JP5302189B2

JP5302189B2 - Sphingomyelinase

Info

Publication number: JP5302189B2
Application number: JP2009513006A
Authority: JP
Inventors: 仁美山口; 昭子佐古田; 美沙椎原; 雄吾岩崎
Original assignee: Nagoya University NUC; Nagase Chemtex Corp; Nagase and Co Ltd; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Nagase Chemtex Corp; Nagase and Co Ltd; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-21
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2028-04-21
Also published as: JPWO2008136451A1; WO2008136451A1

Description

本発明は、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法に関する。 The present invention relates to a novel sphingomyelinase and a method for producing the same.

スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンに作用し、セラミドとホスホリルコリンとを生成する酵素であり、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．１．４．１２として知られている。近年、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）由来のスフィンゴミエリナーゼの立体構造が解明され、その触媒メカニズムの研究は、動物細胞のスフィンゴミエリナーゼが関与するといわれる細胞の分化、老化、アポトーシスの解明にも重要であると考えられている（ヒデオアゴウ（ＨｉｄｅｏＡｇｏ）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２００６年，２８１巻（２３号），ｐｐ．１６１５７−１６１６７）。また、スフィンゴミエリンからスフィンゴミエリナーゼによって生成されるセラミドは、皮膚の角質層にある脂質で、肌の保湿に重要な成分であり、化粧品の基材としても知られている。また、セラミドはアトピー性皮膚炎との関連も注目されており、その治療薬としての開発も期待される。
スフィンゴミエリナーゼは、種々の動物組織、脳、肺、肝、腎、副腎、脾、精巣、胎盤などに存在する。
細菌由来では、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）（ヒロオイケザワ（ＨＩＲＯＨＩＫＥＺＡＷＡ）ら，バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．），１９７８年，５２８巻，ｐｐ．２４７−２５６）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（ヘイゼルエム．ドウリー（ＨＡＺＥＬＭ．ＤＯＥＲＹ）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９６５年，４０巻，ｐｐ．２８３−２９６）、リステリア・イワノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ）（ブルーノゴンザレス−ゾルン（ＢｒｕｎｏＧｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎ）ら，モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９９９年，３３巻，ｐｐ．５１０−５２３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ルウドピー．エイ．エム．セガース（ＲＵＵＤＰ．Ａ．Ｍ．ＳＥＧＥＲＳ）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎｅ．），１９９０年，５８巻，ｐｐ．２１７７−２１８５）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）（イル−チュンチャン（Ｅｒｒ−ＣｈｅｎｇＣｈａｎ）ら，バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０００年，３９巻，ｐｐ．４８３８−４８４５）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）（ノリユキスエヨシ（ＮｏｒｉｙｕｋｉＳｕｅｙｏｓｈｉ）ら，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），２００２年，１８４巻（２号），ｐｐ．５４０−５４６）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）（ケイタロウスズキ（ＫｅｉｔａｒｏｕＳＵＺＵＫＩ）ら，バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９９５年，５９巻（１１号），ｐｐ．２０８１−２０８６、特開昭５８−４３７８６号公報）などに見出されている。このうち、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）（アキヒロヤマダ（ＡｋｉｈｉｒｏＹＡＭＡＤＡ）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９８８年，１７５巻，ｐｐ．２１３−２２０）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（デイビッドシー．コールマン（ＤａｖｉｄＣ．Ｃｏｌｅｍａｎ）ら，マイクロバイアル・パソジェネシス（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．），１９８６年，１巻，ｐｐ．５４９−５６４）、リステリア・イワノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｖａｎｏｖｉｉ）（ブルーノゴンザレス−ゾルン（ＢｒｕｎｏＧｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎ）ら，モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９９９年，３３巻，ｐｐ．５１０−５２３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ルウドピー．エイ．エム．セガース（ＲＵＵＤＰ．Ａ．Ｍ．ＳＥＧＥＲＳ）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．），１９９０年，５８巻，ｐｐ．２１７７−２１８５）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）（ノリユキスエヨシ（ＮｏｒｉｙｕｋｉＳｕｅｙｏｓｈｉ）ら，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），２００２年，１８４巻（２号），ｐｐ．５４０−５４６）由来のスフィンゴミエリナーゼは、それらの遺伝子がクローニングされており、アミノ酸配列も解明されている。
また、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ヨシオヤマカワ（ＹｏｓｈｉｏＹＡＭＡＫＡＷＡ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７７年，８１巻，ｐｐ．１１５−１２６）、クロストリジウム・ノヴィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｎｏｖｙｉ）（リョウタグチ（ＲＹＯＴＡＧＵＣＨＩ）ら，バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．），１９７５年，４０９巻，ｐｐ．７５−８５およびリョウタグチ（ＲｙｏＴＡＧＵＣＨＩ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７７年，８２巻，ｐｐ．１２１７−１２２３）、ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ）（現ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ））（ヨシオオオカワ（ＹｏｓｈｉｏＯＫＡＷＡ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７５年，７８巻，ｐｐ．５３７−５４５）由来のホスホリパーゼＣが、スフィンゴミエリナーゼ活性を有することが知られている。
さらに、サリニスポラ・トロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａｔｒｏｐｉｃａ）およびサリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａａｒｅｎｉｃｏｌａ）のスフィンゴミエリナーゼの遺伝子が報告されているが、その性質は明らかではない。
スフィンゴミエリナーゼを産業上利用するにあたっては、動物組織由来ではスフィンゴミエリナーゼを大量生産することは困難であり、細菌由来が望ましいと考えられる。しかし、スフィンゴミエリナーゼを生成する細菌のなかには、病原性が指摘されているものが多く、その応用範囲が限定されかねない。Sphingomyelinase is an enzyme that acts on sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine. C. Known as 3.1.4.12. In recent years, the three-dimensional structure of sphingomyelinase derived from Bacillus cereus has been elucidated, and the study of its catalytic mechanism has also been used to elucidate the differentiation, aging, and apoptosis of animal cells that are said to be involved in sphingomyelinase in animal cells. It is considered important (Hideo Ago et al., Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 2006, 281 (23), pp. 16157-16167). . Ceramide produced from sphingomyelin by sphingomyelinase is a lipid in the stratum corneum of the skin, is an important component for moisturizing the skin, and is also known as a base material for cosmetics. Ceramide is also attracting attention for its relationship with atopic dermatitis, and its development as a therapeutic agent is also expected.
Sphingomyelinase is present in various animal tissues, brain, lung, liver, kidney, adrenal gland, spleen, testis, placenta and the like.
Bacterial sources include Bacillus cereus (HIROH IKEZAWA et al., Biochim. Biophys. Acta., 1978, 528, pp. 247-256), Staphylococcus aureus (Hazel M. DOREY et al., Journal of General Microbiology), 1965, 40, pp. 283- 296), Listeria ivanovii (Bruno Gonzalez-Zorn et al., Molecular Micro. Iolology (Mol. Microbiol., 1999, 33, pp. 510-523), Leptospira interrogans (RUUD P. A. M. SEGERS) et al., Infection Infect Immun., 1990, 58, pp. 2177-2185), Helicobacter pylori (Err-Chang Chan et al., Biochemistry, 2000) 39, pp. 4838-4845), Pseudomonas sp. (Noriyuki Sue) oshi, et al., Journal of Bacteriol., 2002, 184 (2), pp.540-546), Streptomyces sp. (Keitarou SUZUKI) Et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1995, Vol. 59 (11), pp. 2082-2086, Japanese Patent Laid-Open No. 58-43786). Has been. Among these, Bacillus cereus (Akihiro Yamada et al., European Journal of Biochemistry, 1988, 175, pp.213-220), Star. Staphylococcus aureus (David C. Coleman, et al., Microb. Pathog., 1986, Volume 1, pp. 549-564), Listeria Ivanovi ( Listeria ivanovii) (Bruno Gonzalez-Zorn et al., Molecular Microbiology (Mol. , 1999, 33, pp. 510-523), Leptospira interrogans (RUUD P. A. M. SEGERS) et al., Infection and Immunity. (Infect.Immune.), 1990, 58, pp. 2177-2185), and Pseudomonas sp. (Noriyuki Sueioshi et al., Journal of Bacteriol. (J. Bacteriol.), Sphingomyelinase derived from 2002, Vol. 184 (2), pp. 540-546) has been cloned and its amino acid sequence has been elucidated. That.
Also, Clostridium perfringens (Yoshio YAMAKAWA et al., Journal of Biochemistry, 1977, 81, pp. 115-126), Clostridium novi (Clostrium (RYO TAGUCHI et al., Biochim. Biophys. Acta., 1975, 409, pp. 75-85, and Ryo TAGUCHI et al., Journal of・ Biochemistry (J. Biochem.), 1977, Vol. 82, pp. 1217-1223), Streptomyces honey bee Streptomyces hachijoensis (currently Streptomyces cinnamoneus) (Yoshio OKAWA et al., Journal of Biochemistry, Vol. 37, p. ) -Derived phospholipase C is known to have sphingomyelinase activity.
Furthermore, the genes for Sphingomyelinase from Salinispora tropica and Salinispora arenicola have been reported, but their properties are not clear.
In the industrial use of sphingomyelinase, it is difficult to mass-produce sphingomyelinase from animal tissues, and it is considered desirable to derive from bacteria. However, many bacteria that produce sphingomyelinase have been pointed out to be pathogenic, and their application range may be limited.

