JP2018163155A

JP2018163155A - Amino acid analysis method

Info

Publication number: JP2018163155A
Application number: JP2018057095A
Authority: JP
Inventors: 幸聖唐川; Kosei Karakawa; 真志原田; Masashi Harada; 美智子吉田; Michiko Yoshida
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2018-10-18

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an analysis method which enables highly sensitive and accurate analysis of amino acids contained in a biological sample.SOLUTION: Disclosed herein are: an amino acid analysis method comprising steps of forming derivatized amino acids by adding a compound represented by a specific formula to a sample, and isolating the derivatized amino acids from the sample to detect at least one of the derivatized amino acids that have been isolated; a derivatizing agent for amino acid analysis containing a compound represented by a specific formula; and an amino acid analysis kit including the derivatizing agent.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、アミノ酸の分析方法に関する。 The present invention relates to an amino acid analysis method.

生体試料中にはＬ−アミノ酸の他にＤ−アミノ酸が含まれているが、Ｄ−アミノ酸の量はＬ−アミノ酸の量と比べて非常に微量であることが知られている。従来、生体試料中のＤ−アミノ酸等のアミノ酸を分析する方法として、二次元蛍光ＨＰＬＣ法（特許文献１および非特許文献１）、およびプレカラム誘導体化液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：非特許文献２および３）、アミノ酸を誘導体化せずにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で分析する方法（非誘導体化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：非特許文献４）が報告されている。 A biological sample contains D-amino acid in addition to L-amino acid, and the amount of D-amino acid is known to be very small compared to the amount of L-amino acid. Conventionally, as a method for analyzing amino acids such as D-amino acids in biological samples, two-dimensional fluorescence HPLC method (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1), and pre-column derivatization liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method: Non-patent documents 2 and 3) and a method of analyzing amino acids by LC-MS / MS method without derivatization (non-derivatized LC-MS / MS method: non-patent document 4) have been reported.

特許第４２９１６２８号公報Japanese Patent No. 4291628

ＨａｍａｓｅＫ，ＭｏｒｉｋａｗａＡ，ＯｈｇｕｓｕＴ，ＬｉｎｄｎｅｒＷ，ＺａｉｔｓｕＫ．ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｒａｎｃｈｅｄａｌｉｐｈａｔｉｃＤ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｍａｍｍａｌｓｕｓｉｎｇａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍｕｌｔｉ−ｌｏｏｐｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｏｌｕｍｎ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｙｓｔｅｍｃｏｍｂｉｎｉｎｇｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅａｎｄｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｏｌｕｍｎｓ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ２００７；１１４３：１０５−１１．Hamase K, Morikawa A, Ohgusu T, Lindner W, Zaitu K. Comprehensive analysis of branched aliphatic D-amino acids in mammals using an integrated multi-loop two-dimensional column-switching high-performance liquid chromatographic system combining reversed-phase and enantioselective columns. J Chromatogr A 2007; 1143: 105-11. ＶｉｓｓｅｒＷＦ，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ−ＤｕｉｆＮＭ，ＯｐｈｏｆｆＲ，ＢａｋｋｅｒＳ，ＫｌｏｍｐＬＷ，ＢｅｒｇｅｒＲ，ｅｔａｌ．Ａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｉｍｐｌｅｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ−ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｂｏｄｙｆｌｕｉｄｓ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ２０１１；１２１８：７１３０−６．Visser WF, Verhoeven-Dif NM, Offoff R, Baker S, Klomp LW, Berger R, et al. A sensitive and simple ultra-high-performance-liquid chromatography-tandem mass spectrometry based the quantification of the aid in the id. J Chromatogr A 2011; 1218: 7130-6. ＭｉｎＪＺ，ＨａｔａｎａｋａＳ，ＹｕＨＦ，ＨｉｇａｓｈｉＴ，ＩｎａｇａｋｉＳ，Ｔｏｙｏ’ｏｋａＴ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＤＬ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄｗｉｔｈＲ（−）−４−（３−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−７−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ，ｉｎｎａｉｌｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｐａｔｉｅｎｔｓｂｙＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢＡｎａｌｙｔＴｅｃｈｎｏｌＢｉｏｍｅｄＬｉｆｅＳｃｉ２０１１；８７９：３２２０−８．Min JZ, Hatanaka S, Yu HF, Higashi T, Inagaki S, Toyo'oka T. et al. Determination of DL-amino acids, derivitized with R (-)-4- (3-isothiocyanatopyrrolidin-1-yl) -7- (N, N-dimethylaminodiolefins), 2,3-benzoxadiazobinoidetyl UPLC-ESI-TOF-MS. J Chromatogr B Analyte Technol Biomed Life Sci 2011; 879: 3220-8. ＮａｋａｎｏＹ，ＫｏｎｙａＹ，ＴａｎｉｇｕｃｈｉＭ，ＦｕｋｕｓａｋｉＥ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｃｅＤ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＪＢｉｏｓｃｉＢｉｏｅｎｇ．２０１７；１２３：１３４−１３８．Nakano Y, Konya Y, Taniguchi M, Fukusaki E. et al. Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for quantitative analysis of trace D-amino acids. J Biosci Bioeng. 2017; 123: 134-138.

二次元蛍光ＨＰＬＣ法は、蛍光検出であるため選択性が劣ること、および分析に長時間を要することが課題である。また、生体試料中のＤ−アミノ酸を二次元蛍光ＨＰＬＣ法で定量する場合、アミノ酸安定同位体などでの回収率補正ができない点および微量のＤ−アミノ酸量を正確に特定できない点も大きな課題である。 The two-dimensional fluorescence HPLC method has problems of poor selectivity due to fluorescence detection and a long time for analysis. In addition, when quantifying D-amino acids in biological samples by the two-dimensional fluorescence HPLC method, the point that the recovery rate cannot be corrected with amino acid stable isotopes and the amount of trace amounts of D-amino acids cannot be specified accurately are also significant issues. is there.

プレカラム誘導体化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、ＵＶ検出用や蛍光検出用として過去に開発された既存の誘導体化試薬を質量分析計に適用したものであり、質量分析計での検出用に最適化された誘導体化試薬ではない。そのため、生体試料中の微量なＤ−アミノ酸を検出するのに感度が不十分であることが課題であった。また、試料がＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を含む場合、Ｌ−アミノ酸の次にＤ−アミノ酸を溶出する場合が多く、クロマトグラムにおいて微量なＤ−アミノ酸の小さなピークがＬ−アミノ酸の大きなピークの裾に埋もれ、Ｄ−アミノ酸を正確に定量することが困難となり、分析が不可能となるＤ−アミノ酸もある（例えば、図１）。また、非特許文献２の試薬では試薬の構造に分析対象のアミノ酸であるフェニルアラニンの構造が含まれており、試薬由来のフェニルアラニンが分析試料中のフェニルアラニンの定量を妨害してしまい、フェニルアラニンの定量ができないという課題がある。 The pre-column derivatization LC-MS / MS method is an application of an existing derivatization reagent previously developed for UV detection and fluorescence detection to a mass spectrometer, and is optimized for detection with a mass spectrometer. Not a derivatized reagent. Therefore, the problem is that the sensitivity is insufficient to detect a trace amount of D-amino acid in a biological sample. In addition, when a sample contains D-amino acid and L-amino acid, D-amino acid is often eluted after L-amino acid, and a small peak of trace D-amino acid is a large peak of L-amino acid in the chromatogram. Some D-amino acids are buried in the tail, making it difficult to accurately quantify D-amino acids and making analysis impossible (for example, FIG. 1). In the reagent of Non-Patent Document 2, the structure of the reagent contains the structure of phenylalanine, which is the amino acid to be analyzed. The phenylalanine derived from the reagent interferes with the quantification of phenylalanine in the analysis sample, and the quantification of phenylalanine is not possible. There is a problem that you can not.

非誘導体化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、アミノ酸を誘導体化しないため、選択性と感度が劣り、生体試料中の微量なＤ−アミノ酸まで分析することが困難であった。 Since the non-derivatized LC-MS / MS method does not derivatize amino acids, the selectivity and sensitivity are poor, and it is difficult to analyze even a trace amount of D-amino acids in a biological sample.

また、上記先行技術を用いて同一分析条件で複数のアミノ酸を一斉分析する際、分析できるアミノ酸の種類が限られており、すべてのＤ−アミノ酸を測定する際には移動相の条件、カラム等を測定するアミノ酸に応じてそれぞれ変更する必要が生じるという課題があった。 In addition, when simultaneously analyzing a plurality of amino acids under the same analysis conditions using the above prior art, the types of amino acids that can be analyzed are limited. When measuring all D-amino acids, mobile phase conditions, columns, etc. There is a problem that it is necessary to change the amino acid according to the amino acid to be measured.

本発明は、生体試料中のＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を、その種類、含量の多少に拘らず高感度かつ高精度に分析することができるアミノ酸の分析方法の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide an amino acid analysis method capable of analyzing D-amino acids and L-amino acids in a biological sample with high sensitivity and high accuracy regardless of their types and contents.

本発明は、以下を提供する。
〔１〕一般式（１）：
（一般式（１）中、Ｒ¹は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基であり、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、Ｃは炭素原子を示し、Ｒ²は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
（一般式（２１）中、Ｒ⁷は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁷は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ⁹は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁹は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ¹⁰は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ¹⁰に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ³は、アルキル基または水素原子である。）
で表される化合物を試料に添加し誘導体化アミノ酸を形成すること、および、誘導体化アミノ酸を試料から分離し、分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸を検出することを含む、アミノ酸の分析方法。
〔２〕Ｒ¹は、式（７）、（８）または（９）：
（一般式（７）中、Ｒ⁴は、ハロゲン原子を示す。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示す。）
で表される基、もしくはハロゲン原子である、〔１〕記載の方法。
〔３〕Ｒ²は、式（２）〜（４）のいずれか：
で表される基である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕Ｃは、不斉炭素原子Ｃ^*である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕一般式（１）で表される化合物はＲ体である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕一般式（１）で表される化合物は、下記式（１０）、（１１）、（１２）または（１３）：
で表される化合物である、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕検出される誘導体化アミノ酸は、少なくとも１つの誘導体化Ｄ−アミノ酸および少なくとも１つの誘導体化Ｌ−アミノ酸を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕１〜１００種類の誘導体化アミノ酸を検出する、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕検出される誘導体化アミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸の誘導体化アミノ酸である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕誘導体化アミノ酸は、一般式（１４）または（１５）：
（一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示し、Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示し、ｎ２は１以上の整数を示し、Ｒ²およびＲ³は、前記と同じ意味を示す。
一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示し、Ｒ²およびＲ³は、前記と同じ意味を示す。）
で表される化合物である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕分離が、クロマトグラフィー法、電気泳動法、またはイオン移動度分光法により行われる、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕分離が、疎水性カラムを用いた液体クロマトグラフィー法により行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕分離および検出は、液体クロマトグラフィー質量分析法または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法により行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕液体クロマトグラフィー質量分析法または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で使用される移動相のｐＨが７〜１２である〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕移動相のｐＨが８〜９．５である〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕検出は、内標準に基づく補正を含む、〔９〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１７〕試料に一般式（１）で表される化合物を添加する前に内標準物質を添加する、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量の、Ｌ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比が、１００／１〜１／１００である、〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕試料は、生物学的試料である〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２０〕生物学的試料は、血液、唾液、尿、糞便、胆汁、汗、涙、髄液、組織、羊水、乳汁、子宮液、卵胞液、細胞、核酸溶液、微生物懸濁液、食品および飼料からなる群から選択される、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕血液は、全血、血清および血漿からなる群から選択される、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕一般式（１）：
（一般式（１）中、Ｒ¹は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基であり、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、Ｃは炭素原子を示し、Ｒ²は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
（一般式（２１）中、Ｒ⁷は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁷は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ⁹は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁹は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ¹⁰は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ¹⁰に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ³は、アルキル基または水素原子である。）
で表される化合物を含む、アミノ酸分析用誘導体化剤。
〔２３〕Ｒ¹は、式（７）、（８）または（９）：
（一般式（７）中、Ｒ⁴は、ハロゲン原子を示す。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示す。）
で表される基、もしくはハロゲン原子である、〔２２〕に記載の剤。
〔２４〕Ｒ²は、式（２）〜（４）のいずれか：
で表される基である、〔２２〕または〔２３〕に記載の剤。
〔２５〕一般式（１）で表される化合物は、下記式（１０）、（１１）、（１２）または（１３）：
である〔２２〕〜〔２４〕のいずれか１項に記載の剤。
〔２６〕〔２２〕〜〔２５〕のいずれか１項に記載の剤と、内標準物質とを含む、アミノ酸分析用キット。
〔２７〕一般式（１４）：
（一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示し、Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示し、ｎ２は１以上の整数を示し、Ｒ²は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
（一般式（２１）中、Ｒ⁷は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁷は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ⁹は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁹は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ¹⁰は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ¹⁰に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ³は、アルキル基または水素原子である。）
で表される誘導体化アミノ酸。
〔２８〕一般式（１５）：
（一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示し、Ｒ²は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
（一般式（２１）中、Ｒ⁷は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁷は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ⁹は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁹は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ¹⁰は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ¹⁰に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ³は、アルキル基または水素原子である。）
で表される誘導体化アミノ酸。 The present invention provides the following.
[1] General formula (1):
(In the general formula (1), R ¹ is a group that reacts with at least one amino group of an amino acid, X represents an oxygen atom or a sulfur atom, C represents a carbon atom, and R ² represents a general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
Adding a compound represented by: to a sample to form a derivatized amino acid; and separating the derivatized amino acid from the sample and detecting at least one derivatized amino acid of the separated derivatized amino acids; Analysis method of amino acids.
[2] R ¹ is represented by formula (7), (8) or (9):
(In the general formula (7), R ⁴ represents a halogen atom.
In general formula (9), n1 represents an integer of 1 or more. )
The method of [1], which is a group represented by the formula: or a halogen atom.
[3] R ² is any one of formulas (2) to (4):
The method as described in [1] or [2] which is group represented by these.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein C is an asymmetric carbon atom C ^* .
[5] The method according to [4], wherein the compound represented by the general formula (1) is an R form.
[6] The compound represented by the general formula (1) is represented by the following formula (10), (11), (12) or (13):
The method of any one of [1]-[5] which is a compound represented by these.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the derivatized amino acid to be detected includes at least one derivatized D-amino acid and at least one derivatized L-amino acid.
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein 1 to 100 types of derivatized amino acids are detected.
[9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the derivatized amino acid to be detected is a derivatized amino acid of a protein-constituting amino acid.
[10] The derivatized amino acid has the general formula (14) or (15):
(In the general formula (14), R ′ and R ″ each independently represents a side chain of an amino acid, R ′ ″ represents a hydrogen atom, a metal atom or an alkyl group, and n2 is 1 or more. An integer is shown, and R ² and R ³ have the same meaning as described above.
In the general formula (15), a circle represents a 5-membered ring or a 6-membered ring, and R ² and R ³ have the same meaning as described above. )
The method of any one of [1]-[9] which is a compound represented by these.
[11] The method according to any one of [1] to [10], wherein the separation is performed by chromatography, electrophoresis, or ion mobility spectroscopy.
[12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the separation is performed by a liquid chromatography method using a hydrophobic column.
[13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the separation and detection are performed by liquid chromatography mass spectrometry or liquid chromatography tandem mass spectrometry.
[14] The method according to [13], wherein the mobile phase used in liquid chromatography mass spectrometry or liquid chromatography tandem mass spectrometry has a pH of 7 to 12.
[15] The method according to [14], wherein the mobile phase has a pH of 8 to 9.5.
[16] The method according to any one of [9] to [15], wherein the detection includes correction based on an internal standard.
[17] The method according to [16], wherein the internal standard substance is added before the compound represented by the general formula (1) is added to the sample.
[18] The method according to [17], wherein the ratio of the amount of the internal standard substance of D-amino acid to the amount of the internal standard substance of L-amino acid is 100/1 to 1/100.
[19] The method according to any one of [1] to [18], wherein the sample is a biological sample.
[20] Biological samples include blood, saliva, urine, feces, bile, sweat, tears, spinal fluid, tissue, amniotic fluid, milk, uterine fluid, follicular fluid, cells, nucleic acid solution, microbial suspension, food and The method according to [19], which is selected from the group consisting of feed.
[21] The method according to [20], wherein the blood is selected from the group consisting of whole blood, serum and plasma.
[22] General formula (1):
(In the general formula (1), R ¹ is a group that reacts with at least one amino group of an amino acid, X represents an oxygen atom or a sulfur atom, C represents a carbon atom, and R ² represents a general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
A derivatizing agent for amino acid analysis, comprising a compound represented by:
[23] R ¹ is represented by formula (7), (8) or (9):
(In the general formula (7), R ⁴ represents a halogen atom.
In general formula (9), n1 represents an integer of 1 or more. )
The agent according to [22], which is a group represented by the formula: or a halogen atom.
[24] R ² is any one of formulas (2) to (4):
The agent according to [22] or [23], which is a group represented by:
[25] The compound represented by the general formula (1) is represented by the following formula (10), (11), (12) or (13):
The agent according to any one of [22] to [24].
[26] A kit for amino acid analysis comprising the agent according to any one of [22] to [25] and an internal standard substance.
[27] General formula (14):
(In the general formula (14), R ′ and R ″ each independently represents a side chain of an amino acid, R ′ ″ represents a hydrogen atom, a metal atom or an alkyl group, and n2 is 1 or more. Represents an integer, and R ² represents the general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
A derivatized amino acid represented by
[28] General formula (15):
(In the general formula (15), a circle represents a 5-membered ring or a 6-membered ring, and R ² represents a general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), each R ⁹ is independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁹ is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
A derivatized amino acid represented by

