JP5261381B2

JP5261381B2 - Ｒａｎｔｅｓプロキシレベルに基づくｉｌ−１６活性およびｉｌ−１６活性の調節を検出する方法

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Publication number: JP5261381B2
Application number: JP2009515570A
Authority: JP
Inventors: グラス，ウイリアム・ジー
Original assignee: セントカー・インコーポレーテツド
Priority date: 2006-06-12
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2013-08-14
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Description

本発明は、ＩＬ−１６生物活性を検出する方法およびＩＬ−１６生物活性の調節を検出する方法に関する。さらに、本発明は、ＩＬ−１６関連障害の存在および／または障害に対する感受性を診断する方法に向けられる。

インターロイキン−１６（ＩＬ−１６；配列番号：３）は、Ｔ−リンパ球、単球、好酸球および樹状細胞の正の走化性を誘導するプロ炎症性サイトカインである（非特許文献１）。またＩＬ−１６刺激は、ＩＬ−１６応答性真核細胞において、ＩＬ−１ｂ発現を増大し、ＩＬ−６発現を増大し、そしてＩＬ−１５発現を増大する（非特許文献１）。

ＩＬ−１６ペプチド鎖モノマーは、比較的大きい１４ｋＤａの前駆体分子のカスパーゼ−３媒介蛋白質分解プロセシングによって形成される（非特許文献２）。ＩＬ−１６モノマーはテトラマーのペプチド鎖複合体を形成する。これらのテトラマーのＩＬ−１６複合体は、ＩＬ−１６の生物活性のある形態であると考えられている（非特許文献１）。ＩＬ−１６を産生する真核細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８を発現する細胞、例えばＴ細胞、マスト細胞、好酸球、樹状細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、および小脳の細胞を含む（非特許文献１）。ＩＬ−１６に対して応答性の真核細胞はＣＤ４とＣＤ９ペプチド鎖を発現するが、ＩＬ−１６に対する応答は、これらのペプチド鎖とはまた別の問題のようである（参照、例えば、非特許文献３）。

ＩＬ−１６は、なかんずく、喘息、アトピー性皮膚炎およびリウマチ様関節炎のような疾病において重要な役割を演じると報告された（参照、例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。例えば、ヒト患者では、ＩＬ−１６は、喘息誘導性細胞を肺へ誘引することに関与しており、そして患者における喘息応答のきっかけに決定的役割を演じることが示された（非特許文献４）。明らかに、ＩＬ−１６を活性化または抑制する分子を検出し、かつ同定する能力は、ＩＬ−１６媒介の疾病の有効な処置の開発にとって決定的である。

かくして、ＩＬ−１６生物活性、ＩＬ−１６生物活性のアクチベーターおよびＩＬ−１６生物活性のインヒビターを検出する新規方法に対するニーズが存在する。

６７Ｊ．ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌ．７５７（２０００）２７３Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１１４４（１９９８）１６４Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４２９（２０００）１６２Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１０５（２０００）１０９Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６８１（２００２）３１Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３５（２００４）

本発明の１つの態様は、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第２の集団を、陰性の対照サンプルとともに提供し；真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシ（ｐｒｏｘｙ）の量を測定し；そして真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、ここで、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、真核細胞の第１集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的少量が、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の検出を指示する；という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を検出する方法である。

本発明のその他の態様は、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第２の集団を、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する陽性の対照サンプルとともに提供し；真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を測定し；そして真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、これによって、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、真核細胞の第１集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的少量が、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を増大させる分子の存在を指示する；という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を増大させる分子を検出する方法である。

培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第２の集団を、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する陽性の対照サンプルとともに提供し；真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を測定し；そして真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、これによって、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、真核細胞の第１集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的多量が、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を減少させる分子の存在を指示する；という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を減少させる分子を検出する方法。

