JP5276993B2 - Sensitive quantification of low molecular weight peptides - Google Patents

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Abstract

LC-MS/MS was performed by focusing on a method of protein removal with TCA as a pretreatment method. The results of the measurements of PTH analogues and CNP-22 in plasma were compared between the case of performing LC-MS/MS after the treatment of protein removal with TCA and the case of employing other methods of protein removal. The method of protein removal with TCA showed a much higher recovery rate compared with the other pretreatment methods. Further, by combining SRM measurement using an inmonium ion derived from a single amino acid with a product ion, sensitive measurement could be realized. From the results of validation of this method, it was shown that the method of the invention has high sensitivity as well as sufficient reproducibility and accuracy. The method of the invention can also be applied to disease diagnosis and pharmacokinetic studies.

Description

本発明は、質量分析法による低分子量ペプチドの新規定量方法に関し、特に、LC-MS/MSを用いた定量方法に関する。   The present invention relates to a novel quantification method for low molecular weight peptides by mass spectrometry, and particularly to a quantification method using LC-MS / MS.

近年、LC（液体クロマトグラフィー）/MS（質量分析法）が著しい発展を遂げ、低分子化合物の定量・構造解析、さらにはプロテオーム解析（定性）にも威力を発揮している。最近のプロテオーム技術の発展は、ペプチド・タンパク質製剤、バイオマーカーの増加をもたらしており、LC/MSによる定量技術の開発に一層の注目が集まりつつある。   In recent years, LC (liquid chromatography) / MS (mass spectrometry) has made remarkable progress, and it is also effective for quantitative and structural analysis of low-molecular compounds, and also for proteomic analysis (qualitative). Recent developments in proteome technology have led to an increase in peptide and protein preparations and biomarkers, and more attention is being focused on the development of quantitative technology using LC / MS.

LC/MSによる生体試料中ペプチド・タンパク質の定量技術は、これまでに数多くの試みが報告されているものの（非特許文献１-14）、未だ容易ではないといえる。その理由の一つとして、生体試料から目的ペプチド・タンパク質を抽出することが難しい点が挙げられる。生体試料中にはいうまでもなく多種多様のペプチド・タンパク質が存在する。測定対象以外のペプチド・タンパク質の存在は、LC/MSによる高感度測定に影響を与えうる。そのため、測定対象以外のペプチド・タンパク質は、前処理段階で除去する必要がある。従来方法の多くは、前処理方法として、有機溶媒による除タンパク処理やC18による固相抽出を採用しているが（非特許文献1-13,15,16）、これらの方法には改善の余地が多い。   Although many attempts have been made to quantify peptides / proteins in biological samples by LC / MS (Non-Patent Documents 1-14), it can be said that they are not yet easy. One of the reasons is that it is difficult to extract a target peptide / protein from a biological sample. It goes without saying that there are a wide variety of peptides and proteins in biological samples. Existence of peptides and proteins other than the measurement target can affect high-sensitivity measurement by LC / MS. Therefore, it is necessary to remove peptides and proteins other than the measurement target in the pretreatment stage. Many of the conventional methods employ deproteinization with an organic solvent and solid phase extraction with C18 as pretreatment methods (Non-patent Documents 1-13, 15, 16), but there is room for improvement in these methods. There are many.

例えば、有機溶媒による除タンパク処理は、しばしば測定対象物であるタンパク質自体を沈殿させ、回収率の低下を招く。一方、C18のような固相抽出では、測定対象物が充填剤に十分に吸着せずに低回収率となる場合や、固相抽出カートリッジやコレクションチューブのような基材への非特異吸着によるロスが問題となる場合がある。また、オンライン固相抽出（カラムスイッチング）やイムノアフィニティー抽出は優れた抽出方法であるが、メソッド構築に時間がかかり、創薬早期の開発段階で採用する方法としては適していない。   For example, protein removal treatment with an organic solvent often precipitates the protein that is the measurement object, leading to a reduction in the recovery rate. On the other hand, in the case of solid phase extraction such as C18, the measurement target is not sufficiently adsorbed to the packing material, resulting in a low recovery rate, or due to nonspecific adsorption to a substrate such as a solid phase extraction cartridge or a collection tube. Loss can be a problem. On-line solid phase extraction (column switching) and immunoaffinity extraction are excellent extraction methods, but the method construction takes time and is not suitable as a method to be adopted at the early development stage of drug discovery.

さらに、夾雑物の除去が不十分な試料でLC/MS測定を行うと、試料中に含まれる夾雑物によっては、イオンサプレッションの問題がおきる場合がある。つまり、夾雑物のHPLCにおける溶出時間が測定対象物の溶出時間と同じである場合は、該夾雑物と測定対象物が同時にイオン化されることになる。このような夾雑物のイオン化効率が極めて高いと、夾雑物のイオン化が優先されて測定対象物のイオン化が抑制されてしまい、結果として測定感度に影響を与える。   Further, when LC / MS measurement is performed on a sample with insufficient removal of impurities, ion suppression may occur depending on the impurities contained in the sample. That is, when the elution time in the HPLC of the contaminant is the same as the elution time of the measurement object, the contaminant and the measurement object are ionized at the same time. When the ionization efficiency of such impurities is extremely high, the ionization of the impurities is prioritized and the ionization of the measurement object is suppressed, and as a result, the measurement sensitivity is affected.

このような事情から、生体試料中のペプチド・タンパク質の定量は、ELISA（酵素免疫測定法）やラジオイムノアッセイで行われることが多いのが現状である。簡便かつ高感度なLC/MSによるタンパク質測定法の開発が待たれている。
一方、除タンパク方法の一つとして、トリクロロ酢酸（TCA）を用いた除タンパク方法（TCA除タンパク法）が知られているが（非特許文献17,18）、LC/MSおよびLC-MS/MSによるペプチド定量分析の前処理としてTCA除タンパク法を行った例は、いまのところ報告されていない。
Yamaguchi K, Takashima M, Uchimura T, Kobayashi S. Biomed. Chromatogr. 2000; 14: 77-81. Wolf R, Rosche F, Hoffmann T, Demuth HU. J. Chromatogr. A 2001; 926: 21-27. Darby SM., Miller ML, Allen RO, LeBeau M. J. Anal. Toxicol. 2001; 25: 8-13. Yang JZ, Bastian KC, Moore RD, Stobaugh JF, Borchardt RT. J. Chromatogr. B 2002; 780: 269-281. DOI: 10.1016/S1570-0232(02)00536-6 Stokvis E, Rosing H, Lopez-Lazaro L, Rodriguez I, Jimeno JM, Supko JG, Schellens JH, Beijnen JH. J.Mass Spectrom. 2002; 37: 992-1000. DOI: 10.1002/jms.362 Ji QC, Gage EM, Rodila R, Chang MS, EI-Shourbagy TA. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 794-799. DOI: 10.1002/rcm.981 Bu W, Freer SD, Hollar SM, Stetson PL, Boyd RA, Kurek JB, Sved DW. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 2394-2398. DOI: 10.1002/rcm.1209 Wolf R, Hoffmann T, Rosche F, Demuth HU. J. Chromatogr. B 2004; 803: 91-99. DOI: 10.1016/j.jchromb.2003.11.044 Delinsky DC, Hill KT, White CA, Bartlett MG. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004; 18: 293-298. DOI: 10.1002/rcm.1328 Delinsky DC, Hill KT, Catherine A, Bartlett MG. Biomed. Chromatogr. 2004; 18: 700-705. DOI: 10.1002/bmc.380 Feng WY, Chan KK, Covey JM. J. Pharm. Biomed. Anal. 2002; 28: 601-612. Wan H, Umstot ES, Szeto HH, Schiller PW, Desiderio DM. J. Chromatogr. B 2004; 803: 83-90. DOI: 10.1016/j.jchromb.2003.09.003 Dai S, Song H, Dou G, Qian X, Zhang Y, Cai Y, Liu X, Tang Z. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 1273-1282. DOI: 10.1002/rcm.1917 Wan H, Desiderio DM. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 538-546. DOI: 10.1002/rcm.948 Aguiar M, Gibbs BF, Masse R. J. Chromatogr. B 2004; 803: 83-90. DOI: 10.1016/j.jchromb.2004.12.023 Crowther J, Adusumalli V, Jordan K, Abuaf P, Corkum N, Goldstein G, Tolan J. Anal. Chem. 1994; 66: 2356-2361. Cronlund M., Hardin J, Burton J, Lee L, Haber E, Blch KJ. J. Clin. Invest. 1976; 58: 142-151. Palmerini CA, Fini C, Floridi A, Morelli H, Vedovelli A, J. Chromatogr. 1985; 339: 285-292. Under such circumstances, the quantification of peptides and proteins in biological samples is often performed by ELISA (enzyme immunoassay) or radioimmunoassay. Development of a simple and highly sensitive LC / MS protein measurement method is awaited.
On the other hand, as one of the deproteinization methods, a deproteinization method using trichloroacetic acid (TCA) (TCA deproteinization method) is known (Non-patent Documents 17 and 18), but LC / MS and LC-MS / To date, no TCA protein removal method has been reported as a pretreatment for quantitative peptide analysis by MS.
Yamaguchi K, Takashima M, Uchimura T, Kobayashi S. Biomed. Chromatogr. 2000; 14: 77-81. Wolf R, Rosche F, Hoffmann T, Demuth HU. J. Chromatogr. A 2001; 926: 21-27. Darby SM., Miller ML, Allen RO, LeBeau MJ Anal. Toxicol. 2001; 25: 8-13. Yang JZ, Bastian KC, Moore RD, Stobaugh JF, Borchardt RT. J. Chromatogr. B 2002; 780: 269-281. DOI: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00536-6 Stokvis E, Rosing H, Lopez-Lazaro L, Rodriguez I, Jimeno JM, Supko JG, Schellens JH, Beijnen JH. J. Mass Spectrom. 2002; 37: 992-1000. DOI: 10.1002 / jms.362 Ji QC, Gage EM, Rodila R, Chang MS, EI-Shourbagy TA.Rapid Commun.Mass Spectrom. 2003; 17: 794-799. DOI: 10.1002 / rcm.981 Bu W, Freer SD, Hollar SM, Stetson PL, Boyd RA, Kurek JB, Sved DW.Rapid Commun.Mass Spectrom. 2003; 17: 2394-2398. DOI: 10.1002 / rcm.1209 Wolf R, Hoffmann T, Rosche F, Demuth HU. J. Chromatogr. B 2004; 803: 91-99. DOI: 10.1016 / j.jchromb. 2003.11.044 Delinsky DC, Hill KT, White CA, Bartlett MG.Rapid Commun.Mass Spectrom. 2004; 18: 293-298. DOI: 10.1002 / rcm.1328 Delinsky DC, Hill KT, Catherine A, Bartlett MG. Biomed. Chromatogr. 2004; 18: 700-705. DOI: 10.1002 / bmc.380 Feng WY, Chan KK, Covey JM. J. Pharm. Biomed. Anal. 2002; 28: 601-612. Wan H, Umstot ES, Szeto HH, Schiller PW, Desiderio DM. J. Chromatogr. B 2004; 803: 83-90. DOI: 10.1016 / j.jchromb.2003.09.003 Dai S, Song H, Dou G, Qian X, Zhang Y, Cai Y, Liu X, Tang Z. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 1273-1282. DOI: 10.1002 / rcm. 1917 Wan H, Desiderio DM. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 538-546.DOI: 10.1002 / rcm.948 Aguiar M, Gibbs BF, Masse RJ Chromatogr. B 2004; 803: 83-90. DOI: 10.1016 / j.jchromb.2004.12.023 Crowther J, Adusumalli V, Jordan K, Abuaf P, Corkum N, Goldstein G, Tolan J. Anal. Chem. 1994; 66: 2356-2361. Cronlund M., Hardin J, Burton J, Lee L, Haber E, Blch KJ. J. Clin. Invest. 1976; 58: 142-151. Palmerini CA, Fini C, Floridi A, Morelli H, Vedovelli A, J. Chromatogr. 1985; 339: 285-292.

本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、質量分析法による、混合物中のタンパク質の簡便でかつ高感度な定量法の提供である。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and the problem to be solved by the present invention is to provide a simple and highly sensitive quantitative method for proteins in a mixture by mass spectrometry.

