JP5301234B2 - タンパク質サンプルの大規模収集方法 - Google Patents
タンパク質サンプルの大規模収集方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5301234B2 JP5301234B2 JP2008254746A JP2008254746A JP5301234B2 JP 5301234 B2 JP5301234 B2 JP 5301234B2 JP 2008254746 A JP2008254746 A JP 2008254746A JP 2008254746 A JP2008254746 A JP 2008254746A JP 5301234 B2 JP5301234 B2 JP 5301234B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- minutes
- protein
- ice
- stress
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Description
Paweletz, C.P., et al., Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. Oncogene, 2001. 20(16): p. 1981-9. Ramalingam, S., et al., Quantitative assessment of the p53-Mdm2 feedback loop using protein lysate microarrays. Cancer Res, 2007. 67(13): p. 6247-52. Nishizuka, S., et al., Quantitative Protein Network Monitoring in Response to DNA Damage. J Proteome Res, 2008. Utz, P.J., Protein arrays for studying blood cells and their secreted products. Immunol Rev, 2005. 204: p. 264-82. Liotta, L. and E. Petricoin, Molecular profiling of human cancer. Nat Rev Genet, 2000. 1(1): p. 48-56. Nishizuka, S. and B. Spurrier, Experimental validation for quantitative protein network models. Curr Opin Biotechnol, 2008. Chan, S.M., et al., Protein microarrays for multiplex analysis of signal transduction pathways. Nat Med, 2004. 10(12): p. 1390-6. Winters, M.E., et al., Supra-additive growth inhibition by a celecoxib analogue and carboxyamido-triazole is primarily mediated through apoptosis. Cancer Res, 2005. 65(9): p. 3853-60. Sevecka, M. and G. MacBeath, State-based discovery: a multidimensional screen for small-molecule modulators of EGF signaling. Nat Methods, 2006. 3(10): p. 825-31. Spurrier, B., et al., Antibody screening database for protein kinetic modeling. Proteomics, 2007. 7(18): p. 3259-63. Anderson, L. and J. Seilhamer, A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis, 1997. 18(3-4): p. 533-7. Nishizuka, S., et al., Proteomic profiling of the NCI-60 cancer cell lines using new high-density reverse-phase lysate microarrays. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(24): p. 14229-34. Nishizuka, S., Profiling cancer stem cells using protein array technology. Eur J Cancer, 2006. 42(9): p. 1273-82. Major, S.M., et al., AbMiner: a bioinformatic resource on available monoclonal antibodies and corresponding gene identifiers for genomic, proteomic, and immunologic studies. BMC Bioinformatics, 2006. 7: p. 192. Nishizuka, S., N.R. Washburn, and P.J. Munson, Evaluation method of ordinary flatbed scanners for quantitative density analysis. Biotechniques, 2006. 40(4): p. 442, 444, 446 passim. Carlisle, A.J., et al., Development of a prostate cDNA microarray and statistical gene expression analysis package. Mol Carcinog, 2000. 28(1): p. 12-22. Ramaswamy, A., et al., Application of protein lysate microarrays to molecular marker verification and quantification. Proteome Sci, 2005. 3: p. 9. Calvert, V.S., et al., Development of Multiplexed Protein Profiling and Detection Using Near Infrared Detection of Revese-Phase Protein Microarrays. Clinical Proteomics Journal, 2004. 1: p. 81-89.