本発明のその他の態様は、真核細胞の被験者からのサンプルを提供し；真核細胞のサンプルによって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を測定し；そして参照標準物に対して、すなわち、ＩＬ−１６関連障害を有しないかまたは障害に感受性でない被験者からの細胞に対して、サンプルによって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、これによって、標準物において産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、被験者サンプルによって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的多量が、ＩＬ−１６関連障害の存在または障害に対する感受性を指示する；という段階を含む、被験者におけるＩＬ−１６関連障害の存在または障害に対する感受性を診断する方法である。

発明の詳細な記述

本明細書において引用される、限定されるものではないが特許および特許出願を含む、すべての公表物は、完全な記述をとおして引用によって本明細書に組み入れられている。

本明細書および請求項において使用されるように、単数形態物「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別に明白に指示しない限り、複数引用物を含む。かくして、例えば、「ａｃｅｌｌ」に関しては、１個以上の細胞に関する引用であり、そして当業者にとって既知のその等価物を含む。

別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野における熟達者によって普通に理解されるような同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと類似または等価のすべての組成物および方法が、本発明の実行または教示において使用されてもよいが、代表的な組成物および方法が本明細書では記述される。

用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラのモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、および抗体のフラグメント、部分または変異体を含む、免疫グロブリンまたは抗体分子を意味する。抗体は、形質細胞によって構成的に発現され、そして分泌される分泌蛋白質である。また抗体は、ハイブリドーマ生成のような標準方法によるか、あるいは骨髄腫細胞のような固定化Ｂ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および動物細胞のような他の細胞類中への抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子のトランスフェクションによって、固定化された形質細胞を使用して生産することができる。

用語「生物活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、分子に対する生物系の応答を意味する。そのような生物系は、例えば、細胞、ウイルスもしくはプラスミドのような複製可能な核酸、単離された細胞の構成成分もしくは複製可能な核酸、またはこれらの１種以上を組み入れているインビトロ系であってもよい。

用語「ＣＤ４」は、配列番号：１の残基１〜４３３に対して少なくとも５０％の同一性を有し、そしてＩＬ−１６に応答性であるペプチド鎖を意味する。２種のペプチド鎖間の同一性は、ｔｈｅｄｅｆａｕｌｔｓｅｔｔｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｌｉｇｎＸｍｏｄｕｌｅｏｆＶｅｃｔｏｒＮＴＩｖ．９．０．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して、対を組ませる（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）アミノ酸配列の整列によって決定することができる。ＡｌｉｇｎＸは、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用して、対を組ませるアミノ酸配列の整列を実施する。「ＣＤ４」は、「決定抗原４のクラスター」についての頭字語である。

用語「ＣＤ９」は、配列番号：２の残基１〜２２８に対して少なくとも９０％の同一性を有し、そしてＩＬ−１６に応答性であるペプチド鎖を意味する。「ＣＤ９」は、「決定抗原９のクラスター」についての頭字語である。

用語「真核細胞」は、遺伝物質が少なくとも１つの膜境界のある核中に組織されている細胞を意味する。

用語「発現する」は、核酸によってコードされているペプチド鎖の検出可能な産生を意味する。

用語「ＩＬ−１６」は、ＣＤ４に結合でき、そしてＲＡＮＴＥＳプロキシの産生を減少させる配列番号：３のアミノ酸残基１〜１２１に対して少なくとも８０％の同一性を有するペプチド鎖を意味する。「ＩＬ−１６」は「インターロイキン１６」についての頭字語である。

用語「ＩＬ−１６関連障害」は、感染または免疫に媒介される炎症性疾患、例えば結核、肺炎、呼吸シンシチウムウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）、喘息、アトピー性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、中枢神経系関連障害、例えば多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、グレーブス病、Ｃ型肝炎ウイルス、おたふく風邪、コックスサッキー、エコーウイルス、インフルエンザ、Ｅ．コリ感染、リステリア、髄膜炎、エプスタイン・バールウイルス、ならびに関連するメカニズムおよび／またはＩＬ−１６の上方調節もしくはＩＬ−１６活性の増大を特徴とする疾病および障害を意味する。

