JP5320593B2 - Molecular analysis using laser-induced shock waves - Google Patents
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Description
この発明は、レーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法に関するものであり、特に、マイクロメーターオーダー以下のサイズの分子に対してのレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法に関するものである。 The present invention relates to a molecular analysis method using a laser-induced shock wave, and more particularly to a molecular analysis method using a laser-induced shock wave for a molecule having a size of a micrometer order or less.
微小物体の取り扱い操作、加工は、ナノテクノロジーやバイオテクノロジーに関連して近年特に注目されている分野である。顕微鏡下においてマイクロメーターオーダーの物体をレーザー光により操作することは、レーザーピンセットにより非接触で行うことができ、また、加工については、レーザーアブレーションやレーザーによる重合反応により造形を行うことができる。さらに、微小物体に対して他の物体を接合することや他の物質を注入することは、これら技術の組み合わせのみでは不十分である。レーザー光を顕微鏡の対物レンズにより液体中に集光して発生する衝撃波（レーザー誘起衝撃波）は、物体に強い加速度を与えることができるため、大きな力を必要とする作業を行うための動力として有効と考えられる。 In recent years, handling and processing of minute objects have attracted particular attention in relation to nanotechnology and biotechnology. Manipulating a micrometer-order object with a laser beam under a microscope can be performed in a non-contact manner with laser tweezers, and the processing can be performed by laser ablation or polymerization reaction by laser. Furthermore, it is not sufficient to combine other objects with a minute object or to inject another substance with a combination of these techniques alone. A shock wave (laser-induced shock wave) generated by condensing laser light into a liquid with a microscope objective lens can give a strong acceleration to an object, so it is effective as a power to perform work that requires a large force. it is conceivable that.
ここで、上記に関連した技術が、特開２００３−２１０１５９号公報（特許文献１）、特開２００３−３４４２６０号公報（特許文献２）、特開２００５−１４４５３８号公報（特許文献３）、特開２００５−３３５０２０号公報（特許文献４）、特開２００５−２８７４１９号公報（特許文献５）、特開２００５−１６８４９５号公報（特許文献６）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，８４，２９４０（２００４）（非特許文献１）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ，７９，７９５（２００４）（非特許文献２）に開示されている。 Here, techniques related to the above are disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2003-210159 (Patent Document 1), Japanese Patent Laid-Open No. 2003-344260 (Patent Document 2), Japanese Patent Laid-Open No. 2005-144538 (Patent Document 3), JP 2005-335020 (Patent Document 4), JP 2005-287419 (Patent Document 5), JP 2005-168495 (Patent Document 6), Appl. Phys. Lett. , 84, 2940 (2004) (Non-Patent Document 1), Appl. Phys. A, 79, 795 (2004) (non-patent document 2).
均一溶液中の分子を加速し、濃度差を与える方法として電気泳動法や誘電泳動法があるが、電気泳動法では電荷をもつイオンのみしか移動させることができない。これらの泳動法では、移動速度が小さいため、分析等の時間がかかる問題がある。また、吸着や浸透、あるいは分配平衡を用いたクロマトグラフィーは、物質を移動させながら濃度差を与える方法であり、混合物の分離・分析方法として広く用いられている。しかし、この場合には、望ましくない吸着が充填剤の表面で起こるため、分解能を下げる原因となる。一方、超遠心分離法は、高分子量の分子に対して適用され、分子量測定や分離に用いられている。しかし、後者のいずれの方法も原理的に物質の拡散、移動を含むため、高い分離能と高速化あるいは小型化を両立することは困難である。 Electrophoresis and dielectrophoresis are methods for accelerating molecules in a uniform solution and giving a concentration difference, but only ions having a charge can be moved by electrophoresis. These electrophoresis methods have a problem that it takes time for analysis and the like because the moving speed is low. Further, chromatography using adsorption, permeation, or distribution equilibrium is a method of giving a concentration difference while moving a substance, and is widely used as a method for separating and analyzing a mixture. However, in this case, undesired adsorption occurs on the surface of the filler, causing a reduction in resolution. On the other hand, the ultracentrifugation method is applied to high molecular weight molecules and is used for molecular weight measurement and separation. However, since both of the latter methods include diffusion and movement of substances in principle, it is difficult to achieve both high resolution and high speed or downsizing.
すなわち、従来における電気泳動法や誘電泳動法では、その対象が電荷を持つイオンに限られ、移動速度が小さいことが問題である。また、従来におけるクロマトグラフィーや超遠心分離法では、高い分離能と高速化あるいは小型化を両立することは困難である。 That is, the conventional electrophoresis method or dielectrophoresis method has a problem that its target is limited to ions having a charge, and the moving speed is low. Moreover, it is difficult for conventional chromatography and ultracentrifugation methods to achieve both high resolution and high speed or miniaturization.
ここで、特許文献６に示すように、レーザーによる誘起衝撃波を利用した粒子の検出を行なう際の原理について、簡単に説明する。図２８および図２９は、この場合におけるレーザー誘起衝撃波を利用した粒子の状態を示す図である。図２８は、レーザーによる誘起衝撃波発生直後の状態を示し、図２９は、レーザーによる誘起衝撃波発生後所定の時間を経過した状態を示す。ここで、所定の時間とは、数百ナノ秒レベル〜数マイクロ秒レベルであり、粒子の粒径については、数ｎｍレベルである。図２８を参照して、異なる粒径の粒子１０２、１０３を含む溶媒１０１中の所定の位置１０４に集光するようにパルスレーザーを照射する。そうすると、パルスレーザーが集光する位置１０４を基点として衝撃波１０５が発生する。この衝撃波１０５は、溶媒１０１中を図２８中の矢印で示す方向に伝播する。ここで、溶媒１０１中の粒子１０２、１０３については、粒径に応じて溶媒１０１中を移動する移動距離が異なるため、図２９に示すように、矢印で示す方向において溶媒１０１中に粒子１０２、１０３の粒径に応じた分布が形成される。具体的には、粒径の大きな粒子１０２が、粒径の小さな粒子１０３よりも集光位置１０４から遠い位置に移動した分布が形成される。なお、この詳細な原理については、特許文献６に記載されている。 Here, as shown in Patent Document 6, the principle of particle detection using an induced shock wave generated by a laser will be briefly described. FIG. 28 and FIG. 29 are diagrams showing the state of particles using laser-induced shock waves in this case. FIG. 28 shows a state immediately after the generation of the induced shock wave by the laser, and FIG. 29 shows a state after a predetermined time has elapsed after the generation of the induced shock wave by the laser. Here, the predetermined time is a level of several hundred nanoseconds to several microseconds, and the particle size of the particles is a level of several nm. Referring to FIG. 28, the pulse laser is irradiated so as to be focused at a predetermined position 104 in the solvent 101 including the particles 102 and 103 having different particle diameters. Then, a shock wave 105 is generated with the position 104 where the pulse laser is focused as a base point. The shock wave 105 propagates in the solvent 101 in the direction indicated by the arrow in FIG. Here, the particles 102 and 103 in the solvent 101 have different moving distances in the solvent 101 depending on the particle diameter, and therefore, as shown in FIG. A distribution corresponding to the particle size of 103 is formed. Specifically, a distribution is formed in which the particles 102 having a large particle diameter move to positions farther from the light collection position 104 than the particles 103 having a small particle diameter. This detailed principle is described in Patent Document 6.
このような原理を用い、顕微鏡等を用いて液体内にパルスレーザーを集光して発生させた衝撃波により、粒子の加速、移動を行なうことを利用したクロマトグラフィーにおいては、マイクロメーターオーダーの流路、すなわち、粒子を移動させるための展開用流路へ、異なる粒径を有する粒子を含む試料を導入し、衝撃波発生点より試料展開方向に微小スポットを形成させる必要がある。 In this chromatography, a micrometer-order flow path is used for chromatography using the acceleration and movement of particles by shock waves generated by focusing a pulsed laser in a liquid using a microscope. That is, it is necessary to introduce a sample containing particles having different particle diameters into a development flow path for moving particles, and form a microspot in the sample development direction from the shock wave generation point.