本発明によれば、生体試料中のＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を、その種類、含量の多少に拘らず高感度かつ高精度に分析することができる。 According to the present invention, D-amino acids and L-amino acids in a biological sample can be analyzed with high sensitivity and high accuracy regardless of the kind and content thereof.

図１は、非特許文献２のアミノ酸分析法により得られるＤ，Ｌ−アミノ酸の抽出マスクロマトグラムである。FIG. 1 is an extracted mass chromatogram of D, L-amino acid obtained by the amino acid analysis method of Non-Patent Document 2. 図２は、実施例１にて得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムである。FIG. 2 is an extracted mass chromatogram of the derivatized D, L-amino acid (standard solution) obtained in Example 1. 図３は、実施例１にて得られたヒト血漿中のＤ−アミノ酸濃度を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the D-amino acid concentration in human plasma obtained in Example 1. 図４は、実施例１にて得られたヒト血漿中のＬ−アミノ酸濃度を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the L-amino acid concentration in human plasma obtained in Example 1. 図５は、実施例１にて得られたヒト糞便中のＤ−アミノ酸濃度を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the D-amino acid concentration in human feces obtained in Example 1. 図６は、実施例１にて得られたヒト糞便中のＬ−アミノ酸濃度を示すグラフである。6 is a graph showing the L-amino acid concentration in human feces obtained in Example 1. FIG. 図７は、実施例４で得られたラット組織中のＤ−アミノ酸濃度を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the D-amino acid concentration in the rat tissue obtained in Example 4. 図８は、実施例４で得られたラット組織中のＬ−アミノ酸濃度を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the L-amino acid concentration in the rat tissue obtained in Example 4. 図９は、実施例９で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムである。FIG. 9 is an extracted mass chromatogram of the derivatized D, L-amino acid (standard solution) obtained in Example 9. 図１０は、実施例１０で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムである。FIG. 10 is an extraction mass chromatogram of the derivatized D, L-amino acid (standard solution) obtained in Example 10. 図１１は、実施例１１で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液濃度０．５μＭ）のピークエリア値である。FIG. 11 is a peak area value of the derivatized D, L-amino acid (standard solution concentration 0.5 μM) obtained in Example 11. 図１２は、実施例１１で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液濃度１．０μＭ）のピークエリア値である。12 is a peak area value of the derivatized D, L-amino acid (standard solution concentration: 1.0 μM) obtained in Example 11. FIG.

本明細書において「試料」とは、任意の試料であり、例えば、生物由来の生物学的試料、ならびに有機合成反応により得られる合成試料、天然環境中に存在する環境試料などの非生物学的試料が挙げられる。生物学的試料が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類、昆虫、軟体動物等の動物、微生物、菌類、植物が挙げられるが、好ましくは哺乳動物である。生物学的試料の種類としては、例えば、血液試料（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、糞便、胆汁、汗、涙、髄液（例、脳脊髄液、関節髄液）、組織（例、角層、上皮、真皮等の皮膚組織、神経組織、筋肉組織、消化管上皮）、羊水、乳汁、子宮液、卵胞液、細胞（例、細胞抽出液、細胞懸濁液、細胞溶解液）、核酸溶液、および微生物懸濁液等が挙げられる。生物学的試料は、生体から単離されている試料が好ましい。また、生物学的試料としては、例えば、食品および飼料（例、卵、精肉、魚介、果実、野菜、豆類、それらの加工品、乳製品）も挙げられる。合成試料としては、例えば、アミノ酸を生じる有機合成反応により得られる反応生成物が挙げられる。環境試料としては、例えば、土壌、岩石、隕石、海水、淡水、工業用水由来等の試料が挙げられる。本発明の分析対象としての試料は、これらのうち生物学的試料が好ましい。 In the present specification, the “sample” is any sample, for example, a biological sample derived from a living organism, a non-biological sample such as a synthetic sample obtained by an organic synthesis reaction, and an environmental sample existing in a natural environment. A sample is mentioned. Examples of organisms from which biological samples are derived include animals such as mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), birds, insects, mollusks, and microorganisms. , Fungi and plants, preferably mammals. Examples of biological samples include blood samples (eg, whole blood, serum, plasma), saliva, urine, feces, bile, sweat, tears, cerebrospinal fluid (eg, cerebrospinal fluid, joint cerebrospinal fluid), Tissue (eg, stratum corneum, epithelium, dermis and other skin tissue, nerve tissue, muscle tissue, gastrointestinal epithelium), amniotic fluid, milk, uterine fluid, follicular fluid, cells (eg, cell extract, cell suspension, cell) Lysate), nucleic acid solutions, and microbial suspensions. The biological sample is preferably a sample isolated from a living body. Biological samples also include, for example, food and feed (eg, eggs, meat, seafood, fruits, vegetables, beans, processed products thereof, and dairy products). Examples of the synthetic sample include a reaction product obtained by an organic synthetic reaction that generates an amino acid. Examples of the environmental sample include samples derived from soil, rocks, meteorites, seawater, fresh water, industrial water, and the like. Among these, the biological sample is preferable as the sample to be analyzed in the present invention.

本明細書において「アミノ酸」とは、通常は遊離アミノ酸であり、例えば、α−アミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン、アロトレオニン、アロイソロイシン、ホモセリン、ホモアルギニン、ホモシステイン、シトルリン、セレノシステイン、オルニチン、ピロリシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、α−アミノ酪酸、チロキシン、ドーパ、ホスホセリン、２−フェニルグリシン、テアニン、カイニン酸、イボテン酸、トリコロミン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、２−アミノ−４−ブロモ酪酸、２−アリルグリシン、２−シクロヘキシルグリシン、シスチン）、β−アミノ酸（例、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸、２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、β−フェニルアラニン、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例、スタチン、３−アミノシクロヘキサンカルボン酸）が挙げられる。 In the present specification, the “amino acid” is usually a free amino acid such as an α-amino acid (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, lysine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, Asparagine, glutamine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, proline, allothreonine, alloisoleucine, homoserine, homoarginine, homocysteine, citrulline, selenocysteine, ornithine, pyrrolysine, hydroxyproline, hydroxylysine, α-aminobutyric acid, Thyroxine, dopa, phosphoserine, 2-phenylglycine, theanine, kainic acid, ibotenic acid, tricolominic acid, azetidine-2-carboxylic acid, 2-amino-4-bromobutyric acid Acid, 2-allylglycine, 2-cyclohexylglycine, cystine), β-amino acids (eg, 3-amino-3-phenylpropionic acid, 3-aminoisobutyric acid, 3-aminobutyric acid, 2-aminocyclohexanecarboxylic acid, β- Phenylalanine, β-alanine), and γ-amino acid (eg, statin, 3-aminocyclohexanecarboxylic acid).

本発明の方法は、以下の誘導体化工程、分離および検出工程を含む。これにより、試料中のアミノ酸の分析が可能である。試料中のアミノ酸の分析としては、例えば、試料中の少なくとも１つのアミノ酸の有無、試料中の少なくとも１つのアミノ酸の定量、試料中の２以上のアミノ酸の組成の確認、試料中のアミノ酸の鏡像異性体の比率（Ｌ−アミノ酸の量／Ｄ−アミノ酸の量）の確認、試料中のバイオマーカーとしてのアミノ酸の組成の確認による罹患または罹患リスクの確認、試料中のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸組成の確認等が挙げられる。 The method of the present invention includes the following derivatization steps, separation and detection steps. Thereby, the analysis of the amino acid in a sample is possible. Examples of the analysis of amino acids in a sample include, for example, the presence or absence of at least one amino acid in a sample, quantification of at least one amino acid in a sample, confirmation of the composition of two or more amino acids in a sample, and enantiomeric isomerism of amino acids in a sample Confirmation of body ratio (amount of L-amino acid / amount of D-amino acid), confirmation of morbidity or risk by confirming composition of amino acid as biomarker in sample, confirmation of amino acid composition of peptide or protein in sample Etc.

（誘導体化工程）
本工程においては、試料にまず、以下の一般式（１）で表される化合物を添加し誘導体化アミノ酸を形成する。一般式（１）で表される化合物は、その構造中に非天然アミノ酸の構造を有し得るため、一般式（１）で表される化合物を用いることにより、試料中のアミノ酸の分析を、試薬由来のアミノ酸による妨害を受けずに行うことができ、高感度かつ高精度の分析が可能である。
(Derivatization process)
In this step, first, a compound represented by the following general formula (1) is added to a sample to form a derivatized amino acid. Since the compound represented by the general formula (1) can have a structure of an unnatural amino acid in its structure, the analysis of amino acids in a sample can be performed by using the compound represented by the general formula (1). It can be carried out without being disturbed by the amino acid derived from the reagent, and analysis with high sensitivity and high accuracy is possible.