用語「ペプチド鎖」は、鎖を形成するようにペプチド結合によって連結された少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個以上のアミノ酸の大ペプチド鎖は、「ポリペプチド」または「タンパク質」として言及されてもよい。５０個未満のアミノ酸の小ペプチド鎖は、「ペプチド」として言及されてもよい。

用語「ＨｕＴ−７８細胞」は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡからのＡＴＣＣ^（Ｒ）ナンバー：ＴＩＢ−１６１^ＴＭをもつ細胞またはこれらに由来する細胞を意味する。

用語「ＴＨＰ−１細胞」は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡからのＡＴＣＣ^（Ｒ）ナンバー：ＴＩＢ−２０２^ＴＭをもつ細胞またはこれらに由来する細胞を意味する。

用語「集団」は２個の細胞のような少なくとも２個のアイテムを意味する。

用語「ＲＡＮＴＥＳプロキシ（ｐｒｏｘｙ）」はまたＣＣＬ５とも言及され、配列番号：４のアミノ酸残基１〜６８に対して少なくとも７５％の同一性をもつペプチド鎖、配列番号：４のアミノ酸残基１〜６８に対して少なくとも７５％の同一性をもつペプチド鎖をコードしている核酸、配列番号：４をコードしているネイティブ遺伝子の調節領域を活性化することによって発現されるペプチド鎖、あるいは配列番号：４をコードしているネイティブ遺伝子の調節領域を活性化することによって転写される核酸を意味する。２種のペプチド鎖間の同一性は、ｔｈｅｄｅｆａｕｌｔｓｅｔｔｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｌｉｇｎＸｍｏｄｕｌｅｏｆＶｅｃｔｏｒＮＴＩｖ．９．０．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して、対を組ませる（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）アミノ酸配列の整列によって決定することができる。ＡｌｉｇｎＸは、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用して、対を組ませるアミノ酸配列の整列を実施する。「ＲＡＮＴＥＳ」は、「ｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｐｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌＴ−ｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄｐｒｅｓｕｍａｂｌｙｓｅｃｒｅｔｅｄ（活性化に基づいて調節され、正常Ｔ細胞で発現され、そして多分、分泌される）」についての頭字語である。

用語「応答性」は、刺激に反応して検出可能なシグナルを生じることができることを意味する。

本発明の１つの態様は、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を第１の試験サンプルとともに提供し；培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第２の集団を陰性対照サンプルとともに提供し；真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を測定し；そして真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、これによって、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、真核細胞の第１集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的少
量が、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の検出を指示する；という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を検出する方法（これが、ＩＬ−１６関連障害の存在または障害に対する感受性を指示してもよい）である。

ＩＬ−１６生物活性における変化を指示するＲＡＮＴＥＳプロキシの変化の大きさは、統計学的に有意である大きさ、例えば、少なくとも約１．５倍、例えば２倍、３倍およびより大きい量である。

本発明の方法において有用な真核細胞は接着していても、また懸濁液において存在してもよい。これらの真核細胞は、血清を含有するか、または血清を含有しない細胞の増殖または維持のために適当な培地によって囲まれていてもよい。本発明の方法において有用な真核細胞は、ＩＬ−１６に対して応答性である。ＩＬ−１６応答性細胞は、ＩＬ−１６刺激に対して、ＩＬ−１６起源への走化性、ＩＬ−１ｂ発現の増大、ＩＬ−６の増加、ＩＬ−１５発現の増大、またはＲＡＮＴＥＳ産生の減少によって応答し、そしてまたこれらを基礎にして同定することができる。ＩＬ−１６に応答性である細胞は、典型的には、ＣＤ４、ＣＤ９または両ＣＤ４とＣＤ９を発現し、そしてまたこれを基礎にして同定することができる。試験サンプルおよび陰性対照サンプルは、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の維持に適合し、そして本発明の方法において使用される真核細胞に適合する担体を含んでもよい。リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）はそのような担体の１つの例であり、当業者は他のものも認識できる。理想的には、陰性対照サンプルは検出可能なＩＬ−１６生物活性を含有しないことが知られている。