しかし、流路を用いて液体媒体の流れにより試料を移動させると、その間における分子、粒子の拡散や流れの乱れによりスポットの大きさは空間的に広がっていくことが予想される。そうすると、拡散によって、移動させたい方向やその逆の方向に分子が移動し、分子を分離したい方向に分子が滲んでしまうことになり、クロマトグラムとしての分解能が低下することとなる。流路中に分子を注入して衝撃波発生点まで流れで移動させる場合でも拡散が起こるため、小さな体積中に分析した分子を注入しても、衝撃波発生点に至るまでにその空間分布は広くなってしまう。 However, when the sample is moved by the flow of the liquid medium using the flow path, the spot size is expected to expand spatially due to the diffusion of molecules and particles in the meantime and the disturbance of the flow. If it does so, a molecule | numerator will move to the direction which wants to move by the spreading | diffusion, and the reverse direction, and a molecule will ooze in the direction which wants to isolate | separate a molecule | numerator, and the resolution as a chromatogram will fall. Diffusion occurs even when molecules are injected into the flow path and moved by flow to the shock wave generation point, so even if the analyzed molecules are injected into a small volume, the spatial distribution becomes wide until reaching the shock wave generation point. End up.
この発明の目的は、容易に、かつ、適切に行なうことができるレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a molecular analysis method using a laser-induced shock wave that can be easily and appropriately performed.
本発明においてクロマトグラフィーにより分析される試料は、レーザー誘起衝撃波の発生点付近に導入されなければならない。また、レーザー光は、展開用流路中で試料となる分子より展開方向とは逆の位置に照射される。 In the present invention, the sample to be analyzed by chromatography must be introduced near the generation point of the laser-induced shock wave. In addition, the laser beam is irradiated to a position opposite to the development direction from the molecule as the sample in the development channel.
本発明では、まず、試料の前処理として加熱により溶解するゲル、すなわち、熱可溶性ゲルの表面または内部に測定対象となる被測定分子を含む試料溶液あるいは分散液を滴下等により導入し、溶媒のゲル中への浸透あるいは蒸発により試料をゲル表面近傍に担持、固定する。そして、展開用流路として溶媒を満たしたキャピラリーに試料を担持させたゲルを挿入することにより展開用流路への試料導入を行なうものである。そして、熱可溶性ゲルに担持した試料をゲルと共に加熱することにより、試料を溶媒中に遊離させ、遊離させた試料が拡散する前にレーザーを利用した衝撃波を発生させ、試料をキャピラリー中に展開して、分析を行なうものである。 In the present invention, as a pretreatment of a sample, first, a sample solution or dispersion containing a molecule to be measured to be measured is introduced dropwise or the like on the surface or inside of a heat-soluble gel, that is, a thermosoluble gel, The sample is supported and fixed in the vicinity of the gel surface by penetration or evaporation into the gel. The sample is introduced into the development channel by inserting a gel carrying the sample into a capillary filled with a solvent as the development channel. Then, the sample supported on the heat-soluble gel is heated together with the gel to release the sample in the solvent, generate a shock wave using a laser before the released sample diffuses, and develop the sample in the capillary. Analysis.
すなわち、この発明に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法は、測定対象となる被測定分子を含む試料を、加熱により溶解する熱可溶性ゲルの表面または内部に担持させる担持工程と、試料を担持させた熱可溶性ゲルを、溶媒を満たしたキャピラリー中に導入する導入工程と、キャピラリー中に挿入された熱可溶性ゲルを加熱により溶解させる溶解工程と、溶解工程の後、溶解した熱可溶性ゲル部分にパルスレーザーを照射して、レーザー誘起衝撃波を発生させる工程と、レーザー誘起衝撃波により発生させた衝撃波により溶媒中を移動した被測定分子を観測する観測工程と、観測工程により観測した被測定分子の移動を基に分子を分析する分析工程とを含む。
That is, the molecular analysis method using laser-induced shock waves according to the present invention includes a supporting step of supporting a sample containing a molecule to be measured to be measured on the surface or inside of a heat-soluble gel that is dissolved by heating, and a sample. An introduction step of introducing the supported heat-soluble gel into the capillary filled with the solvent, a dissolution step of dissolving the heat-soluble gel inserted in the capillary by heating, and a portion of the heat-soluble gel dissolved after the dissolution step Irradiating a laser with a pulse laser to generate a laser-induced shock wave, an observation process for observing a molecule to be measured that has moved through the solvent by the shock wave generated by the laser-induced shock wave, and a measurement molecule observed by the observation process And analyzing the molecule based on the movement.
このようなレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法によると、熱可溶性ゲルの表面または内部に被測定分子を含む試料を担持させるため、溶媒内において、分子を拡散させずに所定の位置に導入することができる。そして、レーザーによる誘起衝撃波を発生させる直前に熱可溶性ゲルを溶解させて、レーザー誘起衝撃波による分子の移動を行なわせることができる。そうすると、レーザー誘起衝撃波を発生させる前の分子の拡散等の影響を受けずに、レーザー誘起衝撃波により分子を移動させて、分子の分析を行なうことができる。この場合、上記した従来の吸着法において用いられる充填剤を用いないため、上記したような望ましくない吸着、すなわち、充填剤の表面での吸着が起こり得ず、高い分解能を達成することができる。したがって、容易に、かつ、適切に分子の分析を行うことができる。 According to such a molecular analysis method using laser-induced shock waves, a sample containing a molecule to be measured is supported on the surface or inside of a heat-soluble gel, so that the molecule is introduced into a predetermined position without diffusing in the solvent. can do. Then, the heat-soluble gel is dissolved immediately before the laser-induced shock wave is generated, and the molecules can be moved by the laser-induced shock wave. Then, the molecule can be analyzed by moving the molecule by the laser-induced shock wave without being affected by the diffusion of the molecule before the laser-induced shock wave is generated. In this case, since the filler used in the conventional adsorption method described above is not used, undesirable adsorption as described above, that is, adsorption on the surface of the filler cannot occur, and high resolution can be achieved. Therefore, molecular analysis can be easily and appropriately performed.
また、分析工程は、被測定分子の分子量分布または被測定分子の粒径分布を計測する工程を含む。特に、上記した分子の分析方法によると、分子の分子量分布や粒径分布を適切に計測することができる。 The analysis step includes a step of measuring the molecular weight distribution of the molecule to be measured or the particle size distribution of the molecule to be measured. In particular, according to the molecular analysis method described above, the molecular weight distribution and particle size distribution of the molecules can be appropriately measured.
さらに好ましくは、加熱工程は、電熱線による加熱またはＣＷ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｗａｖｅ）レーザーによる加熱を含む。このような加熱によると、試料を担持した熱可溶性ゲルを効率的に加熱溶解させることができる。 More preferably, the heating step includes heating with a heating wire or heating with a CW (Continuous Wave) laser. According to such heating, the heat-soluble gel carrying the sample can be efficiently heated and dissolved.
さらに好ましい一実施形態として、熱可溶性ゲルは、ゼラチン、寒天、アガロース、合成高分子、および低分子ゲルからなる群のうちのいずれかである。このような熱可溶性ゲルは、安価であり、かつ、取扱い性が良好である。 In a more preferred embodiment, the heat-soluble gel is any of the group consisting of gelatin, agar, agarose, synthetic polymer, and low molecular gel. Such a heat-soluble gel is inexpensive and has good handleability.
さらに好ましくは、観測工程は、被測定分子の光散乱、ラマン散乱、光吸収のいずれかを観測することにより行なう。このような観測により、より正確に分析を行なうことができる。 More preferably, the observation step is performed by observing any one of light scattering, Raman scattering, and light absorption of the molecule to be measured. Such observation enables more accurate analysis.
また、導入工程の前に、被測定分子の蛍光ラベル化を行なう工程を含み、観測工程は、蛍光ラベル化された被測定分子の観測を行なうようにしてもよい。 Further, before the introducing step, a step of fluorescently labeling the molecule to be measured may be included, and the observation step may observe the fluorescently labeled molecule to be measured.
このようなレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法によると、熱可溶性ゲルの表面または内部に被測定分子を含む試料を担持させるため、溶媒内において、分子を拡散させずに所定の位置に導入することができる。そして、レーザーによる誘起衝撃波を発生させる直前に熱可溶性ゲルを溶解させて、レーザー誘起衝撃波による分子の移動を行なわせることができる。そうすると、レーザー誘起衝撃波を発生させる前の分子の拡散等の影響を受けずに、レーザー誘起衝撃波により分子を移動させて、分子の分析を行なうことができる。この場合、上記した従来の吸着法において用いられる充填剤を用いないため、上記したような望ましくない吸着、すなわち、充填剤の表面での吸着が起こり得ず、高い分解能を達成することができる。したがって、容易に、かつ、適切に分子の分析を行うことができる。 According to such a molecular analysis method using laser-induced shock waves, a sample containing a molecule to be measured is supported on the surface or inside of a heat-soluble gel, so that the molecule is introduced into a predetermined position without diffusing in the solvent. can do. Then, the heat-soluble gel is dissolved immediately before the laser-induced shock wave is generated, and the molecules can be moved by the laser-induced shock wave. Then, the molecule can be analyzed by moving the molecule by the laser-induced shock wave without being affected by the diffusion of the molecule before the laser-induced shock wave is generated. In this case, since the filler used in the conventional adsorption method described above is not used, undesirable adsorption as described above, that is, adsorption on the surface of the filler cannot occur, and high resolution can be achieved. Therefore, molecular analysis can be easily and appropriately performed.
以下、この発明の実施の形態を、図面を参照して説明する。図１は、この発明の一実施形態に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法に用いられる測定装置の一部を示す概略図である。図１を参照して、レーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法に用いられる測定装置の構成について、簡単に説明する。なお、ここでは、分子の分子量分布を測定する場合について説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic view showing a part of a measuring apparatus used in a molecular analysis method using a laser-induced shock wave according to an embodiment of the present invention. With reference to FIG. 1, the structure of the measuring apparatus used for the analysis method of the molecule | numerator using a laser induced shock wave is demonstrated easily. Here, the case where the molecular weight distribution of molecules is measured will be described.
この発明の一実施形態に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分子量分布を測定する方法に用いられる測定装置１１は、衝撃波発生用のＹＡＧ（Ｙｔｔｒｉｕｍ Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ Ｇａｒｎｅｔ）レーザー１２と、パルスを発生させるパルスジェネレータ１３と、パルスジェネレータ１３を介してＹＡＧレーザー１２の動作を制御するコンピュータ１４ａと、後述する被測定分子を含む試料の取付けおよび観測を行なう顕微鏡１５と、試料観測用のＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）カメラ１６と、ＣＣＤカメラ１６により撮影した画像のデータを取り込んで、取り込んだ画像データを基にクロマトグラムを作成するコンピュータ１４ｂとを備える。ＹＡＧレーザー１２は、１０６４ｎｍパルスレーザーである。ＹＡＧレーザー１２により発せられるレーザー光は、顕微鏡１５に含まれる後述の対物レンズにより所定の位置に集光される。 A measuring device 11 used in a method for measuring a molecular weight distribution of a molecule using a laser-induced shock wave according to an embodiment of the present invention includes a YAG (Yttrium Aluminum Garnet) laser 12 for generating a shock wave, and a pulse generator for generating a pulse. 13, a computer 14a for controlling the operation of the YAG laser 12 via the pulse generator 13, a microscope 15 for mounting and observing a sample containing a molecule to be measured, which will be described later, and a CCD (Charge Coupled Device) camera for observing the sample 16 and a computer 14b that captures data of an image captured by the CCD camera 16 and creates a chromatogram based on the captured image data. The YAG laser 12 is a 1064 nm pulse laser. Laser light emitted from the YAG laser 12 is condensed at a predetermined position by an objective lens described later included in the microscope 15.
顕微鏡１５には、顕微鏡１５の外部に配置されたＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）１７からの光を顕微鏡１５内の所定の位置に導く光路１８が設けられている。光路１８は、ミラーユニット１９によって、顕微鏡１５に含まれるステージ２１までの方向を制御される。また、光路１８内に導かれる光のうちの赤外領域の光を吸収する赤外吸収フィルター２０も、光路１８内に設けられている。顕微鏡１５は、後述するキャピラリーを取り付けたサンプル３１を固定するステージ２１を含む。顕微鏡１５には、ステージ２１の上部側と下部側に２つの対物レンズ２２ａ、２２ｂが設けられている。ステージ２１の上部側に配置される第一の対物レンズ２２ａは、ＣＣＤカメラ１６による計測用の対物レンズであり、被測定分子を含む試料を撮影するために用いられる。第一の対物レンズ２２ａを介して、ＣＣＤカメラ１６により分子が観測され、ＣＣＤカメラ１６により撮影された画像がコンピュータ１４ｂに取り込まれる。ステージ２１の下部側に配置される第二の対物レンズ２２ｂは、ＹＡＧレーザー１２によるレーザー光を集光させるために用いられる。すなわち、キャピラリー内部の所定の集光位置を基点としたレーザーによる衝撃波を発生させるために用いられる。第二の対物レンズ２２ｂへのレーザー光の導入は、ミラー２３およびスペシャルフィルター２４を介して行なわれる。 The microscope 15 is provided with an optical path 18 that guides light from an LED (Light Emitting Diode) 17 disposed outside the microscope 15 to a predetermined position in the microscope 15. The direction of the optical path 18 to the stage 21 included in the microscope 15 is controlled by the mirror unit 19. An infrared absorption filter 20 that absorbs light in the infrared region of the light guided into the optical path 18 is also provided in the optical path 18. The microscope 15 includes a stage 21 for fixing a sample 31 to which a later-described capillary is attached. The microscope 15 is provided with two objective lenses 22 a and 22 b on the upper side and the lower side of the stage 21. The first objective lens 22a arranged on the upper side of the stage 21 is an objective lens for measurement by the CCD camera 16, and is used for photographing a sample containing a molecule to be measured. Molecules are observed by the CCD camera 16 via the first objective lens 22a, and an image taken by the CCD camera 16 is taken into the computer 14b. The second objective lens 22 b disposed on the lower side of the stage 21 is used for condensing the laser light from the YAG laser 12. That is, it is used to generate a shock wave by a laser having a predetermined condensing position inside the capillary as a base point. Laser light is introduced into the second objective lens 22 b through the mirror 23 and the special filter 24.
次に、被測定分子を含む試料を顕微鏡１５に取り付ける場合について説明する。被測定分子を含む試料は、キャピラリーの内部に導入された後に顕微鏡１５に設けられたステージ２１に取り付けられる。図２は、被測定分子を含む試料をキャピラリーに導入する場合における代表的な工程を示すフローチャートである。図３、図４、図５および図６は、この場合における試料の導入工程の一部を示す概略図である。 Next, a case where a sample including a molecule to be measured is attached to the microscope 15 will be described. A sample containing a molecule to be measured is introduced into the capillary and then attached to a stage 21 provided in the microscope 15. FIG. 2 is a flowchart showing typical steps when a sample containing a molecule to be measured is introduced into a capillary. 3, FIG. 4, FIG. 5 and FIG. 6 are schematic views showing a part of the sample introduction process in this case.
図２を参照して、まず、薄膜状とした熱可溶性ゲルを準備する（図２（Ａ））。この場合の熱可溶性ゲルとして、ゼラチン、寒天、アガロース、合成高分子、および低分子ゲルのうちのいずれかを用いる。ここで、測定対象の分子との相互作用を回避するためには、低分子ゲルを用いることが好ましい。以下、熱可溶性ゲルを単にゲルという。 Referring to FIG. 2, first, a heat-soluble gel having a thin film shape is prepared (FIG. 2A). In this case, any one of gelatin, agar, agarose, synthetic polymer, and low molecular gel is used as the heat-soluble gel. Here, in order to avoid interaction with the molecule to be measured, it is preferable to use a low molecular gel. Hereinafter, the heat-soluble gel is simply referred to as a gel.