(1)各T-25型フラスコ中で培養した細胞集団に所定の時間および/または強度で刺激またはストレスを付加したのち、各フラスコを氷上に静置し、
(2)各フラスコ内の細胞集団を洗浄して細胞懸濁液を調製し、
(3)細胞懸濁液を注入した遠心チューブを直ちに氷上に静置したのち、遠心分離によって細胞ペレットを生成させ、
(4)単離した細胞ペレットをドライアイス上で維持し、
(5)室温に戻した細胞ペレットの量を見積もった後、室温のPinkBufferと細胞ペレットを混合し、氷上で細胞ペレットを溶解させ、
(6)溶解した細胞ペレットを遠心分離し、
(7)遠視分離した溶液からタンパク質溶解物を含む上清を単離する、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
1.材料
(1)試薬
・培養細胞
・Ca2+ およびMg2+ を含まないPBS(BioWhittaker; Cat. no.: 17-516Q)
・Pink buffer(試薬調製方法を参照)
・0.67×希釈バッファー(試薬調製方法を参照)
・尿素(Fluka/BioChemika; Cat. no.: 51456)
・超純水(KD Medical; Cat. no.: RFG-3410)
・Pharamlyte pH 8-10.5 (Amersham Biosciences; Cat. no.: 17-0455-01)
・CHAPS (Calbiochem; Cat. no.: 220201)
・DTT (Amersham Biosciences; Cat. no.: 17-1318-02)
・DI水
・TBST 10X (DakoCytomation; Cat. no.: K3306)
・カゼイン(I-block, Tropix; Cat. no.: T2015-0507022)
・トゥイーン20(Bio-Rad; Cat. no.: 170-6531)
・金コロイド全タンパク質染色(Bio-Rad; Cat. no.: 170-6527)
・CSA Kit (DakoCytomation; Cat. no.: K1500)
・過酸化水素
・アビジンブロック
・ビオチンブロック
・ストレプタビジン複合体
・増幅試薬
・ジアミノベンゾジン(DAB)溶液(DakoCytomation; Cat. no.: K3468) 注意-DABは酸化成分である:基質バッファーとクロモゲンは使用の際まで混合しない。
・DAB+クロモゲン(色原体)
・ビオチン標識抗ウサギ免疫グログリン(DakoCytomation; Cat. no.:K1498)
・アビジン溶液(Invitrogen; Cat. no.: 00-4303)
・ビオチン溶液(Invitrogen; Cat. no.: 00-4303)
・ステパビジン−アレクサFluor 647共役物(オプション) (Invitrogen; Cat. no.:S-32357)
・IRDye-680ヤギ抗マウス二次抗体(オプション) (Li-Cor; Cat. No.: 926-32220)
・IRDye-800CWヤギ抗ウサギ二次抗体(オプション) (Li-Cor; Cat. No.: 926-32211)
(2)実験機器
・細胞インキュベーター(Sanyo UV SafeCell)
・T-25型フラスコ(BD Falcon; Cat. No.: 353808)
・1.5mLマイクロチューブ、1サンプルあたり2個(Daigger; Cat. no.: FX42654RA)
・セルスクレイパー(細胞擦過器)(Corning/Daigger; Cat. no.: FX8612B)
・0.2um Nalgene無菌ろ過器(Nalgene/Daigger; Cat. no.: FX8221D)
・Gentix 384-マイクロプレート(Genetix; Cat. no.: X6004)
・Bio-Radミニインキュベーショントレイ(Bio-Rad; Cat. no.: 170-3903)
・16連ピペット、4.5mm間隔(Matrix; Cat. no.: 2080)
・遠心分離器(Eppendorf Centrifuge 5417C)
・振盪器(Bio-Rad UltraRocker)
・パラフィルム
・ジップロックバッグ
・マイクロアレイヤー(Aushon BioSystems 2470), (図3a)
・自動染色機(DakoCytomation), (図3b)
・蛍光スキャナー(オプション) (Affymetrix 428)
・近赤外線スキャナー(オプション) (Li-Cor Odyssey)
2.試薬調製
(1)細胞培養
細胞はT-25フラスコで適切な培地を選択し、37℃、5%CO2条件下で培養した。所望の数フラスコを得るために必要に応じて何回も培養細胞を分注する。細胞集団が個々のフラスコで約70%のコフルエントになった時点で、培養細胞を適切な数量のフラスコに分注する。研究計画に従った刺激培地を調製し、あるいはストレス装置を準備する。注意:細胞への刺激あるいはストレス付加は完全にサンプリング手順を始める準備が完了してから行う。
(2)Pink Buffer
40mLスケールでの調製においては、尿素21.6 g を 22.5 ml の超純水に加えマグネチックスターラーで溶解させる。30分間もしくは溶液が透明になるまで撹拌する。全量は約40mLとする。0.2nmの無菌ろ過フィルターでろ過をする。0.8 mlのPharmalyte pH 8-10.5、ついで1.6 gのCHAPSを加え、この順序で穏やかに撹拌する(注意:振らないこと)。0.4gのDDTを加え、穏やかに撹拌する(注意:振らないこと)。この溶液を必要に応じて超純水で40mLにメスアップ調製する。分注量を0.5mLから1mLとして、-20℃で保存する(注意:(室温で)一度融解させた後は未使用の溶液であっても廃棄する)。上記のPinkBufferの調整方法は所望の溶液量に応じてスケール変更できる。