本発明は、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、新規なスフィンゴミエリナーゼを得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有するスフィンゴミエリナーゼを見出した。
さらに本発明者らは、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにして、この遺伝子が新規な遺伝子であることを確認した。また、この遺伝子を用いて発現プラスミドを構築し、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を形質転換することにより、該酵素を効率よく生産する微生物を得た。
本発明は、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を提供し、この酵素は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなる：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解作用を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解作用を示すポリペプチド。
１つの実施態様では、上記酵素は、スフィンゴミエリンを基質としたときのｐＨ１０で３７℃にて１０分間の加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
別の実施態様では、上記酵素は、ｐＨ１０で３７℃にて１０分間のスフィンゴミエリンに対する加水分解活性を１００％とした場合にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する活性が５％未満である基質特異性を有する。
別の実施態様では、上記酵素は、等電点が６．１である。
さらに別の実施態様では、上記酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が３５，０００であり、そしてアミノ酸組成より分析した場合の分子量が３２，０００である。
なお別の実施態様では、上記酵素は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
本発明はまた、上記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
別の実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターが導入され、スフィンゴミエリンからセラミドとホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を提供する。
１つの実施態様では、上記形質転換体の宿主は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
本発明はさらに、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法を提供し、この方法は、
上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程を含む。
１つの実施態様では、上記宿主は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼが提供される。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法が提供される。An object of the present invention is to provide a novel sphingomyelinase and a method for producing the same.
As a result of searching for microorganisms that produce the enzyme for the purpose of obtaining a novel sphingomyelinase, the present inventors have found a sphingomyelinase having a novel property from microorganisms belonging to the genus Streptomyces. It was.
Furthermore, the present inventors cloned a gene encoding the enzyme, revealed its structure, and confirmed that this gene is a novel gene. Further, an expression plasmid was constructed using this gene, and a microorganism belonging to the genus Streptomyces was transformed to obtain a microorganism that efficiently produced the enzyme.
The present invention provides an enzyme that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine, which enzyme comprises the polypeptide according to any of the following (a) to (c): Consists of:
(A) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and exhibiting the hydrolysis action; c) A polypeptide having at least 75% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and exhibiting the hydrolysis action.
In one embodiment, the enzyme has a hydrolytic activity of 50% or more within the range of pH 8 to pH 12, assuming that the hydrolysis activity for 10 minutes at 37 ° C. and pH 10 with sphingomyelin as a substrate is 100%. Degradation activity is shown.
In another embodiment, the enzyme is phosphatidylcholine (PC), phosphatidylinositol (PI), phosphatidic acid (PA), phosphatidyl when the hydrolysis activity for sphingomyelin at pH 10 and 37 ° C. for 10 minutes is taken as 100%. It has a substrate specificity that is less than 5% active against ethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), and phosphatidylserine (PS).
In another embodiment, the enzyme has an isoelectric point of 6.1.
In yet another embodiment, the enzyme has a molecular weight of 35,000 as measured by SDS-PAGE and a molecular weight of 32,000 as analyzed from amino acid composition.
In yet another embodiment, the enzyme is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
The present invention also provides a polynucleotide encoding the enzyme.
In one embodiment, the polynucleotide is a polynucleotide according to any of the following (a) to (c):
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions; or (c) at least 80% sequence identity with the base sequence described in SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising:
In another embodiment, the polynucleotide is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
The present invention further provides a vector comprising the polynucleotide.
The present invention further provides a transformant having the ability to produce an enzyme that produces ceramide and phosphorylcholine from sphingomyelin, into which the polynucleotide or the vector is introduced.
In one embodiment, the host of the transformant is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
The present invention further provides a method for producing an enzyme that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine, the method comprising:
Introducing the polynucleotide or the vector into a host to obtain a transformant producing the enzyme; and culturing the transformant to produce the enzyme.
In one embodiment, the host is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
According to the present invention, a novel sphingomyelinase is provided. Furthermore, a method for efficiently producing the enzyme by a microorganism is provided.

図１は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）培養液からの精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。
図２は、ｐＨが１０である場合の酵素活性を基準とした、種々のｐＨでのストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図３は、反応温度が３７℃である場合の酵素活性を基準とした、種々の温度でのストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図４は、種々の温度での処理後のストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素の残存活性を示すグラフである。
図５は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）からクローニングしたスフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域の塩基配列を示す図である。
図６は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺伝子についての推定アミノ酸配列を示す図である。FIG. 1 is an electrophoresis photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of a purified fraction from a Streptomyces cinnamoneus culture solution.
FIG. 2 is a graph showing the sphingomyelinase activity of a purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus at various pHs based on the enzyme activity when the pH is 10.
FIG. 3 is a graph showing the sphingomyelinase activity of a purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus at various temperatures, based on the enzyme activity when the reaction temperature is 37 ° C.
FIG. 4 is a graph showing the residual activity of purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus after treatment at various temperatures.
FIG. 5 is a diagram showing the base sequence of the core region of the sphingomyelinase gene cloned from Streptomyces cinnamoneus.
FIG. 6 is a view showing a base sequence of a region containing a sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamoneus and a deduced amino acid sequence of a structural gene.