本発明者等は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。本発明者等は、前処理方法として、TCA除タンパク法に着目した。TCA除タンパク法は公知ではあるが、LC-MS/MSによるペプチド定量分析の前処理として利用した例は知られていない。本発明者等は、合成副甲状腺ホルモン類似体（PTH類似体）およびC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP-22）を血漿に添加し、該血漿試料についてTCA除タンパク法後LC-MS/MSを行った場合と、他の除タンパク法（アセトニトリルによるタンパク質沈殿およびC18カートリッジによる固相抽出法）の場合の回収率を比較した。すると興味深いことに、TCA除タンパク法で前処理した場合は、いずれの試料においても、他の前処理方法の場合と比較して非常に高い回収率を示した。   The present inventors have conducted intensive research to solve the above problems. The present inventors paid attention to the TCA deproteinization method as a pretreatment method. The TCA deproteinization method is known, but no example of using it as a pretreatment for quantitative peptide analysis by LC-MS / MS is known. The inventors added a synthetic parathyroid hormone analog (PTH analog) and C-type natriuretic peptide (CNP-22) to plasma, and performed LC-MS / MS on the plasma sample after TCA deproteinization. And the recovery rate in the case of other protein removal methods (protein precipitation with acetonitrile and solid phase extraction method with C18 cartridge). Interestingly, the pretreatment with the TCA deproteinization method showed a very high recovery rate in any sample compared with the other pretreatment methods.

また、本方法のバリデーションからは、十分な再現性および真度が示されたのみならず、感度についても測定限界値：0.2 ng/mLが示され、実用上望ましい性能を有することが示された。特筆すべきこととして、本発明者らが行ったLC/MS/MSでは、SRMモードにおけるプロダクトイオンとして低質量域のアミノ酸由来のプロダクトイオンを採用している。通常、SRM分析において低質量域（特にm/z 100未満）のプロダクトイオンを用いることは、低感度または高いバックグラウンドの危険性を孕むために、回避されることが多い。本発明の方法は、試料の前処理やLC分離を工夫すれば、低質量域（特にm/z 100未満）のプロダクトイオンを用いてさえも、高感度定量が可能になることを示したものである。すなわち本発明は、前処理として強酸による除タンパク法を採用した、混合物中に存在するタンパク質またはペプチドを質量分析法により定量する方法に関し、具体的には、以下の発明を提供するものである。
（１）以下の（a）〜（d）の工程を含む、混合物中の目的とするペプチドの定量方法、
（a）ペプチドを含む混合物を除タンパク能を有する強酸で除タンパク処理を行い、定量用試料を調製する工程、
（b）液体クロマトグラフによって前記定量用試料中の成分を分離し、分離された各成分を含む溶出液を取得する工程、
（c）前記溶出液中の成分をイオン化してプリカーサーイオンを生成させ、生成したプリカーサーイオンの中から目的とするペプチド由来のプリカーサーイオンを選択する、第一の質量分析工程、
（d）第一の質量分析工程で選択されたプリカーサーイオンから衝突誘起解離によりプロダクトイオンを生成させ、１または複数の目的とするペプチド由来のプロダクトイオンを選択して検出する、第二の質量分析工程、
（２）前記除タンパク能を有する強酸が、トリクロロ酢酸である、上記（１）に記載の定量方法、
（３）第一の質量分析工程で選択されるプリカーサーイオンが、目的とするペプチド由来のプリカーサーイオンのうち最もイオン強度の強いイオンである、上記（１）又は（２）に記載の定量方法、
（４）第二の質量分析工程で選択されるプロダクトイオンが、低質量域のペプチド又はアミノ酸由来のプロダクトイオンである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の定量方法、
（５）前記低質量域のアミノ酸由来のプロダクトイオンが、単一アミノ酸由来のインモニウムイオンである、上記（４）に記載の定量方法、
（６）前記目的とするペプチドが分子量３０００以下のペプチドである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の定量方法、
（７）前記カラムが逆相クロマトグラフィーカラムである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の定量方法、
（８）工程（b）で分離された各成分について、同時に工程（c）及び（d）を行うことにより、2種以上の異なる目的とするペプチドについて同時に定量する、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の定量方法、
（９）前記混合物が生体由来物である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の定量方法、
（１０）前記生体由来物が哺乳動物の血漿、血清、血液、尿、腹水、胸水、汗、乳頭分泌液、精液、関節液、糞便、骨髄液、胆汁、または組織抽出物のいずれかである、上記（９）に記載の定量方法、
（１１）前記目的とするペプチドが内因性ペプチドである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の定量方法。In addition, the validation of this method showed not only sufficient reproducibility and accuracy, but also a sensitivity limit of 0.2 ng / mL, indicating that it has practically desirable performance. . It should be noted that LC / MS / MS conducted by the present inventors employs a product ion derived from a low-mass amino acid as the product ion in the SRM mode. Usually, the use of product ions in the low mass range (especially less than m / z 100) in SRM analysis is often avoided because of the risk of low sensitivity or high background. The method of the present invention shows that if sample pretreatment and LC separation are devised, high-sensitivity quantification is possible even with product ions in the low mass range (especially less than m / z 100). It is. That is, the present invention relates to a method of quantifying a protein or peptide present in a mixture by mass spectrometry, which employs a deproteinization method with a strong acid as a pretreatment, and specifically provides the following inventions.
(1) A method for quantifying a target peptide in a mixture, comprising the following steps (a) to (d):
(A) a step of deproteinizing a mixture containing a peptide with a strong acid having a deproteinizing ability to prepare a sample for determination;
(B) separating the components in the sample for quantification by a liquid chromatograph and obtaining an eluate containing each separated component;
(C) a first mass analysis step of ionizing components in the eluate to generate a precursor ion, and selecting a target peptide-derived precursor ion from the generated precursor ions;
(D) Second mass spectrometry in which product ions are generated from the precursor ions selected in the first mass spectrometry step by collision-induced dissociation, and product ions derived from one or more target peptides are selected and detected. Process,
(2) The quantification method according to the above (1), wherein the strong acid having deproteinization ability is trichloroacetic acid,
(3) The quantification method according to (1) or (2) above, wherein the precursor ion selected in the first mass spectrometry step is an ion having the strongest ionic strength among the target peptide-derived precursor ions.
(4) The quantification method according to any one of (1) to (3) above, wherein the product ion selected in the second mass spectrometry step is a product ion derived from a peptide or amino acid in a low mass range,
(5) The quantification method according to the above (4), wherein the product ion derived from the low-mass amino acid is an immonium ion derived from a single amino acid,
(6) The quantification method according to any one of (1) to (5), wherein the target peptide is a peptide having a molecular weight of 3000 or less,
(7) The quantification method according to any one of (1) to (6), wherein the column is a reverse phase chromatography column,
(8) About each component isolate | separated at the process (b), by performing process (c) and (d) simultaneously, it quantifies simultaneously about 2 or more types of different target peptides, Said (1)-(7 ) The quantitative method according to any one of
(9) The quantification method according to any one of (1) to (8), wherein the mixture is derived from a living body.
(10) The biological material is any of mammalian plasma, serum, blood, urine, ascites, pleural effusion, sweat, nipple secretion, semen, joint fluid, feces, bone marrow fluid, bile, or tissue extract The quantitative method according to (9) above,
(11) The quantification method according to any one of (1) to (10), wherein the target peptide is an endogenous peptide.

m/z 574.9[M+3H]3+をプリカーサーイオンとして用いた場合の、[M1]-PTH(1-14)NH2の（a）エレクトロスプレー陽イオンマススペクトル、および（b）プロダクトイオンマススペクトルを示す図である。m/z 157.4に観察されるピークはトリプトファン由来のインモニウムイオンである。プロダクトイオンマススペクトルは、MCAによって得たが、これは0〜130 Vの衝突エネルギーに対するMS/MSスペクトルの総和である。(a) Electrospray cation mass spectrum of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and (b) product ion when m / z 574.9 [M + 3H] 3+ is used as the precursor ion It is a figure which shows a mass spectrum. The peak observed at m / z 157.4 is an immonium ion derived from tryptophan. Product ion mass spectra were obtained by MCA, which is the sum of MS / MS spectra for 0-130 V collision energy. m/z 550.4[M+3H]4+をプリカーサーイオンとして用いた場合の、CNP-22の（a）エレクトロスプレー陽イオンマススペクトル、および（b）プロダクトイオンマススペクトルを示す図である。プロダクトイオンマススペクトルは、MCAによって得たが、これは0〜130 Vの衝突エネルギーに対するMS/MSスペクトルの総和である。It is a figure which shows the (a) electrospray cation mass spectrum and (b) product ion mass spectrum of CNP-22 at the time of using m / z 550.4 [M + 3H] 4+ as a precursor ion. Product ion mass spectra were obtained by MCA, which is the sum of MS / MS spectra for 0-130 V collision energy. （a）TCA沈殿によって抽出したブランクマウス血漿、（b）Bond Elut C18 EWP（100 mg、1 cc）によって抽出したブランクマウス血漿、および（c）CNP-22（50 ng/mL）を添加したマウス血漿、のSRMイオンクロマトグラムを示す図である。SRM移行：CNP-22に関してm/z 550.4→86.1。(A) Blank mouse plasma extracted by TCA precipitation, (b) Blank mouse plasma extracted by Bond Elut C18 EWP (100 mg, 1 cc), and (c) CNP-22 (50 ng / mL) added mouse It is a figure which shows the SRM ion chromatogram of plasma. SRM transition: m / z 550.4 → 86.1 for CNP-22. （a）内部標準物質（約20 ng/mL）を添加したラット血漿、および（b）[M1]-PTH(1-14)NH2（0.2 ng/mL）および内部標準（約20 ng/mL）を添加したラット血漿、のSRMイオンクロマトグラムを示す図である。SRM移行：[M1]-PTH(1-14)NH2に関してm/z 574.9→58.2；内部標準に関してm/z 588.8→58.2。(A) Rat plasma supplemented with internal standard (approximately 20 ng / mL), and (b) [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 (0.2 ng / mL) and internal standard (approximately 20 ng / mL) FIG. 2 is a diagram showing an SRM ion chromatogram of rat plasma added with mL). SRM transition: m / z 574.9 → 58.2 for [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 ; m / z 588.8 → 58.2 for internal standard. （a）[M1]-PTH(1-14)NH2測定の検量線を示す図である。相関係数は、1日目：0.9999、2日目：0.9997、3日目：0.9983。0.2-50 ng/mLにおいて直線性が確認された。定量下限値は0.2 ng/mL。（b）CNP-22測定の検量線を示す図である。相関係数は、1日目：0.9951、2日目：0.9859、3日目：0.9852。0.2-50 ng/mLにおいて直線性が確認された。定量下限値は0.2 ng/mL。(A) is a diagram showing a calibration curve of [M 1] -PTH (1-14) NH 2 measurements. The correlation coefficients were as follows: Day 1: 0.9999, Day 2: 0.9997, Day 3: 0.9983. Linearity was confirmed at 0.2-50 ng / mL. The lower limit of quantification is 0.2 ng / mL. (B) It is a figure which shows the calibration curve of CNP-22 measurement. Correlation coefficients were as follows: Day 1: 0.9951, Day 2: 0.9859, Day 3: 0.9852, and linearity was confirmed at 0.2-50 ng / mL. The lower limit of quantification is 0.2 ng / mL. （a）内部標準物質（約20 ng/mL）を添加したラット血漿、および（b）CNP-22（0.2 ng/mL）および内部標準（約20 ng/mL）を添加したラット血漿、のSRMイオンクロマトグラムを示す図である。SRM移行：CNP-22に関してm/z 550.4→86.1；内部標準に関してm/z 591.2→136.1。SRM of (a) rat plasma supplemented with an internal standard (approximately 20 ng / mL) and (b) rat plasma supplemented with CNP-22 (0.2 ng / mL) and an internal standard (approximately 20 ng / mL) It is a figure which shows an ion chromatogram. SRM transition: m / z 550.4 → 86.1 for CNP-22; m / z 591.2 → 136.1 for internal standard. ラットに100μg/kgで[M1]-PTH(1-14)NH2を静脈内投与した時の、血漿濃度対時間プロフィールを示す図である。FIG. 6 shows plasma concentration versus time profile when [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 was intravenously administered to rats at 100 μg / kg. 内部標準物質およびヒトヘプシジンを添加したラット血漿のSRMクロマトグラムを示す図である。ヒトヘプシジン濃度は、(a) ブランク、(b) 2ng/mL、(c) 5ng/mL、(d) 1000ng/mLである。It is a figure which shows the SRM chromatogram of the rat plasma which added the internal standard substance and human hepcidin. Human hepcidin concentrations are (a) blank, (b) 2 ng / mL, (c) 5 ng / mL, (d) 1000 ng / mL. 内部標準物質およびヒトヘプシジンを添加したヒト血漿のSRMクロマトグラムを示す図である。ヒトヘプシジン濃度は、(a) ブランク、(b) 2ng/mL、(c) 5ng/mL、(d) 500ng/mLである。It is a figure which shows the SRM chromatogram of the human plasma which added the internal standard substance and human hepcidin. Human hepcidin concentrations are (a) blank, (b) 2 ng / mL, (c) 5 ng / mL, (d) 500 ng / mL. ラット血漿に添加したヒトヘプシジンを測定した際の検量線を示す図である。2-1000ng/mLにおいて極めて良好な直線性が確認された。It is a figure which shows the calibration curve at the time of measuring the human hepcidin added to rat plasma. Very good linearity was confirmed at 2-1000 ng / mL. ヒトヘプシジン-25の陽イオンESI-マススペクトルを示す図である。: (A) フルスキャン、 (B) [M+5H]5+ (m/z 558.7)をプリカーサーイオンとして用いた場合のプロダクトイオンマススペクトル。It is a figure which shows the cation ESI-mass spectrum of human hepcidin-25. : (A) Full scan, (B) Product ion mass spectrum when [M + 5H] 5+ (m / z 558.7) is used as a precursor ion. (A) 内部標準物質（約100ng/mL)を添加したヒト血清のSRMイオンクロマトグラムを示す図である。(B) ヒトヘプシジン-25（5 ng/mL）および内部標準物質（約100ng/mL）を添加したヒト血清のSRMイオンクロマトグラムを示す図である。 SRM 移行:ヒトヘプシジン-25に関して m/z 558.7→120.1 ; 内部標準物資に関してm/z 562.9→110.2 。(A) It is a figure which shows the SRM ion chromatogram of the human serum which added the internal standard substance (about 100 ng / mL). (B) It is a figure which shows the SRM ion chromatogram of the human serum which added human hepcidin-25 (5 ng / mL) and the internal standard substance (about 100 ng / mL). SRM transition: m / z 558.7 → 120.1 for human hepcidin-25; m / z 562.9 → 110.2 for internal standards.