次に、この薄膜状のゲルの表面に被測定分子を含む試料溶液を滴下等して配置させる（図２（Ｂ））。その後、試料溶液の溶媒は、蒸発あるいはゲル中に浸透する。このようにして、ゲル表面層に被測定対象となる分子を含む試料が担持された薄膜状のゲルを作成する（図２（Ｃ））。この状態の概略図を図３に示す。図３を参照して、薄膜状のゲル３２の上部側の表面に被測定分子を含む試料３３が担持されている。 Next, a sample solution containing the molecule to be measured is placed on the surface of the thin film gel by dropping or the like (FIG. 2B). Thereafter, the solvent of the sample solution evaporates or penetrates into the gel. In this way, a thin-film gel is prepared in which a sample containing molecules to be measured is supported on the gel surface layer (FIG. 2C). A schematic diagram of this state is shown in FIG. Referring to FIG. 3, a sample 33 containing a molecule to be measured is carried on the upper surface of thin film gel 32.
次に、図４を参照して、その内部に水などの溶媒３４を満たしたキャピラリー３５を準備する。キャピラリー３５は、柱状であって、その内部に空洞を有する。すなわち、キャピラリー３５は、筒状である。また、キャピラリー３５の少なくとも一方端部３６側は、開口している。キャピラリー３５は、透明であって、キャピラリー３５を構成する壁部３７を介して、その内部を外部側から視認することができる。すなわち、キャピラリー３５の内部に充填された溶媒３４等を、その外部から壁部３７を介して見ることができる。キャピラリー３５の材質は、ガラスや高分子樹脂材料が用いられる。キャピラリー３５の内部には、測定する分子に応じた溶媒３４が充填されている。 Next, referring to FIG. 4, a capillary 35 filled with a solvent 34 such as water is prepared. The capillary 35 is columnar and has a cavity therein. That is, the capillary 35 is cylindrical. Further, at least one end 36 side of the capillary 35 is open. The capillary 35 is transparent, and the inside of the capillary 35 can be viewed from the outside through the wall portion 37 constituting the capillary 35. That is, the solvent 34 or the like filled in the capillary 35 can be seen from the outside through the wall portion 37. As the material of the capillary 35, glass or a polymer resin material is used. The inside of the capillary 35 is filled with a solvent 34 corresponding to the molecule to be measured.
その後、溶媒３４を充填したキャピラリー３５の内部に、ゲル３２によって担持された試料３３を導入する。具体的には、試料３３を担持させたゲル３２の上部側から、開口したキャピラリー３５の一方端部３６を突き刺す（図２（Ｄ）、図５）。このようにして、キャピラリー３５の内部にゲル３２に担持された試料３３を導入する（図２（Ｅ）、図６）。この場合、導入された試料３３は、キャピラリー３５の一方端部３６側の近傍に配置されることになる。また、キャピラリー３５の他方端部（図示せず）からは余剰の溶媒３４が排出される。 Thereafter, the sample 33 supported by the gel 32 is introduced into the capillary 35 filled with the solvent 34. Specifically, one end 36 of the opened capillary 35 is pierced from the upper side of the gel 32 carrying the sample 33 (FIGS. 2D and 5). In this way, the sample 33 carried on the gel 32 is introduced into the capillary 35 (FIGS. 2E and 6). In this case, the introduced sample 33 is arranged in the vicinity of the one end 36 side of the capillary 35. Excess solvent 34 is discharged from the other end (not shown) of the capillary 35.
このようにして、ゲル３２に担持された試料３３を導入したキャピラリー３５を準備する。こうすることにより、被測定分子を含む試料３３はゲル３２によって担持、固定されているため、溶媒３４側へ分子が拡散することはない。 Thus, the capillary 35 into which the sample 33 supported on the gel 32 is introduced is prepared. By doing so, since the sample 33 containing the molecule to be measured is supported and fixed by the gel 32, the molecule does not diffuse to the solvent 34 side.
次に、準備したキャピラリー３５を測定装置１１に固定する。具体的には、顕微鏡１５に設けられたステージ２１の上部側の所定の位置に固定するようにして取り付ける。ここで、キャピラリー３５は、取り付け部材３８を用いて取り付けられる。取り付け部材３８の構成について簡単に説明すると、図７を参照して、取り付け部材３８は、薄板状であって、その一部に大きな切り欠き３９を有する。切り欠き３９により、取り付け部材３８は、板厚方向から見た場合に、略コの字状となっている。そして、切り欠き３９の中央部には、柱状のキャピラリー３５を差し込むようにして取り付ける取り付け穴４０が設けられている。キャピラリー３５は、試料３３が導入された一方端部３６側と反対側の端部を取り付け穴４０に突き刺すようにして取り付けられる。なお、図７の右側部分で、一方端部３６の拡大図を示している。 Next, the prepared capillary 35 is fixed to the measuring device 11. Specifically, it is attached so as to be fixed at a predetermined position on the upper side of the stage 21 provided in the microscope 15. Here, the capillary 35 is attached using an attachment member 38. The configuration of the mounting member 38 will be briefly described. Referring to FIG. 7, the mounting member 38 is thin plate-shaped and has a large notch 39 in a part thereof. Due to the notch 39, the attachment member 38 is substantially U-shaped when viewed from the thickness direction. An attachment hole 40 is provided at the center of the cutout 39 to attach the columnar capillary 35 so as to be inserted. The capillary 35 is attached so that the end opposite to the one end 36 where the sample 33 is introduced is pierced into the attachment hole 40. In addition, the enlarged view of the one end part 36 is shown in the right part of FIG.
キャピラリー３５のうち、試料３３が導入された一方端部３６の外周領域には、電熱線４１が巻かれている。端部３６は、電熱線４１への通電により加熱可能となっている。電熱線４１については、上記した２つの対物レンズ２２ａ、２２ｂにおけるレーザー光の集光およびＣＣＤカメラ１６による撮影を阻害する位置を避けて巻かれている。 A heating wire 41 is wound around an outer peripheral region of the one end portion 36 where the sample 33 is introduced in the capillary 35. The end 36 can be heated by energizing the heating wire 41. The heating wire 41 is wound around a position where the above-described two objective lenses 22a and 22b interfere with the collection of the laser light and the photographing by the CCD camera 16.
次に、この発明の一実施形態に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分子量分布の測定方法について説明する。図８は、この場合における分子量分布の測定法方の代表的な工程を示すフローチャートである。図１〜図８を参照して、まず、上記したように試料３３を担持したゲル３２を導入したキャピラリー３５を取り付けたサンプル３１をステージ２１の所定の位置に取り付ける（図８（Ａ））。そして、電熱線４１への通電により電熱線４１を加熱し、試料３３を溶媒３４中に溶解させる（図８（Ｂ））。 Next, a method for measuring the molecular weight distribution of molecules using laser-induced shock waves according to an embodiment of the present invention will be described. FIG. 8 is a flowchart showing typical steps of the method for measuring the molecular weight distribution in this case. With reference to FIGS. 1-8, first, the sample 31 which attached the capillary 35 which introduce | transduced the gel 32 which carry | supported the sample 33 as mentioned above is attached to the predetermined position of the stage 21 (FIG. 8 (A)). Then, the heating wire 41 is heated by energizing the heating wire 41, and the sample 33 is dissolved in the solvent 34 (FIG. 8B).
その後、レーザーによる誘起衝撃波を発生させる（図８（Ｃ））。この場合、分子の移動方向と反対側の位置、具体的にはゲル３２が配置されている位置を集光位置とする。そして、被測定分子を衝撃波により溶媒３４中を移動させる。この場合、溶媒３４は、分子量が小さいため衝撃波により粘性抵抗を受けて移動することはない。すなわち、被測定分子の分子量の大きさに応じて移動量が大きくなるように、分子が移動する。その後、移動させた分子の像について、第一の対物レンズ２２ａを介してＣＣＤカメラ１６により撮影する（図８（Ｄ））。撮影した画像を基にクロマトグラムを作成し、試料３３中に含まれる被測定分子の分子量分布を測定する（図８（Ｅ））。 After that, an induced shock wave by a laser is generated (FIG. 8C). In this case, the position opposite to the moving direction of the molecules, specifically, the position where the gel 32 is arranged is set as the light collecting position. Then, the molecule to be measured is moved in the solvent 34 by a shock wave. In this case, since the solvent 34 has a small molecular weight, it does not move due to viscous resistance due to the shock wave. That is, the molecules move so that the amount of movement increases according to the molecular weight of the molecule to be measured. Thereafter, the image of the moved molecule is photographed by the CCD camera 16 through the first objective lens 22a (FIG. 8D). A chromatogram is created based on the photographed image, and the molecular weight distribution of the molecule to be measured contained in the sample 33 is measured (FIG. 8E).