(3)0.67×希釈バッファー
300mLスケールでの調製には、尿素108gを168mLの超純水に加え、マグネチックスターラーで撹拌する。30分間もしくは溶液が透明になるまで撹拌する。0.2μmの無菌ろ過フィルターでろ過する。3.9mlのPharmalyte pH 8-10.5と、8.1gのCHAPSを加え、この順序で穏やかに撹拌する(注意:振らないこと)。1.8gのDTTを加え、穏やかに撹拌する(注意:振らないこと)。この溶液を必要に応じて超純水で300mLにメスアップ調製する。分注量を10mLから15mLとして、-20℃で保存する(注意:(室温で)一度融解させた後は未使用の溶液であっても廃棄する)。上記のPinkBufferの調整方法は所望の溶液量に応じてスケール変更できる。
(4)ブロッキングバッファー
いくつかのブロッキングバッファーを用いることができるが、まずはI-Block溶液を選択した。250μLのトゥイーン20と250mLのPBSを混合して0.1%のウオッシュバッファーを調製した。0.5gのTropix I-Block(粉末状)を250mlのウオッシュバッファーに混合した。電子レンジで30秒加温して、マグネチックスターラーでI-Blockが完全溶解するまで撹拌した0.2μmの無菌フィルターで滅菌ろ過した後、4℃で保存した。
(5)金コロイドの全タンパク質染色
染色試薬は使用まで4℃で保管する。金コロイドの廃液は有害廃棄物処理方法に従って処分する(図5a)。
(6)シグナル増幅触媒試薬
DAKO Cytomationが提供するキット(Cat. no.: K1500)は最低限の準備で足りる。ストレプタビジン−ビオチン複合体は、ストレプタビジン−ビオチン複合体希釈剤1mlに40μL(約1滴)のストレプタビジン−ビオチン複合体試薬A加えて調製する。次いで、40μL(約1滴)のストレプタビジン複合体試薬Bを1mLのストレプタビジン−ビオチン複合体希釈剤および試薬Aに加える。適切な混合撹拌を得るために溶液をゆっくりと倒置させる。このステップは調製プロセスの最後の方で行うことが望ましい。DAB溶液 (DakoCytomation; Cat. no.: K3468)は液体DAB+クロモゲン20μLをDAB基質バッファー1mLごとに添加して調製する。重要事項:DABは酸化剤であるからこの調製ステップは直接この溶液を使う直前に行う(図5b)。
3.実験機器の準備
(1)Aushon Biosystems 2470マイクロアレイヤー
アレイヤーのスイッチを入れ、コントロールビュー上の湿度コントロールを80%に設定する。プレートの数を設定し、抽出設定を10セクタに変える。ピン直径および間隔をサンプルに適合するように調整する(例えば、高密度マトリックスセットでは、ピン直径を130μm、x軸方向の間隔を225μm、y軸方向の間隔を225μmとする)。このステップは実際のピンサイズを変化させず、むしろフューチャー間の距離を適切に設定する。研究計画をよく反映したプリント複製を設定する(図4)。我々は水平式2複製の設定を使用した。ピンチップが余剰な物質を保持しないようにするためスライド10をブロットスライドして使うことを選択する。
(2)DAKO自動染色機
DAKO自動染色機のパラメータの設定は染色するスライドの数に応じて調整する。TBSTおよびDI水を各コンテナに充填する。すべての試薬類は使用するまで4℃で保存する。また、下記のプロトコルで試薬類を調製した場合には、調製の間は試薬をできるだけ蓋をした状態にしておく(重要事項:スライドの染色を開始するまでブロッキングバッファーあるいはDI水でスライドは常に湿潤した状態を保持すること)。
4.手続
(1)刺激・ストレス付加後のサンプル収集
1:サンプル収集に先立ち1.5mLμチューブに収集するサンプルの名称をラベルする(重要事項:ラベルには時点、刺激やストレス付加、用量、および組織の複製の数を記載する)。当該チューブは中間ステップで使用する。
2:1000μLピペットとチップ、氷桶およびセルスクレイパーを準備する(注意:このプロトコルは時間制約的な手順であり、すべての使用物質はサンプル収集の前に準備し、人間工学的に効率的な場所で手の届く範囲に配置しておく)。
3:PBSの入った50mLチューブをそれぞれ氷上に置き、T-25型フラスコ3つに対して約50mLを使って手で注いでリンスする(重要事項:すべてのプロセスは氷上もしくは冷蔵室で行う)。
4:ステップ1でラベルした1.5mLチューブを設置する。これらのチューブには細胞ペレットを収集し、それに従ったラベル付けを行う。
5:適切な時点に達したら、フラスコをその刺激あるいはストレス条件から取り除き、直ちに氷上に静置する(重要事項:刺激・ストレスポイントから氷上への移動を緩慢に行うとタンパク質収集の結果が不均一になる)。
6:収集したサンプルの洗浄手続は接着細胞か否か、あるいは懸濁液中で増殖しているかによって異なる。収集細胞が接着性の場合はオプション(A)を、収集した細胞が懸濁液中で増殖している場合はオプション(B)を使う。
オプション(A):接着細胞のための細胞収集
i:フラスコから培地を吸引する
ii:約5mlLの冷却したPBSで収集細胞を洗浄し、吸引する(注意:ピペットを使わなくともよい)。
iii:収集細胞を約5mLのPBSで2度目の洗浄を行い、吸引する。
iv:収集細胞を約5mLのPBSで3度目の洗浄を行い、培地の残渣をできるだけ少なくして細胞ペレットを生成するために、残らず吸引する。
v:ピペットで1.5mLの冷却したPBSをフラスコに注ぐ。