本発明は、混合物中に存在するペプチドを質量分析法により定量する新規方法を提供する。本発明において「ペプチド」とは、アミノ酸が複数結合した分子を指し、一般的にポリペプチド、タンパク質と呼ばれる分子も本発明の「ペプチド」に含まれる。本発明の方法は、（a）ペプチドを含む混合物を除タンパク能を有する強酸で除タンパク処理を行い、定量用試料を調製する工程、（b）液体クロマトグラフによって前記定量用試料中の成分を分離し、分離された各成分を含む溶出液を取得する工程、（c）前記溶出液中の成分をイオン化してプリカーサーイオンを生成させ、生成したプリカーサーイオンの中から目的とするペプチド由来のプリカーサーイオンを選択する、第一の質量分析工程、（d）第一の質量分析工程で選択されたプリカーサーイオンから衝突誘起解離によりプロダクトイオンを生成させ、１または複数の目的とするペプチド由来のプロダクトイオンを選択して検出する、第二の質量分析工程、の各工程を含む。   The present invention provides a novel method for quantifying peptides present in a mixture by mass spectrometry. In the present invention, “peptide” refers to a molecule in which a plurality of amino acids are bonded, and molecules generally called polypeptides and proteins are also included in the “peptide” of the present invention. The method of the present invention comprises (a) a step of deproteinizing a mixture containing a peptide with a strong acid having a protein-removing ability to prepare a sample for quantification, and (b) a component in the sample for quantification by liquid chromatography. Separating and obtaining an eluate containing each separated component; (c) producing a precursor ion by ionizing the components in the eluate, and producing a precursor derived from the target peptide from the generated precursor ions A first mass analysis step for selecting ions; (d) product ions derived from one or more target peptides by generating product ions from the precursor ions selected in the first mass analysis step by collision-induced dissociation; Each step of the second mass spectrometry step is selected and detected.

本発明の方法の工程（a）：「ペプチドを含む混合物を除タンパク能を有する強酸存在下で除タンパク処理し、定量用試料を調製する工程」では、混合物中に存在する不要なタンパク質またはペプチドを、除タンパク能を有する強酸によって除去する。本発明において「ペプチドを含む混合物」は、測定対象であるペプチドのほか、夾雑物としてタンパク質またはペプチドを含む混合物である。このような混合物としては、例えば、生体由来試料、培養細胞破砕物を挙げることができる。生体由来試料としては、生体から採取されたものであれば動物由来試料でも植物由来試料でもよく、動物または植物の種類は特に問わない。本発明の方法における生体由来試料の好ましい例としては、哺乳動物由来の生体試料を挙げることができる。哺乳動物としては、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、トリ、げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター等）、ウサギ、等を例示することができる。ヒト、サル、げっ歯類は、本発明における哺乳動物として好適な例であるが、本発明における哺乳動物がこれらに限定されるわけではない。また生体由来試料の例としては、血漿、血清、血液、尿、腹水、胸水、汗、乳頭分泌液、精液、関節液、糞便、骨髄液、胆汁、または組織抽出物を挙げることができる。好ましい例としては、血漿、血清、血液または尿を挙げることができ、特に血漿が好ましい。   Step (a) of the method of the present invention: In the “step of deproteinizing a mixture containing a peptide in the presence of a strong acid having a deproteinizing ability to prepare a sample for quantification”, an unnecessary protein or peptide present in the mixture Is removed by a strong acid having a deproteinizing ability. In the present invention, the “mixture containing a peptide” is a mixture containing a protein or peptide as a contaminant in addition to the peptide to be measured. Examples of such a mixture include biological samples and cultured cell disruptions. The biological sample may be an animal-derived sample or a plant-derived sample as long as it is collected from the living body, and the kind of animal or plant is not particularly limited. A preferred example of the biological sample in the method of the present invention includes a biological sample derived from a mammal. Examples of mammals include humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, dogs, cats, birds, rodents (rats, mice, hamsters, etc.), rabbits, and the like. Humans, monkeys, and rodents are suitable examples of mammals in the present invention, but the mammals in the present invention are not limited thereto. Examples of biological samples include plasma, serum, blood, urine, ascites, pleural effusion, sweat, nipple secretion, semen, joint fluid, stool, bone marrow fluid, bile, or tissue extract. Preferred examples include plasma, serum, blood or urine, with plasma being particularly preferred.

本発明の方法における除タンパク処理は、除タンパク能を有する強酸を用いて極めて簡便に行うことができる。例えば、上記混合物のいずれかに除タンパク能を有する強酸を添加して攪拌後、遠心分離を行い夾雑物を沈殿させればよい。得られた上清を定量用試料とすることができる。本発明の方法で使用する強酸としては、一般的に除タンパクに用いられる強酸であればいずれも用いることが可能であり、例えば、トリクロロ酢酸、塩酸、リン酸等があげられる。特にトリクロロ酢酸が好ましい。   The protein removal treatment in the method of the present invention can be carried out very simply using a strong acid having a protein removal ability. For example, a strong acid having a deproteinizing ability may be added to any of the above mixtures and stirred, and then centrifuged to precipitate impurities. The obtained supernatant can be used as a sample for quantification. As the strong acid used in the method of the present invention, any strong acid generally used for deproteinization can be used, and examples thereof include trichloroacetic acid, hydrochloric acid, phosphoric acid and the like. Trichloroacetic acid is particularly preferable.

本発明の方法の工程（b）：「液体クロマトグラフによって前記定量用試料中の成分を分離し、分離された各成分を含む溶出液を取得する工程」では、質量分析を行う前に、工程（a）で調製した定量用試料中に含まれる各成分を液体クロマトグラフィーで分離する。液体クロマトグラフから溶出された画分は、質量分析用の試料となる。   In the step (b) of the method of the present invention, “the step of separating components in the sample for quantification by a liquid chromatograph and obtaining an eluate containing each separated component” is performed before mass spectrometry. Each component contained in the sample for quantification prepared in (a) is separated by liquid chromatography. The fraction eluted from the liquid chromatograph becomes a sample for mass spectrometry.

液体クロマトグラフィーの種類は、定量用試料中に混在する成分を効率的に分離可能な限り、公知の各種液体クロマトグラフィーの中から任意に選択することができる。例えば、逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の中から選択することができるが、好ましくは、逆相カラムクロマトグラフィーである。   The type of liquid chromatography can be arbitrarily selected from various known liquid chromatography as long as components mixed in the sample for quantification can be efficiently separated. For example, it can be selected from reverse phase column chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, isoelectric point chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography and the like. Is preferably reverse phase column chromatography.

使用するカラムは、実施する液体クロマトグラフィーの方法に合わせて適宜選択することができる。逆相カラムクロマトグラフィーであれば、ODS系カラムを選択することが好ましい。市販のODS系カラムの例として、YMC Pack ODS-A （YMC社）、PLRP-S （ポリマーラボラトリー社）等を挙げることができる。移動相は、カラムや液体クロマトグラフ装置に悪影響を与えない溶媒の中から選択することが好ましい。液体クロマトグラフから溶出された画分をそのまま質量分析用試料とする場合は、質量分析で採用するイオン化に適した溶媒を選択することが好ましい。例えば、質量分析のイオン化として、エレクトロスプレーイオン化法（ESI法）や大気圧化学イオン化法（APCI法）を行う場合は、移動相は揮発性であることが好ましく、また極性溶媒であることが望ましい。このような溶媒の例としては、例えば、水や塩類の水溶液、アルコール、アセトニトリル、等を挙げることができる。アセトニトリルは、本発明の方法において移動相として好適に使用可能な溶媒の一例である。
本発明の方法において、液体クロマトグラフィーは１回だけ行ってもよいし、必要に応じて数回繰り返してもよい。１回目の液体クロマトグラフィーで分画された試料を、別の種類のカラムで分離することにより、目的物質の精製度を上げることも可能である。The column to be used can be appropriately selected according to the method of liquid chromatography to be performed. In the case of reverse phase column chromatography, it is preferable to select an ODS column. Examples of commercially available ODS columns include YMC Pack ODS-A (YMC) and PLRP-S (Polymer Laboratory). The mobile phase is preferably selected from solvents that do not adversely affect the column or liquid chromatograph apparatus. When the fraction eluted from the liquid chromatograph is used as it is as a sample for mass spectrometry, it is preferable to select a solvent suitable for ionization employed in mass spectrometry. For example, when performing electrospray ionization (ESI method) or atmospheric pressure chemical ionization (APCI method) as ionization for mass spectrometry, the mobile phase is preferably volatile and preferably a polar solvent. . Examples of such solvents include water and aqueous salt solutions, alcohol, acetonitrile, and the like. Acetonitrile is an example of a solvent that can be suitably used as a mobile phase in the method of the present invention.
In the method of the present invention, liquid chromatography may be performed only once, or may be repeated several times as necessary. It is also possible to increase the degree of purification of the target substance by separating the sample fractionated by the first liquid chromatography with another type of column.