本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われ、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
本発明において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導される）、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
（スフィンゴミエリナーゼ）
本発明は、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素（スフィンゴミエリナーゼ）を提供する。
本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されない。
酵素を、まず２ｍｇ／ｍｌの卵黄由来スフィンゴミエリン（Ｓｉｇｍａ製）を含む２０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に添加し、これを３７℃で１０分間インキュベートして、スフィンゴミエリンを加水分解する。次いで、沸騰水中で５分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の１／５０量を分取する。分取した上清に、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、１ｍＭ塩化マグネシウム、および０．１ユニット／ｍｌの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を４倍量で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させる。さらに、その遊離リン酸を定量するために、９倍量のＢＩＯＭＯＬＧＲＥＥＮＲｅａｇｅｎｔｆｏｒＰｈｏｓｐｈａｔｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＯＭＯＬＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で３０分間放置後、波長６２０ｎｍの吸光度を測定する。この場合、スフィンゴミエリナーゼの酵素量は、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を生成する酵素量を１ユニットとする。
本酵素は、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用いて上記のスフィンゴミエリンと酵素との反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ７〜１３）でスフィンゴミエリナーゼ活性を示し得る。至適ｐＨはｐＨ８〜１２．５の範囲内にあり得る。好ましくは至適ｐＨが９〜１２の範囲内にあり、より好ましくは１０〜１１の範囲内にあり、さらに好ましくは１０付近である。本発明の酵素は、例えば、上記のようにスフィンゴミエリンと酵素とを３７℃にて１０分間反応させた条件下でｐＨ１０における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の活性を示し得る。
本酵素は、例えば、上記のスフィンゴミエリンと酵素との反応条件下では、約２０〜４０℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３０〜４０℃の範囲内にあり、より好ましくは３５〜４０℃の範囲内にあり、さらにより好ましくは約３７℃である。
本酵素は、例えば、５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３０分間処理した場合、４℃から４５℃まででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして５０℃でも７０％程度の活性が残存している。
本酵素は、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて上記のスフィンゴミエリンと酵素溶液との反応条件下におくと、１ｍＭのＭｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、およびＣｏ^２＋で活性が促進され得るが、１ｍＭのＺｎ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ａｌ^３＋、およびＥＤＴＡで活性が阻害され得る。
本酵素は、ｐＨ１０の条件下で該酵素と基質とを３７℃にて１０分間反応させた場合、スフィンゴミエリンが基質である場合に対する加水分解活性を１００％とすると、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）を基質とした場合に対する活性が５％未満である基質特異性を有し得る。
本酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約３５，０００ダルトンを示す。このストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約３２，０００ダルトンである。
本酵素は、泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、ＰｈａｓｔｇｅｌＩＥＦ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、６．１の等電点を示す。
本発明のスフィンゴミエリナーゼは、好ましくは配列番号２の１位から３３３位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号２に記載のアミノ酸配列」ともいう）を有する。本酵素は、スフィンゴミエリナーゼ活性（例えば、スフィンゴミエリンを加水分解する活性；以下も同様である）を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本発明において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
本発明のスフィンゴミエリナーゼの供給源は特に限定されないが、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくはストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２が挙げられる。
例えば、上記ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤として製造することができる。
スフィンゴミエリナーゼ酵素製剤の製造に用い得る微生物は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＲＣ１２７８２に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属しかつ本発明のスフィンゴミエリナーゼを生産し得る微生物であればよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、スフィンゴミエリナーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であっても本発明に用いることができる。
ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２を用いたスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。本菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、本菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であり、好ましくは１〜７日間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
本発明のスフィンゴミエリナーゼは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行うことによりポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。
（スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチド）
上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から９９９位までの塩基配列（本明細書では、「配列番号１に記載の塩基配列」ともいう）を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明のスフィンゴミエリナーゼの好ましい形態を構成する。
本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸を含み、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズでき、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記微生物（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、好ましくは、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２）から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。上記塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡＤａｔａｂａｎｋｏｆＪａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌａｂｅｌｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
さらに、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上で説明したとおりである。また、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定および検索についても、上で説明したとおりである。
上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。
（ベクターおよび形質転換体）
本発明によれば、上記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入することにより、スフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を作製することもできる。
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。微生物中で、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくはターミネーターを３’側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されている。
形質転換の対象となる宿主は、上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、スフィンゴミエリナーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したスフィンゴミエリナーゼを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤を製造することができる。宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。In the present invention, the enzyme is not limited to a purified enzyme, and includes a crude product, an immobilized product, and the like. Enzyme purification is carried out by using methods known to those skilled in the art, such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, etc., using a culture solution of microorganisms. Can be obtained).
In the present invention, the microorganism is any of wild strains, mutant strains (for example, induced by ultraviolet irradiation), or recombinants induced by genetic engineering techniques such as cell fusion or genetic recombination. It may be a stock. Genetically engineered microorganisms such as recombinants are known to those skilled in the art, as described, for example, in Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Can be easily created using various techniques. The culture solution of microorganisms means both a culture solution containing microbial cells and a culture solution from which microbial cells have been removed by centrifugation or the like.
(Sphingomyelinase)
The present invention provides an enzyme (sphingomyelinase) that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine.
The activity of the sphingomyelinase of the present invention can be confirmed, for example, as follows, but the confirmation method is not limited to this.
The enzyme is first added to 20 mM glycine-sodium hydroxide buffer (pH 10.0) containing 2 mg / ml egg yolk-derived sphingomyelin (manufactured by Sigma) and incubated at 37 ° C. for 10 minutes to hydrolyze the sphingomyelin. Decompose. Next, the enzyme is deactivated by heating in boiling water for 5 minutes, and 1/50 of the supernatant is collected. To the collected supernatant, 4 solutions of 50 mM glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9.6), 1 mM magnesium chloride, and 0.1 unit / ml calf intestinal alkaline phosphatase (Takara Bio Inc.) were added. Add in double volume and incubate at 37 ° C for 30 minutes to liberate phosphate from the phosphorylcholine produced. Furthermore, in order to quantify the free phosphoric acid, 9 times the amount of BIOMOL GREEN Reagent for Phosphate Detection (manufactured by BIOMOL Research Laboratories, Inc.) is added, and after standing at room temperature for 30 minutes, the absorbance at a wavelength of 620 nm is measured. In this case, the amount of sphingomyelinase enzyme is determined colorimetrically using phosphoric acid as a standard sample, and the amount of enzyme that produces 1 μmol of phosphoric acid per minute under the above conditions is defined as 1 unit.
When the enzyme is subjected to the reaction conditions of the above sphingomyelin and enzyme using, for example, Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7-9) and glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9-13) as a buffer, Sphingomyelinase activity can be exhibited within the pH range (pH 7 to 13). The optimum pH can be in the range of pH 8 to 12.5. The optimum pH is preferably in the range of 9 to 12, more preferably in the range of 10 to 11, and further preferably in the vicinity of 10. The enzyme of the present invention is, for example, 50 in the range of pH 8 to pH 12 when the hydrolysis activity at pH 10 is 100% under the condition where sphingomyelin and enzyme are reacted at 37 ° C. for 10 minutes as described above. % Or more activity.
This enzyme can act at about 20-40 ° C., for example, under the reaction conditions of the above sphingomyelin and enzyme. The optimum temperature can be within this range. Preferably it is in the range of about 30-40 ° C, more preferably in the range of 35-40 ° C, and even more preferably about 37 ° C.
For example, when this enzyme is treated with 50 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0) for 30 minutes, it can be stable with almost no decrease in activity from 4 ° C. to 45 ° C., and even at 50 ° C. About 70% of activity remains.
For example, when the enzyme is subjected to the reaction conditions of the sphingomyelin and the enzyme solution using Tris-HCl buffer (pH 8.0) as a buffer, 1 mM Mg ²⁺ , Mn ²⁺ and Co ²⁺ are used. Activity can be promoted, but activity can be inhibited with 1 mM Zn ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , and EDTA.
When the enzyme and the substrate are reacted at 37 ° C. for 10 minutes under the condition of pH 10, the enzyme has phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol, assuming that the hydrolysis activity relative to the case where sphingomyelin is the substrate is 100%. (PI), phosphatidic acid (PA), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), or phosphatidylserine (PS) may be used as a substrate and the substrate specificity may be less than 5%.
This enzyme may vary slightly depending on electrophoresis conditions and the like. For example, a natural enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 has a molecular weight of about 35,000 daltons in SDS-PAGE. The natural enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 has a molecular weight calculated from its amino acid composition of about 32,000 daltons.
This enzyme may vary slightly depending on the electrophoresis conditions. For example, a natural enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 uses Pastgel IEF3-10 (manufactured by GE Healthcare Bioscience), etc. An isoelectric point of 6.1 is shown by electric point electrophoresis.
The sphingomyelinase of the present invention preferably has the amino acid sequence from position 1 to position 333 of SEQ ID NO: 2 (also referred to herein as “the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2”). As long as this enzyme has sphingomyelinase activity (for example, the activity of hydrolyzing sphingomyelin; the same applies to the following), one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted or missing. It may be an enzyme having a deleted, inserted and / or added amino acid sequence. Those skilled in the art, for example, site-directed mutagenesis (Nucleic Acid Res., 1982, 10, pp. 6487; Methods in Enzymol., 1983, 100, pp. 448; Molecular Cloning: A Laboratory. Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989; PCR: A Practical Approach, IRL Press, 1991, pp. 200), etc., as appropriate, and The structure of the protein can be altered by introducing additional mutations. In the present invention, the number of amino acid residues that can be substituted, deleted, inserted, and / or added is usually 50 or less, such as 30 or less, or 20 or less, preferably 16 or less, more preferably 5 or less, even more preferably. Is 0-3. In addition, amino acid mutations include not only artificially mutated enzymes but also naturally mutated enzymes as long as they have sphingomyelinase activity and are included in the sphingomyelinase of the present invention.
A protein having an amino acid sequence having homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is also included in the sphingomyelinase of the present invention as long as it has sphingomyelinase activity. The sphingomyelinase of the present invention is preferably at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 75% with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. It may be a protein having an amino acid sequence with 95%, even more preferably at least 99% homology. For protein homology (homology) search, for example, databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PROT, PIR, DAD, or DNA databases such as DDBJ, EMBL, or Gene-Bank, etc. BLAST, FASTA, etc. This program can be used, for example, via the Internet. Confirmation of the activity of the protein can be performed using the procedure described above.