一般式（１）中、Ｒ¹は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基を示す。なお、ここでいう「アミノ基と反応する基」とは、一般式（１）中のＣ＝Ｘ結合の炭素原子にアミノ基が付加することで脱離する脱離基を言う。Ｒ¹は、アミノ基以外の基（例えば、チオール等の、アミノ酸が有することがあるアミノ基以外の基）と反応してもよく、反応することが好ましい。Ｒ¹は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と温和な条件で反応することが好ましい。これにより、反応時の長時間加熱を省略できるので、反応中のアミノ酸のラセミ化を抑制することができる。Ｒ¹は、以下の式（７）、（８）または（９）で示される基、もしくはハロゲン原子が好ましい。
In general formula (1), R ¹ represents a group that reacts with at least one amino group of an amino acid. Here, the “group that reacts with an amino group” refers to a leaving group that is eliminated by adding an amino group to a carbon atom of a C═X bond in the general formula (1). R ¹ may react with a group other than an amino group (for example, a group other than an amino group that an amino acid may have, such as thiol), and preferably reacts. R ¹ preferably reacts with at least one amino group of the amino acid under mild conditions. Thereby, since long-time heating at the time of reaction can be omitted, racemization of amino acids during the reaction can be suppressed. R ¹ is preferably a group represented by the following formula (7), (8) or (9), or a halogen atom.

一般式（７）中、Ｒ⁴は、それぞれ独立して、ハロゲン原子を示す。Ｒ⁴の少なくとも１つがフッ素原子であることが好ましく、すべてのＲ⁴がフッ素原子であることが好ましい。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示し、１〜５の整数が好ましい。
Ｒ¹としてのハロゲン原子は、塩素原子または臭素原子が好ましい。 In general formula (7), R < ⁴ > shows a halogen atom each independently. At least one of R ⁴ is preferably a fluorine atom, and all R ⁴ are preferably fluorine atoms.
In general formula (9), n1 shows an integer greater than or equal to 1, and the integer of 1-5 is preferable.
The halogen atom as R ¹ is preferably a chlorine atom or a bromine atom.

一般式（１）中、Ｘは、酸素原子または硫黄原子を示す。 In general formula (1), X represents an oxygen atom or a sulfur atom.

一般式（１）中、Ｒ²は、一般式（２１）、（２２）または（２３）で表される基である。
In General Formula (1), R ² is a group represented by General Formula (21), (22), or (23).

一般式（２１）中、Ｒ⁷は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁷は、窒素原子である。Ｒ⁷のうちの１つが窒素原子であることが好ましい。
一般式（２２）中、Ｒ⁹は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ⁹は、窒素原子である。Ｒ⁹のうちの１つが窒素原子であることが好ましい。
一般式（２３）中、Ｒ¹⁰は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ¹⁰に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。これにより、誘導体化アミノ酸のイオン化が促進され得る。極性基は、溶液中で容易にイオン化する極性基が好ましく、一般にイオン交換基と称される置換基でもよい。極性基としては例えば、アミノ基、アルキルアミノ基（例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基、トリメチルアミノ基、トリエチルアミノ基等のトリアルキルアミノ基）、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基などが挙げられる。 In general formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom. It is preferable that one of R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom. It is preferable that one of R ⁹ is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. Thereby, ionization of the derivatized amino acid can be promoted. The polar group is preferably a polar group that easily ionizes in a solution, and may be a substituent generally referred to as an ion exchange group. Examples of polar groups include amino groups, alkylamino groups (eg, dialkylamino groups such as dimethylamino group and diethylamino group, trialkylamino groups such as trimethylamino group and triethylamino group), sulfonic acid groups, phosphoric acid groups, Examples thereof include a guanidyl group.

Ｒ²は、式（２）〜（４）のいずれかで表される基であることが好ましい。
R ² is preferably a group represented by any one of formulas (2) to (4).

一般式（１）中のＲ³は、アルキル基または水素原子である。アルキル基としては例えば、炭素原子数１〜４のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基もしくはｔ−ブチル基）が挙げられ、メチル基がより好ましい。 R ³ in the general formula (1) is an alkyl group or a hydrogen atom. Examples of the alkyl group include an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group or t-butyl group), and methyl group. Groups are more preferred.

一般式（１）で表される化合物中のＣは、不斉炭素原子Ｃ^*であることが好ましく、化合物はＲ体、すなわち以下の一般式（１´）で表されることが好ましい。これにより、試料中のＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸よりも先に溶出させることができ、Ｄ−アミノ酸のより正確な定量が可能となる点で好ましい。
一般式（１´）中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、前記と同じ意味を表す。 C in the compound represented by the general formula (1) is preferably an asymmetric carbon atom C ^* , and the compound is preferably represented by an R-form, that is, the following general formula (1 ′). This is preferable in that the D-amino acid in the sample can be eluted before the L-amino acid, and the D-amino acid can be more accurately quantified.
In the general formula (1 ′), R ¹ , R ² and R ³ represent the same meaning as described above.

一般式（１）で表される化合物としては例えば、以下の式（１０）〜（１３）で表される化合物が例示され、これらのうち、式（１０）又は（１１）で表される化合物が好ましく、式（１１）で表される化合物がより好ましい。
Examples of the compound represented by the general formula (1) include compounds represented by the following formulas (10) to (13), and among these, a compound represented by the formula (10) or (11) Is preferable, and the compound represented by Formula (11) is more preferable.

一般式（１）で表される化合物は、試料にアミノ酸が含まれる場合、そのアミノ酸と結合し、構造的に類似した他のアミノ酸と区別し得る誘導体化アミノ酸を形成することができる。形成される誘導体化アミノ酸は、イオン化しやすいことから、後の工程における定量が容易となる。また、試料中にＤ−アミノ酸とその鏡像異性体であるＬ−アミノ酸が含まれる場合、一般式（１）で表される化合物は、それらから各誘導体化アミノ酸を形成するが、各誘導体化アミノ酸は、以下説明するように下記の分離および検出工程において容易に定量可能である。すなわち、同一のクロマトグラム上における誘導体化Ｄ−アミノ酸と誘導体化Ｌ−アミノ酸の溶出順は、前者の方が先となり得るため、Ｄ−アミノ酸のピークとＬ−アミノ酸のピークとの重なりを抑制し識別が容易となる。そのため、試料中のＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸と比べて微量の場合にも、Ｄ−アミノ酸の小さなピークがＬ−アミノ酸の大きなピークの裾に埋もれることを防ぐことができる。 When the sample contains an amino acid, the compound represented by the general formula (1) can bind to the amino acid and form a derivatized amino acid that can be distinguished from other structurally similar amino acids. Since the derivatized amino acid formed is easily ionized, the quantification in the subsequent steps is facilitated. In addition, when a D-amino acid and its enantiomer L-amino acid are contained in the sample, the compound represented by the general formula (1) forms each derivatized amino acid therefrom, Can be easily quantified in the following separation and detection steps as described below. That is, the elution order of the derivatized D-amino acid and the derivatized L-amino acid on the same chromatogram can be preceded by the former, so that the overlap between the D-amino acid peak and the L-amino acid peak is suppressed. Identification becomes easy. Therefore, even when the amount of D-amino acid in the sample is very small compared to L-amino acid, it is possible to prevent the small peak of D-amino acid from being buried in the tail of the large peak of L-amino acid.

試料は、先に定義した試料であればよく、アミノ酸の分析が望まれる試料であればよい。試料は、生物学的試料が好ましく、血液試料、糞便、皮膚組織が好ましい。試料は、一般式（１）で表される化合物を反応させる前に、前処理がなされていてもよい。前処理としては例えば、濾過、濃縮、酵素反応等が挙げられる。これにより、試料中のアミノ酸を高濃度含有する画分を得ることができ、この画分で更なる分析を行ってもよい。 The sample may be a sample as defined above, and may be a sample for which amino acid analysis is desired. The sample is preferably a biological sample, preferably a blood sample, stool, or skin tissue. The sample may be pretreated before reacting the compound represented by the general formula (1). Examples of the pretreatment include filtration, concentration, enzyme reaction, and the like. Thereby, a fraction containing a high concentration of amino acids in the sample can be obtained, and further analysis may be performed on this fraction.

試料に、一般式（１）で表される化合物を添加し、試料中のアミノ酸と一般式（１）で表される化合物を反応させることにより、誘導体化アミノ酸が形成される。一般式（１）で表される化合物の添加量、溶媒、温度、試薬等の反応条件は、誘導体化アミノ酸が形成される条件であればよく、特に限定されない。 A derivatized amino acid is formed by adding the compound represented by the general formula (1) to the sample and reacting the amino acid in the sample with the compound represented by the general formula (1). The reaction conditions such as the amount of the compound represented by the general formula (1), the solvent, the temperature, the reagent and the like are not particularly limited as long as the derivatized amino acid is formed.

誘導体化アミノ酸は、通常は、一般式（１４）または（１５）で表される化合物である。
The derivatized amino acid is usually a compound represented by the general formula (14) or (15).

一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示す。Ｒ’’’は、水素原子、金属原子（例えば、Ｎａ，Ｋ，Ｍｇ）またはアルキル基（例えば、炭素原子数１〜６の直鎖または分岐アルキル基）を示す。ｎ２は１以上の整数を示す。ｎ２が２以上の整数の場合も、複数のＲ’およびＲ’’はそれぞれ独立である。Ｒ’、Ｒ’’から選ばれる少なくとも２つが互いに結合して環を形成していてもよい。Ｒ’、Ｒ’’の定義におけるアミノ酸は、以下の一般式（１６）で示される化合物である。一般式（１６）中のＲ’、Ｒ’’およびｎ２は、一般式（１４）のそれぞれと同じ意味を示す。
In general formula (14), R ′ and R ″ each independently represent an amino acid side chain. R ′ ″ represents a hydrogen atom, a metal atom (for example, Na, K, Mg) or an alkyl group (for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms). n2 represents an integer of 1 or more. Even when n2 is an integer of 2 or more, the plurality of R ′ and R ″ are independent of each other. At least two selected from R ′ and R ″ may be bonded to each other to form a ring. The amino acid in the definition of R ′ and R ″ is a compound represented by the following general formula (16). R ′, R ″ and n2 in the general formula (16) have the same meaning as in the general formula (14).

一般式（１４）および（１６）におけるアミノ酸の側鎖としては、例えば、プロリン以外のタンパク質構成アミノ酸の側鎖が挙げられ、例えば、水素原子、窒素原子および酸素原子から選ばれる少なくとも１つを含有してもよい炭化水素基（アルキル基、アルケニル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基）、ヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、スルホ基、メルカプト基、カルボキシル基が挙げられる。アルキル基、アルケニル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基は、それぞれを構成する水素原子の少なくとも１つが置換基（例えば、アルキル基、カルボキシル基、カルバモイル基、ヒドロキシル基、アルケニル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルチオ基、メルカプト基）で置換されていてもよい。アミノ酸の側鎖の具体例としては、水素原子、２−メチルブチル基、イソプロピル基、３−グアニジノプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、メルカプトメチル基、１Ｈ−イミダゾール−４−イル−メチル基、１−メチルプロピル基、４−アミノブチル基、メチルチオエチル基、ベンジル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、１Ｈ−インドール−４−イル−メチル基、ヒドロキシベンジル基が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’から選ばれる少なくとも２つが互いに結合して環を形成する場合の例としては、シクロヘキシル基を形成する場合が挙げられる。アミノ酸の側鎖の具体例は、さらに以下を含む：
ｎ２が１の場合（通常はα−アミノ酸）：Ｒ’、Ｒ’’とも水素原子の組み合わせ（グリシンの側鎖）；Ｒ’、Ｒ’’の一方が水素原子、もう一方が、メチル基（アラニンの側鎖）、２−メチルブチル基（ロイシンの側鎖）、イソプロピル基（バリンの側鎖）、３−グアニジノプロピル基（アルギニンの側鎖）、カルバモイルメチル基（アスパラギンの側鎖）、２−カルバモイルエチル基（グルタミンの側鎖）、カルボキシメチル基（アスパラギン酸の側鎖）、２−カルボキシエチル基（グルタミン酸の側鎖）、メルカプトメチル基（システインの側鎖）、１Ｈ−イミダゾール−４−イル−メチル基（ヒスチジンの側鎖）、１−メチルプロピル基（イソロイシンの側鎖）、４−アミノブチル基（リシンの側鎖）、２−（メチルチオ）エチル基（メチオニンの側鎖）、ベンジル基（フェニルアラニンの側鎖）、ヒドロキシメチル基（セリンの側鎖）、１−ヒドロキシエチル基（トレオニンの側鎖）、１Ｈ−インドール−３−イル−メチル基（トリプトファンの側鎖）、４−ヒドロキシベンジル基（チロシンの側鎖）；
ｎ２が２の場合（通常はβ−アミノ酸）：β位の炭素原子に結合するＲ’またはＲ’’がフェニル基、それ以外のＲ’およびＲ’’が水素原子（３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の側鎖）；α位の炭素原子に結合するＲ’、Ｒ’’の一方がメチル基、それ以外のＲ’およびＲ’’が水素原子（３−アミノイソ酪酸の側鎖）；β位の炭素原子に結合するＲ’、Ｒ’’の一方がメチル基、それ以外のＲ’およびＲ’’が水素原子（３−アミノ酪酸の側鎖）；α位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかおよびβ位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかが互いに結合しシクロヘキシル基を形成し、それ以外の２つが水素原子（２−アミノシクロヘキサンカルボン酸の側鎖）；Ｒ’およびＲ’’はいずれも水素原子（β−アラニンの側鎖）；ならびに
ｎ２が３の場合（通常はγ−アミノ酸）：β位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’の一方がヒドロキシル基、γ位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’の一方がイソブチル基、それら以外の４つが水素原子（スタチンの側鎖）、α位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかおよびγ位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかが互いに結合しシクロヘキシル基を形成し、それ以外の４つが水素原子（３−アミノシクロヘキサンカルボン酸の側鎖）。 Examples of the side chain of the amino acid in the general formulas (14) and (16) include a side chain of a protein-constituting amino acid other than proline, for example, containing at least one selected from a hydrogen atom, a nitrogen atom and an oxygen atom And a hydrocarbon group (alkyl group, alkenyl group, alkoxyl group, aryl group, heteroaryl group), hydroxyl group, amino group, nitro group, sulfo group, mercapto group, carboxyl group. In the alkyl group, alkenyl group, alkoxyl group, aryl group, heteroaryl group, at least one of the hydrogen atoms constituting each is a substituent (for example, an alkyl group, a carboxyl group, a carbamoyl group, a hydroxyl group, an alkenyl group, an alkoxyl group, Aryl group, heteroaryl group, alkylthio group, mercapto group). Specific examples of the side chain of the amino acid include a hydrogen atom, 2-methylbutyl group, isopropyl group, 3-guanidinopropyl group, carbamoylmethyl group, 2-carbamoylethyl group, carboxymethyl group, carboxyethyl group, mercaptomethyl group, 1H. -Imidazol-4-yl-methyl group, 1-methylpropyl group, 4-aminobutyl group, methylthioethyl group, benzyl group, hydroxymethyl group, hydroxyethyl group, 1H-indol-4-yl-methyl group, hydroxybenzyl Groups. An example of the case where at least two members selected from R ′ and R ″ are bonded to each other to form a ring includes a case where a cyclohexyl group is formed. Specific examples of amino acid side chains further include:
When n2 is 1 (usually an α-amino acid): R ′ and R ″ are a combination of hydrogen atoms (glycine side chain); one of R ′ and R ″ is a hydrogen atom and the other is a methyl group ( Alanine side chain), 2-methylbutyl group (leucine side chain), isopropyl group (valine side chain), 3-guanidinopropyl group (arginine side chain), carbamoylmethyl group (asparagine side chain), 2- Carbamoylethyl group (side chain of glutamine), carboxymethyl group (side chain of aspartic acid), 2-carboxyethyl group (side chain of glutamic acid), mercaptomethyl group (side chain of cysteine), 1H-imidazol-4-yl -Methyl group (histidine side chain), 1-methylpropyl group (isoleucine side chain), 4-aminobutyl group (lysine side chain), 2- (methylthio) ethyl group (methio) Side chain), benzyl group (phenylalanine side chain), hydroxymethyl group (serine side chain), 1-hydroxyethyl group (threonine side chain), 1H-indol-3-yl-methyl group (of tryptophan) Side chain), 4-hydroxybenzyl group (side chain of tyrosine);
When n2 is 2 (usually β-amino acid): R ′ or R ″ bonded to the β-position carbon atom is a phenyl group, and other R ′ and R ″ are hydrogen atoms (3-amino-3- One of R ′ and R ″ bonded to the α-position carbon atom is a methyl group, and the other R ′ and R ″ are hydrogen atoms (the side chain of 3-aminoisobutyric acid); One of R ′ and R ″ bonded to the β-position carbon atom is a methyl group, and the other R ′ and R ″ are hydrogen atoms (side chains of 3-aminobutyric acid); bonded to the α-position carbon atom One of R ′ and R ″ and one of R ′ and R ″ bonded to the carbon atom at the β-position are bonded to each other to form a cyclohexyl group, and the other two are hydrogen atoms (2-aminocyclohexanecarboxylic acid). Acid side chain); R ′ and R ″ are both hydrogen atoms (β-alanine side chain); and n2 is 3 (Usually γ-amino acid): one of R ′ and R ″ bonded to the carbon atom at the β-position is a hydroxyl group, one of R ′ and R ″ bonded to the carbon atom at the γ-position is an isobutyl group, and the others Are bonded to each other by a hydrogen atom (side chain of statin), any of R ′ and R ″ bonded to the α-position carbon atom, and any of R ′ and R ″ bonded to the carbon atom of the γ-position. Cyclohexyl group is formed, and the other four are hydrogen atoms (side chain of 3-aminocyclohexanecarboxylic acid).

Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示す。Ｒ²およびＲ³は、前記と同じ意味を示す。ｎ２は、１以上の整数を示す。α−アミノ酸のｎ２は１であり、β−アミノ酸のｎ２は２であり、γ−アミノ酸のｎ２は３である。 R ′ ″ represents a hydrogen atom, a metal atom or an alkyl group. R ² and R ³ have the same meaning as described above. n2 represents an integer of 1 or more. n2 of α-amino acid is 1, n2 of β-amino acid is 2, and n2 of γ-amino acid is 3.

一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示す。プロリン以外のアミノ酸の誘導体化アミノ酸は、一般式（１４）で表される構造を示し、誘導体化プロリンは、一般式（１５）で表される構造を示す。 In the general formula (15), a circle represents a 5-membered ring or a 6-membered ring. Derivative amino acids other than proline have a structure represented by the general formula (14), and derivatized proline has a structure represented by the general formula (15).

後述する分離および検出工程にて内標準（内部標準）による補正を行う場合、試料にあらかじめ内標準物質（内部標準物質）を添加してから一般式（１）で表される化合物を添加するか、または、試料に一般式（１）で表される化合物を添加して誘導体化アミノ酸を形成した後に、一般式（１）で表される化合物で標識された内標準を添加してもよく、前者が好ましい。内標準物質は、通常、分析対象であるアミノ酸の同位体である。アミノ酸の同位体としては、例えば、対象であるアミノ酸のアミノ酸構造中の、構造が類似するアミノ酸構造中の、または対象であるアミノ酸と保持時間（溶出時間）が近いアミノ酸構造中の、少なくとも１つの原子が²Ｈ（Ｄ）、¹³Ｃ、および¹⁵Ｎ等の安定同位体元素で置換されているアミノ酸安定同位体が挙げられる。 When correcting the internal standard (internal standard) in the separation and detection process described later, whether the compound represented by the general formula (1) is added after the internal standard substance (internal standard substance) is added to the sample in advance. Alternatively, after adding a compound represented by the general formula (1) to the sample to form a derivatized amino acid, an internal standard labeled with the compound represented by the general formula (1) may be added, The former is preferred. The internal standard substance is usually an isotope of an amino acid to be analyzed. The amino acid isotope includes, for example, at least one amino acid structure in the amino acid structure of the target amino acid, in an amino acid structure similar in structure, or in an amino acid structure having a retention time (elution time) close to that of the target amino acid. Amino acid stable isotopes in which the atoms are substituted with stable isotopes such as ² H (D), ¹³ C, and ¹⁵ N.

分析対象が２以上のアミノ酸である場合、各アミノ酸の内標準物質からなる内標準物質群が用いられる。分析対象がＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸である場合、Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量のＬ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比率は、通常は１００／１〜１／１００であり、好ましくは１／３〜１／１００であり、より好ましくは１／１０〜１／１００である。これにより、試料中のアミノ酸をより正確に定量できる。中でも、試料中の、鏡像異性体を構成するＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸とを分析する場合、それぞれのピークの溶出位置が明確に識別可能となる。 When the analysis target is two or more amino acids, an internal standard group consisting of internal standards of each amino acid is used. When the analysis object is D-amino acid and L-amino acid, the ratio of the amount of D-amino acid internal standard substance to the amount of L-amino acid internal standard substance is usually 100/1 to 1/100, preferably Is 1/3 to 1/100, more preferably 1/10 to 1/100. Thereby, the amino acid in a sample can be quantified more correctly. In particular, when analyzing D-amino acids and L-amino acids constituting enantiomers in a sample, the elution position of each peak can be clearly identified.

反応により得られた誘導体化アミノ酸を含む試料は、続く誘導体化アミノ酸の分離の前に、後処理に付されてもよい。後処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、アフィニティー処理、加熱、濃縮、希釈および凍結が挙げられる。 The sample containing the derivatized amino acid obtained by the reaction may be subjected to post-treatment before subsequent separation of the derivatized amino acid. Post treatment includes, for example, centrifugation, extraction, filtration, precipitation, affinity treatment, heating, concentration, dilution and freezing.

（分離および検出工程）
本工程においては、誘導体化アミノ酸を試料から分離し、分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸を検出する。 (Separation and detection process)
In this step, the derivatized amino acid is separated from the sample, and at least one of the separated derivatized amino acids is detected.

分離は、誘導体化アミノ酸を分離できる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法、電気泳動法、イオン移動度分光法（例、イオンモビリティー）、沈殿、結晶化、膜分離等が挙げられ、クロマトグラフィー法、電気泳動法、またはイオン移動度分光法が好ましい。液体クロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が好ましい。これらの方法は、公知の方法により行うことができる。 Separation is not particularly limited as long as it is a method capable of separating derivatized amino acids. For example, chromatography methods such as liquid chromatography, supercritical fluid chromatography, gas chromatography, thin layer chromatography, electrophoresis, Examples include ion mobility spectroscopy (eg, ion mobility), precipitation, crystallization, membrane separation, and the like. Chromatography, electrophoresis, or ion mobility spectroscopy is preferred. As the liquid chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) is preferable. These methods can be performed by known methods.

分離は、液体クロマトグラフィーによることが好ましい。液体クロマトグラフィーとしては、例えば、固定相の極性が移動相の極性よりも高い分離系である順相液体クロマトグラフィー、および固定相の極性が移動相の極性よりも低い分離系である逆相液体クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）等が挙げられる。 Separation is preferably by liquid chromatography. Examples of liquid chromatography include normal phase liquid chromatography, which is a separation system in which the polarity of the stationary phase is higher than that of the mobile phase, and reverse phase liquid, which is a separation system in which the polarity of the stationary phase is lower than the polarity of the mobile phase. Examples include chromatography, hydrophilic interaction chromatography (HILIC), ion exchange chromatography (IEX), and size exclusion chromatography (SEC).

順相液体クロマトグラフィーは、公知の方法により行うことができる。例えば、順相液体クロマトグラフィーは、シリカ、アルミナ等の固定相、ならびにヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、テトラヒドロフランおよびこれらの混合溶媒等の移動相を用いて行うことができる。順相液体クロマトグラフィーの中でも、親水性相互作用型カラムクロマトグラフィーが好ましい。 Normal phase liquid chromatography can be performed by a known method. For example, normal phase liquid chromatography can be performed using a stationary phase such as silica or alumina and a mobile phase such as hexane, ethyl acetate, methylene chloride, isopropyl alcohol, ethanol, methanol, tetrahydrofuran, or a mixed solvent thereof. . Among normal phase liquid chromatography, hydrophilic interaction type column chromatography is preferable.

逆相液体クロマトグラフィーは、公知の方法により行うことができる。逆相液体クロマトグラフィーの固定相としては、例えば、疎水性化合物で修飾された充填剤が挙げられる。具体的には、逆相液体クロマトグラフィーの固定相としては、例えば、疎水性化合物で修飾されたシリカゲルが挙げられる。逆相液体クロマトグラフィーの移動相としては、例えば、有機溶媒、水溶液およびこれらの混合溶媒が挙げられる。有機溶媒としては例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。水溶液としては、例えば、水、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、酢酸水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液、アンモニア水、緩衝液等が挙げられる。また、イオンペア試薬を溶媒に追加してもよく、アルキルスルホン酸ナトリウムおよびその塩や、テトラアルキルアンモニウムまたはトリアルキルアミンおよびその塩などが用いられる。これによりピーク分離が悪い場合、分離能を向上させることができる。液体クロマトグラフィーにおいて、移動相を混合溶媒とする場合、混合比を段階的に変化させてもよく、連続的に変化させてもよい。液体クロマトグラフィーの温度条件、移動相流量は、誘導体化アミノ酸の性質等に応じて適宜設定され得る。 Reverse phase liquid chromatography can be performed by a known method. Examples of the stationary phase for reversed-phase liquid chromatography include a filler modified with a hydrophobic compound. Specifically, examples of the stationary phase for reversed-phase liquid chromatography include silica gel modified with a hydrophobic compound. Examples of the mobile phase for reversed phase liquid chromatography include organic solvents, aqueous solutions, and mixed solvents thereof. Examples of the organic solvent include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, and the like. Examples of the aqueous solution include water, formic acid aqueous solution, ammonium formate aqueous solution, trifluoroacetic acid aqueous solution, acetic acid aqueous solution, ammonium acetate aqueous solution, ammonium bicarbonate aqueous solution, aqueous ammonia, and buffer solution. In addition, an ion pair reagent may be added to the solvent, and sodium alkylsulfonate and its salt, tetraalkylammonium or trialkylamine and its salt, and the like are used. Thereby, when peak separation is bad, the resolution can be improved. In liquid chromatography, when a mobile phase is used as a mixed solvent, the mixing ratio may be changed stepwise or continuously. Liquid chromatography temperature conditions and mobile phase flow rate can be appropriately set according to the properties of the derivatized amino acid.

好ましくは、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである。 Preferably, the liquid chromatography is reverse phase liquid chromatography.

分離はまた、疎水性カラムを用いて行われることが好ましい。疎水性カラムとは、固定相として疎水性充填材を用いたカラムを意味する。疎水性充填材としては、例えば、アルキル化合物（例、Ｃ１〜Ｃ４０化合物、アダマンチル基）や芳香族性化合物（例、ベンゼン、ナフタレン等のアリール化合物）で修飾された充填剤（例、シリカゲルまたはポリマー系の充填剤）が挙げられる。なお、これら修飾に関しては、充填剤表面と修飾基の間にリンカーを含んでもよい。 Separation is also preferably performed using a hydrophobic column. The hydrophobic column means a column using a hydrophobic filler as a stationary phase. Examples of hydrophobic fillers include fillers (eg, silica gel or polymers) modified with alkyl compounds (eg, C1-C40 compounds, adamantyl groups) or aromatic compounds (eg, aryl compounds such as benzene and naphthalene). System fillers). Regarding these modifications, a linker may be included between the filler surface and the modifying group.