本発明の方法の工程（c）：「前記溶出液中の成分をイオン化してプリカーサーイオンを生成させ、生成したプリカーサーイオンの中から目的とするペプチド由来のプリカーサーイオンを選択する、第一の質量分析工程」では、まず、工程（b）で得られた溶出画分を質量分析計に導入し、試料中の成分をイオン化してプリカーサーイオンを生成させる。本発明においてプリカーサーイオンとは、第一の質量分析工程におけるイオン化により生成される1価または多価の陽イオンまたは負イオンをいい、特に、水素付加した1価または多価のイオンを指す。本発明の方法で実施するイオン化法は、水素付加した1価または多価のイオンを生成可能なイオン化法の中から選択することができる。このようなイオン法として、例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ESI）、サーモスプレーイオン化法(TSP)、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）等が挙げられるが、好ましくはESIである。   Step (c) of the method of the present invention: “First mass for ionizing components in the eluate to generate precursor ions, and selecting a precursor ion derived from the target peptide from the generated precursor ions In the “analysis step”, first, the elution fraction obtained in the step (b) is introduced into a mass spectrometer, and components in the sample are ionized to generate precursor ions. In the present invention, the precursor ion refers to a monovalent or polyvalent cation or negative ion generated by ionization in the first mass spectrometry step, and particularly refers to a hydrogenated monovalent or polyvalent ion. The ionization method performed in the method of the present invention can be selected from ionization methods capable of generating hydrogenated monovalent or polyvalent ions. Examples of such an ion method include an electrospray ionization method (ESI), a thermospray ionization method (TSP), a matrix-assisted laser desorption ionization method (MALDI), and the like, preferably ESI.

第一の質量分析工程におけるイオン化によって生成したプリカーサーイオンの中から、第二の質量分析工程に移行させるプリカーサーイオンを選択する。第二の質量分析工程に移行させるプリカーサーイオンの選択は、実施例を参考に実施することができる。まず、本発明の方法を実施する前に、目的とするペプチドのマススペクトルを作成し、該ペプチドの分子量からプリカーサーイオンの生成を確認する。付加する水素数によって価数の異なるプリカーサーイオンが複数種生成する場合は、イオン強度が最も強いプリカーサーイオンを選択する。本発明の方法を実施する際には、第二の質量分析工程に移行させるプリカーサーイオンとして、上記で選択したプリカーサーイオンを選択すればよい。   Precursor ions to be transferred to the second mass analysis step are selected from the precursor ions generated by ionization in the first mass analysis step. Selection of the precursor ion to be transferred to the second mass spectrometry step can be performed with reference to the examples. First, before carrying out the method of the present invention, a mass spectrum of the target peptide is prepared, and production of a precursor ion is confirmed from the molecular weight of the peptide. When a plurality of precursor ions having different valences depending on the number of hydrogens to be added are generated, the precursor ion having the strongest ion intensity is selected. When carrying out the method of the present invention, the precursor ion selected above may be selected as the precursor ion to be transferred to the second mass spectrometry step.

本発明の方法の工程（d）：「第一の質量分析工程で選択されたプリカーサーイオンから衝突誘起解離によりプロダクトイオンを生成させ、１または複数の目的とするペプチド由来のプロダクトイオンを選択して検出する、第二の質量分析工程」では、上記工程（c）で選択された目的ペプチド由来のプリカーサーイオンに、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガスを衝突させてプロダクトイオンを生成させる。本発明の方法において、検出するプロダクトイオンは、１つでもよいし、複数のプロダクトイオンを検出してもよい。高感度の測定を行うためには、高いイオン強度の得られる低質量域のペプチド又はアミノ酸由来のイオンを選択することが好ましく、単一アミノ酸由来のインモニウムイオンを選択することが特に好ましい。本発明において、低質量域のペプチド又はアミノ酸由来のプロダクトイオンとは、ペプチド又はアミノ酸由来のプロダクトイオンであって、通常、低感度または高いバックグラウンドの危険性を孕むため選択することが難しい質量対電荷比（m/z）が300以下であるプロダクトイオンを意味し、特に、単一アミノ酸由来のインモニウムイオンのm/zが157（トリプトファン由来のインモニウムイオン）から29（グリシン由来のインモニウムイオン）まで存在することから、157以下であるプロダクトイオンを選択することが好ましい。   Step (d) of the method of the present invention: “Product ions are generated from the precursor ions selected in the first mass spectrometry step by collision-induced dissociation, and one or more target peptide-derived product ions are selected. In the “second mass spectrometry step to be detected”, product ions are generated by colliding an inert gas such as nitrogen gas or argon gas with the precursor ion derived from the target peptide selected in the step (c). In the method of the present invention, the number of product ions to be detected may be one or a plurality of product ions may be detected. In order to perform high-sensitivity measurement, it is preferable to select ions derived from peptides or amino acids in a low mass range where high ionic strength is obtained, and it is particularly preferable to select immonium ions derived from single amino acids. In the present invention, a product ion derived from a peptide or amino acid having a low mass range is a product ion derived from a peptide or amino acid, and is usually a mass pair that is difficult to select because of low sensitivity or high background risk. This means product ions with a charge ratio (m / z) of 300 or less. In particular, m / z of immonium ions derived from a single amino acid is from 157 (immonium ions derived from tryptophan) to 29 (immonium derived from glycine) Product ions that are 157 or less are preferred.

本発明における質量分析は、上記のとおり第一の質量分析工程と第二の質量分析工程を有しており、いわゆるMS/MS法である。MS/MS法におけるイオン検出法として通常使用される方法には、選択リアクション検出法（SRM）、選択イオン検出法（SIM）等が知られているが、本発明におけるイオン検出法としてはSRMが好ましい。
上記のようにして検出されたプロダクトイオンから目的ペプチドを定量する。目的ペプチドの定量は、検量線法（外部標準法、標準添加法、内部標準法）、同位体希釈法など、公知定量方法によって可能であり、特に限定されない。例えば、まず、目的とするペプチドの一定量（既知量）を血漿等の生体試料に添加して標準溶液を調製し、該標準溶液について本発明の方法を実施し、得られた信号強度と標準溶液の既知量から検量線を作成する。標準溶液の調製に生体試料を用いることは、定量の正確性を確保する上で重要な操作である。測定したい検体中のペプチドについて本発明の方法を実施し、得られた信号強度と該検量線によって目的ペプチドの定量が可能である。具体的な例としては、実施例に記載の方法を参照することができる。The mass spectrometry in the present invention has a first mass analysis step and a second mass analysis step as described above, and is a so-called MS / MS method. Known reaction detection methods (SRM), selective ion detection methods (SIM), etc. are known as methods usually used as ion detection methods in the MS / MS method, but SRM is used as the ion detection method in the present invention. preferable.
The target peptide is quantified from the product ion detected as described above. The target peptide can be quantified by a known quantification method such as a calibration curve method (external standard method, standard addition method, internal standard method), isotope dilution method, etc., and is not particularly limited. For example, first, a certain amount (known amount) of the target peptide is added to a biological sample such as plasma to prepare a standard solution, and the method of the present invention is performed on the standard solution. Create a calibration curve from the known amount of solution. The use of a biological sample for the preparation of a standard solution is an important operation for ensuring the accuracy of quantification. The peptide of the sample to be measured is subjected to the method of the present invention, and the target peptide can be quantified based on the obtained signal intensity and the calibration curve. As specific examples, the methods described in the examples can be referred to.

本発明の方法は、工程（a）の前処理後、工程（b）を液体クロマトグラフ装置で実施し、得られた画分をMS/MS装置に導入し工程（c）および（d）を実施してもよいし、または工程（a）の前処理によって得られた定量用試料を、LC-MS/MSが可能な装置に導入してもよい。MS/MSおよびLC-MS/MSが可能な装置は多数の製品がすでに市販されている。本発明の方法は、実施可能である限りいずれの装置で実施してもよいが、好ましくは、SRMが可能な液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置である。本発明の方法を実施する液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置の具体例として、実施例で使用したAPI 4000（登録商標）（Applied Biosystems社）を挙げることができる。
また、工程（b）を液体クロマトグラフで実施後、分離されたそれぞれの成分について、工程（c）及び（d）を同時に行うことで、混合物中に含まれる複数の異なる目的とするペプチドを同時に定量することも可能である。In the method of the present invention, after the pretreatment in the step (a), the step (b) is carried out with a liquid chromatograph device, and the obtained fraction is introduced into an MS / MS device, and the steps (c) and (d) are carried out. Alternatively, the sample for quantification obtained by the pretreatment in step (a) may be introduced into an apparatus capable of LC-MS / MS. Numerous products are already on the market for MS / MS and LC-MS / MS capable devices. The method of the present invention may be carried out in any apparatus as long as it can be carried out, but is preferably a liquid chromatography / tandem mass spectrometer capable of SRM. Specific examples of the liquid chromatography / tandem mass spectrometer for carrying out the method of the present invention include API 4000 (registered trademark) (Applied Biosystems) used in the examples.
In addition, after performing step (b) with a liquid chromatograph, steps (c) and (d) are simultaneously performed on the separated components, so that a plurality of different target peptides contained in the mixture can be simultaneously obtained. It is also possible to quantify.

本発明の方法は、任意のペプチドの測定に使用できるが、好ましい測定対象は分子量：3000以下のペプチドである。このような例として、内因性ペプチドを挙げることができる。内因性ペプチドの具体例としては、ヘプシジン、副甲状腺ホルモン、C型ナトリウム利尿ペプチドなどを挙げることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。The method of the present invention can be used for measurement of any peptide, but a preferable measurement target is a peptide having a molecular weight of 3000 or less. An example of such a peptide is an endogenous peptide. Specific examples of endogenous peptides include hepcidin, parathyroid hormone, and C-type natriuretic peptide.
It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１ PTH類似体およびCNP-22の測定〕
１．実験方法
［1-1 材料および化学物質］
[M1]-PTH(1-14)NH2（M1＝αアミノイソ酪酸3、Gln10、ホモアルギニン11、Trp14）および[M2]-PTH(1-14)NH2（M2＝シクロペンチルグリシン1、αアミノイソ酪酸3、Gln10、ホモアルギニン11、Trp14）（[M1]-PTH(1-14)NH2の内部標準）は、Peptide Institute, Inc.（Osaka, Japan）において合成し、ここで「M」はアミノ酸改変を表す。未改変のPTH(1-14)配列は、Ala1-Val2-Ser3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn10-Leu11-Gly12-Lys13-His14（配列番号：１）である。CNP-22およびチロシルCNP-22（CNP-22の内部標準）は、Peptide Instituteから購入した。Bond Elut C18（1 cc、100 mg）は、Varian Inc.（Harbor City, CA, USA）から得た。他の化学物質および溶媒は、分析試薬等級を使用した。EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
[Example 1 Measurement of PTH analog and CNP-22]
1. Experimental method [1-1 Materials and chemical substances]
[M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 (M 1 = α-aminoisobutyric acid 3 , Gln 10 , homoarginine 11 , Trp 14 ) and [M 2 ] -PTH (1-14) NH 2 (M 2 = Cyclopentylglycine 1 , α-aminoisobutyric acid 3 , Gln 10 , homoarginine 11 , Trp 14 ) (internal standard for [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 ) at Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japan) Where “M” represents an amino acid modification. The unmodified PTH (1-14) sequence is Ala 1 -Val 2 -Ser 3 -Glu 4 -Ile 5 -Gln 6 -Leu 7 -Met 8 -His 9 -Asn 10 -Leu 11 -Gly 12 -Lys 13 -His 14 (SEQ ID NO: 1). CNP-22 and tyrosyl CNP-22 (CNP-22 internal standard) were purchased from Peptide Institute. Bond Elut C18 (1 cc, 100 mg) was obtained from Varian Inc. (Harbor City, CA, USA). Other chemicals and solvents used analytical reagent grade.

［1-2 LC/ESI-MS/MS分析］
LC/ESI-MS/MSは、LC-10AD HPLCポンプ（Shimadzu Corp., Kyoto, Japan）およびCTC PALオートサンプラー（CTC Analytics, Zwingen, Switzerland）を備えたAPI4000（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて行った。ターボイオンスプレーは、イオンスプレー電圧5000 Vで陽イオンモードで操作した。ゼロ空気を噴霧ガスとして用いて（GS1設定45、GS2設定65）、窒素をカーテンガスとして用いた（設定10）。SRMモードにおける分解能は半値幅で0.7質量単位に設定した。[M1]-PTH(1-14)NH2およびCNP-22の分析的クロマトグラフィーを、YMC Pak ODS-APカラム（5μm、300Å、250 mm×2.0 mm内径、YMC Co., Ltd, Kyoto, Japan）において行った。機器の制御およびデータ処理は、Analyst（商標）ソフトウェアバージョン1.1（Applied Biosystems）を用いて行った。[1-2 LC / ESI-MS / MS analysis]
LC / ESI-MS / MS is an API4000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) equipped with an LC-10AD HPLC pump (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) and a CTC PAL autosampler (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland). ). The turbo ion spray was operated in positive ion mode with an ion spray voltage of 5000 V. Zero air was used as the atomizing gas (GS1 setting 45, GS2 setting 65) and nitrogen was used as the curtain gas (setting 10). The resolution in SRM mode was set to 0.7 mass units with half width. Analytical chromatography of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and CNP-22 was performed using a YMC Pak ODS-AP column (5 μm, 300 mm, 250 mm × 2.0 mm ID, YMC Co., Ltd, Kyoto, Japan). Instrument control and data processing were performed using Analyst ™ software version 1.1 (Applied Biosystems).