Although the supply source of the sphingomyelinase of the present invention is not particularly limited, it can be obtained from living cells such as microorganisms. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Streptomyces. Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 is preferable.
For example, the above Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 secretes the enzyme out of the cell by liquid culture in an appropriate nutrient medium, so that the culture supernatant is freeze-dried, salted out, with an organic solvent, etc. The treated product can be produced as a sphingomyelinase enzyme preparation.
The microorganism that can be used for the production of the sphingomyelinase enzyme preparation is not limited to Streptomyces cinnamoneus NRC12782, and may be any microorganism that belongs to the genus Streptomyces and can produce the sphingomyelinase of the present invention. That's fine. In addition, natural or artificial mutants of these species or gene fragments necessary for the expression of sphingomyelinase activity may be artificially extracted and used in the present invention even for other species incorporating them. it can.
The production thereof will be described by taking as an example a sphingomyelinase enzyme preparation using Streptomyces cinnamoneus NBRC12782. Since this enzyme is secreted out of the cells by liquid culture in a nutrient medium, the culture supernatant is treated with freeze-drying, salting out, an organic solvent, or the treated product is immobilized. Thus, an enzyme preparation can be produced. More specifically, the present bacterium is cultured in a suitable medium, for example, a medium containing a suitable carbon source, nitrogen source and inorganic salts to secrete the enzyme. Here, examples of the carbon source include starch and starch hydrolysate, sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as glycerol, and organic acids (for example, acetic acid and citric acid) or salts thereof (for example, sodium salt). Can be mentioned. Examples of the nitrogen source include organic nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean flour, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, and urea. Examples of inorganic salts include sodium chloride, monopotassium phosphate, magnesium sulfate, manganese chloride, calcium chloride, and ferrous sulfate. The concentration of the carbon source is, for example, in the range of 1 to 20% (w / v), preferably 1 to 10% (w / v). The concentration of the nitrogen source is, for example, in the range of 1 to 20% (w / v), preferably 1 to 10% (w / v). The culture temperature is a temperature at which the above enzyme is stable and the cultured microorganism can sufficiently grow, and is preferably 20 to 37 ° C. The culture time is a time during which the enzyme is sufficiently produced, and is preferably about 1 to 7 days. Culturing can be preferably performed under aerobic conditions, for example, with aeration stirring or shaking.
The sphingomyelinase of the present invention is fractionated by protein solubility (precipitation with organic solvents, salting out with ammonium sulfate, etc.); cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography; chelate, dye, antibody, etc. It can be purified by appropriately combining known methods such as affinity chromatography using For example, after recovering the culture supernatant of the microorganism, ammonium sulfate precipitation and further anion exchange chromatography can be repeated to purify to a substantially single band in polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE).
(Polynucleotide encoding sphingomyelinase)
A polynucleotide encoding the sphingomyelinase is also included in the present invention. The polynucleotide of the present invention may be an artificial molecule including an artificial nucleotide derivative in addition to a natural polynucleotide such as DNA or RNA. The polynucleotide of the present invention may be a DNA-RNA chimeric molecule. The polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention has, for example, the base sequence from position 1 to position 999 of SEQ ID NO: 1 (also referred to herein as “the base sequence described in SEQ ID NO: 1”). The base sequence described in SEQ ID NO: 1 encodes a protein including the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and the protein including this amino acid sequence constitutes a preferred form of the sphingomyelinase of the present invention.
The polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention includes an amino acid in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 as described above, and Also included are polynucleotides that encode proteins having sphingomyelinase activity. A person skilled in the art may introduce substitution, deletion, insertion, and / or addition mutation as appropriate into the polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 using the site-specific mutagenesis method (described above). Thus, it is possible to obtain a homologue of a polynucleotide.
The polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention can also be hybridized under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and Also included are polynucleotides that encode proteins having nuclease activity.
The polynucleotide of the present invention, based on the nucleotide sequence information described in the present specification, converts a target gene into a microorganism belonging to the genus of the above-mentioned microorganism (for example, Streptomyces, preferably Streptomyces, Cinnamoneus (NBRC 12782). PCR and hybridization screening are used for gene acquisition. It is also possible to chemically synthesize the full length of a gene by DNA synthesis. Based on the base sequence information, a polynucleotide encoding the sphingomyelinase derived from an organism other than the above can also be obtained. For example, by designing a probe using the above-mentioned base sequence or a part of the base sequence and performing hybridization on DNA prepared from another organism under stringent conditions, sphingomyeloids derived from various organisms can be obtained. A polynucleotide encoding a nuclease can be isolated. Based on the above base sequence information, PCR primers can be designed from regions with high homology using sequence information registered in DNA databases such as DNA Database of Japan (DDBJ), EMBL, and Gene-Bank. it can. The polynucleotide encoding the sphingomyelinase can also be isolated from various organisms by performing PCR using such primers and chromosomal DNA or cDNA as a template.
The polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions is a sequence of at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60, or 100 consecutive sequences in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The probe is designed by selecting one or more, and using the conditions described in the manual (for example, washing conditions: 42 ° C., 0.5 × SSC) using, for example, ECL direct nucleic acid labeling and detection system (GE Healthcare). In the primary wash buffer).
More specifically, the “stringent conditions” are usually conditions of 42 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS. More preferably, the conditions are 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS, but are not particularly limited to these conditions. Factors affecting the stringency of hybridization include a plurality of factors such as temperature and salt concentration, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
Furthermore, the polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention includes at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Even more preferably, it comprises a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence with at least 95%, even more preferably at least 99% homology, and having sphingomyelinase activity. The protein homology search is as described above. Further, the polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Even more preferably, a polynucleotide having a base sequence having at least 99% sequence identity and encoding a protein having sphingomyelinase activity is also included. The determination and search of the sequence identity of the base sequence is also as described above.
The polynucleotide encoding the sphingomyelinase can be expressed in the same or different host using genetic recombination techniques.
(Vector and transformant)
According to the present invention, a vector comprising the polynucleotide is also provided. In addition, a transformant having the ability to produce enzymes that produce ceramide and phosphorylcholine from sphingomyelin can be produced by introducing the polynucleotide or the vector into a host.
The procedure for producing a transformant and the construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Particularly for actinomycetes, it can be performed with reference to “PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Kieser et al., John Inns Foundation, 2000)”. In order to express a polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention in a microorganism, this DNA is first introduced into a plasmid vector or a phage vector stably present in the microorganism, and the genetic information is transcribed and translated. . For this purpose, a promoter corresponding to a unit controlling transcription / translation may be incorporated upstream of the 5 ′ side of the DNA strand of the present invention, more preferably a terminator downstream of the 3 ′ side. As the promoter and terminator, a promoter and terminator known to function in microorganisms used as hosts are used. Regarding the vectors, promoters, terminators and the like that can be used in these various microorganisms, “Microbiology Basic Course 8 Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan”, especially regarding actinomycetes, “PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Kieser et al., John Inns Foundation, 2000 ) "And the like.
The host to be transformed is not particularly limited as long as it is an organism that can be transformed with a vector containing a polynucleotide encoding the sphingomyelinase and express the sphingomyelinase activity. For example, Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus, Streptococcus Bacteria for which host vector systems such as Lactobacillus are developed; Actinomycetes for which host vector systems are developed such as Rhodococcus and Streptomyces; Saccharomyces and Clyberomyces (Kluyveromyces), Schizosaccharomyces (Sc Izosaccharomyces genus, Zygosaccharomyces genus, Yarrowia genus, Trichosporon genus, Rhodosporidium genus, Pichia (Phodida) genus Examples include yeasts that have been developed in host vector systems such as the genus Neurospora, the genus Aspergillus, the genus Cephalosporum, and the genus Trichoderma. Escherichia coli is preferred for ease of gene recombination, and actinomycetes are preferred for ease of gene expression.
In addition to microorganisms, various host / vector systems have been developed in plants and animals. For example, insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)) and plants such as rapeseed, corn, and potatoes. Systems for expressing large amounts of heterologous proteins have been developed and may be used.
The obtained transformant can be used for production of an enzyme preparation as described above. Specifically, the transformant is liquid-cultured in an appropriate nutrient medium, the expressed sphingomyelinase is secreted to the outside of the cell, and the culture supernatant is treated with lyophilization, salting out, organic solvent, etc. A myelinase enzyme preparation can be produced. Although the culture conditions can vary depending on the host cell, the culture can be performed under conditions commonly used by those skilled in the art. For example, when an actinomycete such as Streptomyces is used as a host, a tryptic soy medium containing thiostrepton (for example, manufactured by Becton Dickinson) can be used. The enzyme produced by the transformant can be further purified as described above.