好ましくは、分離は、上記疎水性カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により行われる。この場合、移動相としては、水溶液（例、水、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、酢酸水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液、アンモニア水）と有機溶媒（例、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール）との混合溶媒を用いることができる。分離は、勾配条件により行うことができる。勾配条件として、先ず、水溶液の比率が有機溶媒の比率より高い混合溶媒を使用し、次いで、段階的または連続的に水溶液の比率を低下させることにより、水溶液の比率が有機溶媒の比率より低い混合溶媒を使用する条件を利用することができる。 Preferably, the separation is performed by reverse phase high performance liquid chromatography (reverse phase HPLC) using the hydrophobic column. In this case, the mobile phase includes an aqueous solution (eg, water, formic acid aqueous solution, ammonium formate aqueous solution, trifluoroacetic acid aqueous solution, acetic acid aqueous solution, ammonium acetate aqueous solution, ammonium bicarbonate aqueous solution, aqueous ammonia) and an organic solvent (eg, acetonitrile, methanol). , Ethanol, isopropyl alcohol) can be used. Separation can be performed under gradient conditions. As a gradient condition, first, a mixed solvent in which the aqueous solution ratio is higher than the organic solvent ratio is used, and then the aqueous solution ratio is lower than the organic solvent ratio by gradually or continuously decreasing the aqueous solution ratio. Conditions using a solvent can be utilized.

分離において、誘導体化アミノ酸の保持時間は、適宜設定することができるが、本発明の方法によれば、誘導体化アミノ酸の保持時間を短時間に設定することが好ましい。これにより、アミノ酸の分析時間を短縮できる。保持時間は、特に限定されず、分析対象であるアミノ酸の種類、および本発明の方法の目的等に応じて適宜設定することができる。誘導体化アミノ酸の保持時間は、例えば、約１２０分以内、約９０分以内、約６０分以内、約５０分以内、約４０分以内、約３０分以内、約２０分以内、約１５分以内、または約１０分以内である。 In the separation, the retention time of the derivatized amino acid can be appropriately set. However, according to the method of the present invention, it is preferable to set the retention time of the derivatized amino acid to a short time. Thereby, the analysis time of an amino acid can be shortened. The retention time is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of amino acid to be analyzed and the purpose of the method of the present invention. The retention time of the derivatized amino acid is, for example, within about 120 minutes, within about 90 minutes, within about 60 minutes, within about 50 minutes, within about 40 minutes, within about 30 minutes, within about 20 minutes, within about 15 minutes, Or within about 10 minutes.

分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸の検出は、通常は質量分析法により行われる。 Detection of at least one derivatized amino acid among the separated derivatized amino acids is usually performed by mass spectrometry.

質量分析法は、特に限定されず、例えば、各種イオン化方法、各種イオン分離方法、各種検出器を組み合わせた質量分析法が挙げられる。 The mass spectrometry is not particularly limited, and examples thereof include mass spectrometry combining various ionization methods, various ion separation methods, and various detectors.

イオン化方法としては、例えば、電子イオン化（ＥｌｅｃｔｒｏｎＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＩ）法、化学イオン化（ＣｈｅｍｉｃａｌＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩ）法、高速原子衝撃（ＦａｓｔＡｔｏｍＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＰｒｅｓｓｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）法、大気圧光イオン化（ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＰｒｅｓｓｕｒｅＰｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＰＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）法、ソフトレーザー脱離イオン化質量分析（ＳｏｆｔＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＤＩ）法、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＤＥＳＩ）法、探針エレクトロスプレーイオン化（ＰｒｏｂｅＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＰＥＳＩ）法等が挙げられる。 Examples of the ionization method include an electron ionization (EI) method, a chemical ionization (CI) method, a fast atom bombardment (FAB) method, and an electrospray ionization (Electrospray Ionization) method. Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI), Atmospheric Pressure Photoionization (APPI), Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization / Matrix-Assisted Laser Desorption Soft laser desorption ionization mass spectrometry (Soft Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry: LDI) method, desorption electrospray ionization (DESI) method, probe electrospray ionization (Probe Electroion ISI method) Is mentioned.

イオン分離方法としては、例えば、磁場型質量分離方法、四重極型質量分離方法、イオントラップ型質量分離方法、飛行時間型質量分離方法、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離方法、電場型フーリエ変換型質量分析装置を用いたイオン分離方法が挙げられる。 Examples of ion separation methods include magnetic field type mass separation methods, quadrupole mass separation methods, ion trap mass separation methods, time-of-flight mass separation methods, Fourier transform ion cyclotron mass separation methods, and electric field type Fourier transform types. Examples include an ion separation method using a mass spectrometer.

検出器としては、例えば、二次電子増倍管、後段加速型検出器、チャンネルトロン、マルチチャンネルトロン、アレイ検出器、位置・時間分解型アレイ検出器、光電子増倍管等が挙げられる。 Examples of the detector include a secondary electron multiplier, a post-acceleration detector, a channeltron, a multichanneltron, an array detector, a position / time-resolved array detector, a photomultiplier tube, and the like.

質量分析法は、負電荷を検出するネガティブモードで行われても、正電荷を検出するポジティブモードで行われてもよいが、好ましくは、正電荷を検出するポジティブモードで行われる。 The mass spectrometry may be performed in a negative mode for detecting a negative charge or in a positive mode for detecting a positive charge, but is preferably performed in a positive mode for detecting a positive charge.

質量分析法による検出は、１つの質量分離装置で行ってもよいし、直列につながれた２以上の質量分離装置を含む装置で行われてもよい。例えば、検出は、直列につながれた３つの質量分離装置を含む装置（例：三連四重極型質量分析計、四重極−飛行時間型質量分析計、四重極−キングドントラップ型質量分析計等）で行うことができる。検出を三連四重極型質量分析計により行う場合、多重反応モニタリング（ＭＲＭ：ＭｕｌｔｉｐｌｅＲｅａｃｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、プロダクトイオンスキャンモード、プリカーサーイオンスキャンモード、ニュートラルロススキャンモードのいずれの方法によっても行うことができる。さらに、質量分析装置の前に、イオンモビリティー分離機能を搭載した質量分析計を用いてもよい。 Detection by mass spectrometry may be performed by one mass separator, or may be performed by an apparatus including two or more mass separators connected in series. For example, detection may include a device comprising three mass separation devices connected in series (eg, triple quadrupole mass spectrometer, quadrupole-time-of-flight mass spectrometer, quadrupole-kingdon trap mass) Analyzer). When detection is performed by a triple quadrupole mass spectrometer, multiple reaction monitoring (MRM), selective reaction monitoring (SRM), product ion scan mode, precursor ion scan mode, neutral loss scan This can be done by any method of mode. Further, a mass spectrometer equipped with an ion mobility separation function may be used before the mass spectrometer.

検出を三連四重極型質量分析計により行う場合、好ましくはＭＲＭ、より好ましくはＳｃｈｅｄｕｌｅｄＭＲＭにより検出を行う。ここで、３つの四重極を、イオン源に近い方から、それぞれＱ１、Ｑ２、Ｑ３と名付けると、Ｑ１において、特定のイオンをプリカーサーイオンとして選択し、Ｑ２においてプリカーサーイオンを分解し、Ｑ３において、プリカーサーイオンの分解により生じたプロダクトイオンのうち特定のイオンを選択する。したがって、ＭＲＭにより検出を行うことにより、夾雑成分の影響を取り除いた検出を行うことができる。
検出の際には、少なくとも１つの誘導体化アミノ酸の検出感度を調整することが好ましく、少なくとも１つの誘導体化Ｌ−アミノ酸の検出感度を調整する（例えば、抑制する）ことがより好ましく、すべての誘導体化Ｌ−アミノ酸の検出感度を調整する（例えば、抑制する）ことがさらに好ましい。調整される誘導体化アミノ酸は、特に限定されないが、好ましくは、試料中の濃度が１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上、さらに好ましくは１０００μＭ以上の、誘導体化Ｌ−アミノ酸を少なくとも１つ含むことが好ましい。生物学的試料中のＬ−アミノ酸の濃度は、一般に、Ｄ−アミノ酸の濃度に対し１００倍以上である。そのため、上記条件で検出することにより、高濃度側での検量線の直線性を確保することができ、高濃度のＬ−アミノ酸と低濃度のＤ−アミノ酸を同時に、より高感度かつ高精度に分析することができる。
前記調整は検出方法により適宜選択できるが、例えば検出をＭＲＭ又はＳＲＭにより行う場合、トランジッションの選択によればよい。例えば、Ｑ３において感度の悪いフラグメントイオンを選択すること（例：Ｄ−Ａｌａ（２９６／２０７）、Ｌ−Ａｌａ（２９６／９２．９））、Ｑ１において天然同位体のｍ＋１を選択すること（例、Ｄ−Ａｌａ（２９６／２０７）、Ｌ−Ａｌａ（２９７／２０７））が挙げられる。 When detection is performed by a triple quadrupole mass spectrometer, detection is preferably performed by MRM, more preferably by Scheduled MRM. Here, when the three quadrupoles are named Q1, Q2, and Q3 from the side closer to the ion source, a specific ion is selected as a precursor ion in Q1, the precursor ion is decomposed in Q2, and in Q3 The specific ions are selected from the product ions generated by the decomposition of the precursor ions. Therefore, by performing detection by MRM, it is possible to perform detection with the influence of the contaminating component removed.
Upon detection, it is preferable to adjust the detection sensitivity of at least one derivatized amino acid, more preferably to adjust (eg, suppress) the detection sensitivity of at least one derivatized L-amino acid, and all derivatives It is further preferable to adjust (for example, suppress) the sensitivity of detection of a modified L-amino acid. The derivatized amino acid to be adjusted is not particularly limited, but preferably contains at least one derivatized L-amino acid having a concentration in the sample of 10 μM or more, more preferably 100 μM or more, and even more preferably 1000 μM or more. . The concentration of L-amino acid in a biological sample is generally 100 times or more that of D-amino acid. Therefore, by detecting under the above conditions, the linearity of the calibration curve on the high concentration side can be ensured, and a high concentration L-amino acid and a low concentration D-amino acid can be simultaneously detected with higher sensitivity and accuracy. Can be analyzed.
The adjustment can be appropriately selected depending on a detection method. For example, when detection is performed by MRM or SRM, transition may be selected. For example, selecting an insensitive fragment ion at Q3 (eg, D-Ala (296/207), L-Ala (296 / 92.9)), selecting a natural isotope m + 1 at Q1 (eg, , D-Ala (296/207), L-Ala (297/207)).

検出の際は、内標準（内部標準）に基づく補正を行うことが好ましい。これにより、アミノ酸をより正確に定量することができる。内標準に基づく補正は、例えば、誘導体化アミノ酸の検出結果（実測値）を、試料に既定量添加された内標準の検出結果と比較して補正することにより実施される。 In detection, it is preferable to perform correction based on the internal standard (internal standard). Thereby, amino acids can be quantified more accurately. The correction based on the internal standard is performed, for example, by correcting the detection result (actual value) of the derivatized amino acid by comparing it with the detection result of the internal standard added to the sample in a predetermined amount.

検出の際は、内標準に基づく補正以外の方法による補正を行ってもよい。このような補正方法としては、例えば、外標準に基づく補正が挙げられる。外標準に基づく補正を行うことにより、アミノ酸をより正確に定量することができる。外標準に基づく補正は、標準添加法に基づき行うことができる。外標準物質としては、検出したいアミノ酸の誘導体化アミノ酸であればよい。外標準物質は、通常、検出までの間にサンプルに所定濃度添加される。 At the time of detection, correction by a method other than correction based on the internal standard may be performed. Examples of such a correction method include correction based on an external standard. By performing correction based on the external standard, amino acids can be quantified more accurately. Correction based on the external standard can be performed based on the standard addition method. The external standard substance may be a derivatized amino acid of an amino acid to be detected. The external standard is usually added to the sample at a predetermined concentration before detection.

分離および検出工程は、分離装置および検出装置を併用して、または１つの分離検出装置を用いて行うことができるが、１つの分離検出装置を用いて行うことが好ましい。これにより、短時間でアミノ酸を分析できる。１つの分離検出装置を用いる方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ法）、または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を利用することができる。
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ法）、または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を利用して分離および検出工程を行う場合は次のことが言える。
誘導体化工程の一般式（１）で表される化合物がＲ体である場合、移動相が酸性であると、Ｌ体が先に溶出し、Ｄ体のピークがＬ体のピークに埋もれてしまう場合がある。そのため、移動相のｐＨ値は、中性またはアルカリ性が好ましい。また、移動相がアルカリ性であると、ピークを高感度で検出し得るが、カラムの耐久性を保つためには、中性〜弱アルカリ性が好ましい。従って、移動相のｐＨ値は、７〜１２が好ましく、８〜１２がより好ましく、８〜９．５がさらにより好ましい。 The separation and detection step can be performed using the separation device and the detection device in combination or using one separation detection device, but is preferably performed using one separation detection device. Thereby, amino acids can be analyzed in a short time. As a method using one separation detection apparatus, for example, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS method) or liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method) can be used.
The following can be said when the separation and detection steps are performed using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS method) or liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method).
When the compound represented by the general formula (1) in the derivatization step is R-form, if the mobile phase is acidic, L-form elutes first, and the D-form peak is buried in the L-form peak. There is a case. Therefore, the pH value of the mobile phase is preferably neutral or alkaline. Further, when the mobile phase is alkaline, the peak can be detected with high sensitivity, but neutral to weak alkaline is preferable in order to maintain the durability of the column. Therefore, the pH value of the mobile phase is preferably 7 to 12, more preferably 8 to 12, and still more preferably 8 to 9.5.