ＲＡＮＴＥＳプロキシの産生は、種々の異なる方法において測定されてもよい。例えば、ＲＡＮＴＥＳプロキシがペプチド鎖である場合は、生産は、ＲＡＮＴＥＳプロキシペプチド鎖を特異的に検出するＲＡＮＴＥＳプロキシ発現アッセイによって測定することができる。そのようなアッセイは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＡＮＴＥＳプロキシ特異的酵素アッセイ、例えばルシフェラーゼアッセイ、またはＲＡＮＴＥＳプロキシ特異的抗体連結ビーズアッセイを含んでもよい。そのようなＲＡＮＴＥＳプロキシペプチド鎖は、配列番号：４のＲＡＮＴＥＳペプチド鎖、または配列番号：４をコードしているネイティブ遺伝子の調節領域の制御下の核酸配列によってコードされたペプチド鎖であってもよい。配列番号：４をコードしているネイティブ遺伝子の調節領域の制御下の核酸配列によってコードされたペプチド鎖は、例えば、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光蛋白質のような容易に検出されるペプチドであってもよい。当業者は、本発明の方法における使用のために適当な他の容易に検出されるペプチドを認識できる。あるいはまた、ＲＡＮＴＥＳプロキシがＲＮＡである場合は、その生産は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、または特異的なＲＮＡ転写物を検出するために当業者によって周知の他の技術によって測定することができる。

核酸配列は、この調節領域を核酸配列に対して操作可能に結合することによって、配列番号：４をコードしているネイティブ遺伝子の調節領域の制御下に位置されてもよい。そのような操作可能な結合は、染色体外核酸、例えばプラスミドに関連して生成されてもよく、これは、ペプチド鎖またはＲＮＡをコードしている染色体外リポーター構築物として使用できる。そのような染色体外構築物は、また、当該技術分野において周知のトランスフェクション技術を使用する無作為の組み換え事象によって染色体ＤＮＡ中に導入されてもよい。あるいはまた、そのような操作可能な結合は、染色体ＤＮＡのような染色体核酸に関連して生成されてもよい。配列番号：４をコードしているネイティブ遺伝子は、染色体核酸に関連して操作可能な結合の１例である。しかしながら、当業者が認識できるように、部位特異的組み換え技術が、染色体ＤＮＡに存在するネイティブ遺伝子の調節領域に異種遺伝子を操作可能に結合させるために使用することができる。そのような染色体核酸によってコードされた得られるペプチド鎖またはＲＮＡは、次いで、ＲＡＮＴＥＳプロキ
シとして機能できる。

本方法の１つの実施態様では、真核細胞はＣＤ４ペプチド鎖またはＣＤ９ペプチド鎖を発現する。ＣＤ４またはＣＤ９ペプチド鎖は、構成的または誘導的に発現されてもよく、そしてネイティブ遺伝子またはｃＤＮＡのような異種核酸によってコードされてもよい。そのようなｃＤＮＡは、例えば、配列番号：１または配列番号：２のペプチド鎖をコードしていてもよい。

本方法のその他の実施態様では、真核細胞は、末梢血単核細胞、ＨｕＴ−７８細胞およびＴＨＰ−１細胞からなる群から選ばれる。これらの真核細胞は、血清を含有するか、または血清を含有しない細胞の増殖または維持のために適当な培地によって囲まれていてもよい。

本方法のその他の実施態様では、第１の試験サンプルの提供は、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌである、真核細胞の第１の集団を囲んでいる培地における最終ＩＬ−１６濃度を生じる。本明細書に記述されるＩＬ−１６アッセイ方法は、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１６の濃度において真核細胞を囲んでいる培地中に存在するＩＬ−１６生物活性を検出することができる。しかしながら、また本発明の方法は、この範囲外にあるサンプル中のＩＬ−１６のより高い濃度およびより低い濃度を検出するためにも適当である。