[M1]-PTH(1-14)NH2の測定条件を以下に示す。選択反応モニタリング（SRM）移行は以下の通りに設定した。：[M1]-PTH(1-14)NH2、m/z 574.9→58.2；[M2]-PTH(1-14)NH2、m/z 588.2→58.2。[M1]-PTH(1-14)NH2および[M2]-PTH(1-14)NH2に関するデクラスタリングポテンシャル（declustering potentials、DP）はそれぞれ、66 Vおよび51 Vに設定した。ターボイオンスプレー源は、温度350℃に維持した。衝突エネルギーは、CADガス設定4で101 Vに設定した。0.1％ギ酸を含んだ10％および100％アセトニトリル溶液（水溶液）を移動相AおよびBとして用い、流速0.2 mL/分でリニアグラジエント溶出を行った。グラジエント勾配は以下の通り設定した。：B 0％（0分）→20％（15分）→0％（15.01分）→0％（20分）。The measurement conditions for [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 are shown below. Selective reaction monitoring (SRM) transition was set as follows. : [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 , m / z 574.9 → 58.2; [M 2 ] -PTH (1-14) NH 2 , m / z 588.2 → 58.2. Declustering potentials (DP) for [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and [M 2 ] -PTH (1-14) NH 2 were set to 66 V and 51 V, respectively. The turbo ion spray source was maintained at a temperature of 350 ° C. The collision energy was set to 101 V with CAD gas setting 4. Linear gradient elution was performed at a flow rate of 0.2 mL / min using 10% and 100% acetonitrile solutions (aqueous solutions) containing 0.1% formic acid as mobile phases A and B. The gradient gradient was set as follows. : B 0% (0 minutes) → 20% (15 minutes) → 0% (15.01 minutes) → 0% (20 minutes).

CNP-22の測定条件を以下に示す。SRM移行は以下の通りに設定した。：CNP-22、m/z 550.4→86.1；チロシルCNP-22、m/z 591.2→136.1。CNP-22およびチロシルCNP-22に関するDPはそれぞれ、51 Vおよび61 Vに設定した。ターボイオンスプレー源は、温度350℃に維持した。CNP-22およびチロシルCNP-22の衝突エネルギーはそれぞれ、66 Vおよび37 Vに設定した。CADガスは4に設定した。0.1％ギ酸を含んだ10％および100％アセトニトリル溶液（水溶液）を移動相AおよびBとして用い、流速0.2 mL/分でリニアグラジエント溶出を行った。グラジエント勾配は以下の通りに設定した。：B 20％（0分）→33％（13分）→90％（13.01分）→90％（17分）→20％（17.01分）→20％（22分）。   The measurement conditions for CNP-22 are shown below. SRM migration was set as follows. : CNP-22, m / z 550.4 → 86.1; Tyrosyl CNP-22, m / z 591.2 → 136.1. The DP for CNP-22 and tyrosyl CNP-22 were set to 51 V and 61 V, respectively. The turbo ion spray source was maintained at a temperature of 350 ° C. The collision energies of CNP-22 and tyrosyl CNP-22 were set to 66 V and 37 V, respectively. CAD gas was set to 4. Linear gradient elution was performed at a flow rate of 0.2 mL / min using 10% and 100% acetonitrile solutions (aqueous solutions) containing 0.1% formic acid as mobile phases A and B. The gradient gradient was set as follows. : B 20% (0 minutes) → 33% (13 minutes) → 90% (13.01 minutes) → 90% (17 minutes) → 20% (17.01 minutes) → 20% (22 minutes).

［1-3 血漿試料の調製］
[M1]-PTH(1-14)NH2およびCNP-22の保存溶液を0.5％BSAで1 mg/mLとなるように調製した。検量線用標準物質は、保存溶液をラット（[M1]-PTH(1-14)NH2）またはマウス（CNP-22）血漿によって希釈して調製した。検量線用標準物質の濃度は、0、0.2、0.5、1、2、5、10、20、および50 ng/mLとした。20 ng/mL内部標準物質を4％w/v TCAにおいて調製した。再現性、真度、回収率、および安定性を試験するために、保存溶液を血漿で希釈してQCサンプルを調製した。調製したQCサンプルの濃度は、[M1]-PTH(1-14)NH2は0.2、0.5、5、および40 ng/mL、およびCNP-22は0.2、2、50 ng/mLである。検量線用標準物質およびQCサンプルの上記調製は氷中で行った。[1-3 Preparation of plasma sample]
A stock solution of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and CNP-22 was prepared with 0.5% BSA to 1 mg / mL. Standards for calibration curves were prepared by diluting stock solutions with rat ([M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 ) or mouse (CNP-22) plasma. The concentration of the standard substance for the calibration curve was 0, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, and 50 ng / mL. A 20 ng / mL internal standard was prepared in 4% w / v TCA. To test reproducibility, accuracy, recovery, and stability, QC samples were prepared by diluting stock solutions with plasma. The concentrations of the prepared QC samples are 0.2, 0.5, 5, and 40 ng / mL for [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and 0.2, 2 , 50 ng / mL for CNP-22. The above preparation of the standard for calibration curve and the QC sample was performed in ice.

［1-4 血漿試料の前処理］
TCAまたはアセトニトリルによるタンパク質沈殿抽出法およびBond Elut C18 EWPカートリッジによる固相抽出を評価した。
［1-4-1 TCAクリーンアップ］
20 ng/mL内部標準物質を含む4％w/v TCA（50μl）を氷中で血漿試料（50μl）に加えた後、ボルテックスミキサーによって混合し、混合物を約8000 gで5分間遠心した。得られた上清の30μlをLC/ESI-MS/MSに直接供した。
［1-4-2 アセトニトリルによるタンパク質沈殿］
アセトニトリル（100μl）を加えて血漿試料（50μl）を沈殿させ、混合物を約8000 gで5分間遠心した。N2ガス（30℃）下で蒸発させた後、残渣を1％トリフルオロ酢酸（TFA、100μl）に溶解した。30μlをLC/ESI-MS/MSに供した。
［1-4-3 Bond Elut C18 EWPによる固相抽出］
血漿試料（50μl）を1％TFA（50μl）で希釈し、混合物をBond Elut C18 EWP（100 mg、1 cc）にローディングした。1％TFA（1 mL）によって洗浄した後、分析物を60％アセトニトリル（1 mL）において0.1％TFAによって溶出した。溶出物をN2ガス下で蒸発させて、残渣を1％TFA（100 μl）に溶解した。30μlをLC/ESI-MS/MSに供した。[1-4 Pretreatment of plasma samples]
Protein precipitation extraction with TCA or acetonitrile and solid phase extraction with Bond Elut C18 EWP cartridge were evaluated.
[1-4-1 TCA cleanup]
4% w / v TCA (50 μl) containing 20 ng / mL internal standard was added to the plasma sample (50 μl) in ice, then mixed by vortex mixer, and the mixture was centrifuged at about 8000 g for 5 minutes. 30 μl of the obtained supernatant was directly subjected to LC / ESI-MS / MS.
[1-4-2 Protein precipitation with acetonitrile]
Acetonitrile (100 μl) was added to precipitate the plasma sample (50 μl) and the mixture was centrifuged at about 8000 g for 5 minutes. After evaporation under N 2 gas (30 ° C.), the residue was dissolved in 1% trifluoroacetic acid (TFA, 100 μl). 30 μl was subjected to LC / ESI-MS / MS.
[1-4-3 Solid phase extraction with Bond Elut C18 EWP]
Plasma samples (50 μl) were diluted with 1% TFA (50 μl) and the mixture was loaded onto Bond Elut C18 EWP (100 mg, 1 cc). After washing with 1% TFA (1 mL), the analyte was eluted with 0.1% TFA in 60% acetonitrile (1 mL). The eluate was evaporated under N 2 gas and the residue was dissolved in 1% TFA (100 μl). 30 μl was subjected to LC / ESI-MS / MS.

［1-5 方法のバリデーション］
方法のバリデーションとして、特異性、直線性、定量下限値（LLOQ）、再現性、真度、抽出回収率、オートサンプラーの安定性、および血漿中での安定性について評価した。特異性は、ブランク血漿試料における分析物の保持時間で干渉ピークが存在しないことを確認することによって、評価した。検量線は、重み付（1/x）直線回帰によって、0.2〜50 ng/mLの範囲で作成した。日内再現性および真度は、同じ日に同じQC試料5個を分析することによって評価した。日間再現性および真度は、異なる3日間にQCサンプルを分析することによって評価した。抽出回収率は、濃度50 ng/mLの無血漿標準液（1％トリフルオロ酢酸）と比較することによって決定した。試料調製後のオートサンプラーにおける安定性は、QCサンプルを用いて評価した。前処置技法の後、試料をオートサンプラーにおいて5℃で保存して、0および24時間目に分析した。血漿（5℃、40 ng/mL）中での[M1]-PTH(1-14)NH2の安定性を0および24時間目に分析した。血漿（-80℃、50 ng/mL）中でのCNP-22の安定性は、保存後7日目に評価した。[1-5 Method validation]
As validation of the method, the specificity, linearity, lower limit of quantification (LLOQ), reproducibility, accuracy, extraction recovery, autosampler stability, and stability in plasma were evaluated. Specificity was assessed by confirming the absence of an interference peak at the retention time of the analyte in the blank plasma sample. A calibration curve was prepared in the range of 0.2 to 50 ng / mL by weighted (1 / x) linear regression. Intraday reproducibility and accuracy were assessed by analyzing 5 identical QC samples on the same day. Daily reproducibility and accuracy were assessed by analyzing QC samples on three different days. Extraction recovery was determined by comparison with a plasma-free standard solution (1% trifluoroacetic acid) at a concentration of 50 ng / mL. The stability of the autosampler after sample preparation was evaluated using QC samples. Following the pretreatment technique, samples were stored at 5 ° C. in an autosampler and analyzed at 0 and 24 hours. The stability of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 in plasma (5 ° C., 40 ng / mL) was analyzed at 0 and 24 hours. The stability of CNP-22 in plasma (−80 ° C., 50 ng / mL) was evaluated 7 days after storage.

［1-6 薬物動態試験］
[M1]-PTH(1-14)NH2を、0.05％Tween 80を含むリン酸緩衝生理食塩液に溶解して、用量100μg/kgでラット大腿静脈に静脈内投与した。大腿動脈のカニューレから投与の2、5、15、30、および60分後に血液（250μl）を採取した。EDTA(K) 5μlを含む試験管に採取した血液試料を8000 gで5分間遠心した。血漿試料を5℃で保存して、24時間以内に決定した。[1-6 Pharmacokinetic study]
[M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 was dissolved in phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 80 and intravenously administered to the rat femoral vein at a dose of 100 μg / kg. Blood was collected from the femoral artery cannula at 2, 5, 15, 30, and 60 minutes after administration (250 μl). A blood sample collected in a test tube containing 5 μl of EDTA (K) was centrifuged at 8000 g for 5 minutes. Plasma samples were stored at 5 ° C. and determined within 24 hours.