検出対象である少なくとも１つの誘導体化アミノ酸は、分析が望まれるアミノ酸の誘導体であればよく、２つ以上の誘導体化アミノ酸が好ましい。検出対象である誘導体化アミノ酸の数の上限は特になく、１００種類でもよい。検出対象である誘導体化アミノ酸の数は、１〜１００種類であってもよい。誘導体化アミノ酸のアミノ酸としては、例えば、前述した具体例が挙げられ、このうち、タンパク質構成アミノ酸が好ましく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、およびプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸がより好ましい。検出対象である誘導体化アミノ酸は、キラル不斉炭素を有するアミノ酸（例えば、上記具体例のうちグリシン以外の１９種のアミノ酸）の誘導体が好ましく、そのＤ体およびＬ体のうち、Ｄ体が好ましい。上記具体例のうちグリシン以外の１９種のアミノ酸のうち、好ましくはプロリン以外の１８種のアミノ酸を構成するＤ体およびＬ体から選ばれる１種以上である。検出対象である少なくとも１つの誘導体化アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸の誘導体を含むことが好ましく、Ｄ−アミノ酸とその鏡像異性体であるＬ−アミノ酸の各誘導体の組み合わせを少なくとも１種含むことがより好ましい。 The at least one derivatized amino acid to be detected may be a derivative of an amino acid desired to be analyzed, and two or more derivatized amino acids are preferable. There is no particular upper limit on the number of derivatized amino acids to be detected, and 100 types may be used. The number of derivatized amino acids to be detected may be 1 to 100. Examples of the amino acid of the derivatized amino acid include the specific examples described above, and among these, protein constituting amino acids are preferable, and glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, lysine, arginine, aspartic acid, An amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, asparagine, glutamine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, and proline is more preferable. The derivatized amino acid to be detected is preferably a derivative of an amino acid having a chiral asymmetric carbon (for example, 19 kinds of amino acids other than glycine in the above specific examples), and D-form is preferred among D-form and L-form. . Among the 19 types of amino acids other than glycine in the above specific examples, it is preferably at least one selected from the D-form and L-form constituting 18 amino acids other than proline. The at least one derivatized amino acid to be detected preferably includes a derivative of D-amino acid, and more preferably includes at least one combination of each derivative of D-amino acid and its enantiomer L-amino acid. .

一般式（１）で表される化合物は、上述のように、アミノ酸分析用誘導体化剤として有用である。また、一般式（１）で表される化合物と、少なくとも１つの内標準物質とを含む分析キットは、上述の分析方法を実施するために用いられ得る。分析対象が２以上のアミノ酸である場合、分析キットには、各アミノ酸の内標準物質からなる内標準物質群が含まれ得る。分析対象がＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸である場合、Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量のＬ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比率は、通常は１００／１〜１／１００であり、好ましくは１／３〜１／１００であり、より好ましくは１／１０〜１／１００である。分析キットは、通常は外標準物質をさらに含む。 The compound represented by the general formula (1) is useful as a derivatizing agent for amino acid analysis as described above. In addition, an analysis kit containing the compound represented by the general formula (1) and at least one internal standard substance can be used to carry out the above-described analysis method. When the analysis target is two or more amino acids, the analysis kit may include an internal standard group consisting of internal standards of each amino acid. When the analysis object is D-amino acid and L-amino acid, the ratio of the amount of D-amino acid internal standard substance to the amount of L-amino acid internal standard substance is usually 100/1 to 1/100, preferably Is 1/3 to 1/100, more preferably 1/10 to 1/100. The analysis kit usually further includes an external standard.

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by a present Example.

実施例１（ヒト血漿サンプル中のアミノ酸の分析）
サンプルの前処理（除タンパク質処理）
被験者より常法に従い採血し、血漿サンプルを調製した。 Example 1 (Analysis of amino acids in human plasma samples)
Sample pretreatment (deproteinization)
Blood was collected from a subject according to a conventional method to prepare a plasma sample.

標準溶液またはヒト血漿サンプル２０μＬに、内標準物質（Ｄ，Ｌ−アミノ酸安定同位体混合溶液）を２０μＬ添加し、さらに、アセトニトリル４０μＬを加えて、ボルテックスで攪拌した後、遠心し（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２０℃）、上清を回収した。上清２０μＬを誘導体化に用いた。なお、標準溶液に用いるＤ−ａｌａｎｉｎｅ、Ｄ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｄ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｄ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｄ−ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ、Ｄ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｄ−ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ、Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｄ−ｖａｌｉｎｅ、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎはＳｉｇｍａ社から、Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄはＡｌｄｒｉｃｈ社から、Ｄ−ａｌｌｏ−ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｄ−ａｌｌｏ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅは東京化成工業社から、その他Ｌ−アミノ酸は和光純薬工業社から、それぞれ購入した。これらのＤ−アミノ酸の濃度が０．１μＭ、Ｌ−アミノ酸濃度が１μＭになるように標準溶液を調製した。 20 μL of an internal standard substance (D, L-amino acid stable isotope mixed solution) is added to 20 μL of a standard solution or human plasma sample, 40 μL of acetonitrile is further added, and the mixture is vortexed and centrifuged (15000 rpm, 10 min, 20 ° C) and the supernatant was collected. 20 μL of supernatant was used for derivatization. In addition, D-alanine, D-argineine, D-asparagine monohydrate, D-glutamine, D-glutamic acid, D-histidine, D-leucine, D-lysine, D-phenineine, D-phenine, D-phenine used for standard solutions proline, D-serine, D-tryptophan, D-tyrosine, D-valine, L-asparagine monohydrate, L-glutamine, L-tryptophan from Sigma, D-asphalicol from Ald D-allo-threonine is available from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Roh acid was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., respectively. Standard solutions were prepared so that the concentration of these D-amino acids was 0.1 μM and the concentration of L-amino acids was 1 μM.

サンプルの（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬による誘導体化
上清サンプル２０μＬとアミノタグワコー用ほう酸緩衝液２０μＬをボルテックスで攪拌した後、（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬（（Ｒ）−Ｎ−（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ）−β−（３−ｐｙｒｉｄｙｌ）−ａｌａｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ；５ｍｇ／ｍＬのアセトニトリル溶液として調製）を２０μＬ加えて室温で１０分間静置した。次に、０．１Ｍ塩酸水溶液を４０μＬ加えて攪拌したものをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析サンプルとした。 Derivatization of sample with (R) -3PyrAla reagent 20 μL of supernatant sample and 20 μL of borate buffer for aminotagwaco were vortexed, and then (R) -3PyrAla reagent ((R) -N- (hydroxysuccinimidyl carbamate) -β 20 μL of-(3-pyrylyl) -alanine methyl ester; prepared as a 5 mg / mL acetonitrile solution) was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Next, 40 μL of 0.1 M hydrochloric acid aqueous solution was added and stirred as an LC-MS / MS analysis sample.

分析装置および分析条件は以下のとおりである。 The analyzer and analysis conditions are as follows.

（分析装置）
ＨＰＬＣシステム：ＮｅｘｅｒａＸ２（島津製作所）
・デガッサー：ＤＧＵ−２０Ａ５Ｒ
・ポンプ：ＬＣ−３０ＡＤ
・オートサンプラー：ＳＩＬ−３０ＡＣＭＰ
・カラム恒温槽：ＣＴＯ−２０ＡＣ
・コミュニケーションバスモジュール：ＣＢＭ−２０Ａ
（ミキサー容量：２１．２μＬ）
質量分析計：ＴｒｉｐｌｅＱｕａｄ６５００（ＳＣＩＥＸ） (Analysis equipment)
HPLC system: Nexera X2 (Shimadzu Corporation)
・ Degasser: DGU-20A5R
・ Pump: LC-30AD
・ Autosampler: SIL-30AC MP
-Column thermostat: CTO-20AC
・ Communication bus module: CBM-20A
(Mixer capacity: 21.2 μL)
Mass spectrometer: Triple Quad 6500 (SCIEX)

（ＨＰＬＣ分析条件）
ガードカラム：ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＢＥＨＣ１８ＶａｎＧｕａｒｄ（２．１ｘ５ｍｍ，１．７μｍ，Ｐ／Ｎ１８６００３９７５)
カラム：ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣ１８（２．１ｘ１００ｍｍ，１．７μｍ，Ｐ／Ｎ１８６００２３５２)
移動相Ａ：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）
移動相Ｂ：８０％メタノール／水
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表１のとおり (HPLC analysis conditions)
Guard column: Waters ACQUITY BEH C18 VanGuard (2.1 × 5 mm, 1.7 μm, P / N 186003975)
Column: Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, P / N186002352)
Mobile phase A: 10 mM aqueous ammonium bicarbonate solution (pH 8.0)
Mobile phase B: 80% methanol / water Flow rate: 0.5 mL / min
Column temperature: 50 ° C
Sample injection volume: 1 μL
Gradient conditions: as shown in Table 1

（質量分析計分析条件）
イオン化法：ＥＳＩ，Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：ＳｃｈｅｄｕｌｅｄＭＲＭ（ＳｃｈｅｄｕｌｅｄＭｕｌｔｉｐｌｅＲｅａｃｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
スキャン条件：ＭＲＭｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｎｄｏｗ６０ｓｅｃ，Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎｔｉｍｅ０．５ｓｅｃ
イオンソースパラメーター：ＣＵＲ４０，ＣＡＤ８，ＩＳ４５００，ＴＥＭ６００，ＧＳ１７０，ＧＳ２７０
データ解析：データの取得は付属ソフトであるＡｎａｌｙｓｔ１．６．２（ＳＣＩＥＸ）を用い、解析はＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（ＳＣＩＥＸ）およびＥｘｃｅｌ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ)を用いて行った。
ＳｃｈｅｄｕｌｅｄＭＲＭ測定条件：表２のとおり (Mass spectrometer analysis conditions)
Ionization method: ESI, Positive mode Scan type: Scheduled MRM (Scheduled Multiple Reaction Monitoring)
Scan conditions: MRM detection window 60 sec, Target scan time 0.5 sec
Ion source parameters: CUR40, CAD8, IS4500, TEM600, GS1 70, GS2 70
Data analysis: Data acquisition was performed using Analyst 1.6.2 (SCIEX), and analysis was performed using MultiQuant (SCIEX) and Excel 2010 (Microsoft).
Scheduled MRM measurement conditions: as shown in Table 2

定量分析における各アミノ酸の内標準物質を表３に示す。Ｄ−アミノ酸の内標準物質の添加量は１μＭ、Ｌ−アミノ酸の内標準物質の添加量は１０μＭとした。 Table 3 shows the internal standard substances of each amino acid in the quantitative analysis. The amount of D-amino acid internal standard substance added was 1 μM, and the amount of L-amino acid internal standard substance added was 10 μM.

（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムを図２に示す。ヒト血漿中のＤ−アミノ酸濃度およびＬ−アミノ酸濃度をそれぞれ図３および４に示す。 An extraction mass chromatogram of (R) -3PyrAla derivatized D, L-amino acid (standard solution) is shown in FIG. The D-amino acid concentration and L-amino acid concentration in human plasma are shown in FIGS. 3 and 4, respectively.

図２〜４から明らかなとおり、各抽出マスクロマトグラムにおいてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸よりも先に溶出しており、微量Ｄ−アミノ酸のピークがＬ−アミノ酸のピークの裾に埋もれず、正確に定量できていることが分かる。また、保持時間はいずれも２０分以内であり、また分析条件は共通であったことから、迅速にかつ正確に定量できたことが分かる。 As is apparent from FIGS. 2 to 4, D-amino acids are eluted before L-amino acids in each extracted mass chromatogram, and the trace D-amino acid peak is not buried in the tail of the L-amino acid peak. It can be seen that it can be quantitatively determined. In addition, since the retention times were all within 20 minutes and the analysis conditions were the same, it can be seen that the determination could be made quickly and accurately.

実施例２（ヒト糞便中のアミノ酸分析）
血漿サンプルの代わりにヒト糞便サンプルを用いたこと、除タンパクに８０％メタノールを使用し、クロロホルムで脱脂処理をしたほかは、実施例１と同様に行った。ヒト糞便サンプルは、被験者１名より採取し抽出、除タンパク、脱脂処理したものを用いた。 Example 2 (Amino acid analysis in human feces)
The same procedure as in Example 1 was performed, except that a human stool sample was used instead of the plasma sample, 80% methanol was used for deproteinization, and the sample was degreased with chloroform. The human stool sample was collected from one subject and extracted, deproteinized, and degreased.

ヒト糞便中のＤ−アミノ酸濃度およびＬ−アミノ酸濃度をそれぞれ図５および６に示す。図５〜６から明らかなとおり、実施例１の血漿の結果と同様、微量Ｄ−アミノ酸を正確に定量できたことが分かる。 The D-amino acid concentration and L-amino acid concentration in human feces are shown in FIGS. 5 and 6, respectively. As is apparent from FIGS. 5 to 6, it can be seen that the trace amount of D-amino acid could be accurately quantified in the same manner as the plasma result of Example 1.