本方法のその他の実施態様では、ＲＡＮＴＥＳプロキシは培地中に分泌される。配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるペプチド鎖は、培地中に分泌されるＲＡＮＴＥＳプロキシの例である。また、そのようなＲＡＮＴＥＳプロキシは、ＲＡＮＴＥＳプロキシペプチド鎖に融合された分泌性シグナル配列を含んでなる融合ペプチド鎖を発現することによって生成されてもよい。１つのそのような分泌性シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）分泌性シグナル配列（配列番号：５）である。当業者は、他の適当な分泌性シグナル配列を認識できる。

本発明のその他の態様は、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第２の集団を、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する陽性の対照サンプルとともに提供し；真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を測定し；そして真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、これによって、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、真核細胞の第１集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的少量が、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を増大させる分子の存在を指示する；という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を増大させる分子を検出する方法である。本発明のこの方法は、ＩＬ−１６生物活性を活性化する薬物のような分子を検出または同定するために使用されてもよい。そのような分子はいかなるメカニズムによってＩＬ−１６生物活性を活性化してもよい。

陽性対照サンプルは、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の維持に適合し、そして本発明の方法において使用される真核細胞に適合する担体を含んでもよい。リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）はそのような担体の１つの例であり、当業者は他のものも認識できる。陽性対照サンプルは検出可能なＩＬ−１６生物活性を含有することが知られている。

本方法の１つの実施態様では、真核細胞はＣＤ４ペプチド鎖またはＣＤ９ペプチド鎖を発現する。

本方法のその他の実施態様では、真核細胞は、末梢血単核細胞、ＨｕＴ−７８細胞およびＴＨＰ−１細胞からなる群から選ばれる。

本方法のその他の実施態様では、第１の試験サンプルは抗体分子を含む。

本方法のその他の実施態様では、ＲＡＮＴＥＳプロキシは培地中に分泌される。

本発明のその他の態様は、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第２の集団を、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する陽性の対照サンプルとともに提供し；真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を測定し；そして真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの量を比較し、これによって、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシレベルに較べて、真核細胞の第１集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシの比較的多量が、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を減少させる分子の存在を指示する；という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を減少させる分子を検出する方法である。本発明のこの方法は、ＩＬ−１６生物活性を抑制する薬物のような分子を検出または同定するために使用されてもよい。そのような分子はいかなるメカニズムによってＩＬ−１６生物活性を抑制してもよい。

ＩＬ−１６生物活性が、対照に較べて末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＲＡＮＴＥＳサイトカインの分泌を減少させることを示すグラフである。ＩＬ−１６生物活性が、対照に較べてＨｕＴ−７８細胞によるＲＡＮＴＥＳサイトカインの分泌を減少させることを示すグラフである。ＩＬ−１６生物活性のインヒビターが、対照に較べてＰＭＢＣによるＲＡＮＴＥＳサイトカインの分泌を増大させることを示すグラフである。

本発明は次の実施例に関してさらに記述される。これらの実施例は本発明の態様を単に具体的に説明するためにあり、そして本発明を限定することを意図するものではない。

例１
ＲＡＮＴＥＳレベルの減少に基づく、ＩＬ−１６活性およびＩＬ−１６活性の正または負の調節を検出するためのアッセイ法
試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の存在は、ＩＬ−１６応答性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または真核細胞系によって分泌されるＲＡＮＴＥＳ走化性サイトカインのレベルを、生物活性のあるＩＬ−１６を含有するサンプルに曝露されなかった陰性対照細胞に較べて減少させる（図１および２）。未知の分子を含有する試験サンプルを受けているＰＢＭＣ（図１）またはＩＬ−１６応答性真核ＨｕＴ−７８細胞（図２）によるＲＡＮＴＥＳサイトカイン分泌の減少されたレベルの検出が、試験サンプルにおける生物活性のあるＩＬ−１６の存在についてアッセイするために使用することができる。またこのアッセイ法は、２種の異なる試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の増大または減少を検出するために使用することができる（図１および２）。