以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（スフィンゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法）
本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行った：
まず２ｍｇ／ｍｌの卵黄由来スフィンゴミエリン（Ｓｉｇｍａ製）および酵素溶液を含む２０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を、３７℃で１０分間インキュベートして、スフィンゴミエリンを加水分解した。次いで、沸騰水中で５分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の１／５０量を分取した。分取した上清に、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、１ｍＭ塩化マグネシウム、および０．１ユニット／ｍｌの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を４倍量で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させた。さらに、その遊離リン酸を定量するために、９倍量のＢＩＯＭＯＬＧＲＥＥＮＲｅａｇｅｎｔｆｏｒＰｈｏｓｐｈａｔｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＯＭＯＬＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で３０分間放置後、波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。なお、本実施例のスフィンゴミエリナーゼについては、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を生成する酵素量を１ユニットとした。
（実施例１：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素の精製）
（ａ）培養
ポリペプトン（日本製薬製）１％（ｗ／ｖ）、肉エキス（鰹由来、和光純薬製）１％（ｗ／ｖ）、グルコース１％（ｗ／ｖ）、および塩化ナトリウム０．３％（ｗ／ｖ）からなる培地４Ｌを調製し、３Ｌ容バッフル付き三角フラスコに５００ｍｌずつ分注して、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。予め「ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．」ＤＡＨｏｐｗｏｏｄ，ＭＪＢｉｂｂ，ＫＦＣｈａｔｅｒ，ＴＫｉｅｓｅｒ，ＣＪＢｒｕｔｏｎ，ＨＭＫｉｅｓｅｒ，ＤＪＬｙｄｉａｔｅ，ＣＰＳｍｉｔｈ，ＪＭＷａｒｄおよびＨＳｃｈｒｅｍｐｆ，出版元ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９８５年の方法で調製しておいたストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）の胞子懸濁液を０．１ｍｌずつ接種し、３０℃で６０時間振とう培養した。この培養液をＡＤＶＡＮＴＥＣ製Ｎｏ２濾紙を用いて濾過することにより、上清を回収した。
（ｂ）硫安分画
（ａ）で回収した培養上清に３０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により除去した。さらに、該溶液に６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により集めた。この沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６０ｍｌに溶解し、同一緩衝液で透析し、粗酵素液を得た。
（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ２００ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．８Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
（ｄ）ＲＥＳＯＵＲＣＥＱカラムクロマトグラフィー
（ｃ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し脱塩した。これを、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥＱ（６ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．８Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した。図１は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、溶出画分のバンドを示す。その結果、単一のバンドが観察された（図１）。
このようにして、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２より、電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。
（実施例２：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素の性質の測定）
上記の実施例１で得た精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を上記方法で測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を有することを確認した。この精製酵素の酵素学的性質について検討した。
（１）作用ｐＨ：緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用いてｐＨを変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果、この酵素は、反応の至適ｐＨが１０であることが分かった。図２は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが１０である場合の酵素活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図２から分かるように、この酵素は、ｐＨ８からｐＨ１２のアルカリ性の広い範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した。
（２）作用温度：酵素とスフィンゴミエリンとの反応温度を変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が３７℃である場合の活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図３に示されるように、この酵素は、２０〜４０℃で活性を発揮し得、そして反応の至適温度は３７℃付近であった。
（３）温度安定性：精製酵素を５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、種々の温度で３０分間処理した後の残存活性を、上記方法に従って測定した。温度処理前の酵素活性を基準として、各温度処理後の酵素活性の残存割合として示した。図４は、種々の温度での処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図４に示されるように、この酵素は、４℃から４５℃までの温度での処理後では、処理前の９０％以上の活性が残存していた。５０℃の処理後では、処理前の７０％程度の活性が残存していた。
（４）各種金属塩およびＥＤＴＡの影響：酵素とスフィンゴミエリンとの反応の際に各種金属イオンまたはＥＤＴＡを添加して、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。この際に、金属塩の沈殿を防ぐために、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に変更した。その結果を、金属塩を添加しない条件を１００とした相対活性で表１に示す。この酵素は、Ｚｎ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ａｌ^３＋、およびＥＤＴＡによって阻害を受けた。
（５）基質特異性：スフィンゴミエリンの代わりに各種リン脂質を基質として用いたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果を、スフィンゴミエリンを基質とした場合を１００とした相対活性で表２に示す。この酵素は、表２に示すような基質特異性を示した。
（６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）に従って、精製酵素の分子量を測定した結果、精製酵素の分子量は約３５，０００であった（図１）。
（７）等電点：ＰｈａｓｔｇｅｌＩＥＦ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、精製酵素の等電点を測定した結果、精製酵素の等電点は６．１であった。
（実施例３：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析）
上記実施例１で得た精製酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列の解析を行った。上記精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は配列番号３に示すとおりであった。
（実施例４：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２の染色体ＤＮＡの分離）
ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２を、トリプチックソイ培地（ベクトン・ディンキンソン社製）５ｍｌを用いて２８℃で４日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および８ｍｇ／ｍｌリゾチームからなる溶液８００μｌに懸濁し、３７℃で４５分間処理した後、さらに−８０℃で１０分間処理した。次に、これに１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ＭＮａＣｌ、および０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）からなる溶液６ｍｌを添加し、６０℃で２０分間処理した後、氷冷した。この溶液４．５ｍｌにフェノール／クロロホルム混合液４ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を３ｍｌ分取した。この水相に６ｍｌのエタノールを添加混合してＤＮＡを回収し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液９００μｌに溶解した。これに、ＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、フェノール／クロロホルム混合液９００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を６００μｌ分取した。この水相に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）６０μｌおよびエタノール１．２ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液６００μｌに溶解した。
（実施例５：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域のクローニング）
スフィンゴミエリナーゼのＮ末端アミノ酸配列およびストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１センスプライマー（配列番号４）を設計した。
また、細菌由来スフィンゴミエリナーゼのアミノ酸配列が、ウシＤＮａｓｅＩのアミノ酸配列と高い相同性を示すことがわかり、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）由来のスフィンゴミエリナーゼおよびウシＤＮａｓｅＩのアミノ酸配列を比較した結果、Ｃ末端に近い領域でＳＤＨＹＰからなるアミノ酸配列を共有していた（ヨウマツオ（ＹＯＭＡＴＳＵＯ）ら，プロテイン・サイエンス（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ），１９９６年，５巻，ｐｐ．２４５９−２４６７）。このアミノ酸配列ＳＤＨＹＰおよびストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＡ１アンチセンスプライマー（配列番号５）を設計した。ここで、配列中のＳはＣまたはＧを表す。
ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。上記実施例４で得た鋳型染色体ＤＮＡ１６８ｎｇ、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１ｍＭ、ＤＭＳＯ３％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；５５℃（サイクルごとに１℃ずつ低く設定する）、３０秒；ステップ４；６８℃、１分；ステップ２からステップ４を２０サイクル繰り返す；ステップ５；９４℃、１５秒；ステップ６；４０℃、３０秒；ステップ７；６８℃、１分；ステップ５からステップ７を３０サイクル繰り返す；ステップ８；６８℃、３分。ＰＣＲによって、約８００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
このＰＣＲ反応液についてアガロース電気泳動を行い、目的の８００ｂｐのバンド部分を切り出し、ＴＯＰＯＢｌｕｎｔＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔｆｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに結合させ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、ｐＨ７．０）で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに由来するＴ７プライマーおよびＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を図５および配列番号１２に示す。
（実施例６：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域周辺のクローニング）
上記の実施例５で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、その上流側と下流側とに分けて、それぞれをＰＣＲにより増幅した。
（ａ）上流側のクローニング
上記実施例４で得た染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで完全消化し、ＴａＫａＲａＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ社製）に付属のＳａｕ３ＡＩＣａｓｓｅｔｔｅを連結させてライブラリーを作製した。これを鋳型にして、キットに付属のＣａｓｓｅｔｔｅＰｒｉｍｅｒＣ１とスフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマーＡＮ１（配列番号６）とを用いて、１回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ５００ｎｇ、１０×ＥＸＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μｌ、プライマー各２μＭ、ｄＮＴＰ混合物各０．２ｍＭ、ＤＭＳＯ３％、およびＴａＫａＲａＥＸＴａｑＨＳＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、３０秒；ステップ３；５５℃、３０秒；ステップ４；７２℃、１分３０秒；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；ステップ５；７２℃、２分。次いで、このＰＣＲ反応液を鋳型として、キットに付属のＣａｓｓｅｔｔｅＰｒｉｍｅｒＣ２とスフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマーＡＮ２（配列番号７）とを用いて、２回目のＰＣＲ増幅を行った。約４００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
（ｂ）下流側のクローニング
上記実施例４で得た染色体ＤＮＡ１００ｎｇをＮａｅＩで完全消化し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてセルフライゲーションさせて、ライブラリーを作製した。これを鋳型にして、スフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したセンスプライマーＳＣ１（配列番号８）およびアンチセンスプライマーＡＣ２（配列番号９）を用いて、いわゆるインバースＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１ｍＭ、ＤＭＳＯ３％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、３分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；６８℃、１分；ステップ２からステップ３を３５サイクル繰り返す；ステップ４；６８℃、３分。ＰＣＲによって、約４００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
上記実施例５で決定した塩基配列と併せて上記（ａ）および（ｂ）で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列を決定し（配列番号１３）、さらに構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号１４）。図６は、この決定したスフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列、およびこの塩基配列の下段に、構造遺伝子の推定アミノ酸配列を示す。図６に示す配列解析の結果から、スフィンゴミエリナーゼをコードする構造遺伝子は９９９ｂｐのヌクレオチドからなり、３３３残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。上記実施例３にて決定したストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のＮ末端アミノ酸配列が、上記推定アミノ酸配列中に存在し、完全に一致した（図６中に下線で示す）。
配列類似性検索プログラムＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡを用いることにより、上記推定アミノ酸配列を４種類のタンパク質配列データベース（ＰＴＲ、ＰＲＦ、ＵＮＩ−ＰＲＯＴおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）内の配列と比較した。その結果、上記推定アミノ酸配列は、ＳａｌｉｎｉｓｐｏｒａｔｒｏｐｉｃａＣＮＢ−４４０株のスフィンゴミエリン・ホスホジエステラーゼ（スフィンゴミエリナーゼ）と５２％の類似性を示した。
また、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素（すなわちスフィンゴミエリナーゼ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、約３２０００ダルトンの分子量を有すると推定された。
（実施例７：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）
放線菌においてストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えプラスミドを作製した。
まず、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼの構造遺伝子の上流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したセンスプライマーＳ２（配列番号１０）、および該構造遺伝子の下流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したアンチセンスプライマーＡ２（配列番号１１）を設計した。次いで、これらのプライマーを用いて、上記実施例４で得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ１６８ｎｇ、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１ｍＭ、ＤＭＳＯ５％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；６８℃、１分；ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；ステップ４；６８℃、２分。このＰＣＲにより約１２００ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。この増幅された断片をＢｇｌＩＩで消化し、放線菌プラスミドｐＩＪ７０２（ＡＴＣＣ３５２８７、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）のＢｇｌＩＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅを得た。
（実施例８：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の作製）
実施例７で得た組換えプラスミドｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅを用いて、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６を形質転換し、組換え放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６（ｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅ）を得た。