実施例３（ヒト角層中のアミノ酸分析）
ヒト血漿サンプルの代わりにヒト角層サンプルを用いたこと、内標準による補正を行った場合と行わない場合の両方について分析を行ったこと、を除き、実施例１と同様に行った。ヒト角層サンプルは、以下のようにしてテープストリッピング法により調製した。被験者（全員女性、年齢構成：２０〜３０代３１名、４０〜６０代４０名：合計人数７１名）は洗顔した後、恒温恒湿室（湿度４０％、室温２０℃）にて２０分間馴化した。被験者の頬中央部に３ｃｍ×３ｃｍにカットしたテープを貼付し、角層を採取した。１回目に採取した最表層の角層は分析には利用せず、２回目または３回目を利用した。採取したテープは、コニカルチューブ（５０ｍｌ）に入れて密閉し、−８０℃にて保存した。採取したテープ（角層）を９５％メチルアルコール水溶液を用いて超音波処理を２回繰り返し、水溶成分を抽出した。抽出液には内標準物質（Ｄ−ＡｒｇやＤ−Ａｓｐ等複数種のＤ，Ｌ−アミノ酸安定同位体を含む）を添加した。得られたメチルアルコール水溶液を、遠心エバポレーターで乾固し、ヒト角層サンプルとした。 Example 3 (Amino acid analysis in human stratum corneum)
Except that a human stratum corneum sample was used in place of the human plasma sample, and that the analysis was performed both when the internal standard was corrected and when it was not corrected, the same procedure as in Example 1 was performed. The human stratum corneum sample was prepared by the tape stripping method as follows. Subjects (women, all age groups: 31 in their 20s and 30s, 40s in their 60s, 40 people: 71 people in total) were face-washed and acclimated for 20 minutes in a constant temperature and humidity room (humidity 40%, room temperature 20 ° C). did. A tape cut to 3 cm × 3 cm was applied to the center of the subject's cheek, and the stratum corneum was collected. The outermost stratum corneum collected at the first time was not used for analysis, but was used for the second or third time. The collected tape was sealed in a conical tube (50 ml) and stored at −80 ° C. The collected tape (horny layer) was sonicated twice using a 95% aqueous methyl alcohol solution to extract water-soluble components. An internal standard substance (containing a plurality of D, L-amino acid stable isotopes such as D-Arg and D-Asp) was added to the extract. The obtained aqueous methyl alcohol solution was dried with a centrifugal evaporator to obtain a human stratum corneum sample.

Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸の角層抽出条件における添加回収率（添加濃度Ｄ−アミノ酸１μＭ、Ｌ−アミノ酸１０μＭ）を表４および５に示す。 Tables 4 and 5 show the addition recovery rates (addition concentration D-amino acid 1 μM, L-amino acid 10 μM) under the stratum corneum extraction conditions for D-amino acids and L-amino acids.

表４および５の結果から、内標準による補正を行ったほうが補正を行わない場合よりもより正確なアミノ酸の定量が可能であることが分かる。 From the results of Tables 4 and 5, it can be seen that amino acid quantification can be performed more accurately when correction is performed using the internal standard than when correction is not performed.

実施例４（ラット組織中のＤ−アミノ酸分析）
ラット組織（視床下部、海馬）は凍結粉砕したのち、１００倍量の８０％メタノール水溶液（内標準含有）で除タンパクした後、クロロホルムで脱脂したサンプルを、実施例１と同じ方法で分析した。結果を図７および８に示す。図７および８から明らかなとおり、各組織のＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を各アミノ酸に共通の分析条件で定量することができ、微量アミノ酸も正確に定量することができることが分かる。
以上の実施例の結果は、本発明により生体試料中のアミノ酸を高感度かつ高精度に分析することができることを示している。 Example 4 (D-amino acid analysis in rat tissue)
The rat tissue (hypothalamus, hippocampus) was freeze-ground and deproteinized with 100-fold 80% aqueous methanol solution (containing internal standard), and then degreased with chloroform, and analyzed in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIGS. As is clear from FIGS. 7 and 8, it can be seen that D-amino acids and L-amino acids in each tissue can be quantified under the analysis conditions common to the respective amino acids, and trace amounts of amino acids can also be accurately quantified.
The results of the above examples indicate that amino acids in biological samples can be analyzed with high sensitivity and high accuracy according to the present invention.

実施例５（式（１０）で表される化合物の合成）
窒素雰囲気下、Ｈ−Ｄ−３ＰｙｒＡｌａ−ＯＭｅ二塩酸塩１２５ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン５ｍＬに懸濁させ、氷冷にて、トリエチルアミン１５０μＬ（１．１ｍｍｏｌ）および炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）１４０ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温まで徐々に昇温させ、一晩撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、（ＳｕＯ）ＣＯ−Ｄ−３ＰｙｒＡｌａ−ＯＭｅを含むサンプルを３５５ｍｇ、アモルファスとして得た。 Example 5 (Synthesis of a compound represented by the formula (10))
Under a nitrogen atmosphere, 125 mg (0.50 mmol) of HD-3PyrAla-OMe dihydrochloride was suspended in 5 mL of methylene chloride, and 150 mL (1.1 mmol) of triethylamine and 140 mg of di (N-succinimidyl) carbonate were cooled with ice. (0.55 mmol) was added, the temperature was gradually raised to room temperature, and the mixture was stirred overnight. After the reaction solution was concentrated under reduced pressure, 355 mg of a sample containing (SuO) CO-D-3PyrAla-OMe was obtained as amorphous.

実施例６（式（１２）で表される化合物の合成）
Example 6 (Synthesis of compound represented by formula (12))

５０ｍＬフラスコに１００ｍｇのＤ−２−Ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｂａｃｈｅｍ製）をメタノール（和光純薬製）に懸濁させ、氷冷下約５分撹拌し、ＳＯＣｌ₂（関東化学製、５０μＬ）をピペッターで滴下した。滴下後、無色透明の溶液となったのを確認し、室温下一晩反応させ、溶媒と過剰量の試薬を減圧下留去し、対応するアミノ酸メチルエステル２塩酸塩を得た。得られた塩酸塩は２０ｍＬの酢酸エチルに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約１０ｍＬにて３回、約１０ｍＬの飽和食塩水にて１回洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、フリーのＤ−２−Ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌａｌａｎｉｎｅメチルエステル３５．２ｍｇを得た。得られた化合物はジクロロメタン（純正化学製、５ｍＬ）を加えて溶解させ、さらに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル)（東京化成製）を３９．２ｍｇ加えて室温下反応させた。一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、黄色の目的物（Ｒ）−３−（２−Ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−Ａｌａｎｉｎｙｌ−Ｎ−ＨｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＣａｒｂａｍａｔｅＭｅｔｈｙｌＥｓｔｅｒを得た。
¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）：δ８．１４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８３−７．７７（ｍ，１Ｈ），７．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．４，６．８，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，２Ｈ），４．９０−４．７６（ｍ，１Ｈ），３．７８−３．６７（ｍ，４Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ）． 100 mg of D-2-quinolinylalanine (manufactured by Bachem) was suspended in methanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) in a 50 mL flask, stirred for about 5 minutes under ice-cooling, and SOCl ₂ (manufactured by Kanto Chemical Co., 50 μL) was added dropwise with a pipetter. . After the dropwise addition, it was confirmed that a colorless and transparent solution was obtained, and the reaction was allowed to proceed overnight at room temperature. The solvent and excess reagent were distilled off under reduced pressure to obtain the corresponding amino acid methyl ester dihydrochloride. The obtained hydrochloride was suspended in 20 mL of ethyl acetate and washed three times with about 10 mL of saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and once with about 10 mL of saturated brine. After drying the organic layer with sodium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 35.2 mg of free D-2-quinolinylalanine methyl ester. The obtained compound was dissolved by adding dichloromethane (manufactured by Junsei Kagaku, 5 mL), and further 39.2 mg of di (N-succinimidyl) carbonate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was added and reacted at room temperature. After stirring overnight, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a yellow target product (R) -3- (2-quinolinyl) -Alaninyl-N-hydroxysuccinimide Carbyl Methyl Ester.
¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): δ 8.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.72 (ddd, J = 8.4, 6.8, 1.5 Hz, 1H), 7.54 (ddd, J = 8.2, 6.8, 1.2 Hz, 1H), 7 .34-7.30 (m, 2H), 4.90-4.76 (m, 1H), 3.78-3.67 (m, 4H), 3.56 (dd, J = 15.2, 4.0 Hz, 1H), 2.80 (s, 4H).

実施例７（式（１３）で表される化合物の合成）
Ｄ−ＰｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅｍｅｔｈｙｌＥｓｔｅｒ塩酸塩（国産化学製、１．０ｇ）を２０ｍＬの酢酸エチルに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約１０ｍＬにて３回、約１０ｍＬの飽和食塩水にて１回洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、Ｄ−ＰｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅＭｅｔｈｙｌＥｓｔｅｒのフリー体を得た。得られた化合物はジクロロメタン（純正化学製、１０ｍＬ）を加えて溶解させ、さらに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（東京化成製）を１６９．５ｍｇ加えて室温下反応させた。一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、白色の目的物（Ｒ）−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｙｌ−Ｎ’−ＨｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＣａｒｂａｍａｔｅＭｅｔｈｙｌＥｓｔｅｒを得た。
¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）：δ７．３８（ｍ，５Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ）． Example 7 (Synthesis of a compound represented by the formula (13))
D-Phenylglycine methyl Ester hydrochloride (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd., 1.0 g) was suspended in 20 mL of ethyl acetate and washed three times with about 10 mL of saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and once with about 10 mL of saturated saline. . The organic layer was dried over sodium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a free form of D-phenylglycine Mester. The obtained compound was dissolved by adding dichloromethane (manufactured by Junsei Kagaku, 10 mL), and further, 169.5 mg of di (N-succinimidyl) carbonate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was added and reacted at room temperature. After stirring overnight, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a white target product (R) -2-phenylglycinyl-N′-hydroxysuccinimidyl Carbamate Methyl Ester.
¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): δ 7.38 (m, 5H), 6.63 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.33 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 3 .76 (s, 3H), 2.80 (s, 4H).

実施例８（式（１１）で表される化合物の合成）
Ｄ−３−ＰｙｒｉｄｙｌａｌａｎｉｎｅＭｅｔｈｙｌＥｓｔｅｒ塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ製、３００ｍｇ）を陰イオン交換カラム（三菱化学製ＰＡ４０８）に通し、得られた溶液を凍結乾燥させ、得られた化合物から４８ｍｇとり、ジクロロメタン（純正化学製、１０ｍＬ）を加えて溶解させ、さらに炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）（東京化成製）を１０５ｍｇ加えて室温下反応させた。５分撹拌した後、溶媒を減圧留去し、白色の目的物（Ｒ）−３−Ｐｙｒｉｄｙｌａｌａｎｙｌ−Ｎ’−ＰｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌＣａｒｂａｍａｔｅＭｅｔｈｙｌＥｓｔｅｒを得た。
¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）：δ８．５３（ｄｄ，Ｊ＝４．９，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．４７−８．３２（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｄｔ，Ｊ＝７．９，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．９，５．０，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｄｔ，Ｊ＝７．４，５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，５．８Ｈｚ，１Ｈ）. Example 8 (Synthesis of compound represented by formula (11))
D-3-Pyridylalanine Methyl Ester hydrochloride (manufactured by Bachem, 300 mg) was passed through an anion exchange column (Mitsubishi Chemical PA408), the resulting solution was lyophilized, 48 mg of the resulting compound was taken from dichloromethane (pure chemical) Product, 10 mL) was added and dissolved, and 105 mg of bis (pentafluorophenyl) carbonate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was further added and reacted at room temperature. After stirring for 5 minutes, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a white target product (R) -3-Pyridylalanyl-N′-Pentafluorophenyl Carbamate Methyl Ester.
¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): δ 8.53 (dd, J = 4.9, 1.6 Hz, 1H), 8.47-8.32 (m, 1H), 7.64 (dt, J = 7.9, 1.9 Hz, 1H), 7.39 (ddd, J = 7.9, 5.0, 0.8 Hz, 1H), 6.00 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4 .71 (dt, J = 7.4, 5.6 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.36 (dd, J = 14.2, 5.6 Hz, 1H), 3.19 ( dd, J = 14.2, 5.8 Hz, 1H).

実施例９（標準溶液中のアミノ酸の分析）
サンプルの前処理
各種Ｄ−アミノ酸濃度を１μＭ、各種L-アミノ酸の濃度を１０μＭに調整した以外は実施例１と同じ標準溶液を調製した。この標準溶液２０μＬに、内標準物質（Ｄ，Ｌ−アミノ酸安定同位体混合溶液）を２０μＬ添加し、さらに、アセトニトリル４０μＬを加えて、ボルテックスで攪拌した後、遠心し（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２０℃）、上清を回収した。上清２０μＬを誘導体化に用いた。 Example 9 (Analysis of amino acids in standard solution)
Sample Pretreatment The same standard solution as in Example 1 was prepared except that various D-amino acid concentrations were adjusted to 1 μM and various L-amino acid concentrations were adjusted to 10 μM. 20 μL of an internal standard substance (D, L-amino acid stable isotope mixed solution) is added to 20 μL of this standard solution, 40 μL of acetonitrile is further added, and the mixture is vortexed and centrifuged (15000 rpm, 10 min, 20 ° C.). The supernatant was collected. 20 μL of supernatant was used for derivatization.