ヒトＰＢＭＣは、標準方法を使用して血清を含有しないＡＩＭ−Ｖ^（Ｒ）細胞培養培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において分離され、そして維持された（参照、例えば、７４（４）Ｂｌｏｏｄ．１３４８（１９８９））。ＣＤ４（決定抗原４のクラスター）を発現し、そしてＩＬ−１６活性に応答する固定化真核ＨｕＴ−７８ヒトリンパ芽球細胞（ＡＴＣＣ^（Ｒ）ナンバー：ＴＩＢ−１６１^ＴＭ；ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｄ−ＭＥＭ；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２０％ｖ／ｖの胎児ウシ血清（ＦＢＳ；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する細胞培養培地において標準真核細胞培養技術を使用して維持された。

試験サンプル中のＩＬ−１６生物活性は、分離されたＰＢＭＣ（図１）またはＨｕＴ−７８細胞（図２）のいずれかを使用してアッセイされた。最初に、ほぼ５００，０００個
のＰＢＭＣまたはＨｕＴ−７８細胞が、ＰＢＭＣ（図１）またはＨｕＴ−７８細胞（図２）のいずれかの維持のために適当な細胞培養培地（ＡＩＭ−ＶまたはＤ−ＭＥＭ）を含有する９６穴組織培養プレートのウエル中に入れられた。第２に、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）媒質中に生物活性のある、組み換えホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）ＩＬ−１６（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する試験サンプルが、細胞を囲んでいる培地中の生物活性ＩＬ−１６の最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌになるように各組織培養ウエルに添加された（図１および図２）。陰性対照ＰＢＭＣまたは陰性対照ＨｕＴ−７８細胞は、培養ウエルに添加されるＩＬ−１６を含有する試験サンプルを有せず、代わりに、ＰＢＳ媒質のみを含有する陰性対照サンプルが、これらの細胞を囲んでいる媒質に添加された（図１および図２）。第３に、生物活性ＩＬ−１６を含有する試験サンプルを受けている細胞と陰性対照細胞は、次いで別々に、標準の真核細胞培養条件下で３７℃において６時間インキュベートされた。第４に、試験サンプルを受けている細胞または陰性対照細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルが、製造者によって指示されるようにＲＡＮＴＥＳ特異的Ｌｕｍｉｎｅｘ^（Ｒ）アッセイを使用して測定された。第５に、試験サンプルを受けた細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルが、陰性対照細胞を囲んでいる培地中のＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルと比較された。陰性対照細胞に較べて試験サンプルを受けている細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳレベルの減少は、生物活性ＩＬ−１６を含有する試験サンプルの指示であった（図１および図２）。最後に、生物活性ＩＬ−１６を含有する第１の試験サンプルを受けている細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルが、生物活性ＩＬ−１６の異なる量を含有する第２の試験サンプルを受けた細胞を囲んでいる培地中のＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルと比較された。最高量のＩＬ−１６生物活性を含有する試験サンプルは、このサンプルが、細胞を囲んでいる培地中に最低レベルの分泌ＲＡＮＴＥＳを含有するので、この比較によって同定することができる（図１および図２）。最低量のＩＬ−１６生物活性を含有する試験サンプルは、このサンプルが、細胞を囲んでいる培地中に最高レベルの分泌ＲＡＮＴＥＳを含有するので、この比較によって同定することができる（図１および図２）。

これらの結果は、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する試験サンプルに曝露されたＩＬ−１６応答性細胞によるＲＡＮＴＥＳの分泌が、試験サンプルを受けなかった陰性対照細胞に較べて減少される細胞に基づくアッセイ方法によって、サンプルにおけるＩＬ−１６活性が検出できることを例証している。