（実施例９：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の酵素活性測定）
実施例８で得た組換え放線菌を、２０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む１００ｍｌのトリプチックソイ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で培養した。得られた培養液から遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１６時間放置し、遠心分離にて（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）沈殿を回収した。回収した沈殿を５００μｌの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を外液として透析を行い、０．９ｍｌの酵素溶液を得た。この酵素溶液中の酵素活性を、上記スフィンゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法に従って測定した。その結果、酵素溶液の酵素活性は１０．２ユニット／ｍｌであった。なお、ベクターであるプラスミドｐＩＪ７０２を用いて形質転換した放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６（ｐＩＪ７０２）では、スフィンゴミエリナーゼ活性は検出されなかった。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
(Method for measuring enzyme activity of sphingomyelinase)
In this example, measurement of enzyme activity was basically performed as follows:
First, 20 mg glycine-sodium hydroxide buffer (pH 10.0) containing 2 mg / ml egg yolk-derived sphingomyelin (manufactured by Sigma) and an enzyme solution was incubated at 37 ° C. for 10 minutes to hydrolyze sphingomyelin. Next, the enzyme was inactivated by heating in boiling water for 5 minutes, and 1/50 of the supernatant was collected. To the collected supernatant, 4 solutions of 50 mM glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9.6), 1 mM magnesium chloride, and 0.1 unit / ml calf intestinal alkaline phosphatase (Takara Bio Inc.) were added. A double amount was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to liberate phosphoric acid from the phosphorylcholine produced. Furthermore, in order to quantify the free phosphoric acid, 9 times amount of BIOMOL GREEN Reagent for Phosphorus Detection (manufactured by BIOMOL Research Laboratories, Inc.) was added, and after standing at room temperature for 30 minutes, the absorbance at a wavelength of 620 nm was measured. The sphingomyelinase of this example was colorimetrically determined using phosphoric acid as a standard sample, and the amount of enzyme producing 1 μmol of phosphoric acid per minute under the above conditions was defined as 1 unit.
(Example 1: Purification of an enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus)
(A) Culture Polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 1% (w / v), meat extract (derived from salmon, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 1% (w / v), glucose 1% (w / v), and sodium chloride 0 4 L of a medium consisting of 3% (w / v) was prepared, 500 ml was dispensed into a 3 L Erlenmeyer flask with a baffle and steam sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. “Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual.” DA Hopwood, MJ Bibb, KF Chater, T Kieser, CJ Bruton, HM Kieser, DJ LiS. 0.1 ml of a spore suspension of Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 (obtained from National Institute of Technology and Evaluation), which had been prepared by the method of the year, was inoculated in 0.1 ml portions and shaken at 30 ° C. for 60 hours. Cultured at last. The supernatant was collected by filtering this culture solution using ADVANTEC No2 filter paper.
(B) Ammonium sulfate fraction Ammonium sulfate was added to the culture supernatant collected in (a) so as to be 30% (w / v) saturation, and the resulting precipitate was removed by centrifugation (7500 rpm, 30 minutes, 4 ° C.). did. Further, ammonium sulfate was added to the solution so as to be 60% (w / v) saturation, and the resulting precipitate was collected by centrifugation (7500 rpm, 30 minutes, 4 ° C.). This precipitate was dissolved in 60 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and dialyzed against the same buffer to obtain a crude enzyme solution.
(C) DEAE-Toyopearl column chromatography (b) The crude enzyme solution obtained in (b) was previously equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), a DEAE-Toyopearl 650M column (inner diameter 26 mm, height 200 mm, Applied to Tosoh Corporation). After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of sodium chloride (from 0 M to 0.8 M).
(D) The active fractions obtained by RESOURCE Q column chromatography (c) were collected and dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) for desalting. This was applied to a RESOURCE Q (6 ml) column (manufactured by GE Healthcare Biosciences) pre-equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), washed with the same buffer, The active fraction was eluted with a linear gradient (from 0M to 0.8M). The eluted active fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE (12.5% (w / v) polyacrylamide gel). FIG. 1 is an electrophoresis photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE of the eluted fraction. Lane 1 is a molecular weight marker, and lane 2 shows a band of the eluted fraction. As a result, a single band was observed (FIG. 1).
In this way, an electrophoretically purified enzyme was obtained from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782.
(Example 2: Measurement of the properties of Streptomyces cinnamoneus-derived enzyme)
The sphingomyelinase activity of the purified enzyme obtained in Example 1 was measured by the above method, and it was confirmed that it had sphingomyelinase activity. The enzymatic properties of this purified enzyme were examined.
(1) Working pH: Sphingomellia according to the above method except that the pH was changed using Tris-HCl buffer (pH 7-9) and glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9-13) as the buffer. The enzyme activity was measured. As a result, this enzyme was found to have an optimum pH of reaction of 10. FIG. 2 is a graph showing enzyme activities at various reaction pHs as relative activities based on enzyme activities when the reaction pH is 10. As can be seen from FIG. 2, this enzyme showed an activity of 50% or more of the maximum activity in a wide alkaline range from pH 8 to pH 12.
(2) Working temperature: Sphingomyelinase activity was measured according to the above method except that the reaction temperature between the enzyme and sphingomyelin was changed. FIG. 3 is a graph showing enzyme activities at various reaction temperatures as relative activities based on the activity when the reaction temperature is 37 ° C. As shown in FIG. 3, the enzyme was able to exert activity at 20-40 ° C. and the optimal temperature for the reaction was around 37 ° C.
(3) Temperature stability: The residual activity after treating the purified enzyme in 50 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0) at various temperatures for 30 minutes was measured according to the above method. Based on the enzyme activity before the temperature treatment, it was shown as the remaining ratio of the enzyme activity after each temperature treatment. FIG. 4 is a graph showing the residual activity of the enzyme after treatment at various temperatures. As shown in FIG. 4, 90% or more of the enzyme remained after the treatment at a temperature from 4 ° C. to 45 ° C. before the treatment. After the treatment at 50 ° C., about 70% of the activity before the treatment remained.
(4) Influence of various metal salts and EDTA: Various metal ions or EDTA were added during the reaction between the enzyme and sphingomyelin, and sphingomyelinase activity was measured. At this time, in order to prevent precipitation of the metal salt, the glycine-sodium hydroxide buffer (pH 10.0) was changed to a Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0). The results are shown in Table 1 in terms of relative activity with the condition that no metal salt is added as 100. This enzyme was inhibited by Zn ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , and EDTA.
(5) Substrate specificity: Sphingomyelinase activity was measured according to the above method except that various phospholipids were used as substrates instead of sphingomyelin. The results are shown in Table 2 in terms of relative activity when the sphingomyelin was used as a substrate, taken as 100. This enzyme showed substrate specificity as shown in Table 2.
(6) Molecular weight: As a result of measuring the molecular weight of the purified enzyme according to the SDS-PAGE method (12.5% (w / v) polyacrylamide gel), the molecular weight of the purified enzyme was about 35,000 (FIG. 1). .
(7) Isoelectric point: As a result of measuring the isoelectric point of the purified enzyme by isoelectric focusing using Phasgel IEF3-10 (manufactured by GE Healthcare Bioscience), the isoelectric point of the purified enzyme was 6. .1.
(Example 3: Analysis of N-terminal amino acid sequence of an enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus)
The amino acid sequence was analyzed by a protein sequencer using the purified enzyme obtained in Example 1 above. The N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme was as shown in SEQ ID NO: 3.
(Example 4: Separation of chromosomal DNA of Streptomyces cinnamoneus NBRC12782)
Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 was cultured at 28 ° C. for 4 days using 5 ml of tryptic soy medium (Becton Dinkinson) and collected. Next, the cells were suspended in 800 μl of a solution consisting of 0.15 M NaCl, 0.1 M EDTA (pH 8.0), and 8 mg / ml lysozyme, treated at 37 ° C. for 45 minutes, and further treated at −80 ° C. for 10 minutes. Treated for minutes. Next, 6 ml of a solution consisting of 1% (w / v) SDS, 0.1 M NaCl, and 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was added thereto, treated at 60 ° C. for 20 minutes, Ice-cooled. 4 ml of a phenol / chloroform mixed solution was added to 4.5 ml of this solution and stirred, and 3 ml of the aqueous phase was collected by centrifugation. To this aqueous phase, 6 ml of ethanol was added and mixed to recover DNA, and dissolved in 900 μl of a solution consisting of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 1 mM EDTA. RNase A was added to this so that it might be set to 20 micrograms / ml, and after processing at 37 degreeC for 1 hour, 900 microliters of phenol / chloroform liquid mixture was added and stirred, 600 microliters of water phases were fractionated by centrifugation. To this aqueous phase, 60 μl of 3M sodium acetate (pH 5.2) and 1.2 ml of ethanol were added and mixed to recover DNA. This DNA was immersed in 70% (v / v) ethanol for 10 minutes and then dissolved in 600 μl of a solution consisting of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