すなわち、この発明に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分子量分布の測定方法は、測定対象となる被測定分子を含む試料を、加熱により溶解するゲルの表面に担持させる担持工程と、試料を担持させたゲルを、溶媒を満たしたキャピラリー中に導入する導入工程と、キャピラリー中に挿入されたゲルを加熱により溶解させる溶解工程と、溶解工程の後、溶解した熱可溶性ゲル部分にパルスレーザーを照射して、レーザー誘起衝撃波を発生させる工程と、レーザー誘起衝撃波により発生させた衝撃波により溶媒中を移動した被測定分子を観測する観測工程と、観測工程により観測した被測定分子の移動を基に分子の分子量分布を測定する工程とを含む。
That is, the method for measuring the molecular weight distribution of molecules using laser-induced shock waves according to the present invention includes a supporting step for supporting a sample containing a molecule to be measured on a surface of a gel that is dissolved by heating, and a sample supporting The introduced gel into a capillary filled with a solvent, a dissolution process in which the gel inserted in the capillary is dissolved by heating, and after the dissolution process, the melted gel is irradiated with a pulse laser Based on the steps of generating the laser-induced shock wave, the observation step of observing the molecule to be measured that has moved in the solvent by the shock wave generated by the laser-induced shock wave, and the movement of the molecule to be measured observed in the observation step Measuring the molecular weight distribution.
このようなレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分子量分布の測定方法によると、ゲルの表面に被測定分子を含む試料を担持させるため、溶媒内において、分子を拡散させずにキャピラリー内の所定の位置に導入することができる。そして、レーザーによる誘起衝撃波を発生させる直前にゲルを溶解させて、レーザー誘起衝撃波による分子の移動を行なわせることができる。そうすると、レーザー誘起衝撃波を発生させる前の分子の拡散等の影響を受けずに、レーザー誘起衝撃波により分子を移動させて、分子の分子量分布の測定を行なうことができる。この場合、上記した従来の吸着法において用いられる充填剤を用いないため、上記したような望ましくない吸着、すなわち、充填剤の表面での吸着が起こり得ず、高い分解能を達成することができる。したがって、容易に、かつ、適切に分子の分子量分布の測定を行うことができる。 According to the method for measuring the molecular weight distribution of molecules using such a laser-induced shock wave, the sample containing the molecule to be measured is supported on the surface of the gel. Can be introduced. Then, the gel can be dissolved immediately before generating the laser-induced shock wave, and molecules can be moved by the laser-induced shock wave. Then, the molecular weight distribution of the molecule can be measured by moving the molecule by the laser-induced shock wave without being affected by the diffusion of the molecule before the laser-induced shock wave is generated. In this case, since the filler used in the conventional adsorption method described above is not used, undesirable adsorption as described above, that is, adsorption on the surface of the filler cannot occur, and high resolution can be achieved. Therefore, the molecular weight distribution of the molecule can be measured easily and appropriately.
この場合、透明のキャピラリーを用いているため、キャピラリーの内部を容易に外部から視認することができる。すなわち、キャピラリーの内部に導入された被測定分子を含む試料の視認が容易となる。 In this case, since a transparent capillary is used, the inside of the capillary can be easily visually recognized from the outside. That is, the sample including the molecule to be measured introduced into the capillary can be easily viewed.
また、この場合、ゲルの表面に被測定分子を含む試料を担持し、キャピラリーを突き刺すようにして被測定分子を含む試料を担持したゲルをキャピラリー内部に導入しているため、簡易な方法および構成でキャピラリー内部に試料を導入することができる。 In this case, the sample containing the molecule to be measured is carried on the surface of the gel, and the gel carrying the sample containing the molecule to be measured is introduced into the capillary so as to pierce the capillary. Thus, the sample can be introduced into the capillary.
なお、上記構成については、分子の粒径分布を測定する場合についても適用可能である。すなわち、この発明に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の粒径分布の測定方法は、測定対象となる被測定分子を含む試料を、加熱により溶解するゲルの表面に担持させる担持工程と、試料を担持させたゲルを、溶媒を満たしたキャピラリー中に導入する導入工程と、キャピラリー中に挿入されたゲルを加熱により溶解させる溶解工程と、溶解工程の後、溶解した熱可溶性ゲル部分にパルスレーザーを照射して、レーザー誘起衝撃波を発生させる工程と、レーザー誘起衝撃波により発生させた衝撃波により溶媒中を移動した被測定分子を観測する観測工程と、観測工程により観測した被測定分子の移動を基に分子の粒径分布を測定する工程とを含む。 In addition, about the said structure, it is applicable also when measuring the particle size distribution of a molecule | numerator. That is, the method for measuring the particle size distribution of molecules using laser-induced shock waves according to the present invention includes a supporting step for supporting a sample containing a molecule to be measured on a surface of a gel that is dissolved by heating, and a sample. An introduction step of introducing the supported gel into a capillary filled with a solvent, a dissolution step of dissolving the gel inserted into the capillary by heating, and a pulse laser is applied to the dissolved thermosoluble gel portion after the dissolution step. Irradiation to generate a laser-induced shock wave, an observation process to observe a molecule to be measured that has moved through the solvent by the shock wave generated by the laser-induced shock wave, and a movement of the molecule to be measured observed in the observation process Measuring the particle size distribution of the molecules.
このようなレーザー誘起衝撃波を利用した分子の粒径分布の測定方法によると、ゲルの表面に被測定分子を含む試料を担持させるため、溶媒内において、分子を拡散させずにキャピラリー内の所定の位置に導入することができる。そして、レーザーによる誘起衝撃波を発生させる直前にゲルを溶解させて、レーザー誘起衝撃波による分子の移動を行なわせることができる。そうすると、レーザー誘起衝撃波を発生させる前の分子の拡散等の影響を受けずに、レーザー誘起衝撃波により分子を移動させて、分子の粒径分布の測定を行なうことができる。したがって、容易に、かつ、適切に分子の粒径分布の測定を行うことができる。 According to such a method for measuring the particle size distribution of molecules using laser-induced shock waves, a sample containing molecules to be measured is supported on the surface of the gel. Can be introduced into the position. Then, the gel can be dissolved immediately before generating the laser-induced shock wave, and molecules can be moved by the laser-induced shock wave. As a result, the particle size distribution of the molecules can be measured by moving the molecules by the laser-induced shock wave without being affected by the diffusion of the molecules before the laser-induced shock wave is generated. Therefore, it is possible to easily and appropriately measure the particle size distribution of molecules.
ここで、この発明の一実施形態に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分子量分布の測定方法において、ゼラチンの分子量分布を測定する方法について説明する。まず、魚ゼラチンおよびアルカリ処理を行った牛骨ゼラチンをＦＩＴＣ−Ｉ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）により蛍光ラベル化し、ｐＨ１０．００の緩衝溶液に加熱溶解させ、被測定分子を含む試料とした。試料を担持するゲルとしてのゼラチン溶液は、厚み約３ｍｍでシャーレに展開し、冷却してゲル化したものを用いた。 Here, the method for measuring the molecular weight distribution of gelatin in the method for measuring the molecular weight distribution of molecules using laser-induced shock waves according to an embodiment of the present invention will be described. First, fish gelatin and beef bone gelatin that had been subjected to alkali treatment were fluorescently labeled with FITC-I (Fluorescein-4-isothiocynate), dissolved by heating in a buffer solution of pH 10.00, and used as a sample containing a molecule to be measured. As the gelatin solution as a gel supporting the sample, a gelatin solution having a thickness of about 3 mm, developed on a petri dish, and cooled to gel was used.