また、これらの結果は、前記ＩＬ−１６生物活性のアッセイが、増大または減少されたＩＬ−１６活性を含有する試験サンプルを同定するために使用することができることを例証している。結論として、前記アッセイは、サンプルにおけるＩＬ−１６活性を増大または減少させる分子の検出または同定のために適当である。そのような分子は、ＩＬ−１６活性を増大させる分子であるかもしれず、あるいは単に、サンプルに添加された生物活性のあるＩＬ−１６のさらなる分子であるかもしれない。あるいはまた、そのような分子はＩＬ−１６活性を減少させる薬物であるかもしれない。結論として、ここに記述されたアッセイは、試験サンプルにおけるＩＬ−１６活性の正または負の調節を検出することができ、そしてＩＬ−１６の生物活性を調節する分子、例えば薬物を検出または同定するために使用することができる。

星印は、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を使用してｐ＜０．０５における陰性対照に対する統計学的有意差を示している（図１および図２）。

例２
ＲＡＮＴＥＳレベルの減少に基づくＩＬ−１６活性を調節する分子を検出するためのア
ッセイ法
前記実施例１に記述されたアッセイ法は、ＩＬ−１６活性を調節する試験サンプル中の分子（例えば、薬物）の検出または同定を可能にするために改変されてもよい。そのような分子は、例えば、ＩＬ−１６活性のインヒビターであってもよい。図３に示されるように、ＩＬ−１６生物活性のインヒビターを含有する試験サンプルを受けているＰＢＭＣによるＲＡＮＴＥＳサイトカインの分泌は、ＩＬ−１６のみを含有する試験サンプルを受けている陽性対照細胞に較べて増大される。結論として、ここに記述される改変アッセイ法は、ＩＬ−１６生物活性を調節する分子を検出または同定するために使用することができる。

ＩＬ−１６活性を調節する分子を検出または同定するためのアッセイ法は、次のように実施される。最初に、ほぼ５００，０００個のＰＢＭＣ細胞が、ＡＩＭ−Ｖ細胞培養培地を含有する９６穴組織培養プレートのウエル中に入れられた。ＰＢＭＣ細胞は前記実施例１に記述されたように得られ、そして維持された。第２に、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）媒質中に生物活性のある、組み換えホモ・サピエンスＩＬ−１６（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびインビトロでＩＬ−１６生物活性を抑制する抗体を含有する試験サンプルが、各組織培養ウエルに添加された。図３に指示されるように、ＩＬ−１６は、細胞を囲んでいる培地中の生物活性ＩＬ−１６の最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌのいずれかになるように添加された。抗ヒトＩＬ−１６抗体は、ＩＬ−１６生物活性を抑制するマウスのモノクローナル抗体であった。陰性対照ＰＢＭＣ細胞は、培養ウエルに添加されたＩＬ−１６を有せず、代わりに、ＰＢＳ媒質のみまたは抑制性抗ＩＬ−１６ｍＡｂを含有する陰性対照サンプルが、これらの細胞を囲んでいる培地に図３に指示される濃度において添加された。陽性対照ＰＢＭＣ細胞は、細胞を囲んでいる培地中の生物活性ＩＬ−１６の最終濃度が図３に指示されるように１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌのいずれかになるように、生物活性ＩＬ−１６のみを受けた。第３に、試験サンプルを受けている細胞、陰性対照ＰＢＭＣ細胞および陽性対照ＰＢＭＣ細胞は、次いで別々に、標準の真核細胞培養条件下で３７℃において６時間インキュベートされた。第４に、試験サンプルを受けている細胞、陰性対照細胞または陽性対照細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルが、製造者によって指示されるようにＲＡＮＴＥＳ特異的Ｌｕｍｉｎｅｘ^（Ｒ）アッセイを使用して測定された。第５に、生物活性ＩＬ−１６および抑制性抗ＩＬ−１６ｍＡｂを含有する試験サンプルを受けた細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルが、生物活性ＩＬ−１６のみを受けている陽性対照細胞を囲んでいる培地中のＲＡＮＴＥＳサイトカインレベルに比較された。陽性対照細胞に較べて試験サンプルを受けている細胞を囲んでいる培地中の分泌されたＲＡＮＴＥＳレベルの増大は、生物活性ＩＬ−１６のインヒビターを含有する試験サンプルの指示であった（図３）。