(Example 5: Cloning of the core region of the sphingomyelinase gene from Streptomyces cinnamoneus)
A degenerate oligonucleotide primer S1 sense primer (SEQ ID NO: 4) for PCR was designed based on the N-terminal amino acid sequence of sphingomyelinase and the codon used in the genus Streptomyces.
In addition, it was found that the amino acid sequence of bacterial sphingomyelinase shows high homology with the amino acid sequence of bovine DNase I, and Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Leptospira interrogans (Leptospira). As a result of comparing amino acid sequences of sphingomyelinase derived from interrogans and bovine DNase I, an amino acid sequence consisting of SDHYP was shared in a region close to the C-terminus (YO MATSUO et al., Protein Science) 1996, Vol. 5, pp. 2459-2467). Based on this amino acid sequence SDHYP and the used codons of the genus Streptomyces, a degenerate oligonucleotide primer A1 antisense primer (SEQ ID NO: 5) for PCR was designed. Here, S in the sequence represents C or G.
The composition of the reaction solution for PCR is as follows. Template chromosomal DNA 168 ng obtained in Example 4 above, 10 × PCR Buffer for KOD-plus-5 μl, primer 300 nM each, dNTP mixture 0.2 mM, MgSO ₄ 1 mM, DMSO 3%, and KOD-plus-DNA Polymerase To 0 unit, distilled water was added to a total volume of 50 μl. PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C., 2 minutes; Step 2; 94 ° C., 15 seconds; Step 3; 55 ° C. (set lower by 1 ° C. per cycle), 30 seconds; Step 4; 68 ° C., 1 minute; Step 4 is repeated 20 cycles; Step 5; 94 ° C, 15 seconds; Step 6; 40 ° C, 30 seconds; Step 7; 68 ° C, 1 minute; Step 5 to Step 7 are repeated 30 cycles; Step 8; 3 minutes. A specific amplification product of about 800 bp was obtained by PCR.
The PCR reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, the target 800 bp band was excised, bound to the pCR4-TOPO vector using TOPO Blunt Cloning Kit for Sequencing (manufactured by Invitrogen), and E. coli JM109 was transformed. The transformed strain was cultured in LB medium (peptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%, pH 7.0) containing 50 μg / ml kanamycin, and DNA sequencing was performed using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen). The plasmid for use was extracted and purified. Subsequently, the base sequence of the inserted fragment was determined by an automatic sequencer using the T7 primer and M13 reverse primer derived from the pCR4-TOPO vector. This base sequence is shown in FIG. 5 and SEQ ID NO: 12.
(Example 6: Cloning around the core region of the sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamoneus)
In order to clarify the sequence of the peripheral region of the gene sequence determined in Example 5 above, it was divided into its upstream side and downstream side, and each was amplified by PCR.
(A) Cloning on the upstream side The chromosomal DNA obtained in Example 4 above was completely digested with Sau3AI, and a library was prepared by ligating Sau3AI Cassette attached to TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). . Using this as a template, the first PCR amplification was performed using Cassette Primer C1 attached to the kit and an antisense primer AN1 (SEQ ID NO: 6) prepared based on the partial gene sequence of sphingomyelinase. The composition of the reaction solution for PCR is as follows. Template chromosomal DNA 500 ng, 10 × EX Taq Buffer 5 μl, primer 2 μM each, dNTP mixture 0.2 mM each, DMSO 3%, and TaKaRa EX Taq HS Polymerase 2.5 units were added with distilled water to a total volume of 50 μl. . PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C., 2 minutes; Step 2; 94 ° C., 30 seconds; Step 3; 55 ° C., 30 seconds; Step 4; 72 ° C., 1 minute 30 seconds; Step 2 to Step 4 are repeated 30 cycles; 72 ° C., 2 minutes. Next, using this PCR reaction solution as a template, the second PCR amplification was performed using the cassette primer C2 attached to the kit and the antisense primer AN2 (SEQ ID NO: 7) prepared based on the partial gene sequence of sphingomyelinase. went. A specific amplification product of about 400 bp was obtained, which was subcloned into the pCR4-TOPO vector, and the nucleotide sequence was determined.
(B) Downstream Cloning 100 ng of the chromosomal DNA obtained in Example 4 above was completely digested with NaeI and self-ligated using DNA Ligation Kit (Takara Bio Inc.) to prepare a library. Using this as a template, so-called inverse PCR amplification was performed using a sense primer SC1 (SEQ ID NO: 8) and an antisense primer AC2 (SEQ ID NO: 9) prepared based on the partial gene sequence of sphingomyelinase. The composition of the reaction solution for PCR is as follows. Template chromosomal DNA 100 ng, 10 × PCR Buffer for KOD-plus-5 μl, primer 300 nM each, dNTP mixture 0.2 mM each, MgSO ₄ 1 mM, DMSO 3%, and KOD-plus-DNA Polymerase 1.0 unit in distilled water Was added to a total volume of 50 μl. PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C., 3 minutes; Step 2; 94 ° C., 15 seconds; Step 3; 68 ° C., 1 minute; Step 2 to Step 3 are repeated 35 cycles; Step 4; By PCR, a specific amplification product of about 400 bp was obtained, which was subcloned into the pCR4-TOPO vector, and the nucleotide sequence was determined.
Based on the base sequence determined in the above (a) and (b) together with the base sequence determined in Example 5 above, the base sequence of the region containing the sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamoneus Then, the amino acid sequence was deduced from the nucleotide sequence of the structural gene portion (SEQ ID NO: 13). FIG. 6 shows the base sequence of the region containing the determined sphingomyelinase gene, and the deduced amino acid sequence of the structural gene at the bottom of this base sequence. The results of the sequence analysis shown in FIG. 6 revealed that the structural gene encoding sphingomyelinase consists of 999 bp nucleotides and encodes a 333 residue amino acid. The N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus determined in Example 3 above was present in the deduced amino acid sequence and was completely consistent (indicated by the underline in FIG. 6).
By using the sequence similarity search programs BLAST and FASTA, the above deduced amino acid sequences were compared with sequences in four protein sequence databases (PTR, PRF, UNI-PROT and SWISS-PROT). As a result, the deduced amino acid sequence showed 52% similarity to the sphingomyelin phosphodiesterase (sphingomyelinase) of the Salinispora tropicala CNB-440 strain.
Further, the purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus (namely, sphingomyelinase) was calculated based on the amino acid composition of this deduced amino acid sequence, and was estimated to have a molecular weight of about 32,000 daltons.
(Example 7: Preparation of a recombinant plasmid containing a sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamoneus)
In order to express Streptomyces cinnamoneus-derived sphingomyelinase in actinomycetes, a recombinant plasmid used for transformation was prepared.
First, a sense primer S2 (SEQ ID NO: 10) in which a BglII site is added to the upstream sequence of a structural gene of Sphingomyelinase derived from Streptomyces cinnamoneus, and a BglII site is added to the downstream sequence of the structural gene The antisense primer A2 (SEQ ID NO: 11) was designed. Subsequently, PCR was performed using these primers with the chromosomal DNA obtained in Example 4 as a template. The composition of the reaction solution for PCR is as follows. Template chromosomal DNA 168 ng, 10 × PCR Buffer for KOD-plus-5 μl, primer 300 nM each, dNTP mixture 0.2 mM each, MgSO ₄ 1 mM, DMSO 5%, and KOD-plus-DNA Polymerase 1.0 unit in distilled water Was added to a total volume of 50 μl. PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C., 2 minutes; Step 2; 94 ° C., 15 seconds; Step 3; 68 ° C., 1 minute; Step 2 to Step 3 are repeated 30 cycles; Step 4; By this PCR, a specific amplification product of about 1200 bp was obtained. This amplified fragment was digested with BglII and inserted into the BglII site of actinomycete plasmid pIJ702 (ATCC 35287, obtained from American Type Culture Collection) to obtain recombinant plasmid pIJ702-SMase.
(Example 8: Production of recombinant actinomycetes expressing Sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamoneus)
Using the recombinant plasmid pIJ702-SMase obtained in Example 7, protoplastized Streptomyces lividans protoplasts according to the method described in “PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Kieser et al., John Inns Foundation, 2000)” Streptomyces lividans) 1326 was transformed to obtain recombinant actinomycetes Streptomyces lividans 1326 (pIJ702-SMase).
(Example 9: Measurement of enzyme activity of recombinant actinomycetes expressing a sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamoneus)
The recombinant actinomycete obtained in Example 8 was cultured in 100 ml of tryptic soy medium (Becton Dickinson) containing 20 μg / ml thiostrepton. The supernatant was recovered from the obtained culture broth by centrifugation (15000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), and ammonium sulfate was added so as to be 60% (w / v) saturation. The mixture was left at 4 ° C. for 16 hours, and the precipitate was collected by centrifugation (15000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.). The collected precipitate was dissolved in 500 μl of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and dialyzed using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) as an external solution to obtain 0.9 ml of an enzyme solution. The enzyme activity in this enzyme solution was measured according to the method for measuring the enzyme activity of sphingomyelinase. As a result, the enzyme activity of the enzyme solution was 10.2 units / ml. No sphingomyelinase activity was detected in Streptomyces lividans 1326 (pIJ702) transformed with the plasmid pIJ702, which is a vector.

本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法が提供される。スフィンゴミエリナーゼをスフィンゴミエリンに作用させて生成されるセラミドは、化粧品の基材などとして有用である。
［配列表］
According to the present invention, a novel sphingomyelinase and a method for producing the same are provided. Ceramide produced by allowing sphingomyelinase to act on sphingomyelin is useful as a base material for cosmetics.
[Sequence Listing]

Claims

The following properties:
Action: acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine;
Substrate specificity: Less than 5% activity against phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, and phosphatidylserine, assuming 100% hydrolysis activity for sphingomyelin at 37 ° C for 10 minutes at pH 10 Is
Action pH: When the hydrolysis activity for 10 minutes at 37 ° C. is set to 100% at a pH of 10 when using sphingomyelin as a substrate, it shows a hydrolysis activity of 50% or more within the range of pH 8 to pH 12;
PH optimum: 9 to 11;
Optimal temperature: 30 ° C to 40 ° C;
Temperature stability: After treatment for 30 minutes at a temperature from 4 ° C. to 45 ° C., the hydrolysis activity when sphingomyelin is used as a substrate remains 90% or more before treatment;
Effects of various metal salts and EDTA: Mg ²⁺ , Mn ²⁺ , and Co ²⁺ promote the activity, and Zn ²⁺ , Fe ³⁺ , Al ³⁺ , and EDTA inhibit the activity;
Isoelectric point: 6.1;
Molecular weight: 35,000 when measured by SDS-PAGE and 32,000 when analyzed from amino acid composition; and Origin: Origin: Streptomyces cinnamoneus NBRC12782
Having an enzyme.

(A) a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and acting on sphingomyelin to hydrolyze the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine; or (b) an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 An enzyme having at least 90% sequence identity, acting on sphingomyelin and hydrolyzing the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine.

A polynucleotide encoding the enzyme according to claim 1 or 2.

Polynucleotide comprising the nucleotide sequence depicted in SEQ ID NO: 1.

The polynucleotide according to claim 3 or 4, which is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.

A vector comprising the polynucleotide according to any one of claims 3 to 5.

A transformant into which the polynucleotide according to any one of claims 3 to 5 or the vector according to claim 6 is introduced, and has the ability to produce an enzyme that produces ceramide and phosphorylcholine from sphingomyelin.

The transformant according to claim 7, wherein the host of the transformant is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.

A method for producing an enzyme that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine,
A step of introducing the polynucleotide according to any one of claims 3 to 5 or the vector according to claim 6 into a host to obtain a transformant producing the enzyme; and culturing the transformant, A method comprising the step of producing an enzyme.

The production method according to claim 9, wherein the host is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.