vi:セルスクレイパーを使ってフラスコの底から細胞を取り除き、1.5mL以下のPBSで懸濁した細胞液を得る。
オプション(B):細胞懸濁液からの細胞収集
i: 4℃、5000Gで30秒間遠心分離をしてペレットを生成する。
ii:上清を吸引除去する。
iii:約5mLの冷却したPBSを加え、細胞が完全に懸濁するまでピペット操作を何回か繰り返して細胞を洗浄する。
iv:4℃、5000Gで30秒間遠心分離をしてペレットを生成する。
v:上清を吸引除去する。
vi:約5mLの冷却したPBSを加え、細胞が完全に懸濁するまでピペット操作を何回か繰り返して細胞を洗浄する。
vii:4℃、5000Gで30秒間遠心分離をしてペレットを生成する。
viii:上清を吸引除去する。
ix:約5mLの冷却したPBSを加え、細胞が完全に懸濁するまでピペット操作を何回か繰り返して細胞を洗浄する。
x:4℃、5000Gで30秒間遠心分離をしてペレットを生成する。
xi:上清を吸引除去する。
xii:ピペットで1.5mLの冷却したPBSをフラスコに注ぐ。
xiii:ピペット操作を何回か繰り返して1.5mLの細胞懸濁液を調製する。
7:得られた1.5mLの細胞懸濁液をピペットを用いて、ステップ4で予めラベルをしておいた遠心チューブに移す。
8:遠心チューブは「直ちに」氷上に静置する。
9:4℃、6000Gで30秒間遠心分離をしてペレットを生成する(注意:チューブの底にペレットが生成していることを確認すること)。
10:ピペットを使ってPBSを除去し、直ちに細胞ペレットをドライアイス上に載せる(注意:吸引操作に真空ポンプを使用しないこと)。
11:それぞれのサンプルについて同じ操作を繰り返す(重要事項:このプロセスは生物学的複製(同様のサンプル)を取得する場合には、複数のフラスコを使って同時に行う必要がある。それぞれのサンプル収集操作は6分以内に行い、フラスコの最大数は一度に扱える個数として4個である。一時的中断:細胞ペレットを-80℃で保存することにより2〜3ヶ月の後に再開することが可能である。
(2)細胞ライセートの調製
12:新しく「protein lysate」とラベルされた遠心チューブを用意する。
13:PinkBufferを室温にする(重要事項:PinkBufferが十分長い一定の時間にわたり室温であることを確認すること)。チューブを倒置させて緩やかに混合し、すべての内容物を溶解させる。
14:細胞ペレットを室温にする。
15:細胞ペレットを簡単に遠心し、PBS残渣のないことを確認する。もし残渣がある場合はピペットを使って取り除く。
16:細胞ペレットの量を見積もる。この際、既知量として5、10、20、40μLの可視物質(例えば食物色素)を同種のチューブに入れたものを比較に用いる。
17:細胞ペレットをピペット操作で(前ステップで見積もった量と等量の)PinkBufferに溶解させる。重要事項:細胞ペレットのサイズの見積もりは、それらが全くコフルエントを示し、かつ、同じフラスコから集められたものである限りは、完全に正確でなくともかまわない。しかしながら、細胞ペレットのPinkBufferの量に対する割合はこの実験で収集したすべてのサンプルを通じて同じでなければならない。そして、このPinkBufferの量と細胞ペレットの量の比は理想的には1:1であり、これによって約10〜20μg/μLの溶解物が生成できる。そして0.67×バッファー成分に等しい濃度となる。表2(トラブルシューティング)参照。
18:チューブの蓋を閉め、チューブを連続的に指先で慎重にはじいて(フリックして)、見える細胞ペレットがバッファー中に溶解するまでこれを続ける(注意:フリックの際にチューブ内に泡が立たないように注意する)。表2(トラブルシューティング)参照。
19:すべての細胞ペレットがPinkBufferに溶解するまで溶解物チューブは氷上で静置する。
20:それぞれのサンプルについて前記の細胞の溶解ステップを繰り返す。
21:すべての細胞溶解物を4℃、16,000Gで30分間遠心をして細胞分子のより大きな画分を分離する。小さなペレットが視認できるようになったら、完了とする。表2(トラブルシューティング)参照。
22:タンパク質溶解物を含む上清を新しく用意した「protein lysate」と書かれたチューブにピペットで移す。表2(トラブルシューティング)参照。
23:-80℃で凍結保存する。一時的中断:得られたタンパク質溶解物は-80℃で少なくとも1年間は保存することができる。
(3)マイクロタイタープレートの準備
24:マイクロタイタープレートの全体配置について、たとえば、生物学的複製が異なる列、行、プレートになるように検討する。
25:マイクロタイタープレートのセットアップは、用いるのが384ウェルのプレートか、1536ウェルのプレートかによって異なる。配置が384ウェルのプレートに合せたものである場合はオプション(A)を、1536ウェルのプレートの場合はオプション(B)を使う。
オプション(A):384ウェルプレート
i:384ウェルプレートを4×8ウェルの12セクションに区切るようにマークする(図3b)。注意事項:他のプレートと混同しないようにプレートのネーミングまたはナンバリングを行う。
ii:約8mLの希釈バッファーをミニインキュベーショントレイの単一ウェルに入れる。注意事項:ミニインキュベーショントレイをベンチトップにテープで動かないよう固定する。
iii:マルチチャンネルピペット(4.5mm間隔)を使い、20μLの希釈バッファーをミニインキュベーショントレイからセクタ2から10に移す。注意事項:マイクロタイタープレートをベンチトップにテープで動かないよう固定する。