２．結果および考察
［2-1 LC/ESI-MS/MS分析］
［2-1-1 [M1]-PTH(1-14)NH2］
[M1]-PTH(1-14)NH2の典型的な陽イオンESI-マススペクトルおよびプロダクトイオンマススペクトルを図1に示す。主要なイオンとして三価および四価のプロトン化分子に相当するイオンがm/z 574.9および431.3に認められた。三価イオンは四価イオンよりわずかに高い感度を示した。最も強いプロダクトイオンは、上記プリカーサーイオン双方に関してm/z 58において観察され、αアミノイソ酪酸のインモニウムイオンであると考えられた。m/z 574.9→58.2およびm/z 431.3→58.2でのSRM移行（SRM transmission）に関して、質量分析パラメータを最適化すると、双方に関してほぼ同じ強度が得られ、m/z 574.9→58.2をSRM移行として選択した。しかし、低質量域（特にm/z 100未満）のプロダクトイオンを用いることによって、内因性の成分による干渉が起こる可能性は非常に高い。したがって、250 mmカラムを用いて、緩やかなグラジエント勾配によるクロマトグラフィー分離を行った。2. Results and discussion [2-1 LC / ESI-MS / MS analysis]
[2-1-1 [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 ]
A typical cation ESI-mass spectrum and product ion mass spectrum of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 are shown in FIG. Ions corresponding to trivalent and tetravalent protonated molecules were found at m / z 574.9 and 431.3 as major ions. Trivalent ions showed slightly higher sensitivity than tetravalent ions. The strongest product ion was observed at m / z 58 for both of the above precursor ions and was considered to be the immonium ion of α-aminoisobutyric acid. For SRM transmission at m / z 574.9 → 58.2 and m / z 431.3 → 58.2, optimizing the mass spectrometry parameters gives almost the same strength for both, and m / z 574.9 → 58.2 as SRM transition Selected. However, the use of product ions in the low mass range (especially less than m / z 100) is very likely to cause interference by endogenous components. Therefore, chromatographic separation with a gentle gradient was performed using a 250 mm column.

［2-1-2 CNP-22］
CNP-22の典型的な陽イオンESI-マススペクトルおよびプロダクトイオンマススペクトルを図2に示す。最も強いプリカーサーイオンおよびプロダクトイオンはそれぞれ、m/z 550.4（四価のプロトン化分子）およびm/z 86.1（ロイシンのインモニウムイオン）で観察された。SRM移行はm/z 550.4→86.1で設定した。[2-1-2 CNP-22]
A typical positive ion ESI-mass spectrum and product ion mass spectrum of CNP-22 are shown in FIG. The strongest precursor and product ions were observed at m / z 550.4 (tetravalent protonated molecule) and m / z 86.1 (leucine immonium ion), respectively. SRM transition was set at m / z 550.4 → 86.1.

［2-2 血漿試料の前処理］
表1は、３種の前処理（TCAクリーンアップ、アセトニトリルによる沈殿、ならびにペプチドおよびタンパク質用に開発されたBond Elut C18 EWP（Extra Wide Pore）カートリッジ（100 mg、1 cc）による固相抽出）による血漿からの[M1]-PTH(1-14)NH2およびCNP-22の回収率を示す。TCAクリーンアップは、75％以上の高い回収率を示した。TCAクリーンアップによる回収率は、３つの方法の中で最高であった。Bond Elut C18 EWPカートリッジでのCNP-22の抽出回収率は許容できる範囲であったが、保持時間での干渉ピークの存在により、特異性は不十分であった（図3）。全体として、TCAクリーンアップは、高い回収率を有する最も単純、迅速で選択的な方法であることから、血漿中の[M1]-PTH(1-14)NH2およびCNP-22の前処置にとって最も有効な方法であった。
本発明者らは次に、いくつかのペプチドを用いてTCA沈殿の分子量限界を調べた。[M1]-PTH(1-14)NH2（分子量1721）、CNP-22（分子量2196）、およびチロシルCNP-22（分子量2361）の血漿からの抽出は効率的であったが、hANP(1-28)（ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、分子量3080）、hPTH(1-34)（分子量4118）、GLP-1（グルカゴン様ペプチド、分子量4112）、およびCNP53（分子量5802）の抽出は不十分であった（表２）。これらの結果は、TCA沈殿は、分子量3000以下のペプチドを測定する場合に適していることを示唆している。[2-2 Pretreatment of plasma samples]
Table 1 shows three pretreatments (TCA cleanup, precipitation with acetonitrile, and solid phase extraction with Bond Elut C18 EWP (Extra Wide Pore) cartridge (100 mg, 1 cc) developed for peptides and proteins) The recovery of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and CNP-22 from plasma is shown. TCA cleanup showed a high recovery rate of over 75%. The recovery rate from TCA cleanup was the highest among the three methods. Extraction recovery of CNP-22 on the Bond Elut C18 EWP cartridge was acceptable, but the specificity was insufficient due to the presence of interference peaks at retention time (Figure 3). Overall, pretreatment of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and CNP-22 in plasma because TCA cleanup is the simplest, fastest and selective method with high recovery It was the most effective method for this.
We next examined the molecular weight limit of TCA precipitation using several peptides. Extraction of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 (molecular weight 1721), CNP-22 (molecular weight 2196), and tyrosyl CNP-22 (molecular weight 2361) was efficient, but hANP ( 1-28) (human atrial natriuretic peptide, molecular weight 3080), hPTH (1-34) (molecular weight 4118), GLP-1 (glucagon-like peptide, molecular weight 4112), and CNP53 (molecular weight 5802) are insufficiently extracted (Table 2). These results suggest that TCA precipitation is suitable for measuring peptides with a molecular weight of 3000 or less.

Figure 0005276993
（表１：ラット血漿からの[M1]-PTH(1-14)NH2およびマウス血漿からのCNP-22の回収率）
Figure 0005276993
 (Table 1: Recovery of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 from rat plasma and CNP-22 from mouse plasma)

Figure 0005276993
（表２：適用可能な分子量の限界）
Figure 0005276993
 (Table 2: Limits of applicable molecular weight)

［2-3 方法のバリデーション］
［2-3-1 [M1]-PTH(1-14)NH2］
キャリブレーションブランク（0 ng/mL）および最低検量線標準物質（0.2 ng/mL）から得た典型的なSRMクロマトグラムを図4に示す。これらのクロマトグラムにおいて、[M1]-PTH(1-14)NH2の保持時間で内因性の物質に由来する干渉ピークは存在しなかった。検量線は、3日間のデータから直線回帰によって作成した。該検量線を図5Aに示す。直線回帰は、濃度に対してプロットした、内部標準のピーク面積に対する[M1]-PTH(1-14)NH2のピーク面積の比によって、重み付（1/x）を導入した。直線性は、0.2〜50 ng/mL（相関係数：r>0.9983）のあいだで良好であり、逆計算（back-calculated）した濃度の真度は83.0〜111.0％内であった（表3）。アッセイの再現性および真度を、表4に要約する。日内（n＝5）および日間（n＝5、3日）の変動係数（CV）はそれぞれ、全てのレベルについて12.1および13.9％未満であった。日内および日間真度は、表示値の100.8〜112.0％の範囲内であった。これらの結果から、LLOQは、0.2 ng/mLであると割付された。オートサンプラーにおいて保存（5℃、24時間）後の残存率は91.6％以上であった。血漿中での保存（5℃、24時間）後の残存率は104.8％であった。[2-3 Method validation]
[2-3-1 [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 ]
A typical SRM chromatogram from the calibration blank (0 ng / mL) and the lowest standard curve standard (0.2 ng / mL) is shown in FIG. In these chromatograms, there were no interference peaks derived from endogenous substances at the retention time of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 . A calibration curve was prepared by linear regression from data for 3 days. The calibration curve is shown in FIG. 5A. Linear regression introduced weight (1 / x) by the ratio of the peak area of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 to the peak area of the internal standard plotted against concentration. Linearity was good between 0.2 and 50 ng / mL (correlation coefficient: r> 0.9983), and the accuracy of back-calculated concentrations was within 83.0-111.0% (Table 3). ). Assay reproducibility and accuracy are summarized in Table 4. The coefficient of variation (CV) for intraday (n = 5) and daily (n = 5, 3 days) was less than 12.1 and 13.9% for all levels, respectively. The intraday and intraday accuracy was within the range of 100.8 to 112.0% of the indicated value. From these results, LLOQ was assigned to be 0.2 ng / mL. The residual rate after storage (5 ° C., 24 hours) in the autosampler was 91.6% or more. The residual ratio after storage in plasma (5 ° C., 24 hours) was 104.8%.

Figure 0005276993
（表３：ラット血漿中[M1]-PTH(1-14)NH2測定およびマウス血漿中CNP-22測定における検量線の直線性）
Figure 0005276993
 (Table 3: Linearity of calibration curve in [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 measurement in rat plasma and CNP-22 measurement in mouse plasma)

Figure 0005276993
（表４：ラット血漿中[M1]-PTH(1-14)NH2測定における日内および日間再現性および真度）
Figure 0005276993
 (Table 4: Intraday and intraday reproducibility and accuracy in [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 measurement in rat plasma)

［2-3-2 CNP-22］
マウスブランク血漿および低濃度の検量線標準物質のSRMイオンクロマトグラムを図6に示す。CNP-22の保持時間では干渉ピークは存在せず、生理的条件下で血漿濃度が極めて低いレベル（<0.2 ng/mL）で維持されることを示している。上記と同様に作成した検量線を図5Bに示す。直線性は0.2〜50 ng/mLで良好であった。日内（n＝5）および日間（n＝5、3日）の再現性および真度は、CVが9.0％未満、真度が102.0〜122.2の範囲内であり、全てのQCレベルで十分な再現性および真度であった（表5）。これらの結果は、TCAタンパク質沈殿を用いる本方法によって、合成ペプチドのみならず生体試料中の内因性ペプチドも定量できることを示唆している。[2-3-2 CNP-22]
FIG. 6 shows SRM ion chromatograms of mouse blank plasma and a low standard calibration curve standard. There is no interference peak at the retention time of CNP-22, indicating that plasma concentrations are maintained at very low levels (<0.2 ng / mL) under physiological conditions. A calibration curve prepared in the same manner as above is shown in FIG. 5B. The linearity was good at 0.2-50 ng / mL. Reproducibility and accuracy of intraday (n = 5) and daily (n = 5, 3 days) CV is less than 9.0%, accuracy is in the range of 102.0-122.2, sufficient reproduction at all QC levels Gender and trueness (Table 5). These results suggest that not only synthetic peptides but also endogenous peptides in biological samples can be quantified by this method using TCA protein precipitation.

Figure 0005276993
（表５：マウス血漿中CNP-22測定における日内および日間再現性および真度）
Figure 0005276993
 (Table 5: Intraday and intraday reproducibility and accuracy in measuring CNP-22 in mouse plasma)

［2-4 薬物動態試験］
本方法の有用性を証明するために、本方法でラットにおける[M1]-PTH(1-14)NH2の薬物動態試験を実施した。血漿濃度対時間プロットおよび薬物動態パラメータを図7および表6に示す。[M1]-PTH(1-14)NH2は、ラットにおいて3.25分という短い半減期、および126 mL/分/kgという高い代謝クリアランスを示し、低い薬理効果であった。さらに、CNP-22の定量法は、マウスにおける薬物動態試験に応用可能であった（データは示していない）。[2-4 Pharmacokinetic study]
In order to demonstrate the usefulness of this method, a pharmacokinetic study of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 in rats was performed with this method. Plasma concentration versus time plots and pharmacokinetic parameters are shown in FIG. [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 showed a low pharmacological effect, with a short half-life of 3.25 minutes and a high metabolic clearance of 126 mL / min / kg in rats. Furthermore, the CNP-22 quantification method was applicable to pharmacokinetic studies in mice (data not shown).