これらの結果は、前記ＩＬ−１６生物活性のアッセイが、試験サンプルにおけるＩＬ−１６活性を調節する分子を検出または同定するために使用できることを例証している。そのような分子はＩＬ−１６活性を抑制する薬物か、あるいはまた、ＩＬ−１６活性を増大させる薬物であるかもしれない。

誤差バーは平均からの標準偏差を表す（図３）。

本発明は、ここに、完全に記述されたが、多くの変更および修飾が、付随される請求項の精神または範囲から逸脱することなく、それに対して作成できることは、当業者にとって明らかであろう。

Claims

ａ）培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；
ｂ）ａ）と同じ型の真核細胞であり、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する、第２の集団を、陰性の対照サンプルとともに提供し；
ｃ）真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質の量を測定し；そして
ｄ）真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質の量を比較し、ここで、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質レベルに較べて、真核細胞の第１集団によってより少ない量のＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質が産生されることが、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性の検出を示す；
という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を検出する方法であって、
該真核細胞が、末梢血単核細胞またはＨｕＴ−７８細胞である、上記方法。
真核細胞がＣＤ４ペプチド鎖またはＣＤ９ペプチド鎖を発現する、請求項１の方法。
第１の試験サンプルの提供が、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌである、真核細胞の第１の集団を囲んでいる培地における最終ＩＬ−１６濃度を生じる、請求項１の方法。
ＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質が培地中に分泌される、請求項１の方法。
第２の集団に較べて第１の集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質のより少ない量が、少なくとも１．５倍減少である、請求項１の方法。
ａ）培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；
ｂ）ａ）と同じ型の真核細胞であり、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する、第２の集団を、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する陽性の対照サンプルとともに提供し；
ｃ）真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質の量を測定し；そして
ｄ）真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質の量を比較し、ここで、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質レベルに較べて、真核細胞の第１集団によってより少ない量のＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質が産生されることが、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を増大させる分子の存在を示す；
という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を増大させる分子を検出する方法であって、
該真核細胞が、末梢血単核細胞またはＨｕＴ−７８細胞である、上記方法。
真核細胞がＣＤ４ペプチド鎖またはＣＤ９ペプチド鎖を発現する、請求項６の方法。
第１の試験サンプルが抗体分子を含む、請求項６の方法。
ＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質が培地中に分泌される、請求項６の方法。
第２の集団に較べて第１の集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質のより少ない量が、少なくとも１．５倍減少である、請求項６の方法。
ａ）培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する真核細胞の第１の集団を、第１の試験サンプルとともに提供し；
ｂ）ａ）と同じ型の真核細胞であり、培地によって囲まれ、そしてＩＬ−１６生物活性に応答する、第２の集団を、生物活性のあるＩＬ−１６を含有する陽性の対照サンプルとともに提供し；
ｃ）真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質の量を測定し；そして
ｄ）真核細胞の第１および第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質の量を比較し、ここで、真核細胞の第２集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質レベルに較べて、真核細胞の第１集団によってより多い量のＲＡＮＴＥＳプロキシタンパク質が産生されることが、試験サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を減少させる分子の存在を示す；
という段階を含む、サンプルにおけるＩＬ−１６生物活性を減少させる分子を検出する方法であって、
該真核細胞が、末梢血単核細胞またはＨｕＴ−７８細胞である、上記方法。
真核細胞がＣＤ４ペプチド鎖またはＣＤ９ペプチド鎖を発現する、請求項１１の方法。
第１の試験サンプルが抗体分子を含む、請求項１１の方法。
ＲＡＮＴＥＳプロキシが培地中に分泌される、請求項１１の方法。
第２の集団に較べて第１の集団によって産生されたＲＡＮＴＥＳプロキシのより多い量が、少なくとも１．５倍増大である、請求項１１の方法。