、請求項1〜20に記載の方法の使用、請求項21〜25に記載の方法の使用、および/または請求項26〜29に記載のキットの使用。
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