サンプルの（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬による誘導体化
上清サンプル２０μＬとアミノタグワコー用ほう酸緩衝液２０μＬをボルテックスで攪拌した後、（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬（（Ｒ）−３−ｐｙｒｉｄｙｌａｌａｎｙｌ−Ｎ−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃａｒｂａｍａｔｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ；５ｍｇ／ｍＬのアセトニトリル溶液として調製）を２０μＬ加えて室温で１０分間静置した。次に、０．０５Ｍ塩酸水溶液を４０μＬ加えて攪拌したものをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析サンプルとした。 Derivatization of sample with (R) -3PyrAla reagent 20 μL of the supernatant sample and 20 μL of bovine acid buffer for aminotagwaco were vortexed, and then (R) -3PyrAla reagent ((R) -3-pyrenylyl-N-pentafluorophenylcarbamate 20 μL of methyl ester (prepared as a 5 mg / mL acetonitrile solution) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Next, 40 μL of 0.05 M hydrochloric acid aqueous solution was added and stirred as an LC-MS / MS analysis sample.

ＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである。なお、分析装置は、実施例１と同じ分析装置を用いた。また、質量分析計分析条件は、ＳｃｈｅｄｕｌｅｄＭＲＭ測定条件を表７のとおりに変更したこと以外は、実施例１と同じである。さらに、内標準物質は、実施例１と同じである。 The HPLC analysis conditions are as follows. Note that the same analyzer as in Example 1 was used as the analyzer. Further, the mass spectrometer analysis conditions are the same as those in Example 1 except that the Scheduled MRM measurement conditions are changed as shown in Table 7. Further, the internal standard substance is the same as in Example 1.

（ＨＰＬＣ分析条件）
ガードカラム：ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＢＥＨＣ１８ＶａｎＧｕａｒｄ（２．１ｘ５ｍｍ，１．７μｍ，Ｐ／Ｎ１８６００３９７５）
カラム：ＩｎｅｒｔｓｕｓｔａｉｎＣ１８（２．１ｘ１５０ｍｍ，２μｍ）
移動相Ａ：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．８）
移動相Ｂ：８０％メタノール／水
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表６のとおり (HPLC analysis conditions)
Guard column: Waters ACQUITY BEH C18 VanGuard (2.1 × 5 mm, 1.7 μm, P / N 186003975)
Column: Inertsustain C18 (2.1 × 150 mm, 2 μm)
Mobile phase A: 10 mM aqueous ammonium bicarbonate solution (pH 7.8)
Mobile phase B: 80% methanol / water Flow rate: 0.4 mL / min
Column temperature: 50 ° C
Sample injection volume: 1 μL
Gradient conditions: as shown in Table 6

上記に示す条件で測定した、（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムを図９に示す。 FIG. 9 shows an extraction mass chromatogram of (R) -3PyrAla derivatized D, L-amino acid (standard solution) measured under the conditions described above.

図９から明らかなとおり、本分析条件の各抽出マスクロマトグラムにおいてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸よりも先に溶出しており、微量Ｄ−アミノ酸のピークがＬ−アミノ酸のピークの裾に埋もれず、正確に定量できていることが分かる。また、実施例１と比較して、誘導体化試薬、カラム及び移動相条件の変更により、分離性能がより向上した分析方法であることが分かる。 As is apparent from FIG. 9, in each extracted mass chromatogram under the present analysis conditions, D-amino acid elutes earlier than L-amino acid, and the trace D-amino acid peak is not buried in the tail of the L-amino acid peak. It can be seen that accurate quantification is possible. Moreover, it turns out that it is the analysis method which the separation performance improved more by changing the derivatization reagent, a column, and mobile phase conditions compared with Example 1. FIG.

実施例１０（標準溶液中のアミノ酸の分析：移動相ｐＨの評価）
サンプルの前処理および（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬による誘導体化
実施例９と同様にして行った。 Example 10 (Analysis of amino acids in standard solution: evaluation of mobile phase pH)
Sample Pretreatment and Derivatization with (R) -3PyrAla Reagent Performed as in Example 9.

ＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである。なお、分析装置は、ＨＰＬＣにはＳｈｉｍａｄｚｕ２０Ａシリーズを、質量分析計にはＴｈｅｒｍｏＴＳＱＶａｎｔａｇｅＥＭＲを、それぞれ用いた。質量分析計分析条件は、実施例１と同じである。さらに、内標準物質は、実施例１と同じである。 The HPLC analysis conditions are as follows. As the analyzer, a Shimadzu 20A series was used for HPLC, and a Thermo TSQ Vantage EMR was used for a mass spectrometer. Mass spectrometer analysis conditions are the same as in Example 1. Further, the internal standard substance is the same as in Example 1.

（ＨＰＬＣ分析条件（ｉ））
ｐＨ９．５
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８（２．１ｘ１００ｍｍ，３．５μｍ）
移動相Ａ：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９．５）
移動相Ｂ：９０％アセトニトリル／水
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表８のとおり (HPLC analysis conditions (i))
pH 9.5
Column: XBridge C18 (2.1 × 100 mm, 3.5 μm)
Mobile phase A: 10 mM aqueous ammonium bicarbonate solution (pH 9.5)
Mobile phase B: 90% acetonitrile / water Flow rate: 0.2 mL / min
Column temperature: 25 ° C
Sample injection volume: 1 μL
Gradient conditions: as shown in Table 8

（ＨＰＬＣ分析条件（ｉｉ））
ｐＨ２．０
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８（２．１ｘ１００ｍｍ，３．５μｍ）
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液（ｐＨ２．０）
移動相Ｂ：６０％アセトニトリル／水
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表９のとおり (HPLC analysis conditions (ii))
pH 2.0
Column: XBridge C18 (2.1 × 100 mm, 3.5 μm)
Mobile phase A: 0.1% formic acid aqueous solution (pH 2.0)
Mobile phase B: 60% acetonitrile / water Flow rate: 0.2 mL / min
Column temperature: 25 ° C
Sample injection volume: 1 μL
Gradient conditions: as shown in Table 9

移動相Ａの条件を、１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ９．５）、０．１％ギ酸（ｐＨ２．０）で分析した際の抽出マスクロマトグラムを図１０に示す。 FIG. 10 shows an extraction mass chromatogram when the mobile phase A was analyzed with 10 mM ammonium formate (pH 9.5) and 0.1% formic acid (pH 2.0).

図１０から明らかなとおり、移動相条件がｐＨ９．５のアルカリ性条件では、各抽出マスクロマトグラムにおいてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸よりも先に溶出しているのに対し、移動相条件がｐＨ２の酸性条件では、各抽出マスクロマトグラムにおいてＬ−アミノ酸がＤ−アミノ酸よりも先に溶出している。従って、アルカリ性の移動相条件において微量Ｄ−アミノ酸のピークがＬ−アミノ酸のピークの裾に埋もれず、正確に定量できることが分かる。 As apparent from FIG. 10, in the alkaline condition where the mobile phase condition is pH 9.5, the D-amino acid is eluted before the L-amino acid in each extracted mass chromatogram, whereas the mobile phase condition is pH 2. Under acidic conditions, L-amino acid is eluted before D-amino acid in each extracted mass chromatogram. Therefore, it can be seen that the trace D-amino acid peak is not buried in the bottom of the L-amino acid peak under alkaline mobile phase conditions and can be accurately quantified.

実施例１１（標準溶液中のアミノ酸の分析：移動相ｐＨの検討）
実施例９において、以下の２点の変更のほかは同様にして標準溶液中のＤ−アミノ酸の分析を行った。第１に、ＨＰＬＣ分析条件における移動相Ａの組成を、それぞれ、２５ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４，５，６，８）、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０，９．０，９．５）に変更した。第２に、サンプルの各種Ｄ−アミノ酸の標準溶液濃度を１μＭ及び０．５μＭに変更した。 Example 11 (Analysis of amino acids in standard solution: examination of mobile phase pH)
In Example 9, D-amino acids in the standard solution were analyzed in the same manner except for the following two changes. First, the composition of mobile phase A under HPLC analysis conditions was changed to 25 mM ammonium formate (pH 4, 5, 6, 8) and 10 mM ammonium bicarbonate (pH 8.0, 9.0, 9.5), respectively. . Second, the standard solution concentration of various D-amino acids in the sample was changed to 1 μM and 0.5 μM.

標準溶液濃度０．５μＭのサンプルを使用した際のピークエリア値を図１１に示し、標準溶液濃度１．０μＭのサンプルを使用した際のピークエリア値を図１２に示す。 FIG. 11 shows peak area values when using a sample with a standard solution concentration of 0.5 μM, and FIG. 12 shows peak area values when using a sample with a standard solution concentration of 1.0 μM.

図１１から明らかなとおり、各Ｄ−アミノ酸の検出ピークのエリア値は、酸性条件（ｐＨ４〜６）よりも塩基性条件（ｐＨ８）において高く、塩基性条件でより高感度に検出可能であることが分かる。図１２から明らかなとおり、塩基性条件（ｐＨ８．０〜９．５）においては、ピークエリア値の差はなく、同等の感度で検出されることが分かる。 As is clear from FIG. 11, the area value of the detection peak of each D-amino acid is higher in the basic condition (pH 8) than in the acidic condition (pH 4 to 6), and can be detected with higher sensitivity under the basic condition. I understand. As is clear from FIG. 12, it can be seen that, under basic conditions (pH 8.0 to 9.5), there is no difference in peak area values and detection is performed with the same sensitivity.

Claims

General formula (1):
(In the general formula (1), R ¹ is a group that reacts with at least one amino group of an amino acid, X represents an oxygen atom or a sulfur atom, C represents a carbon atom, and R ² represents a general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
Adding a compound represented by: to a sample to form a derivatized amino acid; and separating the derivatized amino acid from the sample and detecting at least one derivatized amino acid of the separated derivatized amino acids; Analysis method of amino acids.

R ¹ represents formula (7), (8) or (9):
(In the general formula (7), R ⁴ represents a halogen atom.
In general formula (9), n1 represents an integer of 1 or more. )
The method of Claim 1 which is group represented by these, or a halogen atom.

R ² is any one of formulas (2) to (4):
The method of Claim 1 or 2 which is group represented by these.

The method according to claim 1, wherein C is an asymmetric carbon atom C ^* .

The method of Claim 4 that the compound represented by General formula (1) is R body.

The compound represented by the general formula (1) is represented by the following formula (10), (11), (12) or (13):
The method of any one of Claims 1-5 which is a compound represented by these.

7. The method of any one of claims 1-6, wherein the derivatized amino acid detected comprises at least one derivatized D-amino acid and at least one derivatized L-amino acid.

The method according to any one of claims 1 to 7, wherein 1 to 100 kinds of derivatized amino acids are detected.

The derivatized amino acid has the general formula (14) or (15):
(In the general formula (14), R ′ and R ″ each independently represents a side chain of an amino acid, R ′ ″ represents a hydrogen atom, a metal atom or an alkyl group, and n2 is 1 or more. An integer is shown, and R ² and R ³ have the same meaning as described above.
In the general formula (15), a circle represents a 5-membered ring or a 6-membered ring, and R ² and R ³ have the same meaning as described above. )
The method of any one of Claims 1-8 which is a compound represented by these.

The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the separation is performed by chromatography, electrophoresis, or ion mobility spectroscopy.

The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the separation is performed by a liquid chromatography method using a hydrophobic column.

The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the separation and detection are performed by liquid chromatography mass spectrometry or liquid chromatography tandem mass spectrometry.

The method according to claim 12, wherein the pH of the mobile phase used in liquid chromatography mass spectrometry or liquid chromatography tandem mass spectrometry is 7-12.

The method according to claim 13, wherein the mobile phase has a pH of 8 to 9.5.

The method further comprises adding an internal standard substance before adding the compound represented by the general formula (1) to the sample, and the ratio of the amount of D-amino acid internal standard substance to the amount of L-amino acid internal standard substance 15. The method according to any one of claims 1 to 14, wherein is 100/1 to 1/100.

The method according to claim 1, wherein the sample is a biological sample.

Biological samples consist of blood, saliva, urine, stool, bile, sweat, tears, spinal fluid, tissue, amniotic fluid, milk, uterine fluid, follicular fluid, cells, nucleic acid solution, microbial suspension, food and feed The method of claim 16, wherein the method is selected from the group.

General formula (1):
(In the general formula (1), R ¹ is a group that reacts with at least one amino group of an amino acid, X represents an oxygen atom or a sulfur atom, C represents a carbon atom, and R ² represents a general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
A derivatizing agent for amino acid analysis, comprising a compound represented by:

R ¹ represents formula (7), (8) or (9):
(In the general formula (7), R ⁴ represents a halogen atom.
In general formula (9), n1 represents an integer of 1 or more. )
The agent of Claim 18 which is group represented by these, or a halogen atom.

R ² is any one of formulas (2) to (4):
The agent of Claim 18 or 19 which is group represented by these.

The compound represented by the general formula (1) is represented by the following formula (10), (11), (12) or (13):
The agent according to any one of claims 18 to 20.

The kit for amino acid analysis containing the agent of any one of Claims 18-21, and an internal standard substance.

General formula (14):
(In the general formula (14), R ′ and R ″ each independently represents a side chain of an amino acid, R ′ ″ represents a hydrogen atom, a metal atom or an alkyl group, and n2 is 1 or more. Represents an integer, and R ² represents the general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
A derivatized amino acid represented by

General formula (15):
(In the general formula (15), a circle represents a 5-membered ring or a 6-membered ring, and R ² represents a general formula (21), (22) or (23):
(In General Formula (21), R ⁷ is each independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least one R ⁷ is a nitrogen atom.
In general formula (22), R <^9> is respectively independently a carbon atom or a nitrogen atom, and at least 1 R < ⁹ > is a nitrogen atom.
In general formula (23), R < ¹⁰ > is a carbon atom or a nitrogen atom each independently. The hydrogen atom bonded to R ¹⁰ may be substituted with a polar group. )
Represents a group represented by
R ³ is an alkyl group or a hydrogen atom. )
A derivatized amino acid represented by