Figure 0005276993
（表６： [M1]-PTH(1-14)NH2の薬物動態パラメーター（ラット、静注（100μg/kg）））
Figure 0005276993
 (Table 6: Pharmacokinetic parameters of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 (rat, IV (100 μg / kg)))

〔実施例２ ヒトヘプシジンの測定〕
１．実験方法
100ng/mL内部標準物質（マウスヘプシジン mouse hepcidin-25）を含む4％TCA（50μl）をヒトヘプシジン（Human Hepcidin-25）を含む血漿試料（50μl）に添加、混合し、混合物を遠心し（15000rpm、４℃、５分）、得られた上清の30μlをLC/ESI-MS/MSに供した。血漿はラットまたはヒト血漿を使用した。検量線用標準物質の濃度は、2、5、10、20、50、100、200、500、および1000 ng/mLとした。
LC/ESI-MS/MSは、LC10Avp（Shimadzu）およびHTC-PALオートサンプラーを備えたAPI4000を用いた。ヒトヘプシジンは分子量：m/z2789であり、アミノ酸配列は、
Asp-Thr-His-Phe-Pro-Ile-Cys-Ile-Phe-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-His-Arg-Ser-Lys-Cys-Gly-Met-Cys-Cys-Lys-Thr（配列番号：２）である。LC/MS/MS条件は下記のとおりである。
スキャンモード: SRM
SRM 移行: m/z 558.7 [M+5H]5+ →m/z 120.1 [フェニルアラニンのインモニウムイオン]
カラム: PLRP-S (5 um, 150 x 2.0 mm i.d.)
移動相: A, 0.1% formic acid in H20; B, 0.1% formic acid in CH3CN
グラジエント勾配: B%, 15% (0分)→45% (10分)→90% (10.01分)→90% (12分)→15% (12.01分)→15% (15分)
流速: 0.2 mL/min[Example 2 Measurement of human hepcidin]
1. experimental method
Add 4% TCA (50 μl) containing 100 ng / mL internal standard (mouse hepcidin-25) to plasma sample (50 μl) containing human hepcidin-25, mix, and centrifuge the mixture (15000 rpm (4 ° C., 5 minutes), 30 μl of the obtained supernatant was subjected to LC / ESI-MS / MS. As plasma, rat or human plasma was used. The concentration of the standard substance for the calibration curve was 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, and 1000 ng / mL.
For LC / ESI-MS / MS, API4000 equipped with LC10Avp (Shimadzu) and HTC-PAL autosampler was used. Human hepcidin has a molecular weight of m / z 2789, and the amino acid sequence is
Asp-Thr-His-Phe-Pro-Ile-Cys-Ile-Phe-Cys-Cys-Gly-Cys-Cys-His-Arg-Ser-Lys-Cys-Gly-Met-Cys-Cys-Lys-Thr ( SEQ ID NO: 2). LC / MS / MS conditions are as follows.
Scan mode: SRM
SRM transition: m / z 558.7 [M + 5H] 5+ → m / z 120.1 [Immonium ion of phenylalanine]
Column: PLRP-S (5 um, 150 x 2.0 mm id)
Mobile phase: A, 0.1% formic acid in H20; B, 0.1% formic acid in CH3CN
Gradient gradient: B%, 15% (0 min) → 45% (10 min) → 90% (10.01 min) → 90% (12 min) → 15% (12.01 min) → 15% (15 min)
Flow rate: 0.2 mL / min

２．結果
内部標準物質および各種濃度のヒトヘプシジンを添加したラットおよびヒト血漿のSRMクロマトグラムを図8（ラット）および図9（ヒト）に示す。ヘプシジン保持時間内で内因性の物質に由来する干渉ピークは見られなかった。
ラット血漿中のヘプシジン測定結果について、真度を表７に、検量線を図10に示す。直線回帰は、上記と同様に重み付（1/x）を導入した。直線性は、2〜1000ng/mLの間で良好であった（相関係数：r=0.9984）。また、ヒト血漿中のヘプシジン測定について、日内再現性および真度を表8に示す。2. Results FIG. 8 (rat) and FIG. 9 (human) show SRM chromatograms of rat and human plasma to which an internal standard substance and various concentrations of human hepcidin were added. Within the hepcidin retention time, no interference peak derived from endogenous substances was observed.
Regarding the measurement results of hepcidin in rat plasma, the accuracy is shown in Table 7, and the calibration curve is shown in FIG. For linear regression, weighting (1 / x) was introduced as described above. The linearity was good between 2 and 1000 ng / mL (correlation coefficient: r = 0.9984). Table 8 shows the daily reproducibility and accuracy of hepcidin measurement in human plasma.

Figure 0005276993
（表７：ラット血漿に添加したヒトヘプシジン測定の真度）
Figure 0005276993
 (Table 7: Accuracy of measurement of human hepcidin added to rat plasma)

Figure 0005276993
（表８：ヒト血漿に添加したヒトヘプシジン測定の日内再現性および真度）
Figure 0005276993
 (Table 8: Daily reproducibility and accuracy of measurement of human hepcidin added to human plasma)

〔実施例３ PTH類似体およびヒトヘプシジンの測定〕
１．実験方法
[1-1 材料および化学物質]
[M1]-PTH(1-14)NH2、[M2]-PTH(1-14)NH2および未改変のPTH(1-14)は、実施例１と同一のものを使用した。
ヒトヘプシジン-25と[13C18, 15N3]-ヒトヘプシジン-25は、Peptide Institute, Inc.(Osaka, Japan)から入手した。
ラットブランク血漿は、Sprague-Dawleyラットのオス(Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan)から抗凝固剤としてヘパリンを用いて採取されたものを購入した。ヒトブランク血漿は、Uniglobe Research Corp.(Reseda, CA, USA)から購入した。Example 3 Measurement of PTH analog and human hepcidin
1. experimental method
[1-1 Materials and chemical substances]
[M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 , [M 2 ] -PTH (1-14) NH 2 and unmodified PTH (1-14) were the same as those in Example 1.
Human hepcidin-25 and [ 13 C 18 , 15 N 3 ] -human hepcidin-25 were obtained from Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japan).
Rat blank plasma was purchased from a male Sprague-Dawley rat (Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan) using heparin as an anticoagulant. Human blank plasma was purchased from Uniglobe Research Corp. (Reseda, CA, USA).

[1-2 LC/ESI-MS/MS分析]
LC/ESI-MS/MSは、実施例１と同様にして行った。ヒトペプシジン-25の分析カラムには、PLRP-S (5μm, 300Å, 150mm×2.0mm i.d., Polymer Laboratories Ltd., Shropshire, UK)を用いた。機器の制御およびデータの処理は、Analyst（商標）ソフトウェアバージョン1.1又は1.4 (Applied Biosystems) を用いた。
[M1]-PTH(1-14)NH2の測定条件は実施例１と同様である。ただし、移動相AおよびBは、0.1％ギ酸水溶液および0.1％ギ酸アセトニトリル溶液を用い、流速0.2mL/分でリニアグラジエント溶出を行った。グラジエント勾配は：B 15％(0分)→35％(15分)→0％(15.01分)→0％(20分)。[1-2 LC / ESI-MS / MS analysis]
LC / ESI-MS / MS was performed in the same manner as in Example 1. PLRP-S (5 μm, 300 mm, 150 mm × 2.0 mm id, Polymer Laboratories Ltd., Shropshire, UK) was used as the analytical column for human pepsidin-25. Instrument control and data processing used Analyst ™ software version 1.1 or 1.4 (Applied Biosystems).
The measurement conditions for [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 are the same as in Example 1. However, for mobile phases A and B, a 0.1% formic acid aqueous solution and a 0.1% formic acid acetonitrile solution were used, and linear gradient elution was performed at a flow rate of 0.2 mL / min. The gradient is: B 15% (0 minutes) → 35% (15 minutes) → 0% (15.01 minutes) → 0% (20 minutes).

ヒトヘプシジン-25の測定条件を以下に示す。選択反応モニタリング（SRM）条件は以下の通りに設定した。：ヒトヘプシジン-25、m/z558.7→120.1；[13C18, 15N3]-ヒトヘプシジン-25 、m/z562.9→110.2。ヒトヘプシジン-25および[13C18, 15N3]-ヒトヘプシジン-25に関するDPは、それぞれ59Vおよび79Vに設定した。CADガスは8に設定した。0.1％ギ酸水溶液および0.1％ギ酸アセトニトリル溶液を移動相AおよびBとして用いた。グラジエント勾配は：B 20％(0分, 0.3mL/分)→20％(2分, 0.3mL/分)→25％(2.01分, 0.2mL/分)→25％(10分, 0.2mL/分)→90％(10.01分, 0.3mL/分)→90％(12分, 0.3mL/分)→20％(12.01分, 0.3mL/分)→20％(14分, 0.3mL/分)。The measurement conditions for human hepcidin-25 are shown below. Selective reaction monitoring (SRM) conditions were set as follows. : Human hepcidin-25, m / z 558.7 → 120.1; [ 13 C 18 , 15 N 3 ] -human hepcidin-25, m / z 562.9 → 110.2. The DP for human hepcidin-25 and [ 13 C 18 , 15 N 3 ] -human hepcidin-25 was set at 59V and 79V, respectively. CAD gas was set to 8. 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1% formic acid acetonitrile solution were used as mobile phases A and B. Gradient gradient: B 20% (0 min, 0.3 mL / min) → 20% (2 min, 0.3 mL / min) → 25% (2.01 min, 0.2 mL / min) → 25% (10 min, 0.2 mL / min) Min) → 90% (10.01 min, 0.3 mL / min) → 90% (12 min, 0.3 mL / min) → 20% (12.01 min, 0.3 mL / min) → 20% (14 min, 0.3 mL / min) .

［1-3 血漿試料の調製]
[M1]-PTH(1-14)NH2を実施例１と同様に調製した。ヒトヘプシジン-25の保存溶液を蒸留水で100μg/mLとなるように調製した。検量線用標準物質はヒト血漿によって希釈し、その濃度は、0, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200および500ng/mLとした。バリデーションスタディでは、内因性ヒトヘプシジン-25を含まない（＜1ng/mL）、ヒトブランク血漿を使用した。[1-3 Preparation of plasma sample]
[M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 was prepared as in Example 1. A stock solution of human hepcidin-25 was prepared with distilled water to 100 μg / mL. The standard for the standard curve was diluted with human plasma, and the concentrations were 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 and 500 ng / mL. The validation study used human blank plasma without endogenous human hepcidin-25 (<1 ng / mL).

［1-4 血漿試料の前処理]
実施例１と同様にTCAクリーンアップを行った。[1-4 Pretreatment of plasma samples]
TCA cleanup was performed in the same manner as in Example 1.

［1-5 方法のバリデーション]
実施例１と同様にバリデーションを行なった。ヒトヘプシジン-25の検量線は、重み付(1/x2)直線回帰によって、2-500ng/mLの範囲で作成した。日内再現性および真度、日間再現性および真度も実施例１と同様に評価した。抽出率は、ブランク血漿をTCAクリーンアップした後に血漿中濃度として50ng/mLの[M1]-PTH(1-14)NH2および500 ng/mLのヒトヘプシジン-25となるように標準溶液を加えたものと、50ng/mLの[M1]-PTH(1-14)NH2および500 ng/mLのヒトヘプシジン-25の血漿試料をTCAクリーンアップしたものとを比較することにより算出した。[1-5 Method validation]
Validation was performed in the same manner as in Example 1. A calibration curve for human hepcidin-25 was generated in the range of 2-500 ng / mL by weighted (1 / x 2 ) linear regression. Intraday reproducibility and accuracy and daily reproducibility and accuracy were also evaluated in the same manner as in Example 1. Extraction rate of the standard solution was adjusted to 50 ng / mL of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and 500 ng / mL human hepcidin-25 after TCA cleanup of blank plasma. Calculations were made by comparing the additions with the TCA cleanup of 50 ng / mL [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 and 500 ng / mL human hepcidin-25 plasma samples.

２．結果および考察
［2-1 LC/ESI-MS/MS分析]
［2-1-1 [M1]-PTH(1-14)NH2］
ラット血漿に濃度0.2 ng/mLとなるように[M1]-PTH(1-14)NH2を加えた時のシグナル/ノイズ(S/N)比を表９に示す。SRMチャンネルm/z 574.9→58.2, m/z 574.9→84.3, m/z 574.9→110.2, m/z 574.9→770.1についてS/N比を評価した。興味深いことに、SRMチャンネルm/z 574.9→58.2は、m/z 574.9→110.2または m/z 574.9→770.1より約5倍高いS/N比を示した。加えて、SRMチャンネルm/z 574.9→110.2（ヒスチジンのインモニウムイオン）およびm/z 574.9→84.3 （グルタミンまたはリジンのNH3脱離インモニウムイオン） もS/N比が約3で測定に使用することが可能であった。このことは、選択性が低いと考えられていたインモニウムイオンの使用が、本方法においては有用であることを示唆している。これらの結果から、最も高感度で選択性の高いSRMチャンネルとしてm/z 574.9→58.2を選択した。2. Results and discussion [2-1 LC / ESI-MS / MS analysis]
[2-1-1 [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 ]
Table 9 shows the signal / noise (S / N) ratio when [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 was added to rat plasma at a concentration of 0.2 ng / mL. The S / N ratio was evaluated for SRM channels m / z 574.9 → 58.2, m / z 574.9 → 84.3, m / z 574.9 → 110.2, m / z 574.9 → 770.1. Interestingly, the SRM channel m / z 574.9 → 58.2 showed an S / N ratio about 5 times higher than m / z 574.9 → 110.2 or m / z 574.9 → 770.1. In addition, the SRM channels m / z 574.9 → 110.2 (histidine immonium ion) and m / z 574.9 → 84.3 (glutamine or lysine NH3 desorbed immonium ion) are also used for measurement with an S / N ratio of about 3. It was possible. This suggests that the use of immonium ions, which were thought to have low selectivity, is useful in this method. From these results, m / z 574.9 → 58.2 was selected as the most sensitive and highly selective SRM channel.