iv:サンプル原液(収集した細胞ライセート)40μLを開始セクタのそれぞれのウェルにピペットで入れる。合計20の40μLサンプルによって希釈系を構成することになる。表2(トラブルシューティング)参照。
v:希釈サンプルを作成する。20μLをマルチピペットの中央部の8チャンネルを使ってセクタ10の各列の8ウェルから20μLを抜き取って、それぞれ次のセクタの対応するウェルに移す。重要なステップ:セクタ1のD列からはじめピペットで3回撹拌する。20μLの原液をセクタ2の対応する列に移す。このウェルの全量が40μLとなるので、タンパク質が2倍希釈されたこととなる。
vi:緩やかに3〜5回撹拌し、順次セクタ10まで希釈を繰り返す。注意事項:気泡を生じさせない(図3a)。表2(トラブルシューティング)参照。
vii:セクタ10では最終的に全量を20μLとするために、希釈作成したサンプル(40μL)から20μLを抜き取って捨てる。
viii:残りのサンプル原液についても、セクタ1から10まで順次同様の希釈調製を繰り返して希釈系列を作成する。重要なステップ:8セットのサンプル希釈が単一の希釈系列準備で作成できる(マイクロピペットで一度に8サンプルを扱った場合)
オプション(B):1536ウェルプレート
i:1536ウェルプレートを8×166ウェルの12セクションに区切るようにマークする(図3d)。注意事項:他のプレートと混同しないようにプレートのネーミングまたはナンバリングを行う。希釈サンプルの位置を飛石配置することで、12のセクタそれぞれに4サンプルづつ配置することができる(図3c)。
ii:左上のプレート外縁部にそれぞれのサンプル番号を1から40までマークする(図3d)
iii:約80mLの希釈バッファーをミニインキュベーショントレイの単一ウェルに入れる。注意事項:ミニインキュベーショントレイをベンチトップにテープで動かないよう固定する。
iv:マルチチャンネルピペット(4.5mm間隔)を使い、10μLの希釈バッファーをミニインキュベーショントレイからセクタ2から10に移す。注意事項:マイクロタイタープレートをベンチトップにテープで動かないよう固定する。
v:サンプル原液(収集した細胞ライセート)20μLをセクタ1のそれぞれのウェルにピペットで入れる。注意事項:1536ウェルプレートの各ウェルの最大容量は22μLである。表2(トラブルシューティング)参照。
vi:希釈サンプルを作成する。10μLをマルチピペットの中央部の8チャンネルを使ってセクタ1の各列の8ウェルから20μLを抜き取って、それぞれ次のセクタの対応するウェルに移す。重要なステップ:セクタ1のD列からはじめピペットで3回撹拌する。10μLの原液をセクタ2の対応する列にマルチチャンネルピペットで移すると、全量が20μLとなる。これによりライセートが2倍希釈されたこととなる。
vii:緩やかに3〜5回撹拌し、分注希釈をセクタ10まで繰り返す。注意事項:気泡を生じさせないこと。表2(トラブルシューティング)参照。
viii:残りのサンプル原液についても、セクタ1から10まで順次同様の希釈調製を繰り返して2倍10段階の希釈系列を作成する。
ix:前記ステップivからviiiをセクタ11から20、21から30、31から40についても同様に繰り返す。
26:このプレートを適切に保存するにはパラフィルムで包んで、5〜10分間ドライアイス処理をしてライセートを氷結させる。
27:凍らせたプレートはジップロックバッグに入れて-80℃で保存する。一時的中断:このマイクロタイタープレートは-80℃で少なくとも1年間は保存が可能である。
(4)逆相タンパク質ライセートマイクロアレイプリント
28:アレイヤーの湿度が現在80%であることを確認する。
29:プレートを-80℃の保存状態から持ってきて、ジップロックバッグおよびパラフィルムはそのままの状態で10分間解凍する。
30:ジップロックバッグからプレートを取り出し、さらに15分間静置解凍する。
31:さらにパラフィルムをはがし、プレートが室温になるまで(約10分間)静置する。注意事項:プレートのカバーを外してはならない。
32:マイクロタイタープレートを解凍している間に、貯留タンクにDI水を充填し、廃液は空にしておく。
33:アレイの配置に従ってプレートを載せる。用いるプレートが384ウェルのプレートの場合はオプション(A)を、1536ウェルのプレートの場合はオプション(B)を使う。
オプション(A):384ウェルプレートによるマイクロアレイプリント
i:最初のプレートを載せる前に384ウェルプレートライブラリを選択する(図4a)
ii:プレートアイコンをダブルクリックしてソースプレートの必要数量をロードする。
iii:それぞれのロードしたソースプレートについて抽出物検体の数量(10まで)を設定する。
オプション(B):1536ウェルプレートによるマイクロアレイプリント
i:最初のプレートを載せる前に1536ウェルプレートライブラリを選択する(図4a)
ii:プレートアイコンをダブルクリックしてソースプレートの必要数量をロードする。
iii:それぞれのロードしたソースプレートについて抽出物検体の数量(40まで)を設定する。
34:5つのブロッティングスライドを含む最大50個のスライドをロードする。ライセートをマイクロアイレイヤーにプリントする(図2a)。一時的中断:使用するパラメータによるが、このプロセスは最大17時間程度(オバーナイトで行う場合も含む)かけて行うことができる。プリントが完了したら、プリントしたプレートは前述の方法に従って-80℃で再度保存することができる。
35:プラテンからスライドを取り除く。一時的中断:プリントしたスライドは乾燥剤いりの密閉コンテナで-20℃で保存することができる。表2(トラブルシューティング)参照)。