また、上記した図２〜図６に示すように、緩衝溶液を満たした内径１４０μｍのガラスキャピラリーを薄膜状のゲルに突き刺し、キャピラリーの先端部内にゲルを約５００μｍの長さで導入したものを作成した。キャピラリーは、図７に示すように固定し、測定直前に１．５Ｖの電圧をかけた電熱線により先端部を加熱し、内部のゼラチンゲルを溶解させた。 Also, as shown in FIGS. 2 to 6 described above, a glass capillary with an inner diameter of 140 μm filled with a buffer solution was stabbed into a thin-film gel, and the gel was introduced into the tip of the capillary at a length of about 500 μm. did. The capillary was fixed as shown in FIG. 7, and the tip was heated by a heating wire to which a voltage of 1.5 V was applied immediately before the measurement to dissolve the gelatin gel inside.
再び図１を参照して、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザーの基本波（１０６４ｎｍ、半値幅６ｎｓ、６０μＪ）を、正立型顕微鏡の下方より２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．４６）を用いて、キャピラリー内部のゲル溶解部分（溶解したゼラチン−緩衝溶液界面から試料側におおよそ５０μｍ）に集光、照射を行い、キャピラリー内部で衝撃波を発生させた。ここで、ゼラチン試料は、緩衝溶液側に展開する。 Referring to FIG. 1 again, the fundamental wave of the pulse Nd: YAG laser (1064 nm, half width 6 ns, 60 μJ) is used with an objective lens (NA = 0.46) 20 times from below the upright microscope. The gel-dissolved portion inside the capillary (approximately 50 μm from the dissolved gelatin-buffer solution interface to the sample side) was focused and irradiated to generate a shock wave inside the capillary. Here, the gelatin sample is developed on the buffer solution side.
展開したゼラチン試料は、青色ＬＥＤ（４Ｗ、波長４５０〜５００ｎｍ）を照明光とし、４倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．１６）を集光レンズとする落射照明系によりＦＩＴＣを励起し、蛍光像を観測した。観測画像を、図９、図１０、および図１１に示す。図９は、ＦＩＴＣラベル化した魚ゼラチンのレーザー誘起衝撃波による展開前の蛍光像を示す画像である。図１０は、ＦＩＴＣラベル化した魚ゼラチンのレーザー誘起衝撃波による展開後の蛍光像を示す画像である。図１１は、ＦＩＴＣラベル化した魚ゼラチンのレーザー誘起衝撃波による展開前後の蛍光強度差を示す画像である。このような蛍光強度差を導き出すことにより、観測時における散乱光の影響等を排除し、展開前後の蛍光強度の差をより正確に把握することができる。蛍光像は、対物レンズとリレーレンズにより顕微鏡上部に取り付けた冷却ＣＣＤカメラにより撮影された。図９等の中の縦軸および横軸で示す目盛りについて、図９以降の蛍光画像の１ピクセルは、４．１７μｍ×４．１７μｍに相当する。また、図１０において矢印で示す位置は、衝撃波発生点を示す。以下に示す図１５、図２０、図２３および図２６中の矢印においても同様である。 The developed gelatin sample was excited by FITC by an epi-illumination system using a blue LED (4 W, wavelength 450 to 500 nm) as illumination light and a 4 × objective lens (NA = 0.16) as a condensing lens. Was observed. Observation images are shown in FIG. 9, FIG. 10, and FIG. FIG. 9 is an image showing a fluorescence image of fish gelatin labeled with FITC before development by laser-induced shock waves. FIG. 10 is an image showing a fluorescence image of the FITC-labeled fish gelatin after development by laser-induced shock waves. FIG. 11 is an image showing a difference in fluorescence intensity between before and after the development of FITC-labeled fish gelatin by a laser-induced shock wave. By deriving such a fluorescence intensity difference, it is possible to eliminate the influence of scattered light at the time of observation and grasp the difference in fluorescence intensity before and after deployment more accurately. The fluorescence image was taken with a cooled CCD camera attached to the top of the microscope with an objective lens and a relay lens. With respect to the scales indicated by the vertical and horizontal axes in FIG. 9 and the like, one pixel of the fluorescence image in FIG. 9 and subsequent figures corresponds to 4.17 μm × 4.17 μm. Moreover, the position shown by the arrow in FIG. 10 shows a shock wave generation point. The same applies to the arrows in FIGS. 15, 20, 23, and 26 shown below.
撮影された蛍光画像は、レーザー照射前の強度との差を取った後、展開方向と垂直に積分され、図１２に示すような展開方向に関する試料の濃度分布に対応する蛍光強度分布に変換される。 After taking the difference from the intensity before laser irradiation, the photographed fluorescence image is integrated perpendicularly to the development direction and converted into a fluorescence intensity distribution corresponding to the concentration distribution of the sample in the development direction as shown in FIG. The
牛骨由来のＦＩＴＣラベル化ゼラチンを同様にｐＨ１０．００の緩衝溶液で満たした内径１４０μｍのキャピラリーの先端に導入、加熱の後、レーザー誘起衝撃波によりキャピラリー中に展開した牛骨ゼラチンの分布をＣＣＤカメラで蛍光観測した。図１３、図１４、図１５に衝撃波発生前後の蛍光画像、および衝撃波発生前後の蛍光画像の差を示す。図１３は、ＦＩＴＣラベル化した牛骨ゼラチンのレーザー誘起衝撃波による展開前の蛍光像を示す画像である。図１４は、ＦＩＴＣラベル化した牛骨ゼラチンのレーザー誘起衝撃波による展開後の蛍光像を示す画像である。図１５は、ＦＩＴＣラベル化した牛骨ゼラチンのレーザー誘起衝撃波による展開前後の蛍光強度差を示す画像である。図１６は、図１５に示す蛍光強度差の画像を積分して得られたクロマトグラムを示す図である。 The distribution of bovine bone gelatin developed in the capillary by laser-induced shock waves after heating was introduced into the tip of a capillary with an inner diameter of 140 μm, similarly filled with bovine bone FITC-labeled gelatin with a pH 10.00 buffer solution. Fluorescence was observed at. FIGS. 13, 14 and 15 show the difference between the fluorescence images before and after the shock wave generation and the fluorescence images before and after the shock wave generation. FIG. 13 is an image showing a fluorescence image of FITC-labeled bovine bone gelatin before development by laser-induced shock waves. FIG. 14 is an image showing a fluorescence image of FITC-labeled bovine bone gelatin after development by laser-induced shock waves. FIG. 15 is an image showing the fluorescence intensity difference before and after the development of FITC-labeled bovine bone gelatin by laser-induced shock waves. FIG. 16 is a diagram showing a chromatogram obtained by integrating the fluorescence intensity difference image shown in FIG.
また、図１７は、魚ゼラチンおよび牛骨ゼラチンのＧＰＣチャートを示すグラフである。図１７に示すように、魚ゼラチンおよび牛骨ゼラチンのゲル浸透クロマトグラム（ＧＰＣ：Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）では、ゼラチンは、コラーゲン三本鎖複合体の分解により得られる、分子量がそれぞれ約１０万、約２０万、約３０万の一本鎖、二本鎖、三本鎖コラーゲンによって構成され、これらの単位タンパク質分子鎖の加水分解により分子量分布が広がる。このＧＰＣチャートを波形分離し、図１２、図１６のクロマトグラムを波形分離して各成分の比較を行なった。結果を表１に示す。 FIG. 17 is a graph showing a GPC chart of fish gelatin and beef bone gelatin. As shown in FIG. 17, in gel permeation chromatograms (GPC: Gel Permeation Chromatography) of fish gelatin and bovine bone gelatin, gelatin has molecular weights of about 100,000 and about respectively obtained by degradation of a collagen triple chain complex. It is composed of 200,000, about 300,000 single chain, double chain, and triple chain collagens, and the molecular weight distribution is expanded by hydrolysis of these unit protein molecular chains. The GPC chart was waveform-separated, and the chromatograms of FIGS. 12 and 16 were waveform-separated to compare each component. The results are shown in Table 1.