Figure 0005276993
（表９ ラット血漿中の[M1]-PTH(1-14)NH2（0.2ng/mL）のS/N比およびイオン強度）
Figure 0005276993
 (Table 9 S / N ratio and ionic strength of [M 1 ] -PTH (1-14) NH 2 (0.2 ng / mL) in rat plasma)

［2-1-2 ヒトヘプシジン-25］
ヒトヘプシジン-25の典型的な陽イオンESI-マススペクトルおよびプロダクトイオンマススペクトルを図11(A)および11(B)に示す。最も強いプリカーサーイオンがm/z558.7[M+5H]5+において観察された。m/z70.1, 86.3および120.3におけるプロダクトイオンが同様のイオン強度で、m/z693.4の約3倍の感度を示した。これらのプロダクトイオンを使用してSRM条件を最適化した後、SRMチャンネルを最も高い感度を示したm/z558.7→120.1（フェニルアラニンのプロダクトイオン）に設定した。[2-1-2 human hepcidin-25]
Typical cation ESI-mass and product ion mass spectra of human hepcidin-25 are shown in FIGS. 11 (A) and 11 (B). The strongest precursor ion was observed at m / z 558.7 [M + 5H] 5+ . The product ions at m / z 70.1, 86.3, and 120.3 showed similar ionic strength and about three times the sensitivity of m / z 693.4. After optimizing SRM conditions using these product ions, the SRM channel was set to m / z 558.7 → 120.1 (phenylalanine product ion), which showed the highest sensitivity.

［2-2 血漿試料の前処理]
ヒトヘプシジン-25の回収率は、34％（n=２）であった。ヒトヘプシジン-25の分子量は2789であり、本結果もTCAクリーンアップが、分子量3000以下のペプチドを測定する場合に適していることが示唆している。[2-2 Pretreatment of plasma samples]
The recovery rate of human hepcidin-25 was 34% (n = 2). Human hepcidin-25 has a molecular weight of 2789, and this result also suggests that TCA cleanup is suitable for measuring peptides with a molecular weight of 3000 or less.

［2-3 方法のバリデーション]
ヒトヘプシジン-25測定のための検量線標準物質は、ヒト血清中には内因性ヒトヘプシジン-25が含まれることから、ラット血漿を使って準備した。1/x2重みづけで検量線を3日間作成したところ、2〜500ng/mLの範囲で良好な直線性を示し（相関係数：r＞0.9969）、各濃度における逆算値の真度は91.2-113.0％の範囲内であった（表10）。ヒトブランク血清とヒトヘプシジン-25 （LLOQ:5ng/mL） を加えたヒト血清の典型的なSRMイオンクロマトグラムを図12に示した。日内（n=5）および日間（n=5, 3日）分析の結果から、CVが17.3％未満、真度が80.2-113.3％の範囲内であり、全てのQCレベルで充分な再現性および真度を有することが示された（表11）。以上の結果、前処理にTCAクリーンアップを用いた、インモニウムイオンをプロダクトイオンとして使用するSRM分析は、ヒトヘプシジン-25に対しても有効であるばかりか、内因性ペプチドにも適用可能であることを示唆している。[2-3 Method validation]
A calibration standard for measuring human hepcidin-25 was prepared using rat plasma because human serum contains endogenous human hepcidin-25. When a calibration curve was created for 3 days with 1 / x 2 weighting, it showed good linearity in the range of 2 to 500 ng / mL (correlation coefficient: r> 0.9969), and the accuracy of the back-calculated value at each concentration was 91.2 It was within the range of -113.0% (Table 10). FIG. 12 shows a typical SRM ion chromatogram of human serum added with human blank serum and human hepcidin-25 (LLOQ: 5 ng / mL). From the results of intraday (n = 5) and daily (n = 5, 3 days) analysis, CV is less than 17.3%, accuracy is within the range of 80.2-113.3%, sufficient reproducibility at all QC levels and It was shown to have trueness (Table 11). As a result of the above, SRM analysis using immonium ions as product ions using TCA cleanup for pretreatment is effective not only for human hepcidin-25 but also for endogenous peptides. Suggests that.

Figure 0005276993
（表１０ ラット血漿中ヒトヘプシジン-25測定における検量線の直線性）
Figure 0005276993
 (Table 10 Linearity of calibration curve for measurement of human hepcidin-25 in rat plasma)

Figure 0005276993
（表１１ ヒト血清中ヒトヘプシジン-25測定における日内および日間再現性および真度）
Figure 0005276993
 (Table 11 Intraday and intraday reproducibility and accuracy in measuring human hepcidin-25 in human serum)

本発明によって、混合物中に存在するタンパク質またはペプチドを、質量分析法によって簡易かつ高感度に定量する新規方法が提供された。本発明におけるTCAクリーンアップによる前処理は、簡便な操作であるにもかかわらず、夾雑タンパクを極めて有効に取り除くことが可能である。また本発明の方法は、再現性、真度に関し十分な性能を備え、高感度の定量法であることが立証されている。ペプチドの定量法としては、SELDI-TOFMSによってヘプシジンを半定量している例が公知（Tomosugi er al, Blood, 108, 1381-1387, 2006）となっているが、検出限界は約40ng/mL（S/N=2）である。これに対し、本発明の方法でヘプシジンを測定した場合には、簡便な前処理法で2 ng/mL（S/N=3）の検出が確認されており、生体内において微量に存在する内因性のペプチドを高感度に定量することが可能となった。また、PTHアナログ、CNP-22のように極めて微量で薬効を発揮するペプチドにおいては、薬効領域でのPKを追跡する上で、pg/mLレベルの感度が必須であるが、本発明の定量方法により0.2 ng/mLという定量下限を達成することが可能となった。本発明の方法は、ヒトにおける病気の診断のみならず、動物における薬物動態試験にも応用でき、新規医薬品の開発に大きく寄与するものと期待される。   According to the present invention, a novel method for quantifying a protein or peptide present in a mixture easily and with high sensitivity by mass spectrometry is provided. Although the pretreatment by TCA cleanup in the present invention is a simple operation, it is possible to remove contaminating proteins very effectively. In addition, the method of the present invention has sufficient performance with respect to reproducibility and accuracy, and has been proved to be a highly sensitive quantitative method. As a peptide quantification method, an example in which hepcidin is semi-quantified by SELDI-TOFMS is known (Tomosugier al, Blood, 108, 1381-1387, 2006), but the detection limit is about 40 ng / mL ( S / N = 2). On the other hand, when hepcidin was measured by the method of the present invention, detection of 2 ng / mL (S / N = 3) was confirmed by a simple pretreatment method. Sex peptides can be quantified with high sensitivity. Moreover, in the case of a peptide that exhibits a medicinal effect in a very small amount such as PTH analog and CNP-22, a sensitivity of pg / mL level is essential for tracking PK in the medicinal effect region. It became possible to achieve the lower limit of quantification of 0.2 ng / mL. The method of the present invention can be applied not only to diagnosing diseases in humans but also to pharmacokinetic studies in animals, and is expected to greatly contribute to the development of new drugs.

Claims (11)

以下の（a）〜（d）の工程を含む、混合物中の目的とするペプチドの定量方法であって、前記目的とするペプチドが、分子量３０００以下のペプチドである、前記定量方法。
（a）ペプチドを含む混合物を除タンパク能を有する強酸で除タンパク処理を行い、定量用試料を調製する工程
（b）液体クロマトグラフによって前記定量用試料中の成分を分離し、分離された各成分を含む溶出液を取得する工程
（c）前記溶出液中の成分をイオン化してプリカーサーイオンを生成させ、生成したプリカーサーイオンの中から目的とするペプチド由来のプリカーサーイオンを選択する、第一の質量分析工程
（d）第一の質量分析工程で選択されたプリカーサーイオンから衝突誘起解離によりプロダクトイオンを生成させ、１または複数のアミノ酸由来のインモニウムイオンを選択して検出する、第二の質量分析工程 A method for quantifying a target peptide in a mixture, comprising the following steps (a) to (d), wherein the target peptide is a peptide having a molecular weight of 3000 or less.
(A) a step of deproteinizing a mixture containing a peptide with a strong acid having a protein-removing ability to prepare a sample for quantification (b) separating components in the sample for quantification by a liquid chromatograph and separating each component A step of obtaining an eluate containing a component (c) generating a precursor ion by ionizing a component in the eluate, and selecting a precursor ion derived from a target peptide from the generated precursor ions; Mass analysis step (d) A second mass that generates product ions from the precursor ions selected in the first mass analysis step by collision-induced dissociation and selects and detects immonium ions derived from one or more amino acids. Analysis process 前記除タンパク能を有する強酸が、トリクロロ酢酸である、請求項１に記載の定量方法。 The quantification method according to claim 1, wherein the strong acid having deproteinizing ability is trichloroacetic acid. 第一の質量分析工程で選択されるプリカーサーイオンが、目的とするペプチド由来のプリカーサーイオンのうち最もイオン強度の強いイオンである、請求項１又は２に記載の定量方法。 The quantification method according to claim 1 or 2, wherein the precursor ion selected in the first mass spectrometry step is an ion having the strongest ionic strength among the target peptide-derived precursor ions. 第二の質量分析工程で選択されるインモニウムイオンが、質量対電荷比が３００ｍ／ｚ以下であるインモニウムイオンである、請求項１〜３のいずれかに記載の定量方法。 The quantification method according to any one of claims 1 to 3, wherein the immonium ions selected in the second mass spectrometry step are immonium ions having a mass-to-charge ratio of 300 m / z or less. 前記インモニウムイオンが、単一アミノ酸由来のインモニウムイオンである、請求項１に記載の定量方法。 The method according to claim 1, wherein the immonium ion is an immonium ion derived from a single amino acid. 前記液体クロマトグラフのカラムが逆相クロマトグラフィーカラムである、請求項１〜５のいずれかに記載の定量方法。 The quantification method according to claim 1, wherein the column of the liquid chromatograph is a reverse phase chromatography column. 工程（b）で分離された各成分について、同時に工程（c）及び（d）を行うことにより、２種以上の異なる目的とするペプチドについて同時に定量する、請求項１〜６のいずれかに記載の定量方法。 The components separated in step (b) are simultaneously quantified for two or more different target peptides by simultaneously performing steps (c) and (d). Quantification method. 前記混合物が生体由来物である、請求項１〜７のいずれかに記載の定量方法。 The quantification method according to claim 1, wherein the mixture is derived from a living body. 前記生体由来物が哺乳動物の血漿、血清、血液、尿、腹水、胸水、汗、乳頭分泌液、精液、関節液、糞便、骨髄液、胆汁、または組織抽出物のいずれかである、請求項８に記載の定量方法。 The biological material is any one of mammalian plasma, serum, blood, urine, ascites, pleural effusion, sweat, nipple secretion, semen, joint fluid, stool, bone marrow fluid, bile, or tissue extract. 9. The quantitative method according to 8. 前記目的とするペプチドが内因性ペプチドである、請求項１〜９のいずれかに記載の定量方法。 The quantification method according to claim 1, wherein the target peptide is an endogenous peptide. 前記目的とするペプチドが合成副甲状腺ホルモン類似体、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、またはヘプシジンである、請求項１〜９のいずれかに記載の定量方法。 The quantification method according to claim 1, wherein the target peptide is a synthetic parathyroid hormone analog, a C-type natriuretic peptide, or hepcidin.
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