(5)スライドの抗体染色のための準備
36:プリント処理されたスライドを貯蔵庫から取り出し、20分間TBSTで洗浄する。
37:TBSTを交換し、さらに新しいTBSTで20分間洗浄する。
38:プリント処理されたスライドは2つの方法を選択してブロッキングを行う。オプション(A)は短時間でのブロッキング用、(B)はオーバーナイトでのブロッキング用である。重要事項:スライドを乾燥させないこと。
オプション(A):1時間ブロッキング
i:スライドをI-Block(あるいは選択したブロッキングバッファー)で浸漬させて少なくとも室温で1時間、ほんのわずかに攪拌をしながらインキュベートする。
ii:スライドは蒸発を防ぐためカバーをしておく。
オプション(B):オーバーナイトブロッキング
i:スライドをI-Block(あるいは選択したブロッキングバッファー)で浸漬させて、ほんのわずかに攪拌をしながら4℃・オーバーナイトでインキュベートする。
ii:スライドは蒸発を防ぐためカバーをしておく。
(6)特異的一時抗体によるスライドの染色
39:オートステイナー(自動染色機:図2b)を用いた場合、適切な数量のスライド染色するためのパラメータを設定するが、以下の方法とタイミングを推奨する。
過酸化水素[5分]
アビジンブロック[25分]
ビオチンブロック[25分]
I-Bloc(ブロッキングバッファー)[10分]
一次抗体[30分]
TBST(TBS + 0.5% Tween20)[15分]
2次抗体[15分]
TBST[5分]
ストレパビジン−ビオチン−HRP複合体[15分]
TBST[5分]
増幅試薬(ビオチニル−トリアミド)[15分]
TBST[5分]
HRP[5分]
TBST[5分]
DAB[5分]
40:プレ抗体(下記で用いる)を除き個々のステップの合間に「リンス」を加える。
41:廃液ビンを空にして、DI水およびTBST貯留タンクに充填する。注意:オートステイナー(自動染色機)のGUI(グラフィカルユーザインターフェイス)によれは、DI水およびTBSTがどのくらいの量が必要であるかわかる。しかしながら、その量より余分に入れるほうが望ましい。
42:水ポンプに呼び水を入れる。
43:同様にバッファーポンプも準備したのち、オートステイナーによる処理をスタートする。
44:終了したら、TBSTでスライドをリンスして、空気乾燥させておく。
45:使用した抗体、その他の重要な情報をスライドにラベルしておく。
46:プローブを付加したスライドは、光学式フラッドベットスキャナー(可視検出)、アフィメトリクス428スキャナー(蛍光検出)、あるいはLi-Cor社のオデッセイスキャナー(近赤外線検出)によりスキャニングを行う。
47:PSCANおよびProteinScanソフトウェアパッケージ(非特許文献6)を使って、検出した信号強度を定量する。表2(トラブルシューティング)参照。
(7)所用時間
以上の各ステップの所用時間は以下のとおりである。
ステップ1-4:15分
ステップ4−10:個々の収集時毎に6分
ステップ12:10分
ステップ13+14:30分
ステップ15-17:5分
ステップ18-20:1分
ステップ21:30分
ステップ22+23:5分
ステップ24:15分
ステップ25:プレートごとに1時間
ステップ26+27:10分
ステップ28-29:10分
ステップ30:15分
ステップ31:10分
ステップ32-34:15分
ステップ35-36:オーバーナイト(17時間まで)
ステップ37:20分
ステップ38:20分
ステップ38(A):1時間
ステップ38(B):オーバーナイト
ステップ40-44:30分
ステップ45-46:1時間
ステップ47:1スライドあたり15分
(8)金コロイドによる全タンパク質の染色
1:プリントされたスライドをDI水で15分ごくわずかに揺らしながら洗浄する。
2:水を取り替え、DI水で15分ごくわずかに揺らしながら洗浄する。
3:スライドを金コロイドタンパク質染色(キット)とともに、わずかに揺らしながら1時間室温でインキュベートする。
4:手早くDI水でスライドをリンスして空気乾燥させる。
(9)SYPRO Rubyによる全タンパク質の蛍光染色
1:プリントされたスライドをDI水で15分室温で7%酢酸溶液+10%メタノールの溶液で洗浄する。
2:DI水で5分洗浄する。
3:新しいDI水に取り替え、さらに5分洗浄する。
4:再度DI水を交換し、三回目の洗浄を5分行う。
5:スライドをSYPRO Rubyブロット染色液に包埋して30分インキュベートする。
6:メンブレンをDI水で10分洗浄する。DI水は2分ごとに交換する。
7:処理したスライドを空気乾燥させる。
8:蛍光スライドスキャナー(Affymetrix 428)を用い、635nmの波長でスライドをスキャンする。
(10)蛍光チアミドシグナル増幅による検出
1:過酸化水素[5分]
2:アビジンブロック[25分]
3:ビオチンブロック[25分]
4:I-Block(ブロッキングバッファー)[10分]
5:一次抗体[30分]
6:TBST(TBS + 0.5% Tween20)[15分]
7:ビオチン化二次抗体[15分]
8:TBST[5分]
9:ストレパビジン−ビオチン複合体[15分]
10:TBST[5分]
11:ストレパビジン−HRP[15分]
12:TBST[5分]
13:増幅試薬(biotinyl-tyramide)[15分]
14:TBST[5分]
15:ストレプトアビジン-AlexaFluor-647[15分]
16:TBST[5分]
17:スライドを空気乾燥させ、蛍光スキャナー(Affymetrix 428)を用い、635nmの波長でスライドをスキャンする。
(11) Singleplex(単独)近赤外線検出