タンパク質分子鎖の数が複数あるコラーゲンは、ＦＩＴＣ分子が複数ラベル化されているため、蛍光積分強度をタンパク質分子鎖の数で除し、規格化を行なうとＧＰＣによる分析結果がよい一致を示す。 Collagen having a plurality of protein molecular chains has a plurality of FITC molecules labeled. Therefore, when the fluorescence integrated intensity is divided by the number of protein molecular chains and normalized, the analysis results by GPC show good agreement.
次に、この発明の一実施形態に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の粒径分布の測定方法において、分子の粒径分布を測定する方法について説明する。 Next, a method for measuring the particle size distribution of molecules in the method for measuring the particle size distribution of molecules using laser-induced shock waves according to an embodiment of the present invention will be described.
まず、上記と同様に、魚ゼラチンをｐＨ１０．００の緩衝溶液に加熱溶解させた。ゼラチン溶液は、厚み約３ｍｍでシャーレに展開し、冷却してゲル化させた。セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｑｄｏｔ５６５ＩＴＫＴＭｃａｒｂｏｘｙｌ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ：直径４．６ｎｍ、Ｑｄｏｔ６５５ＩＴＫＴＭｃａｒｂｏｘｙｌ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ：短径６ｎｍ、長径１２ｎｍ、以下それぞれ「Ｑｄｏｔ５６５」、「Ｑｄｏｔ６５５」と略す）の分散液、あるいはそれらの混合物をゲル上に展開し、緩衝溶液を満たした内径１４０μｍのガラスキャピラリーをゲル薄膜に突き刺し、キャピラリーの先端部内にゲルを約５００μｍの長さで導入したものを用いた。 First, in the same manner as described above, fish gelatin was heated and dissolved in a buffer solution having a pH of 10.00. The gelatin solution was developed in a petri dish with a thickness of about 3 mm, and cooled to be gelled. Cadmium selenide (CdSe) nanoparticles (manufactured by Invitrogen, USA, Qdot 565ITK ™ carboyl quantum dots: diameter 4.6 nm, Qdot 655ITK ™ carbox quantum dots, length 6 nm, 56 nm The dispersion liquid or mixture thereof was spread on a gel, a glass capillary with an inner diameter of 140 μm filled with a buffer solution was pierced into the gel thin film, and the gel was introduced into the tip of the capillary at a length of about 500 μm. .
電熱線により先端部を加熱し、内部のゼラチンゲルを溶解させた後、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザーの基本波（１０６４ｎｍ、半値幅６ｎｓ、６０μＪ）を、正立型顕微鏡の下方より２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．４６）を用いて、キャピラリー内部のゲル溶解部分（溶解したゼラチン−緩衝溶液界面から試料側に約５０μｍ）に集光、照射を行い、キャピラリー内部で衝撃波を発生させた。 The tip is heated by heating wire to dissolve the gelatin gel inside, and then the fundamental wave of the pulse Nd: YAG laser (1064 nm, half width 6 ns, 60 μJ) is 20 times the objective lens from below the upright microscope. (NA = 0.46) was used to collect and irradiate the gel-dissolved portion inside the capillary (about 50 μm from the dissolved gelatin-buffer solution interface to the sample side) to generate a shock wave inside the capillary.
展開したゼラチン試料は、緑色ＬＥＤ（４Ｗ、波長５００〜５４０ｎｍ）を照明光とし、４倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．１６）を集光レンズとする落射照明系によりＱｄｏｔ粒子を励起し、蛍光像を冷却ＣＣＤカメラにより観測した。蛍光画像の処理は、ゼラチンの例と同様に行った。 The developed gelatin sample was excited by Qdot particles by an epi-illumination system using a green LED (4 W, wavelength 500 to 540 nm) as illumination light and a 4 × objective lens (NA = 0.16) as a condenser lens, and fluorescent. The image was observed with a cooled CCD camera. The fluorescent image was processed in the same manner as the gelatin example.
図１８は、Ｑｄｏｔ６５５のレーザー誘起衝撃波による展開前の蛍光像を示す画像である。図１９は、Ｑｄｏｔ６５５のレーザー誘起衝撃波による展開後の蛍光像を示す画像である。図２０は、Ｑｄｏｔ６５５のレーザー誘起衝撃波による展開前後の蛍光強度差を示す画像である。図２１は、Ｑｄｏｔ５６５のレーザー誘起衝撃波による展開前の蛍光像を示す画像である。図２２は、Ｑｄｏｔ５６５のレーザー誘起衝撃波による展開後の蛍光像を示す画像である。図２３は、Ｑｄｏｔ５６５のレーザー誘起衝撃波による展開前後の蛍光強度差を示す画像である。図２４は、Ｑｄｏｔ５６５およびＱｄｏｔ６５５の混合試料（１：５）のレーザー誘起衝撃波による展開前の蛍光像を示す画像である。図２５は、Ｑｄｏｔ５６５およびＱｄｏｔ６５５の混合試料（１：５）のレーザー誘起衝撃波による展開後の蛍光像を示す画像である。図２６は、Ｑｄｏｔ５６５およびＱｄｏｔ６５５の混合試料（１：５）のレーザー誘起衝撃波による展開前後の蛍光強度差を示す画像である。図２７は、図２６に示す蛍光強度差の画像を積分して得られたクロマトグラムを示す図である。 FIG. 18 is an image showing a fluorescence image of Qdot 655 before development by a laser-induced shock wave. FIG. 19 is an image showing a fluorescence image after development by a laser-induced shock wave of Qdot655. FIG. 20 is an image showing the difference in fluorescence intensity between before and after the development of Qdot 655 due to the laser-induced shock wave. FIG. 21 is an image showing a fluorescence image before development by a laser-induced shock wave of Qdot565. FIG. 22 is an image showing a fluorescence image after development by a laser-induced shock wave of Qdot565. FIG. 23 is an image showing the difference in fluorescence intensity between before and after the development of the Qdot 565 due to the laser-induced shock wave. FIG. 24 is an image showing a fluorescence image of a mixed sample of Qdot 565 and Qdot 655 (1: 5) before development by a laser-induced shock wave. FIG. 25 is an image showing a fluorescence image after development of a mixed sample of Qdot 565 and Qdot 655 (1: 5) by a laser-induced shock wave. FIG. 26 is an image showing the difference in fluorescence intensity between before and after the development of the mixed sample of Qdot 565 and Qdot 655 (1: 5) by the laser-induced shock wave. FIG. 27 is a diagram showing a chromatogram obtained by integrating the fluorescence intensity difference image shown in FIG.
図１８〜図２７を参照して、蛍光強度差の画像は、Ｑｄｏｔ６５５がＱｄｏｔ５６５よりも長い距離に分布していることを示しており、混合物では広い範囲にそれらが分布していることを示している。図２７に示すように、移動方向、すなわち、キャピラリー長さ方向の各位置に対して、その垂直方向に対する蛍光の積分強度をプロットしたクロマトグラムを作成すると、Ｑｄｏｔ６５５とＱｄｏｔ５６５の各成分は、移動距離が異なることが判る。また、混合物がそれぞれの単一試料の場合と同じ移動距離のところに分布することを示すピークが見られたことは、衝撃波によるナノ粒子の分離が行なわれたことを示している。また、波形分離により両者の成分に分け、それらの定量分析が可能であることは、上記したゼラチンの場合と同様である。なお、Ｑｄｏｔ６５５において、１００μｍ付近に負の蛍光強度差を示しているが、図１８〜図２０との比較を行なうと、これは泡の発生によるものであることが判る。すなわち、図２０に示される蛍光強度差を参照すれば判るように、矢印で示す点から右側にある黒点は、衝撃波を発生した際に泡が生じたことを意味し、この泡の影響で、蛍光強度差として負の値になっていると推測できる。 Referring to FIGS. 18-27, the fluorescence intensity difference images show that Qdot 655 is distributed over a longer distance than Qdot 565, indicating that they are distributed over a wide range in the mixture. Yes. As shown in FIG. 27, when a chromatogram in which the integrated intensity of fluorescence with respect to the vertical direction is plotted for each position in the moving direction, that is, in the capillary length direction, each component of Qdot 655 and Qdot 565 becomes a moving distance. Is different. In addition, the fact that the peak indicating that the mixture is distributed at the same moving distance as in the case of each single sample was observed indicates that the nanoparticles were separated by shock waves. Further, as in the case of gelatin as described above, both components can be separated by waveform separation and quantitative analysis thereof can be performed. In addition, in Qdot 655, a negative fluorescence intensity difference is shown in the vicinity of 100 μm, but when compared with FIGS. 18 to 20, it can be seen that this is due to generation of bubbles. That is, as can be seen by referring to the difference in fluorescence intensity shown in FIG. 20, the black dot on the right side from the point indicated by the arrow means that bubbles are generated when a shock wave is generated. It can be estimated that the fluorescence intensity difference is a negative value.
以上より、この発明に係るレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分子量分布の測定方法および粒径分布の測定方法によると、容易に、かつ、適切に分子の分子量分布および粒径分布の測定を行うことができる。 As described above, according to the molecular weight distribution measurement method and the particle size distribution measurement method using the laser-induced shock wave according to the present invention, the molecular weight distribution and the particle size distribution of the molecule can be easily and appropriately measured. Can do.
なお、上記の実施の形態においては、試料を導入した側のキャピラリーの一方端部に電熱線を巻き付け、電熱線に通電することによりゲルを加熱溶解させることとしたが、これに限らず、例えば、試料を導入した側のキャピラリーの一方端部側に集光するようにＣＷレーザーを照射するようにして試料を導入した側のキャピラリーの一方端部を加熱し、ゲルを溶解させるようにしてもよい。すなわち、加熱工程は、電熱線による加熱またはＣＷレーザーによる加熱を含む。このような加熱によると、試料を担持した熱可溶性ゲルを効率的に加熱溶解させることができる。 In the above embodiment, the heating wire is wound around one end of the capillary on the side where the sample is introduced, and the gel is heated and dissolved by energizing the heating wire. The CW laser is irradiated so that the light is focused on one end of the capillary on the side where the sample is introduced, and one end of the capillary on the side where the sample is introduced is heated to dissolve the gel. Good. That is, the heating step includes heating with a heating wire or heating with a CW laser. According to such heating, the heat-soluble gel carrying the sample can be efficiently heated and dissolved.
また、上記の実施の形態においては、分子を蛍光ラベル化し、観測工程は、分子から発せられる蛍光を観測することにより行なったが、これに限らず、観測工程は、被測定分子の光散乱、ラマン散乱、光吸収のいずれかを観測することにより行なう。このような観測により、より正確に分析を行なうことができる。 In the above embodiment, the molecule is fluorescently labeled, and the observation step is performed by observing the fluorescence emitted from the molecule. However, the observation step is not limited to this, the light scattering of the molecule to be measured, This is done by observing either Raman scattering or light absorption. Such observation enables more accurate analysis.
なお、上記の実施の形態においては、ゲルの表面に被測定分子を含む試料を担持することとしたが、これに限らず、ゲルの内部に被測定分子を含む試料を担持させるようにしてもよい。具体的には、例えば、ゲルの内部に被測定分子を含む試料を注射器状のもので注入するようにしてもよいし、上記したようにゲルの表面に試料を担持させた後、さらにその上部にゲルを配置するようにしてもよい。こうすることにより、より効果的に測定前、すなわち、レーザーによる誘起衝撃波を利用した分子の移動の前における分子の拡散の抑制を行なうことができる。 In the above embodiment, the sample containing the molecule to be measured is carried on the surface of the gel. However, the present invention is not limited to this, and the sample containing the molecule to be measured may be carried inside the gel. Good. Specifically, for example, a sample containing the molecule to be measured may be injected into the inside of the gel with a syringe, or after the sample is supported on the surface of the gel as described above, the upper part You may make it arrange | position gel. By doing so, it is possible to more effectively suppress the diffusion of molecules before the measurement, that is, before the movement of the molecules using the induced shock wave by the laser.
また、上記の実施の形態においては、分子の分析方法として、分子の分子量分布および分子の粒径分布を測定することとしたが、これに限らず、他の分析方法を行なう際にも有効に適用される。 In the above embodiment, the molecular weight distribution and the molecular particle size distribution are measured as the molecular analysis method. However, the present invention is not limited to this, and it is effective when performing other analysis methods. Applied.
以上、図面を参照してこの発明の実施形態を説明したが、この発明は、図示した実施形態のものに限定されない。図示した実施形態に対して、この発明と同一の範囲内において、あるいは均等の範囲内において、種々の修正や変形を加えることが可能である。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described with reference to drawings, this invention is not limited to the thing of embodiment shown in figure. Various modifications and variations can be made to the illustrated embodiment within the same range or equivalent range as the present invention.
この発明に係るレーザー誘起衝撃波を用いた分子の分析方法は、タンパク質等の微小物体についての分子量分布等を容易に、かつ、適切に行なうことが要求される場合に、有効に利用される。 The molecular analysis method using a laser-induced shock wave according to the present invention is effectively used when it is required to easily and appropriately perform a molecular weight distribution or the like for a minute object such as a protein.
１１ 測定装置、１２ ＹＡＧレーザー、１３ パルスジェネレータ、１４ａ，１４ｂ コンピュータ、１５ 顕微鏡、１６ ＣＣＤカメラ、１７ ＬＥＤ １８ 光路、１９ ミラーユニット、２０ 赤外吸収フィルター、２１ ステージ、２２ａ，２２ｂ 対物レンズ、２３ ミラー、２４ スペシャルフィルター、３１ サンプル、３２ ゲル、３３ 試料、３４ 溶媒、３５ キャピラリー、３６ 端部、３７ 壁部、３８ 取り付け部材、３９ 切り欠き、４０ 取り付け穴、４１ 電熱線。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 Measuring apparatus, 12 YAG laser, 13 Pulse generator, 14a, 14b Computer, 15 Microscope, 16 CCD camera, 17 LED 18 Optical path, 19 Mirror unit, 20 Infrared absorption filter, 21 Stage, 22a, 22b Objective lens, 23 Mirror , 24 Special Filter, 31 Sample, 32 Gel, 33 Sample, 34 Solvent, 35 Capillary, 36 End, 37 Wall, 38 Mounting Member, 39 Notch, 40 Mounting Hole, 41 Heating Wire.
Claims (6)
前記試料を担持させた熱可溶性ゲルを、溶媒を満たしたキャピラリー中に導入する導入工程と、
前記キャピラリー中に挿入された熱可溶性ゲルを加熱により溶解させる溶解工程と、
前記溶解工程の後、前記溶解した熱可溶性ゲル部分にパルスレーザーを照射して、レーザー誘起衝撃波を発生させる工程と、
前記レーザー誘起衝撃波により発生させた衝撃波により前記溶媒中を移動した前記被測定分子を観測する観測工程と、
前記観測工程により観測した前記被測定分子の移動を基に分子を分析する分析工程とを含む、レーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法。 A supporting step for supporting a sample containing a molecule to be measured to be measured on the surface or inside of a heat-soluble gel that is dissolved by heating;
Introducing a heat-soluble gel carrying the sample into a capillary filled with a solvent;
A dissolution step of dissolving the heat-soluble gel inserted into the capillary by heating;
After the dissolving step, irradiating the melted heat-soluble gel part with a pulsed laser to generate a laser-induced shock wave;
An observation step of observing the molecule to be measured that has moved in the solvent by a shock wave generated by the laser-induced shock wave;
A molecular analysis method using laser-induced shock waves, comprising: an analysis step of analyzing the molecule based on the movement of the molecule to be measured observed in the observation step.
前記観測工程は、蛍光ラベル化された前記被測定分子の観測を行なう、請求項１〜５のいずれかに記載のレーザー誘起衝撃波を利用した分子の分析方法。
Before the introduction step, including the step of fluorescent labeling of the molecule to be measured
6. The molecule analysis method using laser-induced shock waves according to claim 1, wherein the observation step comprises observing the molecule to be measured that is fluorescently labeled.
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