1:I-block(ブロッキングバッファー)[10分]
2:一次抗体[30分]
3:TBST[15分]
4:IRDye-680ヤギ抗マウスあるいは抗ウサギ二次抗体[15分]
5:TBST[15分]
6:ライドを空気乾燥させ、近赤外スキャナー(Li-Cor Odyssey)でスライドをスキャンする。
(12) Multiplex(多重)近赤外線検出
1:I-block(ブロッキングバッファー)[10分]
2:抗マウス一次抗体[30分]
3:TBST[15分]
4:IRDye-680ヤギ抗マウス二次抗体[15分]
5:TBST[15分]
6:抗ウサギ一次抗体[30分]
7:TBST[15分]
8:IRDye-800CWヤギ抗ウサギ二次抗体[15分]
9:TBST[15分]
10:スライドを空気乾燥させ、近赤外スキャナー(Li-Cor Odyssey)でスライドをスキャンする。
5.予想される結果
この実験手順を上記通りに行うと、収集されたサンプルはいずれも生成ペレットは、ほぼ等量であると予想される。一般的には、T-25フラスコ(おおよそ70〜80%のコフルエントを示す場合)中の2〜3百万個の接着細胞から得られる細胞溶解物40μLがこの手順により得られ、結果的にタンパク質全量は約10〜25μLとなる。金コロイド全タンパク質染色(前記4(8))あるいはSYPRORuby全タンパク質染色(前記4(9))によれば、プリントした希釈カーブを可視化することができる。詳細な特徴形態は、これらのいずれの染色方法によったとしても、光学(可視光)顕微鏡でも蛍光顕微鏡のいずれでも観察可能であり、迅速に視覚的な検査ができるのである。
Claims (1)
- 持続時間および/または強度の異なる刺激またはストレスに暴露された細胞集団から均質なタンパク質を1時間から8時間で大規模収集する方法であって、以下のステップ:
(1)各T-25型フラスコ中で培養した細胞集団に所定の時間および/または強度で刺激またはストレスを付加したのち、各フラスコを氷上に静置し、
(2)各フラスコ内の細胞集団を洗浄して細胞懸濁液を調製し、
(3)細胞懸濁液を注入した遠心チューブを直ちに氷上に静置したのち、遠心分離によって細胞ペレットを生成させ、
(4)単離した細胞ペレットをドライアイス上で維持し、
(5)室温に戻した細胞ペレットの量を見積もった後、室温のPinkBufferと細胞ペレットを混合し、氷上で細胞ペレットを溶解させ、
(6)溶解した細胞ペレットを遠心分離し、
(7)遠心分離した溶液からタンパク質溶解物を含む上清を単離する、
を含むことを特徴とする方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008254746A JP5301234B2 (ja) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | タンパク質サンプルの大規模収集方法 |
PCT/JP2009/066811 WO2010038707A1 (ja) | 2008-09-30 | 2009-09-28 | タンパク質サンプルの大規模収集方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008254746A JP5301234B2 (ja) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | タンパク質サンプルの大規模収集方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010081879A JP2010081879A (ja) | 2010-04-15 |
JP5301234B2 true JP5301234B2 (ja) | 2013-09-25 |
Family
ID=42073471
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008254746A Expired - Fee Related JP5301234B2 (ja) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | タンパク質サンプルの大規模収集方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5301234B2 (ja) |
WO (1) | WO2010038707A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2021162028A1 (ja) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | ||
CN117088937B (zh) * | 2023-10-20 | 2023-12-26 | 天津纽赛生物技术有限公司 | 一种细胞蛋白提取液、其制备方法及用途 |
-
2008
- 2008-09-30 JP JP2008254746A patent/JP5301234B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-09-28 WO PCT/JP2009/066811 patent/WO2010038707A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010081879A (ja) | 2010-04-15 |
WO2010038707A1 (ja) | 2010-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Spurrier et al. | Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis | |
Mueller et al. | Reverse phase protein microarrays advance to use in clinical trials | |
Krutzik et al. | Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry | |
Baldelli et al. | Reverse phase protein microarrays | |
Armknecht et al. | High-throughput RNA interference screens in Drosophila tissue culture cells | |
JP6317771B2 (ja) | 電気泳動分離装置およびそれを使用するための方法 | |
Pin et al. | Preparation and use of reverse protein microarrays | |
US8877141B2 (en) | System for preparing arrays of biomolecules | |
JP2004511788A (ja) | 高スループット処理システム及び使用方法 | |
Spurrier et al. | Protein and lysate array technologies in cancer research | |
JP2007506419A (ja) | 実験室操作手順を自動的に実行するための装置及び方法 | |
JP5301234B2 (ja) | タンパク質サンプルの大規模収集方法 | |
Ramm et al. | A high‐throughput screening assay to identify kidney toxic compounds | |
Kobelt et al. | Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the incucyte system | |
Valekova et al. | Multiplex immunoassays for quantification of cytokines, growth factors, and other proteins in stem cell communication | |
US6468736B2 (en) | High efficiency cell analysis system and high throughput drug screening system | |
Pietiainen et al. | The high throughput biomedicine unit at the institute for molecular medicine Finland: high throughput screening meets precision medicine | |
US20110028339A1 (en) | Methods and compositions related to microscale sample processing and evaluation | |
Lycke et al. | ELISPOT assay for measurement of antigen‐specific and polyclonal antibody responses | |
JP2011147403A (ja) | 細菌検査装置及び細菌検査方法 | |
Servoss et al. | High-throughput analysis of serum antigens using sandwich ELISAs on microarrays | |
Zong et al. | Forward-phase and reverse-phase protein microarray | |
WO2010009387A1 (en) | Methods for controlling protein loading variability in reverse phase protein microarrays | |
Gonzalez et al. | Sandwich ELISA microarrays: generating reliable and reproducible assays for high-throughput screens | |
Thurow | Strategies for automating analytical and bioanalytical laboratories |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110706 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130305 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130507 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130611 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130619 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5301234 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |