JP5257073B2 - ソフト型抗コリン作動性エステル - Google Patents

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Description

本発明は、新規なソフト型抗コリン作動薬、それを含有する薬剤組成物、その製造方法、および特に気道の閉塞性疾患の治療または過活動膀胱の治療のための抗コリン作動性反応を引き出す方法を提供する。
さまざまな抗コリン作動性化合物がこれまでに記載されてきたが、それらは最適ではない。
ムスカリン受容体拮抗薬は、アセチルコリンの作用を、平滑筋、心筋、および腺細胞上での、ならびに末梢ガングリオン（神経節）および中枢神経系（ＣＮＳ）での神経交換器部位におけるムスカリン性コリン作動性受容体へのその結合を妨害することによって阻害する、しばしば使用される治療薬である。しかし、口の乾き、まぶしがり、視力障害（目のかすみ）、排尿躊躇および尿貯留、発汗低下、眠気、めまい、情動不安、刺激過敏、失見当識、幻覚、頻脈および心臓不整脈、悪心、便秘、および重症のアレルギー反応を含むことのあるそれらの副作用のために、その臨床使用が制限されることが多く、局所用の抗コリン作動薬ですら同様の望ましくない副作用を生ずることがある。
グリコピロレートおよびチオトロピウムは、第４級アンモニウム型抗コリン作動薬に属し、それらは血液脳関門を通過することができないので、ＣＮＳに関係する副作用は少ない。しかし、グリコピロレートは（そして、恐らくはチオトロピウムも）、尿中で主に未変化薬剤または活性代謝産物として排泄されるため、若年または老年の患者、特に尿毒症患者ではその投与は問題である。
抗コリン作動薬の治療指数を高めるために、ソフト薬（弱めの薬）の手法が、過去２０年にわたって各種の先頭化合物から出発して多くの異なる設計で応用されてきたが、なお別の新規なソフト型抗コリン作動薬が求められている。このような新規なムスカリン拮抗薬は、他の全てのソフト薬と全く同様に、投与（適用）部位においてその意図される薬理作用を発揮するが、全身循環系に入るとすばやく代謝されて、その設計通りの不活性な代謝産物になり、身体からすばやく排泄されるので、全身性副作用が低減し、治療指数が増大する。
新規なソフト型抗コリン作動薬、それを含有する薬剤組成物、その製造方法、および特に気道の閉塞性疾患の治療または過活動膀胱の治療のための抗コリン作動性反応を引き出す方法が提供される。
１つの代表的態様において、下記一般式で示される化合物が提供される。
Figure 0005257073
式中、Ｒ1およびＲ2は、どちらもフェニルであるか、またはＲ1とＲ2の一方がフェニルで、他方はシクロペンチルであり；Ｒは直鎖もしくは分岐鎖のＣ1〜Ｃ8アルキルであり；そしてＸ-は１価の負電荷を持つアニオンであり；各＊印はキラル中心を示し、該化合物は特に指定しない限り、各キラル中心においてＲ,ＳもしくはＲＳ立体異性配置を有するか、またはその混合物である。
別の代表的態様において、すぐ上の態様に述べた化合物が提供されるが、ただし、Ｒ1とＲ2の一方がフェニルで、他方がシクロペンチルである場合には、一般式(Ｉａ)のＲはメチルまたはエチルであって、一般式(Ｉａ)の化合物は、キラル中心２に関しては分割されていないか、またはＲ配置をとり、そしてキラル中心１'および３'に関しては分割されていない。
別の代表的態様において、次式で示され、式中のＲがメチルまたはエチルである化合物が提供される。
Figure 0005257073
別の代表的態様において、上記化合物の製造方法が提供される。
別の代表的態様において、上記いずれかの一般式で示される１種または２種以上の化合物と薬剤に許容されるその担体とを含む薬剤組成物；上記いずれかの一般式で示される１種または２種以上の化合物と抗炎症性コルチコステロイド、ベータミメティック剤（betamimetic agent）または抗アレルギー剤とを含む薬剤混合物 (合剤)；ならびにこれらの組成物および混合物の使用方法が提供される。
本明細書を通して、下記の定義、一般説明および例示が適用されうる。
本書に言及した特許、公開出願および科学文献は当業者の知識を確立するものである。本書で引用した文献と本明細書の具体的記載との間の不一致は、後者の方を選んで解決するものとする。同様に、技術分野で理解されている単語または語句の定義と本明細書に具体的に記述されている単語または語句の定義との間の不一致も後者の方を選んで解決するものとする。
本書において、請求項の連結句または本文のいずれにあろうと、「〜を含有する」または「〜を含む」なる語句は、オープンエンド（非制限型）の意味を有すると解釈されるべきである。即ち、これらの語句は「〜を少なくとも有する」または「〜を少なくとも含んでいる」なる語句と同義であると解釈されるべきである。方法に関して使用される場合、「〜を含む」なる語句は、その方法が少なくとも記載された工程を包含するが、追加工程をも包含しうることを意味する。組成物に関して使用される場合、「〜を含有する」または「〜を含む」なる語句は、その組成物が少なくとも記載された特色または成分を含んでいるが、追加の特色または成分も含みうることを意味する。
「〜から本質的になる」または「本質的に〜からなる」なる語句は、部分排他的意味を有する。即ち、これらの語句は、方法または組成物の本質的特徴を実質的に変化させるような工程または特色もしくは成分、例えば、本明細書に記載した組成物の所望の特性を著しく妨げるような工程または特色もしくは成分、を含むことを許さない。即ち、方法または組成物は、明記された工程または材料、ならびに本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないものに制限される。
本発明の基本的かつ新規な特色は、上記一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物、ならびにそれらの化合物と他の薬剤、特に抗炎症性ステロイド、ことにロテプレドノール・エタボネートまたはエチプレドノール・ジクロロアセテート（ジクロロ酢酸エチプレドノール）との組合わせ（混合物）、特にロテプレドノール・エタボネート（ＬＥ）の場合には、後で詳述するように、ＬＥに対する不活性代謝産物増強剤をさらに含有するもの、の提供である。
「〜から成る」および「から成る」は排他的用語であり、記載された工程または特色もしくは成分しか含むことを許さない。
本明細書で用いた単数形での記載は、記載内容が明らかにそうではないことを意味する場合を除いて、それが言及する用語の複数形も包含する。
「約」なる用語は、ほぼ、およそ、略、または前後を意味するとして本明細書で使用される。「約」なる用語が数値範囲に関して使用される場合、それは記載された数値範囲の上下の境界を拡張することによりその範囲を緩和する。一般に、「約」または「ほぼ」なる用語を本明細書において使用した場合、数値は記載された値の上下に２０％の変動率で緩和される。
ある変数についての数値範囲の記述は、その変数がその範囲内のどの値にも等しくなりうる（どの値をもとりうる）ことを意味する。従って、本来的に離散（不連続）の変数の場合、その変数は、その数値範囲の終端点を含む範囲内の任意の整数値に等しい値をとることができる。また、本来的に連続的な変数の場合、その変数は、その数値範囲の終端点を含む範囲内の任意の実数値に等しい値をとることができる。１例として、０〜２の値であると記載された変数は、本来的に離散の変数である場合は０、１または２であることができ、本来的に連続する変数の場合には、０.０、０.１、０.０１、０.００１、または任意の他の実数であることができる。
明細書および特許請求の範囲において、単数形は、記載内容が明らかにそうではないことを意味する場合を除いて、そのものの複数形も包含する。ここで用いた「または」や「もしくは」なる語は、具体的にそうではないことが指示されていない限り、「いずれか一方」という「排他的」意味ではなく、「および／または」という「包括的」意味で使用される。
ここで用いた技術および科学用語は、特に指摘しない限り、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解する意味である。本明細書では当業者に公知の各種の方法および材料への言及がなされる。薬理学の一般原理を説明する標準的な参考文献としては、GoodmanおよびGilman著The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第10版, McGraw Hill社、ニューヨーク(2001)が挙げられる。
ここで用いた「治療」なる用語は、上記一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物を含む混合物または組成物を投与した個体において、治療しなかった個体の徴候に比べて、徴候の発現の低減、防止、阻止もしくは阻害、または徴候の抑制、緩和ならびに／または逆転が起こることを意味する。ここに説明した混合物、組成物、剤形および方法が、その後の治療法を決めるために熟練医療関係者（医師または獣医師）による連続的臨床評価と併存しながら使用すべきものであることを医療関係者は理解しよう。そのような評価は、その治療用量を増加、減少もしくは継続のいずれにするか、ならびに／または投与モードを変更するか否かを評価するのを助けたり、知らせることになる。
ここに記載した方法は、その方法の利益を享受できる任意の個体／患者に使用するためのものである。従って、「個体」ならびに「患者」、「個別体」および「温血動物」なる用語は、ヒトならびにヒト以外の個体、特に家畜動物、特に犬、猫、馬および牛、ならびに他の農場動物、動物園動物および／もしくは絶滅危惧種を包含する。
Ｘ-は１価の負電荷を持つアニオンを意味する。このアニオンは薬剤に許容される酸のアニオンである。好ましくは、Ｘ-は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩またはｐ−トルエンスルホン酸塩のイオンである。より好ましくは、Ｘ-は塩化物、臭化物、４−トルエンスルホン酸塩またはメタンスルホン酸塩イオンである。最も好ましくは、Ｘ-は臭化物イオン（臭素イオン）である。
一般式(Ｉａ) において、キラル中心２に関してＲ配置をとる化合物が特に興味を引く。
一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ) におけるＲ部分は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルもしくはｎ−オクチルまたはそれらの分岐鎖異性体でよい。
一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)の化合物において、Ｒは好ましくはＣ1〜Ｃ6直鎖アルキル基である。
一般式(Ｉａ)の化合物において、Ｒ1とＲ2の一方がフェニルで、他方がシクロペンチルである化合物が特に興味深い。
やはり興味深いのは、次式で示され、式中のＲがメチルまたはエチルである化合物である。
Figure 0005257073
一般式(Ｉａ)で示される下記の具体的化合物が特に興味深い：
(ａ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド；
(ｂ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド；
(ｃ) (２Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド；
(ｄ) (２Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｅ) (２Ｒ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｆ) (２Ｒ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｇ) (２Ｒ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｈ) (２Ｓ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｉ) (２Ｓ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｊ) (２Ｒ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｋ) (２Ｒ,１'Ｒ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｌ) (２Ｒ,１'Ｓ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｍ) (２Ｒ,１'Ｒ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｎ) (２Ｒ,１'Ｓ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｏ) (２Ｒ,１'Ｒ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(ｎ−ヘキシルオキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｐ) (２Ｒ,１'Ｓ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(ｎ−ヘキシルオキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｑ) (２Ｒ,１'Ｒ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(ｎ−ヘキシルオキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｒ) (２Ｒ,１'Ｓ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(ｎ−ヘキシルオキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド;
(ｓ) (２Ｒ,１'Ｒ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−メチル−１−(ｎ−オクチルオキシカルボニルメチル)ピロリジニウム・ブロミド;
(ｔ) (２Ｒ,１'Ｓ,３'Ｓ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−メチル−１−(ｎ−オクチルオキシカルボニルメチル)ピロリジニウム・ブロミド;
(ｕ) (２Ｒ,１'Ｒ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−メチル−１−(ｎ−オクチルオキシカルボニルメチル)ピロリジニウム・ブロミド;
(ｖ) (２Ｒ,１'Ｓ,３'Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−メチル−１−(ｎ−オクチルオキシカルボニルメチル)ピロリジニウム・ブロミド。
中でも、特に下記の化合物を挙げることができる：
(ａ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド；
(ｂ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド；
(ｃ) (２Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(メトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド；または
(ｄ) (２Ｒ) ３−(２−シクロペンチル−２−フェニル−２−ヒドロキシアセトキシ)−１−(エトキシカルボニルメチル)−１−メチルピロリジニウム・ブロミド。
一般式(Ｉｂ) において、Ｒがエチルであり、Ｘ-がＢｒ-である化合物が特に興味深い。Ｒがメチル、ｎ−ヘキシルおよびｎ−オクチルであり、Ｘ-がＢｒ-である一般式(Ｉｂ)の化合物は、Ｒ＝エチルの化合物と類似のやり方で作製することができ、やはり特に興味深い。
本発明の化合物の各種の製造方法を次に例示する。
一般的に言って、一般式(Ｉａ)で示される化合物は、一般式：
ＢｒＣＨ2ＣＯＯＲ
（式中、Ｒは上に規定した通りの意味である）で示されるブロモ酢酸エステルを、下記一般式(IIａ)
Figure 0005257073
（式中、Ｒ1およびＲ2、＊印、ならびに立体異性配置は上に規定した通りの意味である）で示される化合物と反応させ、場合により個々の立体異性体を分離して一般式(Ｉａ)で示される化合物を生じさせ、所望であれば、臭素アニオンを別のＸ-アニオン（ここで、Ｘ-は上に規定した通りの意味であるが、ただしＢｒ-以外である）に交換することにより製造することができる。
特定の１態様において、一般式(IIａ)の化合物はキラル中心２についてＲ配置をとる。
別の特定の態様において、一般式(IIａ)の化合物は、キラル中心１'またはキラル中心３'についてＲまたはＳ配置をとる。
別の態様において、この方法は、一般式(Ｉａ)で示される化合物の個々の立体異性体を、それらの生成後に、可能な程度まで分離することを含む。
特定の１態様において、上記製造方法は、次式：
Figure 0005257073
で示される化合物を、式：
ＢｒＣＨ2ＣＯＯＲ
（式中、Ｒはメチルまたはエチル）で示されるブロモ酢酸アルキルによって第四級化することにより、目的生成物を得ることを含む。
同じように、一般式(Ｉｂ)で示される化合物の製造方法について次に説明する。一般的に言って、この方法は、一般式：
ＢｒＣＨ2ＣＯＯＲ
（式中、Ｒは上に規定した通りの意味である）で示されるブロモ酢酸エステルを、下記一般式(IIｂ)
Figure 0005257073
で示される化合物と反応させ、場合により個々の立体異性体を分離して一般式(Ｉｂ)で示される化合物を生じさせ、所望であれば、臭素アニオンを別のＸ-アニオン（ここで、Ｘ-は上に規定した通りの意味であるが、ただしＢｒ-以外である）に交換することにより製造することを含む。
一般式(Ｉａ)の化合物と一般式(Ｉｂ)の化合物のどちらの場合も、上述した反応スキームにおいて、ＢｒＣＨ2ＣＯＯＲの代わりに、ＩＣＨ2ＣＯＯＲまたはＣｌＣＨ2ＣＯＯＲの使用を採用することにより、Ｘ-がＩ-またはＣｌ-である対応する化合物を得ることができる。あるいは、イオン交換カラムを用いて、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の生成物におけるＢｒ-アニオンを別のＸ-アニオンに置換することもできる。
一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物は、それらの抗コリン作用活性のために、薬剤として有用である。抗コリン作用有効量のこの種の薬剤は、アセチルコリンの作用を、神経効果器部位におけるムスカリン性コリン作動性受容体へのその結合を阻止することによって阻害する。抗コリン作動性反応を誘発する方法を必要とする患者は、抗コリン作動薬による治療に反応する症状に苦しんでいる者である。
そのような症状としては、気道の閉塞性疾患、例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患、迷走神経誘発洞性徐脈および心臓リズム異常、痙縮、例えば、胃腸管もしくは尿管の痙縮（過活動膀胱を含む）、ならびに月経障害が挙げられる。一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物はまた、短時間作用性の散瞳を誘導するために使用することができ、従って、視覚検査における目の瞳孔散大のために使用できる。一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物の他の用途としては、潰瘍の治療、ならびに過発汗（汗かき）の治療における制汗剤としての局所使用が挙げられる。
一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物は、気道の閉塞性疾患の治療に特に有用である。「気道の閉塞性疾患」なる表現は、喘息のような呼吸器疾患、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ,chronic obstructive pulmonary disease）、アレルギー性鼻炎、および感染性鼻炎を包含する。
「喘息」とは、炎症（腫張）による気管支収縮（気道狭窄）および気道周囲の筋肉の引き締まりを引き起こす慢性肺疾患である。炎症はまた粘液生成量の増大を生じ、それが、長時間続くこともある咳を引き起こす。喘息は一般に、憎悪発作（exacerbations）と呼ばれる、無呼吸、喘鳴、咳、および胸の締め付けの反復発現を特徴とする。憎悪発作のひどさは、軽いものから生命を脅かすものまでに及ぶことがある。憎悪発作は、例えば、呼吸器感染症、ダスト、カビ、花粉、冷気、運動、ストレス、煙草の煙、および大気汚染物質などへの露出の結果として起こりうる。
「ＣＯＰＤ」とは慢性閉塞性肺疾患を意味し、これは必ずではないが、主に過去および現在の喫煙に関係する疾患である。それは、主に肺気腫および慢性気管支炎に付随する呼吸流の閉塞を伴う。肺気腫は、肺内部の気嚢の脆弱化と破壊による不可逆的な肺の損傷を引き起こす。慢性気管支炎は、気道の粘液と気管支の細菌感染を増大させて、気道の閉塞を生ずる炎症性疾患である。
「アレルギー性鼻炎」とは、枯草熱を含む、急性鼻炎または鼻炎を意味する。これは、花粉またはダストなどのアレルゲンにより引き起こされる。この疾患は、くしゃみ、うっ血、鼻水、ならびに鼻、喉、眼、および耳のかゆみを生ずることがある。
「感染性鼻炎」とは、感染に原因がある急性鼻炎または鼻炎を意味する。これは、感染性ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（respiratory syncytical virus）、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、またはＡ群β−溶血性連鎖球菌による上気道感染により引き起こされ、一般的には普通のかぜ（感冒）と呼ばれる疾患である。これは、くしゃみ、うっ血、鼻水、ならびに鼻、喉、眼、および耳のかゆみを生ずることがある。
一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)で示される化合物は、過活動膀胱（ＯＡＶ,overactive bladder）の治療にも特に有用である。
過活動膀胱は、米国において１７００〜２０００万人もの人々が罹患していると推定される治療可能な医学的症状である。過活動膀胱の徴候としては、排尿筋（膀胱を収縮させ、それを空にさせる膀胱の平滑筋）の過活動から生ずる、頻尿、尿意切迫、突然かつ止めることができない排尿要求による切迫性尿失禁（突発的尿漏れ）、夜間頻尿（排尿要求による夜間睡眠障害）または遺尿を挙げることができる。
神経性過活動膀胱（または神経性膀胱もしくは過敏膀胱）は、既知の神経性障害に付随する、排尿筋反射亢進と呼ばれる排尿筋の過活動の結果として起こる種類の過活動膀胱である。脳卒中、パーキンソン病、糖尿病、多発性硬化症、末梢神経障害、または脊髄損傷のような神経性障害の患者は、往々にして神経性過活動膀胱に苦しむことがある。これに対して、非神経性の過活動膀胱は、排尿筋不安定と呼ばれる排尿筋過活動の結果として起こる。排尿筋不安定は、膀胱結石、筋肉疾患、尿路感染症、または薬物副作用のような非神経性異常から生ずることがあるか、あるいは突発性（本態性）のことがある。
排尿（尿排出行為）の非常な複雑さのために、過活動膀胱を引き起こす正確なメカニズムはわかっていない。過活動膀胱は、炎症状態、ホルモンのアンバランス、および前立腺肥大を含む多様な因子から生ずる膀胱の知覚ニューロンの過敏から起こりうる。脊髄の仙骨部の圧潰損傷、または脊髄に入る個所の後根線維の損傷を引き起こす疾患のいずれかによる知覚神経線維の破壊も過活動膀胱を生ずることがある。さらに、伝達信号の断絶を引き起こす脊髄または脳幹の損傷は排尿異常を生ずることがある。従って、過活動膀胱における活動変化の媒介には、末梢と中枢の両方のメカニズムが関係している可能性がある。
過活動膀胱の現在の治療法としては、薬物治療、食事改善、排尿訓練プログラム、電気刺激、および手術がある。現在、過活動膀胱の治療に使用される主な薬剤は、抗ムスカリン薬（抗コリン作動薬の一般分類の中の一員）である。抗ムスカリン薬のオキシブチニンが過活動膀胱の治療の主要薬剤となってきた。しかし、既知の抗ムスカリン薬による治療は、効果が限定的である上、口の乾き、ドライアイ、膣乾燥、視力障害（目のかすみ）、心臓の副作用（動悸および不整脈など）、嗜眠、尿貯留、体重増加、高血圧および便秘といった副作用があるという問題を抱え、それらの副作用に一部の患者は耐えることが難しいことが判明している。従って、新たな抗コリン作動薬の必要性は明らかである。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)で示される化合物は、単独で使用してもよく、あるいは本発明に係る一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)で示される別の活性物質と併用してもよい。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)で示される化合物は、場合により、他の薬理学的に活性な物質と併用することもできる。そのような物質としては、特に、ベータミメティック剤、抗アレルギー剤、およびコルチコステロイド (「抗炎症性ステロイド」、「抗炎症性コルチコステロイド」または単に「ステロイド剤」とも呼ばれる) ならびにこれらの活性物質の混合物が挙げられる。ベータミメティック剤、抗アレルギー剤またはコルチコステロイドとの併用 (混合物、組み合わせ) は、気道の閉塞性疾患、特にＣＰＯＤまたは喘息の治療に重要である。従って、そのような併用薬剤は、粉末剤 (散剤) またはエアゾール剤として経口吸入により投与することが意図される。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と組み合わせて使用してもよいベータミメティック剤の例としては、下記よりなる群から選ばれる化合物を挙げることができる：バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、フェノテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、イブテロール、ピルブテロール、プロカテロール、レプロテロール、サルメテロール、スルフフォンテロール、テルブタリン、ツロブテロール、4-ヒドロキシ−７−[２−{[２−{[３−(２−フェニルエトキシ)プロピル]スルホニル}エチル]アミノ}エチル]−２(３Ｈ)−ベンゾチアゾロン、１−(２−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル)−２−[４−(１−ベンズイミダゾリル)−２−メチル−２−ブチルアミノ]エタノール、１−[３−(４−メトキシベンジルアミノ)−４−ヒドロキシフェニル]−２−[４−(１−ベンズイミダゾリル)−２−メチル−２−ブチルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−[３−(４−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノフェニル)−２−メチル−２−プロピルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−[３−(４−メトキシフェニル)−２−メチル−２−プロピルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−[３−(４−ｎ−ブチルオキシフェニル)−２−メチル−２−プロピルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−{４−[３−(４−メトキシフェニル)−１,２,４−トリアゾール−３−イル]−２−メチル−２−ブチルアミノ}エタノール、５−ヒドロキシ−８−(１−ヒドロキシ−２−イソプロピルアミノブチル)−２Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−３−(４Ｈ)−オン、１−(４−アミノ−３−クロロ−５−トリフルオロメチルフェニル)−２−tert−ブチルアミノ)エタノール、および１−(４−エトキシカルボニルアミノ−３−シアノ−５−フルオロフェニル)−２−tert−ブチルアミノ)エタノール。これらは場合によりそれらのラセミ体、それらの鏡像異性体、それらのジアステレオマー、ならびに場合によりそれらの薬理学的に許容される酸付加塩および水和物の形態であってもよい。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と組み合わせるベータミメティック剤としては、フェンテロール、フォルモテロール、サルメテロール、１−[３−(４−メトキシベンジルアミノ)−４−ヒドロキシフェニル]−２−[４−(１−ベンズイミダゾリル)−２−メチル−２−ブチルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−[３−(４−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノフェニル)−２−メチル−２−プロピルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−[３−(４−メトキシフェニル)−２−メチル−２−プロピルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−[３−(４−ｎ−ブチルオキシフェニル)−２−メチル−２−プロピルアミノ]エタノール、１−[２Ｈ−５−ヒドロキシ−３−オキソ−４Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−８−イル]−２−{４−[３−(４−メトキシフェニル)−１,２,４−トリアゾール−３−イル]−２−メチル−２−ブチルアミノ}エタノールから選んだこの種の活性物質を使用することが特に好ましい。これらは場合により、それらのラセミ体、それらの鏡像異性体、それらのジアステレオマー、ならびに場合によりそれらの薬理学的に許容される酸付加塩および水和物の形態であってもよい。上述したベータミメティック剤の中でも、フォルモテロールおよびサルメテロール (これらは場合によりそれらのラセミ体、それらの鏡像異性体、それらのジアステレオマー、ならびに場合によりそれらの薬理学的に許容される酸付加塩および水和物の形態であってもよい) が特に重要である。
ベータミメティック剤の酸付加塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩およびキシナホ酸塩の中から選ばれたものが本発明において好ましい。サルメテロールの場合、塩酸塩、硫酸塩およびキシナホ酸塩の中から選ばれた塩が特に好ましく、ことに硫酸塩およびキシナホ酸塩が好ましい。フォルモテロールの場合は、塩酸塩、硫酸塩およびフマル酸塩の中から選ばれた塩が特に好ましく、ことに塩酸塩およびフマル酸塩が好ましい。著しく重要であるのは、フマル酸フォルモテロールである。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と場合により併用しうるコルチコステロイドとしては、フルニソリド、ベクロメタゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、フルチカゾン、モメタゾン、シクレソニド、ロフレポニド、GW 215864、KSR 592、ST-126、ロテプレドノール・エタボネート、エチプレドノール・ジクロロアセテート、およびデキサメタゾンの中から選ばれた化合物が挙げられる。好ましいコルチコステロイドは、フルニソリド、ベクロメタゾン、トリアムシノロン、ロテプレドノール・エタボネート、エチプレドノール・ジクロロアセテート、ブデソニド、フルチカゾン、モメタゾン、シクレソニド、およびデキサメタゾンの中から選ばれた化合物であるが、ブデソニド、フルチカゾン、ロテプレドノール・エタボネート、エチプレドノール・ジクロロアセテート、モメタゾン、およびシクレソニドが、ことにブデソニド、フルチカゾン、ロテプレドノール・エタボネートおよびエチプレドノール・ジクロロアセテートが特に重要である。
本書におけるステロイド剤の言及は、それらのステロイド剤から形成しうる塩または誘導体の言及をも包含する。可能な塩または誘導体としては次のものが挙げられる：ナトリウム塩、スルホ安息香酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、リン酸二水素塩、パルミチン酸塩、ピバル酸塩、またはフロ酸（フランカルボン酸）塩。コルチコステロイドも場合によりその水和物の形態をとりうる。
コルチコステロイドがロテプレドノール・エタボネートである場合、それは下記よりなる群から選ばれた増強剤と組み合わせることが有利となることがある：
(a)１１β,１７α−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン−１７β−カルボン酸（コルチエン酸（cortienic acid）またはＣＡ）；
(b)１１β,１７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１,４−ジエン−３−オン−１７β−カルボン酸（Δ1-コルチエン酸またはΔ1−ＣＡ）；
(c)１１β,１７α−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン−１７β−カルボン酸メチル（コルチエン酸メチルエステルまたはＭｅＣＡ）；
(d)１１β,１７α−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン−１７β−カルボン酸エチル（コルチエン酸エチルエステルまたはＥｔＣＡ）；
(e)１１β,１７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１,４−ジエン−３−オン−１７β−カルボン酸メチル（Δ1コルチエン酸メチルエステルまたはΔ1−ＭｅＣＡ）；
(f)１１β,１７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１,４−ジエン−３−オン−１７β−カルボン酸エチル（Δ1コルチエン酸エチルエステルまたはΔ1−ＥｔＣＡ）。
ここで、ロテプレドノール・エタボネート：増強剤のモル比は約５：１〜約０.５：１の範囲内である。このような組み合わせは、WO 2005／000317 A1に詳述されている。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物との併用剤として使用しうる抗アレルギー剤の例としては、エピナスチン、セチリジン、アゼラスチン、フェキソフェナジン、レボカバスチン、ロラタジン、ミゾラスチン、ケトチフェン、エメダスチン、ジメチンデン、クレマスチン、バミピン、セクスクロロフェニラミン、フェニラミン、ドキシラミン、クロロフェノキサミン、ジメンヒドリネート、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、エバスチン、デスロラチジンおよびメクリジンが挙げられる。一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と組み合わせて使用できる好ましい抗アレルギー剤は、エピナスチン、セチリジン、アゼラスチン、フェキソフェナジン、レボカバスチン、ロラタジン、エバスチン、デスロラチジンおよびミゾラスチンの中から選ばれ、エピナスチンおよびデスロラチジンが特に好ましい。上記抗アレルギー剤の言及は、存在可能なそれらの薬理学的に許容される酸付加塩の言及も包含する。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を他の活性物質と併用する場合、ステロイド剤またはベータミメティクス剤との併用が、上述した化合物の各種カテゴリーの中で特に好ましい。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を他の活性物質と併用するか否かにかかわらず、それらは典型的には、抗コリン作用有効量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と、そのための無毒な薬剤に許容される担体とを含む薬剤組成物の形態で投与される。
薬剤に許容される担体、または希釈剤は、本技術分野では周知である。担体は投与に適した任意の不活性な材料（有機でも無機でも）でよく、例えば、水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、微結晶セルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド状二酸化ケイ素などが挙げられる。
薬剤組成物は、上述したような他の薬学的に活性な薬剤、および／または安定剤、湿潤剤、乳化剤、香料、緩衝剤、結着剤、崩壊剤、滑剤、すべり剤（glidant）、粘着防止剤、噴射剤などの慣用の添加剤も含有しうる。担体、例えば、非活性成分は、活性薬剤成分が非常に可溶性であるｐＨに調整された水（滅菌）だけでもよい。ｐＨは７またはその近傍とすることが好ましい。或いは、好ましくは、非活性担体は適当なｐＨに調整された整理食塩水でよい。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)で示される新規化合物は、任意の適当な経路で投与することができる。この化合物は、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤など、エアゾール剤、滅菌溶液剤、懸濁液剤または乳剤などといった、固体または液体形態に構成することができる。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物は、許容された薬学的手法に従って、経口、直腸、経皮、腸管外、鼻、肺（典型的には経口吸入により）、または局所（眼を含む）経路を経た投与のための組成物といった適当な剤形に構成することができる。投与経路、従って剤形は、本発明の抗コリン作動薬で治療する症状に照らして選択されよう。
実例のみを目的として、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物をＣＯＰＤもしくは喘息または他の気道の深刻な閉塞性疾患の治療のために投与する場合、この化合物を吸入またはインサフレーション（insufflation、吹送）により投与するのが有利なことがある。そのためには、化合物をエアゾール剤または吸入用散剤とすることが有利である。鼻炎などのより軽い呼吸器疾患の治療のために投与する場合には、鼻スプレー剤、ミスト剤またはゲル剤が有利であるかもしれない。散瞳を誘導するには、点眼剤などの眼科用処方組成物が最も適しているかもしれない。ＯＡＢに対しては、錠剤もしくはカプセル剤などの経口投与用の処方組成物または経皮製剤が好ましいかもしれない。過発汗の治療に対しては、制汗用スティック剤、ゲル剤、スプレー剤、クリーム剤などとして処方された局所製剤が好ましいだろう。
例示を目的として、投与量は、Atrovent Inhalation Aerosol製品（ベーリンガー・インゲルハイム社）のようなエアゾール溶液の吸入に基づいて表記される。他の吸入投与方式による投与のための投与量の調整は当業者には周知である。
一般に、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物の治療有効量または抗コリン作用有効量は、約１μｇ〜約１０００μｇ、例えば、約１０μｇ〜約１０００μｇまたは約１００μｇ〜約１０００μｇである。しかし、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の具体的化合物の厳密な投与量は、その効力、投与方式、患者の年齢および体重、ならびに治療する症状の重篤度に応じて変動しよう。日用量は、例えば、体重ｋｇ当たり約０.０１μｇ〜約１０μｇでよく、これを１回で、または複数回に分けて、それぞれ、例えば、約１μｇ〜約１０００μｇの用量で投与することができる。一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物は１日に１〜４回、例えば、１日に１回または２回、投与することができる。
吸入用の剤形はエアゾール剤とすることができる。エアゾール送出の最小量は約０.２ｍｌであり、その最大エアゾール送出量は約５ｍｌである。一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物の濃度は、送出スプレー量の全量が約０.２〜５ｍｌの範囲内の量となり、それが抗コリン作用有効量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を送出する限り、変動可能である。濃度が高くなるほど、同じ有効量を送出するのにより少ない用量とすることは当業者には周知である。
吸入用剤形は、鼻孔内スプレーによるものとすることもできる。エアゾール送出の最小量は鼻孔当たり約０.０２ｍｌであり、その最大エアゾール送出量は鼻孔当たり約０.２ｍｌである。一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物の濃度は、送出スプレー量の全量が鼻孔当たり約０.０２〜０.２ｍｌ、例えば鼻孔当たり約０.０５〜０.０８ｍｌ、の範囲内となり、それが抗コリン作用有効量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を送出する限り、変動可能である。
もちろん、抗コリン作用有効量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を送出するためのエアゾール剤または鼻孔内スプレー剤の量（容積）は、そのエアゾール剤または鼻孔内スプレー剤中の該化合物の濃度に依存する。即ち、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物の濃度が高いほど、治療有効量を送出するのに必要な投与量は少なくなり、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物の濃度が低くなると、同じ抗コリン作用有効量を送出するのにより多くの投与量を必要とする。
喘息治療用の多くのエアゾール剤をはじめとして、各種薬剤について吸入用エアゾール剤が当業者には周知である。エアゾール剤はネブライザー（噴霧吸入器）つきで製造されることもある。典型的には、ネブライザーには抗コリン作用有効量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を有効に送出するのに十分な量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と担体溶液とが充填される。例えば、ネブライザーとその動作条件に応じて、ネブライザーには、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を約１μｇ〜約１０００μｇ、例えば、約１０μｇ〜約１０００ｇまたは約５０μｇ〜約５００μｇ送出するために数百万ｍｇの抗コリン作動性化合物を充填することができる。
吸入用剤形は散剤形態とすることもできる。喘息治療用の多くの散剤をはじめとして、各種薬剤について吸入用の散剤が当業者には周知である。剤形が散剤（粉末剤）である場合、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物は純品として、または不活性担体で希釈して投与することができる。不活性担体を使用する場合、本化合物は、送出される粉末の合計量が「有効量」の本発明に係る化合物を送出するように配合される。活性化合物の実際の濃度は変動しうる。この濃度が低いと、より多量の粉末を送出しなければならなくなる。濃度が高くなるほど、有効量の本発明に係る活性化合物を供給するのに必要な送出する材料の総量が少なくてすむ。以上に述べた薬剤組成物のいずれも、１種または２種以上のの追加の活性物質、特に前述したようなコルチコステロイドおよび／またはベータミメティク剤をさらに含有しうる。
「薬剤に許容される」とは、患者にとっては薬理学的／毒物学的観点から、製薬化学者にとっては組成物、処方、安定性、患者受容性および生物学的利用能に関する物理的／化学的観点から、許容される特性および／または物質を意味する。
一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を投与するための適当な製剤は、錠剤、カプセル剤、座剤、溶液剤などを包含する。特に重要である（特に喘息もしくはＣＯＰＤまたは他の呼吸器疾患を治療する場合）のは、吸入による本化合物の投与である。薬学的に活性な化合物の割合は、全組成物の０.０５〜９０重量％、好ましくは０.１〜５０重量％である。
適当な錠剤は、例えば、活性物質を既知の賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくは乳糖など不活性希釈剤、コーンスターチもしくはアルギン酸などの崩壊剤、デンプンもしくはゼラチンのような結着剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはタルクなどの滑剤、ならびに／またはカルボニルメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースもしくはポリ酢酸ビニルなどの放出遅延剤、と混合することにより得ることができる。錠剤は複数の層を含んでいてもよい。錠剤および他の固体経口処方組成物は、ＯＡＢまたは潰瘍の治療に特に重要である。一方、眼科用溶液剤、懸濁液剤およびゲル剤は散瞳誘導用に特に重要であり、局所用ゲル剤、固形剤およびスプレー剤は制汗剤としての使用に重要である。
被覆錠剤は、錠剤と同様に製造されたコアを、錠剤コーティングに一般に使用される物質、例えば、コリドンもしくはシェラック、アラビアゴム、タルク、二酸化チタンまたは糖類、でコーティングすることによって製造することができる。遅延放出（徐放）の達成または不適合の防止のために、コアを多数の層から構成してもよい。同様に、遅延放出を達成するために、錠剤コーティングを場合により錠剤に対して上述した賦形剤を用いて、多数の層から構成してもよい。
一般式(Ｉａ)もしくは(Ｉｂ)の活性物質または上述したようにその併用剤を含有するシロップ剤またはエリキシル剤は、サッカリン、チクロ、アスパルテーム、スクラロース、グリセロールおよび糖類のような甘味料、ならびに香り増強剤、例えばバニリンおよびオレンジエキスのような香料、をさらに含有しうる。それらはまた、カルボニルメチルセルロースナトリウムのような懸濁佐剤もしくは増粘剤、例えば、脂肪アルコールとエチレンオキシドとの縮合生成物のような湿潤剤、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存剤も含有しうる。
溶液剤は常法により、例えば、等張剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存剤、またはエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩のような安定剤を添加し、場合により乳化剤および／または分散剤も使用して製造される。希釈剤として水を使用する場合には、場合により溶媒和剤または溶解助剤として有機溶媒が使用されることがある。得られた溶液剤は注射用バイアルもしくはアンプルまたは輸注用ボトルに移される。
１種もしくは２種以上の活性物質または活性物質の併用剤を含有するカプセル剤は、例えば、活性物質を乳糖またはソルビトールのような不活性担体と混合し、混合物をゼラチンカプセルに充填することにより製造されうる。適当な座剤は、例えば、中性脂肪またはポリエチレングリコールもしくはその誘導体のようなこの目的に提供される担体と混合することにより製造されうる。
使用できる賦形剤としては、例えば、水、薬剤に許容される有機溶媒、例えば、パラフィン（例、石油留分）、植物油（例、落花生油もゴマ油）、１価もしくは多価アルコール（例、エタノールもしくはグリセロール）、担体、例えば、天然鉱物粉末（例、カオリン、粘土類、タルク、白亜）、合成鉱物粉末（例、高分散ケイ酸およびケイ酸塩）、糖類（例、しょ糖、乳糖およびブドウ糖）、乳化剤（例、リグニン、亜硫酸パルプ廃液、メチルセルロース、デンプンおよびポリビニルピロリドン）、ならびに滑剤（例、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸およびラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
製剤は、通常の方法により、好ましくは喘息もしくはＣＯＰＤまたは他の呼吸器疾患の治療においては吸入により、投与される。経口投与用の錠剤は、もちろん、上述した担体とは別に、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびリン酸二カルシウムのような添加剤を、デンプン、好ましくは馬鈴薯デンプン、ゼラチンなどの各種添加剤と一緒に含有しうる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑剤も、錠剤製造過程で同時に使用してもよい。水性懸濁液剤の場合、活性物質は上述した賦形剤に加えて、各種の香り増強剤または着色剤と組み合わせてもよい。
一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)の化合物の投与量は、当然ながら投与経路および治療すべき疾病の種類に応じて大きく変動する。吸入より投与する場合、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物はμｇ範囲内の用量でも高い効力を特徴とする。一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物はμｇ範囲を超えても有効に使用することができる。例えば、投与量はグラム範囲になってもよい。特に吸入以外の方法で投与する場合には、本発明に係る化合物はより高い用量で投与してもよい（例えば、１〜１０００ｍｇの範囲内、この用量は何ら制限を意図していないが）。
上述したように、一般式(Ｉａ)および(Ｉｂ)の化合物、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と他の１種または２種以上の有効薬剤との併用剤（合剤、混合物）、ならびに一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を含み、他の１種または２種以上の有効薬剤を含むか、含んでいない組成物は、従って、抗コリン作用有効量の該化合物または組成物を必要とする患者に投与することを含む、該患者において抗コリン作動性反応を発現させる方法に有用である。
特定の１態様において、該方法は、気道の閉塞性疾患を治療するため（特に、疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息である場合）、或いは過活動膀胱を治療するためである。別の態様においては、該方法は、散瞳有効量の一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物または上述したようなそれを含む併用剤もしくは組成物をそのような処置を必要とする患者の眼に局所投与することを含む、該患者の眼に散瞳を誘導する方法である。抗コリン作動薬に反応する症状（例えば、上に開示したこれらの症状のいずれでもよい）を治療するための薬剤の製造に一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物を使用することもまた、本発明により提供される。
特定のいくつかの態様では、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物と他の有効薬剤、特に抗炎症性コルチコステロイド、ベータミメティック剤または抗アレルギー剤の１種または２種以上のとの併用剤（合剤）が提供される。このような合剤製品においては、存在する複数の有効薬剤の合計量は、目標の症状の治療、特に気道の閉塞性疾患の治療、最も特別には慢性閉塞性肺疾患または喘息の治療に有効な量である。好適態様においては、他の活性薬剤はベータミメティック剤または抗炎症性コルチコステロイドである。特に興味あるのは、一般式(Ｉａ)または(Ｉｂ)の化合物とコルチコステロイド、特にロテプレドノール・エタボネートまたはエチプレドノール・ジクロロアセテートとの合剤である。ロテプレドノール・エタボネートをコルチコステロイドとして選択する場合、その活性は、コルチエン酸もしくはΔ1−コルチエン酸またはコルチエン酸もしくはΔ1−コルチエン酸のメチルもしくはエチルエステルと約５：１〜約０.５：１のモル比で組み合わせることにより増強することができる。約１：１のモル比（これは約１：１の重量比で近似できる）が特に好都合である。
初期研究
材料および方法
・材料
グリコピロレート（臭化グリコピロニウム）は、Boehringer Ingelheim Chemicals, Inc.の好意により提供された。臭化カルバミルコリン（カルバコール）、臭化メチルアトロピン（アトロピンMeBr）、および臭化メチルスコポラミン（スコポラミンMeBr）はSigma Chemicals Co. (ミズーリ州セントルイス)から入手した。Ｎ−[3Ｈ]−メチルスコポラミン（NMS）は、Amersham Biosciences UK Limited (イギリス、バッキンガムシャー)から入手した。クローン化ヒトムスカリン受容体サブタイプＭ1−Ｍ4はApplied Cell Science Inc. (メリーランド州ロックビル)から得た。Scintiverse BDは、Fisher Scientific Co. (ペンシルバニア州ピッツバーグ)から入手した。
合成に用いた化学薬品は試薬級またはHPLC級であり、Aldrich (ウイスコンシン州ミルウォーキー)およびFisher Scientific Co.から入手した。融点はFisher-Johns融点測定装置で測定した。NMRスペクトルはBruker Advance 500 MHz NMRスペクトルメータで記録したものであって、TMSに対するppmで報告する。元素分析はAtlantic Microlab Inc. (ジョージア州アトランタ) により実施された。
合成
・ラセミ体シクロペンチルマンデル酸、(1)
臭化シクロペンチルマグネシウムのエーテル溶液 (100 ml, 2M; 0.2 mol) を、０℃で無水エチルエーテル330 ml中のベンゾイルギ酸 (15 g, 0.1 mol) に滴下した。この混合物を０℃で30分間、次に室温で24時間撹拌した。反応混合物を1N HClで処理し、水溶液をエーテルで抽出した。合わせたエーテル溶液をK2CO3溶液により処理した。炭酸カリウム溶液をHClで酸性化し、エーテルで２回抽出した。エーテル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発すると粗生成物が得られた。この粗生成物を水洗すると、純粋なラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1) (8.0 g, 36.4％)が得られた。針状結晶、融点：153-154℃。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 1.28-1.39, 1.42-1.50, 1.51-1.61, 1.63-1.72 [8H, m, (CH2)4], 2.93 [1H, p, CHC(OH)], 7.26-7.30, 7.33-7.36, 7.65-7.67(5H, m, Ph) ppm。
・シクロペンチルマンデル酸メチル、(2)
DMF (50 ml)中のラセミ体シクロペンチルマンデル酸R/S(±)-(1) (4.47 g, 20 mmol) と炭酸カリウム (7.01 g, 50 mmol) との混合物に、ヨウ化メチル (8.64 g, 60 mmol) を室温で添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した後、水に投入し、ヘキサンで３回抽出した。乾燥したヘキサン抽出液を蒸発させて粗生成物を得た。この粗生成物を1.5：1 ヘキサン：塩化メチレンを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー処理すると、純生成物(2)が得られた (3.02 g, 64％)。1H NMR(CDCl3, 300 MHz): 1.32-1.37, 1.43-1.69 [8H, m, (CH2)4], 2.90 [1H, p, CHC(OH)], 3.74(1H, s, OH), 3.77 (3H, s, CH3), 7.25-7.37, 7.63-7.65 (5H, m, Ph) ppm。
・シクロペンチルマンデル酸N-メチル-3-ピロリジニルエステル、(4)
n-ヘプタン40 ml中の化合物(2) (2.20 g, 9.4 mmol) およびN-メチル-3-ピロリジノール [(3)、1.30 g, 13 mmol] の溶液を20 mlのヘプタンが留去してしまうまで加熱した。ナトリウム約0.003 gを添加した後、蒸留を続けながら溶液を２時間加熱撹拌した。その間、反応体積を一定に保持するような割合で追加のヘプタンを添加した。１時間後には追加のナトリウムを添加した。その後、溶液を冷却し、3N HClで抽出した。酸抽出液を濃NaOHでアルカリ性にした後、エーテルで３回抽出した。乾燥したエーテル溶液を蒸発させると粗製油状物が得られた。この粗生成物を8：1 EtOAc：EtOHを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー処理すると、純生成物(4)が得られた (2.053 g, 72％)。
C18H25NO3の分析: 計算値: C, 71.26; H, 8.31; N, 4.62; 実測値: C, 71.55; H, 8.44; N, 4.68。1H NMR(CDCl3, 500 MHz): 1.27-1.35, 1.40-1.47, 1.54-1.60, 1.75-1.90 [8H, m, (CH2)4], 2.12-2.30, 2.52-2.57, 2.64-2.81 (6H, m CH2NCH2CH2), 2.33, 2.36 (3H, 2s, NCH3), 2.93 [(1H, p, CHC(OH)], 3.83 (1H, bs, OH), 5.23 (1H, m, CO2CH), 7.23-7.36, 7.64-7.67 (5H, m, Ph) ppm。
・3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(メトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、化合物(a)
乾燥アセトニトリル30 ml中の化合物(4) (0.8235 g, 2.71 mmol) に、ブロモ酢酸メチル (1.08 g, 7.06 mmol) を室温で添加した。この混合物を２時間撹拌した。アセトニトリルを蒸発させると粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化メチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル100 ml中に投入して沈殿させた。この処理を３回繰り返して、化合物(a)を純品として得た (0.9912 g, 80％)。白色粉末、融点：192-194℃。
C21H30BrNO5.の分析: 計算値: C, 55.27; H, 6.63; N, 3.07; 実測値: C, 55.11; H, 6.59; N, 3.03。1H NMR(CDCl3, 500 MHz): 1.23-1.29, 1.31-1.37, 1.41-1.47, 1.53-1.67 [8H, m, (CH2)4], 2.18-2.23, 2.73-2.80, 4.04-4.16, 4.21-4.25 (6H, m, CH2NCH2CH2), 2.85 [1H, p, CHC(OH)], 3.57 (3H, s, NCH3), 3.80 (3H, s, CO2CH3), 4.66, 4.85 (2H, 2dd, CH2CO2), 5.27 (1H, s, OH), 5.52 (1H, m, CO2CH), 7.25-7.28, 7.32-7.35, 7.57-7.59 (5H, m, Ph) ppm。
・3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、化合物(b)
乾燥アセトニトリル10 ml中の化合物(4) (0.369 g, 1.22 mmol) に、ブロモ酢酸エチル (0.377 g, 2.25 mmol) を室温で添加した。この混合物を２時間撹拌した。アセトニトリルを蒸発させると粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化エチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル50 ml中に投入して沈殿させた。この処理を３回繰り返し、化合物(b)を純品として得た (0.45 g, 79％)。白色粉末、融点：192-194℃。
C22H32BrNO5の分析: 計算値: C, 56.17; H, 6.86; N, 2.98; 実測値: C, 56.14; H, 6.89; N, 2.94。1H NMR(CDCl3, 500 MHz): 1.35(3H, t, CH 3CH2), 1.26-1.33, 1.42-1.47, 1.55-1.67 [8H, m, (CH2)4], 2.14-2.21, 2.73-2.79, 4.12-4.17, 4.22-4.29 (6H, m, CH2NCH2CH2), 2.86 [1H, p, CHC(OH)], 3.62 (3H, s, NCH3), 4.25 (2H, q, CH3CH 2), 4.67, 4.83 (2H, dd, CH2CO2), 4.91 (1H, s, OH), 5.53 (1H, m, CO2CH), 7.25-7.27, 7.32-7.34, 7.57-7.59(5H, m, Ph) ppm。
・ラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1)の分割
メタノール50 ml中の(-)-ストリキニン (6.10 g) (懸濁液) を、室温でメタノール (20 ml)中のラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1) (3.96 g) に添加した。この反応溶液を一晩静置した。析出した結晶を濾別し、熱メタノールで再び晶出させた。２回目に析出した結晶を濾取し、水酸化ナトリウム溶液で処理した。この塩基性溶液を塩化メチレンで２回抽出した後 (塩化メチレン溶液は廃棄)、塩酸で酸性化して、光学分割されたシクロペンチルマンデル酸を回収した。この分割された酸 (酢酸エチル0.1 ml中20.6 mg) に(+)-α−フェニルエチルアミン13μLを添加した。析出した沈殿をヘキサンで３回洗浄し、減圧乾燥した。この沈殿はNMRにより、光学的に純粋なシクロペンチルマンデル酸、R(-)-(1)であると同定された (1.49 g, 37.6％)。
融点：121-122℃。[α]25゜ D＝−22.5°(c＝1 g/100 ml, CHCl3)。1H NMR(CDCl3, 500 MHz): 1.28-1.39, 1.42-1.50, 1.51-1.61, 1.64-1.73 [8H, m, (CH2)4], 2.93 [1H, p, CHC(OH)], 7.25-7.28, 7.32-7.35, 7.64-7.65(5H, m, Ph) ppm。
・(-)-シクロペンチルマンデル酸メチル、R(-)-(2)
DMF (21 ml)中の(-)-シクロペンチルマンデル酸、R(-)-(1) (1.83 g, 8.3 mmol) と炭酸カリウム (2.87 g, 21 mmol) との混合物に、ヨウ化メチル (3.53 g, 25 mmol) を室温で添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した後、水に投入し、ヘキサンで３回抽出した。乾燥したヘキサン抽出液を蒸発させて粗生成物を得た。この粗生成物を1.5：1 ヘキサン：塩化メチレンを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー処理すると、純生成物R(-)-(2)が得られた (1.95 g, 100％)。
C18H18O3の分析: 計算値: C, 71.77; H, 7.74; 実測値: C, 71.88; H, 7.80。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 1.32-1.36, 1.43-1.61 [8H, m, (CH2)4], 2.90 [1H, p, CHC(OH)], 3.71 (1H, s, OH), 3.79 (3H, s, CH3), 7.25-7.28, 7.31-7.35, 7.63-7.65 (5H, m, Ph) ppm。
・(-)シクロペンチルマンデル酸N-メチル-3-ピロリジニルエステル、2R-(4)
n-ヘプタン40 ml中のR(-)-(2) (1.85 g, 7.9 mmol)およびN-メチル-3-ピロリジノール [(3)、1.05 g,10.4 mmol] の溶液を20 mlのヘプタンが留去してしまうまで加熱した。ナトリウム約0.003 gを添加した後、蒸留を続けながら溶液を２時間加熱撹拌した。その間、反応体積を一定に保持するような割合で追加のヘプタンを添加した。１時間後には追加のナトリウムを添加した。その後、溶液を冷却し、3N HClで抽出した。酸抽出液を濃NaOHでアルカリ性にした後、エーテルで３回抽出した。乾燥したエーテル溶液を蒸発させると粗製油状物が得られた。この粗生成物を8：1 EtOAc：EtOHを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー処理すると、NMR推測比が1：1の２種類のジアステレオ異性体の混合物として2R-(4)化合物が得られた (1.68 g, 70％)。
C18H25NO3×0.2H2Oの分析: 計算値: C, 70.42; H, 8.34; N, 4.5; 実測値: C, 70.60; H, 8.26; N, 4.63。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 1.28-1.37, 1.40-1.47, 1.51-1.70, 1.73-1.80, 1.83-1.90 [8H, m, (CH2)4], 2.14-2.21, 2.27-2.35, 2.36-2.42, 2.52-2.55, 2.64-2.81 (6H, m, CH2NCH2CH2), 2.33, 2.37 (3H, 2s, NCH3), 2.93 [1H, p, CHC(OH)], 3.78 (1H, bs, OH), 5.22 (1H, m CO2CH), 7.24-7.27, 7.31-7.35, 7.64-7.66 (5H, m, Ph) ppm。
・(2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(メトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、化合物(c)
乾燥アセトニトリル6 ml中の化合物2R-(4) (0.15 g, 0.49 mmol) に、ブロモ酢酸メチル (0.194 g, 1.27 mmol) を室温で添加した。この混合物を６時間撹拌した。アセトニトリルを蒸発させると粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化メチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル50 ml中に投入して沈殿させた。この処理を３回繰り返して、化合物(c)をNMR推測比で1：1：2：2の４種類のジアステレオ異性体の混合物として得た (0.1879 g, 83％)。白色粉末、融点：153-155 ℃。[α]25゜ D＝＋0.5°(c＝1 g/100 ml CHCl3)。
C21H30BrNO5×0.2H2Oの分析: 計算値: C, 54.86; H, 6.62; N, 3.05; 実測値: C, 54.75; H, 6.66; N, 3.01。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 1.30-1.37, 1.41-1.50, 1.55-1.73 [8H, m, (CH2)4], 1.93-2.00, 2.12-2.26, 2.75-2.95, 3.00-3.03, 4.30-4.50, 4.57-4.61 [7H, m, CHC(OH)およびCH2NCH2CH2], 3.09, 3.30 (1H, 2s, OH), 3.64, 3.66, 3.84, 3.95, 3.97 (3H, 5s, NCH3), 3.74, 3.77, 3.79, 3.81 (3H, 4s, CO2CH3), 4.78, 4.83; 4.90, 4.97; 5.30, 5.35; 5.37, 5.41 (2H, 4群の2dd, CH2CO2), 5.53 (1H, m, CO2CH), 7.23-7.29, 7.31-7.38, 7.56-7.60 (5H, m, Ph) ppm。
・(2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、化合物(d)
乾燥アセトニトリル10 ml中の化合物2R-(4) (0.22 g, 0.73 mmol) に、ブロモ酢酸エチル (0.21 ml, 0.316 g, 1.89 mmol) を室温で添加した。この混合物を22時間撹拌した。アセトニトリルを除去すると粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化エチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル50 ml中に投入して沈殿させた。この処理を３回繰り返して、化合物(d)をNMR推測比で1：1：2：2の４種類のジアステレオ異性体の混合物として得た (0.3085 g, 90％)。白色粉末、融点：143-145 ℃。[α]25゜ D＝＋5.6°(c＝1 g/100 ml CHCl3)。
C22H32BrNO5×0.3H2Oの分析: 計算値: C, 55.53; H, 6.91; N, 2.94; 実測値: C, 55.46; H, 6.85; N, 2.97。1H NMR (CDCl3, 500 MHz): 1.26, 1.28, 1.32, 1.35 (3H, 4t, CH 3CH2), 1.44-1.50, 1.53-1.63, 1.65-1.70 [8H, m, (CH2)4], 1.93-2.00, 2.04-2.11, 2.18-2.25, 2.76-2.96, 3.01-3.04, 4.09-4.26 [7H, m, CHC(OH)およびCH2NCH2CH2], 3.06, 3.28 (1H, 2s, OH), 3.66, 3.69, 3.81, 3.82, 3.94, 3.96 (3H, 6s, NCH3), 4.61, 4.69; 4.76, 4.85; 5.17, 5.22; 5.26, 5.30 (2H, 4組のdd, CH2CO2), 4.26-4.52 (2H, m, CH3 CH2), 5.53 (1H, m, CO2CH), 7.24-7.29, 7.31-7.38, 7.56-7.60 (5H, m, Ph) ppm。
・ｐＨプロファイル
各種ｐＨ（pH 6.00〜8.40）の標準的なリン酸緩衝液 (0.05 M) 中における本ソフト型グリコピロレート類の安定性を37℃で試験した。各化合物の4.4 mM水溶液を少しずつ緩衝液に最終濃度が0.44 mMになるまで添加した。適当な時点ごとにサンプルを採取し、HPLCで分析して、ソフト型類似物の消失とその加水分解生成物の生成とを監視した。緩衝液中の化合物消失の擬一次速度定数 (ｋ、min-1) および半減期 (ｔ1/2, min) を算出した。
・In vitro試験
In vitro生物学的媒質中でのソフト型グリコピロレート類の安定性を、ラット血液および血漿中での化合物消失の擬一次速度定数 (ｋ、min-1) および半減期 (ｔ1/2, min) を測定することにより求めた。22 mM 水溶液を少しずつ37℃の生物学的媒質に添加して0.7 mMの最終濃度に到達させた。適当な時点ごとにサンプル (0.15 ml) を採取し、アセトニトリル中の5％ジメチルスルホキシド溶液0.3 mlと混合した。この混合物を遠心分離し、上清をHPLCで分析した。実験は３回実施した。
・分析法
一般式(I)で示される化合物およびそれらの加水分解生成物の分析に用いたHPLCシステムは次の通りであった：Supelcosil LC-8カラム(25 cm×4.6mm) を、アセトニトリル (42％)とリン酸ナトリウム (10 mM)、酢酸 (0.1％)、およびトリエチルアミン (0.1％) を含有する水溶液 (58％)とからなる移動相とともに使用した。1 ml/minの流量で、保持時間は化合物(a)および(c) については6.02分、化合物(b)および(d) については7.27分、そして4.14分 (加水分解生成物) であった。10μlの注入量で検出限界は1μg/mlであった。
・受容体結合親和性
受容体結合試験は、Applied Cell Science Inc. (メリーランド州ロックビル) から得たプロトコルに従って、アッセイ緩衝液 (リン酸緩衝食塩水, PBS, Ca++またはMg++無添加、pH 7.4) 中のN-[3H]-メチルスコポラミン (NMS) により実施した。この緩衝液にはエステラーゼ阻害剤として10 mM NaF溶液を添加した。アッセイ混合物 (0.2 ml) は、20μLの希釈された膜 (受容体タンパク質、最終濃度: M1, 38μg/ml; M2, 55μg/ml; M3, 27μg/ml;およびM4, 84μg/ml) を含有していた。結合試験のためのNMSの最終濃度は0.5 nMであった。比結合は、M1およびM2については5μMアトロピンの、M3およびM4については1μMアトロピンの存在下および不存在下での[3H] NMS結合の差として定義された。インキュベーションは室温で120分間行った。アッセイは、Whatman GF/Cフィルター (0.5％ポリエチレンイミンに予備浸漬) を通した濾過で終えた。このフィルターをその後、1 mlの氷冷緩衝液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 0.9% NaCl) により６回洗浄し、バイアルに移し、シンチバース (Scintiverse) 5 mlを添加した。最終検出はPackard 31800 液体シンチレーション分析器 (Packard Instrument Inc., イリノイ州ダウナーズグローブ)で実施した。
結合実験で得られたデータは、
式： [3H] NMS 結合率(％)＝100 - [100xn/k/(1 + xn/k)]
に当てはめて、ヒル係数 (Hill coefficient)、n を求め、次いで、
式： [3H] NMS 結合率(％)＝100 - [100xn/IC50/(1 + xn/IC50)]
に当てはめて、IC50を求めた (xは、試験化合物の濃度)。ChengおよびPrusoff (Cheng & Prusoff 1973) の方法に基づいて、式： Ki ＝ IC50/(1 + L/Kd) (式中、Lは放射性リガンドの濃度) から Ki を導出した。IC50は特定の放射性リガンド結合の50％阻害を引き起こす薬剤濃度を意味し、そして、Kd は放射性リガンド／受容体複合体の解離定数を意味する。実験は３回実施した。データは、Scientistソフトウェア (MicroMath Inc., ユタ州ソルトレイクシティ) を用いて、非線形最小二乗曲線フィッティング処理によって解析した。
・ｐＡ 2 値
Harlan Sprague Dawley Inc. (インディアナ州インディアナポリス)から入手した体重約400 gの雄性モルモットを一晩絶食させた後に使用した。動物を断頭により致死させ、回腸 (盲腸より5 cm上の領域) を分離し、摘出した。回腸を2.5 cmの小片に切り、タイロード液と0.1 mM 臭化ヘキサメトニウムとの混合液30 mlを入れたオルガン浴 (organ bath、器官浴) 中に懸架した。このオルガン浴には常時酸素を通気し、37℃に保持した。回腸短冊片の一端はオルガン浴の底部の固定サポートに、他端は2〜10 g範囲で動作させた等尺力 (isometric force) トランスデューサ (TRN001型、Kent Scientific Corp., コネチカット州) にそれぞれ取り付けた。回腸短冊片は2 gの張力に保持し、カルバコールを作用薬として使用した。回腸は、カルバコールの添加 (2×10-4〜2×10-3M水溶液を10〜20μl) を継続していくと、累増的に収縮した。収縮をフィジオグラフ装置 (physiograph) (Kipp & Zonen Flarbed Recorder, オランダ) に記録した。最大反応が得られたら、回腸を３回洗浄し、適当な濃度の拮抗薬 (化合物(a)、(b)、(c)もしくは(d)、グリコピロレート、またはスコポラミン) を含有する新しいタイロード液に取り替えた。カルバコールを添加する前に、各拮抗薬に対して10分間の平衡化時間を与えた。各拮抗薬に対して４〜６回の試験を実施した。
・ソフト型グリコピロレート類の薬理活性
ソフト薬化合物(a)、(b)、(c)および(d)のウサギの眼における散瞳効果をグリコピロレートのそれと比較した。体重約3.5 kgの健康な雄性ニュージーランド白ウサギ４匹を使用した。用量−散瞳反応の関係を調べるために、100μlの各種濃度の試験化合物 (ソフト薬化合物については0、0.5、および1％、グリコピロレートについては0、0.05、0.1および0.2％) を眼に投与して、最大瞳孔散大を誘起する最低用量である薬力学的実効用量（pharmacodynamically equivalent dose）を求めた。薬剤溶液は片方の眼に投与し、対照として用いる他方の眼には水のみを投与した。実験は照明と温度が管理された室内で行った。適当な時間間隔で両眼の瞳孔径を記録した。各時点と零時点との瞳孔径の差を、処置した眼と対照の眼の両方について算出し、散瞳反応 [(処置−対照)／対照 (％)]として記録した。対照の眼の散大の監視は、全身性吸収が起こったか否かを調べるためであった。各化合物について４回の試験を実施した。動物試験は、米国国立衛生研究所 (NIH) により採択された「実験動物の管理と使用に関する指針 (Guide for the Care abd Use of Laboratory Animals)」に従って実施された。本研究の開始前とその実施中に、米国動物管理使用委員会 (IACUC) の認可を得た。
・統計解析
安定性、受容体結合、およびｐＡ2活性は、ｔ-検定とノンパラメトリック・マン-ホイットニーＵ検定 (化合物−対象対について) の両方を用いて比較した。薬理活性 (最大反応Ｒmax％と効果曲線下面積 (AUCeff) は、ANOVA検定と、それに続くターキー-クラマー(Turkey-Kramer)多重比較検定 (パラメトリックpost hoc検定 (Jones 2002) として) とを用いて比較した。ｐ＜0.05の有意レベルを全例において使用した。全ての統計解析はソフトウェア NCSS (Number Cruncher Statistical Systems, 米国、ユタ州ケイズビル<Kaysville>) を用いて実施した。
結果と考察
・合成
本発明の新規ソフト型グリコピロレート誘導体である化合物(a)および(b)、即ち、[3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(アルコキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド (アルコキシは、(a)および(b) についてそれぞれメトキシおよびエトキシ) は、第２工程の分割工程を除いて、下の図式１に示すように合成された。この図式 (スキーム) は、(i)無水エーテル中で臭化シクロペンチルマグネシウムとベンゾイルギ酸とのグリニャール反応によるラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1)の生成、(ii)室温のDMF中でヨウ化メチルおよび炭酸カリウムにより(1)をメチル化することによるシクロペンチルマンデル酸メチルエステル(2)の生成、(iii)ヘプタン中で(2)と1-メチル-3-ピロリジノール(3)とのエステル交換反応によるシクロペンチルマンデル酸 N-メチル-3-ピロリジニルエステル(4)の生成、および(iv)アセトニトリル中でブロモ酢酸アルキルにより(4)を第四級化することによる最終生成物(5) [化合物(a)または化合物(b)] の生成、を含む。これらはラセミ体ソフト型グリコピロレート誘導体であり、それらはNMRおよび元素分析により特性決定された。
ムスカリン受容体では立体特異性が重要であって、改善された抗コリン作動活性が2R立体配置のグリコピロレート型物質で得られることが知られているので、これらのソフト薬候補も、光学的に純粋なシクロペンチルマンデル酸、R(-)-(1)から出発して合成してみた。ラセミ体(1)を、酸(1)と(-)-ストリキニン (別名:ストリキニーネ) との間で生ずる塩の晶析を繰り返して分割した。この塩の水酸化ナトリウム溶液による塩基性化とその後の塩酸による酸性化とによって、光学的に純粋な遊離酸を回収した。得られた左旋性(−22.5°)の光学的に純粋な R(-)-(1)はNMRにより特性決定された。
Groverおよび共同研究者は、2000年に(S)-マンデル酸を用いた(S)-シクロペンチル-フェニルグリコキシル酸の高度に立体選択的な合成について報告し、彼らは(S)-シクロペンチル-フェニルグリコキシル酸が正の旋光を有することを見出した。従って、旋光度が[α]＝−22.5°であることが判明したR(-)-(1)は R型である。分割されたシクロペンチルマンデル酸 R(-)-(1)と(+)-α-フェニルエチルアミンとにより形成された塩のNMRは、CHC(OH)基について単一の五重線を与えたのに対し、未分割の(1)と(+)-α-フェニルエチルアミンとの塩はCHC(OH) について二つの五重線を与えた。
2R立体配置を有するソフト型グリコピロレート化合物(c)および(d)は、R(-)-シクロペンチルマンデル酸、R(-)-(1)から、図式１に示す経路によって合成され、それらについてもNMRおよび元素分析によって特性決定された。化合物(c)および化合物(d)の旋光はそれぞれ＋0.5°および＋5.6°であった。
Figure 0005257073
ラセミ体の化合物(a)および化合物(b)は対応する分割化合物である化合物(c)および化合物(d)よりずっと単純なNMRスペクトルを有していた。これらの分子は図式１に示すように合計３個のキラル中心を有している。化合物(c)および化合物(d)では、キラル中心の１つが分割されていたが、残る２つはそのままであった。従って、それらはどちらも４種類のジアステレオ異性体の混合物であり、そのことがそれらのNMRスペクトルを複雑にした。例えば、CH 3CH2のメチル基は、化合物(b)では1.35 ppmに１つの三重線しか示さなかったが (この化合物ではその基は等しくない化学環境には曝されていない)、化合物(d)ではそれぞれ1.26、1.28、1.32および1.35 ppmに４つの三重線を示した。化合物(d)は、１つの分割キラル中心と２つの未分割キラル中心とを有し、４種類のジアステレオ異性体 (RRR, RSR, RRS, RSS) の混合物である。また、化合物(b)のCH2CO2基のＡＢ系は4.67および4.83 ppmに一組の二重線−二重線シグナルを示したが、化合物(d)の同じ系は、4.61, 4.69; 4.76, 4.85; 5.17, 5.22;および 5.26, 5.30 ppmに四組の二重線−二重線シグナルを示した。
・ｐＨプロファイル
6.00〜8.40のｐＨ範囲および37℃において、本ソフト型グリコピロレート化合物の化学的加水分解は著しくｐＨ依存性であった。図１に示すように、それらは酸性条件下ではより安定であり、エチル誘導体は対応するメチル誘導体より安定であった。pH 6.0の水溶液中での化合物(a)、(c)、(b)および(d)の半減期は、それぞれ91、77、155および134時間であった。しかし、pH 8.4では、対応する半減期はそれぞれ8、7、16および12分に減少した。ｐＨプロファイルを図１に示すが、この結果は、相関係数0.997〜0.998での該化合物の塩基触媒加水分解を示している。例示として、pH 7.4での化合物(c)の消失と同時に起こる対応する酸の生成の時間プロファイルを図２に示す。
・in vitro安定性
In vitro安定性試験は、ラットの血液および血漿を用いて、親化合物消失の擬一次速度定数 (ｋ、min-1) および半減期 (ｔ1/2, min) を測定することにより実施した (表１)。37℃およびpH 7.4で、グリコピロレート類似物の加水分解は、血漿中では比較的速く、半減期は化合物(a)、(c)、(b)および(d) についてそれぞれ19.5、20、44および34分であり、血液中ではかなり遅くなった (半減期はそれぞれ57、57、97および86分；全ての化合物についてｐ＜0.05、ｔ-検定またはノンパラメトリック・マン-ホイットニーＵ検定)。このことは、血球 (血液細胞) 結合がこれらのエステル類の加水分解を遅くするのに有意に十分であることを示している。エチルエステルはメチル誘導体より安定であった (ｐ＜0.05、ｔ-検定またはノンパラメトリック・マン-ホイットニーＵ検定)。
Figure 0005257073
in vitro薬力学的評価
新たに合成されたソフト型類似物の相対的薬効を評価するため、受容体結合親和性ｐＫiおよびモルモット回腸収縮能力ｐＡ2を測定した。
・受容体結合試験
ヒトクローン化ムスカリン受容体サブタイプＭ1〜Ｍ4を使用した放射性リガンド（radioligant）結合アッセイにより求めた各化合物の受容体結合親和性を表２に示す。2R異性体である化合物(c)および(d)のｐＫi値は8.7〜9.5の範囲内であった。これは、本設計に対する先導となる公知の高活性拮抗薬、N-メチルスコポラミンおよびグリコピロレートで認められた値 (それぞれ9.2〜9.9および8.7〜9.9) よりいくらか低いが、それに近い。予想通り、ラセミ形態の化合物(a)および(b)の受容体結合親和性は、それらの対応する2R異性体より低い値を示し (Ｍ3についてｐ＜0.05レベルで有意な差、ｔ-検定およびノンパラメトリック・マン-ホイットニーＵ検定)、これらの受容体では立体特異性が重要であることが確認された。
Figure 0005257073
・ｐＡ 2 試験
モルモット回腸収縮アッセイから求めたｐＡ2値は、作用薬濃度−反応曲線における右側への２倍シフト(two-fold shift) を生ずる拮抗薬のモル濃度の負の対数を意味し、抗コリン作動性親和性 (Ｍ3ムスカリン受容体での)の古典的な機能試験である。本試験のソフト型抗コリン作動薬について、van Rossumの方法により作用薬 (刺激薬) としてカルバコールを用いて回腸の長手方向収縮から得られたｐＡ2値 (表2) は、一般に、Ｍ3受容体結合試験で得られたｐｋi値に一般に匹敵していた。やはり、2R異性体は対応するラセミ体より有意により活性であり、最も活性なソフト型類似物 [化合物(d)、ｐＡ2＝8.55±0.16] はグリコピロレート (ｐＡ2＝8.57±0.12) に似た活性を示した。
ソフト型類似物の散瞳活性
新規なソフト誘導体である化合物(a)および(b)の散瞳効果をウサギにおいてグリコピロレートのそれと比較した。散瞳反応は、薬剤投与後に適当な時間間隔で瞳孔サイズの変化率(％)として記録した。最大反応 (Ｒmax、投与から１時間後の瞳孔サイズの変化率) と反応−時間曲線下面積 (AUCeff) を表３に示す。全ての検討した処置 (表３の化合物種および濃度) の中で最大反応Ｒmaxには有意差が認められないのに対し、AUCeff の値にははっきりそれが認められる (ｐ＜0.05、ANOVAとその後のターキー-クラマー多重比較検定)。
グリコピロレート (0.1％、0.2％) は、いずれのソフト薬剤よりも有意により長く続く効果 (より大きなAUCeff) を与えた。ソフト薬剤のエチル化合物は対応するメチル類似物よりやや高い効果を示すようであり、2R異性体は異性体混合物より高い効果を示すようである。ソフト薬剤の原理に見合って、それらの作用持続時間は、図３Ａおよび図３Ｂに示すように、薬力学的に等効力の用量で比較して、「ハード」型薬剤であるグリコピロレートのそれよりずっと短い。
化合物(c)、化合物(d)、およびグリコピロレートの散瞳活性は、それぞれ24時間、＜48時間および144時間持続した。このことは、ソフト薬剤は、目的とする薬理作用が達成された後、容易に加水分解され急速に身体から排出されることを示している。これに見合って、そして他の従来型の抗コリン作動薬とは異なり、これらのソフト薬剤は反対側の (水で処置された) 眼の瞳孔の散大を誘導しなかった。このことは、全身性副作用が全くないか、非常に低いことを示している。従って、これらの化合物は安全で、望ましくない副作用が著しく低減している可能性が大である短時間作用型抗コリン作動薬の見込みがある。
Figure 0005257073
結論として、一組の新規なグリコピロレート系ソフト型抗コリン作動薬が設計、合成および試験された。それらは、グリコピロレートまたはN-メチルスコポラミンに匹敵する受容体結合親和性を有し、かつそれらのソフトな性質のために、全身性作用がないかごく最小で、良好であるが短時間持続性の散瞳活性を有する。その結果、その目的とする薬理活性を発揮した後、容易なワン・ステップ代謝により意図された代謝産物になることができる。
別の試験
目的：立体特異性がムスカリン受容体では重要であることが知られているので、グリコピロレートに基づくN-置換ソフト型抗コリン作動薬の (2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(アルコキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミドのメチルおよびエチルエステル、化合物(c)および(d)と、それらの両性イオン型代謝産物である (2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-メチル-1-カルボキシメチルピロリジニウム・内部塩の両方の異性体を合成し、それらの薬理活性をin vitroとin vivoで評価した。
方法：化合物(c)および(d)の異性体を、いずれも光学的に純粋なシクロペンチルマンデル酸メチルと3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジンとを用いて合成した。エステル交換に続いて、ブロモ酢酸アルキルで第四級化すると、窒素キラル中心が未分割のメチルまたはエチルエステルの４種類の異性体が得られた。これらの４種類の異性体を加水分解した後でHPLC分離を行うと、対応する酸の完全に分割された８種類の異性体が得られた。薬理活性を、in vitro受容体結合アッセイ、モルモット回腸ｐＡ2アッセイ、およびin vivoウサギ散瞳効果を用いて評価した。結果を、グリコピロレート、N-メチルスコポラミンおよびトロピカミドのような従来の抗コリン作動薬ならびに先に合成したラセミ体および2R異性体のそれと比較した。
結果：これらの新たに合成されたメチルおよびエチルエステル異性体のクローン化ヒトムスカリン受容体 (Ｍ1〜Ｍ4サブタイプ) での受容体結合、ｐＫi値、は6.0〜9.5の範囲内であり、両性イオン異性体では5.0〜8.6の範囲内であった。いずれの場合も、2R異性体の方が2S異性体より著しく活性が高いことが判明した (メチルエステル異性体では27〜447倍、両性異性体では6〜4467倍)。
メチルエステル化合物(c)の４種類の異性体 (キラル中心1'は未分割) の中では、3'R異性体が対応する3'S異性体より活性が高かった (1.5〜12.9倍)。しかし、両性イオン異性体の場合には、3'S異性体は対応する3'R異性体より必ずしも活性が高くはなかった。これは、キラル中心3'に基づいて決まる活性は他の２つのキラル中心2および1'の立体配置に著しく影響されることを示している。
完全に分割された８種類の両性イオン異性体 (３つのキラル中心がすべて分割)では、いずれの場合も1'S異性体の方が対応する1'R異性体より活性が高いことが判明した (1.8〜22.4倍)。この結果も、ある種の異性体が良好なＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性を示し (約3〜5倍)、2Rおよび3'Sがこの特性に対する決定的な立体配置であることを示している。
両性イオン異性体に対するモルモット回腸アッセイおよびウサギ散瞳試験は、立体特異性を二重に確認した。ウサギの眼では、一部の2R両性イオン異性体はグリコピロレートおよび過剰トロピカミドに似た散瞳効力を示したが、それらの散瞳効果の持続時間はかなり短く、またそれらは反対側の水で処置した眼には瞳孔の散大を誘導しなかった。これらの結果は、それらのソフトな特性に見合って、それらが局所活性を有するが、安全で、全身性副作用を引き起こすには効力が低いことを示している。８種類の両性イオン異性体の薬理学的効力は次の順序であると結論づけられた： (2R1'S3'S, 2R1'S3'Rおよび2R1'R3'S)＞2R1'R3'R＞2S1S3'R＞(2S1'S3'Sおよび2S1'R3'R)＞2S1'R3'S。
結論：ソフト型抗コリン作動性の化合物(c)および(d)ならびにそれらの両性イオン型代謝産物の立体特異性およびＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性が実証された。先の結果に加えて、これらのソフト薬剤の使用の安全性が確認された。
概論
抗コリン作動薬の立体特異性はムスカリン受容体では重要であり、化合物(c)および(d)の(2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(アルコキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、およびそれらの共通の両性イオン型代謝産物である (2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-メチル-1-カルボキシメチルピロリジニウム内部塩が動物試験において有望な活性と安全性を示した。これらの化合物は実際にムスカリン受容体に対して立体特異性を示し、抗コリン作動活性は2R配置では改善された。また、両性イオン型代謝産物も温和なＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性を示した。これは全身性の心臓への副作用が低いことを意味する。しかし、この種のソフト型類似物の分子は３つのキラル中心を有するので、各ラセミ体化合物は８個までの異なる異性体、即ち、下に示すように、2R1'R3'R, 2R1'R3'S, 2R1'S3'R, 2R1'S3'S, 2S1'R3'R, 2S1'R3'S, 2S1'S3'R, および 2S1'S3'S を含有しうる。
Figure 0005257073
即ち、１つの分割キラル中心 (2Rまたは2S) に基づく本ソフト型グリコピロレート異性体の前述した研究は、2Rエナンチオマー (鏡像異性体) (４種のジアステレオ異性体：2R1'3'R, 2R1'R3'S, 2R1'S3'R, 2R1'S3'Sの混合物)の方が、2Sエナンチオマー (2S1'R3'R, 2S1'R3'S, 2S1'S3'R, 2S1'S3'Sの混合物)より活性高いことを示すだけであった。ここでは、５種類の部分分割されたソフト型抗コリン作動性異性体と８種類の完全分割された両性イオン代謝産物異性体 (2Rおよび2Sエナンチオマーについて上述したもの) を用いて、これらのソフト型グリコピロレート誘導体の立体特異性のさらなる検討について報告する。これらの化合物は系統的に合成され、異性体が分離された。相対的な薬理活性およびＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性を、in vitro受容体結合アッセイ、in vitroモルモット回腸ｐＡ2アッセイ、およびin vivoウサギ散瞳効果により検討した。
材料と方法
・材料
グリコピロレート（臭化グリコピロニウム）は、Boehringer Ingelheim Chemicals, Inc.の好意により提供された。臭化カルバミルコリン（カルバコール）、アトロピンメチルブロミド (アトロピンMeBr)、およびスコポラミンメチルブロミド（スコポラミンMeBr）はSigma Chemicals Co. (ミズーリ州セントルイス)から、トロピカミド(1％)はBausch & Lomb Pharmaceutical (フロリダ州タンパ) から入手した。N-[3H]-メチルスコポラミン（NMS）は、Amersham Biosciences UK Limited (イギリス、バッキンガムシャー) から入手した。クローン化ヒトムスカリン受容体サブタイプＭ1−Ｍ4はApplied Cell Science Inc. (メリーランド州ロックビル) から入手した。Scintiverse BDは、Fisher Scientific Co. (ペンシルバニア州ピッツバーグ) から入手した。(R)-3-ヒドロキシピロリジン塩酸塩および(S)-3-ヒドロキシピロリジン塩酸塩はAstatech Inc. (ニュージャージー州モンマウス・ジャンクション) から入手した。N-[3H]-メチルスコポラミン（NMS）は、Amersham Biosciences UK Limited (イギリス、バッキンガムシャー) から入手した。クローン化ヒトムスカリン受容体サブタイプＭ1−Ｍ4はApplied Cell Science Inc. (メリーランド州ロックビル) から入手した。Scintiverse BDは、Fisher Scientific Co. (ペンシルバニア州ピッツバーグ) から入手した。
合成に用いた他の化学薬品は試薬級またはHPLC級であり、Aldrich (ウイスコンシン州ミルウォーキー)およびFisher Scientific Co.から入手した。融点はFisher-Johns融点測定装置で測定した。NMRスペクトルはBruker Advance 300、400および500 MHz NMRスペクトルメータで記録したものであって、TMSに対するppmで報告する。NOESYは、2D NMRスペクトロメータ Mercury-300BBを用いて実施した。動物試験は、米国国立衛生研究所により採択された「実験動物の管理と使用に関する指針」に従って実施された。本研究の開始前とその実施中に、米国動物管理使用委員会 (IACUC) の認可を得た。
・２Ｒ異性体の合成
・ラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1)
臭化シクロペンチルマグネシウムのエーテル溶液 (100 ml, 2M; 0.2 mol) を、０℃の無水エチルエーテル330 ml中のベンゾイルギ酸 (15 g, 0.1 mol) に滴下した。この混合物を０℃で30分間、次に室温で24時間撹拌した。反応混合物を1N HClで処理し、水溶液をエーテルで抽出した。合わせたエーテル溶液をK2CO3溶液により処理した。炭酸カリウム溶液をHClで酸性化し、エーテルで２回抽出した。エーテル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発すると粗生成物が得られた。この粗生成物を水洗すると、純粋なラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1) (8.0 g, 36.4％)が得られた。針状結晶、融点：153-154℃。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.28-1.39, 1.42-1.50, 1.51-1.61, 1.63-1.72 [8H, m, (CH2)4], 2.93 [1H, p, CHC(OH)], 7.26-7.30, 7.33-7.36, 7.65-7.67(5H, m, Ph) ppm。
・ラセミ体シクロペンチルマンデル酸の分割、R(-)-(1)
メタノール100 ml中の(-)-ストリキニン (11.4 g) (懸濁液) を、室温でメタノール (20 ml)中のラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1) (7.5 g) に添加した。この反応溶液を一晩静置した。析出した結晶を濾別し、熱メタノールで再び晶出させた。２回目に析出した結晶を濾取し、水酸化ナトリウム溶液で処理した。この塩基性溶液を塩化メチレンで２回抽出した後 (塩化メチレン溶液は廃棄)、塩酸で酸性化して、光学分割されたシクロペンチルマンデル酸を回収した。この分割された酸 (酢酸エチル0.1 ml中20.6 mg) に、(+)-α−フェニルエチルアミン13μLを添加した。析出した沈殿をヘキサンで３回洗浄し、減圧乾燥した。この沈殿は、NMRにより、光学的に純粋なシクロペンチルマンデル酸、R(-)-(1)であると同定された (2.5 g, 33.3％)。
融点：121-122℃。[α]25゜ D＝−22.5°(c＝1 g/100 ml, CHCl3)。1H NMR(CDCl3, 300 MHz): 1.28-1.39, 1.42-1.50, 1.51-1.61, 1.64-1.73 [8H, m, (CH2)4], 2.93 [1H, p, CHC(OH)], 7.25-7.28, 7.32-7.35, 7.64-7.65(5H, m, Ph) ppm。
・(-)-シクロペンチルマンデル酸メチル、R(-)-(2)
DMF (21 ml)中の(-)-シクロペンチルマンデル酸、R(-)-(1) (1.83 g, 8.3 mmol) と炭酸カリウム (2.87 g, 21 mmol) との混合物に、ヨウ化メチル (3.53 g, 25 mmol) を室温で添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した後、水に投入し、ヘキサンで３回抽出した。乾燥したヘキサン抽出液を蒸発させて粗生成物を得た。この粗生成物を1.5：1 ヘキサン：塩化メチレンを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー処理すると、純生成物R(-)-(2)が得られた (1.90 g, 95％)。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.32-1.36, 1.43-1.61 [8H, m, (CH2)4], 2.90 [1H, p, CHC(OH)], 3.71 (1H, s, OH), 3.79 (3H, s, CH3), 7.25-7.28, 7.31-7.35, 7.63-7.65 (5H, m, Ph) ppm。
・(R)-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン、(R)-(3)
100 mlのフラスコに、2 gの(R)-3-ヒドロキシピロリジン、25 mlのTHF、0.49 gのパラホルムアルデヒドおよび1.5 gのギ酸 (90％) を加えた。この混合物を５時間還流下で撹拌した後 (固体がすべて消失するまで)、０℃に冷却し、10 mlのNaOH溶液 (10 N) を加えてｐＨを約10に調整した。有機層を分離し、MgSO4で乾燥した。乾燥した溶液を濾過し、溶媒 (THF) を除去すると、(R)-(3)の油状生成物 (1.5 g, 92％)が得られた。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.50-1.60 (m, 1H), 1.98-2.10 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.25-2.40 (m, 2H), 2.50-2.60 (m, 1H), 2.61-2.70 (m, 1H), 3.80 (brs, 1H), 4.20-4.30 (m, 1H)。
・(S)-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン、(S)-(3)
(S)-(3)の合成は、出発物質が(S)-3-ヒドロキシピロリジンであったことを除いて(R)-(3)の合成と同じであった。得られた生成物(S)-(3) (1.5 g, 92％)もやはり油状物であった。1H NMR (DMSO-D6 300 MHz): 1.50-1.60 (m, 1H), 1.98-2.05 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 2.15-2.35 (m, 2H), 2.45-2.52 (m, 1H), 2.61-2.70 (m, 1H), 4.20 (brs, 1H), 4.60-4.70 (m, 1H)。
・3(R)-N-メチル-3-ピロリジニル・2(R)-シクロペンチルマンデレート、(4)
トルエン40 ml中のR(-)-(2) (0.7 g, 3 mmol)および(R)-(3) (0.7 g, 7 mmol)の溶液を20 mlのトルエンが留去してしまうまで加熱した。ナトリウム約0.003 gを添加した後、蒸留を続けながら溶液を２時間加熱撹拌した。その間、反応体積を一定に保持するような割合で追加のトルエンを添加した。１時間後には追加のナトリウムを添加した。その後、溶液を冷却し、3N HClで抽出した。酸抽出液を濃NaOHでアルカリ性にした後、エーテルで３回抽出した。乾燥したエーテル溶液を蒸発させると粗製油状物が得られた。この粗生成物を8：1 EtOAc：EtOHを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィー処理すると、(4)の油状生成物が得られた (0.4 g, 44％)。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.28-1.37, 1.51-1.70, 1.83-1.90 [8H, m, (CH2)4], 2.27-2.40 (m, 3H), 2.52-2.55 (m, 1H), 2.64-2.72 (m, 1H), 2.74-2.81 (m, 1H), 2.33 (3H, s, NCH3), 2.93 [1H, p, CHC(OH)], 3.85 (1H, bs, OH), 5.22 (m, 1H), 7.24-7.27, 7.31-7.35, 7.64-7.66 (5H, m, Ph) ppm。
・3(S)-N-メチル-3-ピロリジニル・2(R)-シクロペンチルマンデレート、(5)
(5)の合成は、(R)-(3)の代わりに(S)-(3)を使用したこと以外は、(4)の場合と同じであった。得られた生成物(5) (0.35 g, 39％)もやはり油状物であった。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 1.28-1.37, 1.51-1.70, 1.75-1.82[8H, m, (CH2)4], 2.15-2.22 (m, 1H), 2.30-2.40 (m, 2H), 2.65-2.70 (m, 1H), 2.70-2.82(m, 2H), 2.35(3H, s, NCH3), 2.95[1H, p, CHC(OH)], 3.82(1H, bs, OH), 5.22(m, 1H), 7.24-7.27, 7.31-7.35, 7.64-7.66(5H, m, Ph) ppm。
・(2R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(メトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(6) [化合物(e)]
乾燥アセトニトリル12 ml中の化合物(4) (0.3 g, 0.98 mmol) に、ブロモ酢酸メチル (0.5 g, 3.2 mmol) を室温で添加した。この混合物を６時間撹拌した。アセトニトリルを蒸発させると粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化メチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル50 ml中に投入して沈殿させた。この処理を３回繰り返して、純生成物(6)、即ち、化合物(e) (0.3 g, 70％) を白色粉末として得た。これは、NMR推測比で2:1の２種類のジアステレオ異性体の混合物であった。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 1.30-1.37, 1.41-1.50, 1.55-1.70 [8H, m, (CH2)4], 2.10-2.27 (m, 1H), 2.79-2.95 (m, 2H), 3.05, 3.60 (2s, total 3H, N-CH3), 3.75, 3.79 (2s, total 3H, O-Me), 3.95-4.40 (m, 4H), 4.68, 5.16 (2AB, total 2H, N-CH2-COOMe), 5.52-5.58 (m, 1H), 7.23-7.29, 7.31-7.38, 7.56-7.60 (5H, m, Ph) ppm。
・(2R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(メトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(7a) [化合物(f)]
乾燥アセトニトリル8 ml中の化合物(5) (0.16 g, 0.52 mmol) に、ブロモ酢酸メチル (0.3 g, 1.9 mmol) を室温で添加した。(6) [化合物(e)]と同じ手順に従って、純生成物(7a) [化合物(f)] (0.16 g, 80％) を得た。化合物(f)も白色粉末で、NMR推測比で2:1の２種類のジアステレオ異性体の混合物であった。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 1.30-1.70 [8H, m, (CH2)4], 1.95-2.00, 2.10-2.20 (m, 1H), 2.75-2.95 (m, 2H), 3.30, 3.70 (2s, total 3H, N-CH3), 3.78, 3.82 (2s, total 3H, O-Me), 4.00-4.42 (m, 4H), 4.90, 5.38 (2AB, total 2H, N-CH2-COOMe), 5.52-5.58 (m, 1H), 7.23-7.29, 7.31-7.38, 7.56-7.60 (5H, m, Ph) ppm。
・(2R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(7b) [化合物(g)]
乾燥アセトニトリル10 ml中の化合物(5) (0.16 g, 0.52 mmol) に、ブロモ酢酸エチル (0.32 g, 1.9 mmol) を室温で添加した。この混合物を22時間撹拌し、アセトニトリルを除去すると、粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化エチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル50 ml中に投入して沈殿を生じさせた。この処理を３回繰り返して、純生成物(7b)、即ち、化合物(g) (0.16 g, 80％) を得た。化合物(g)も白色粉末で、NMR推測比で2:1の２種類のジアステレオ異性体の混合物であった。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 1.32, 1.35 (2t, 3H, CH3CH2), 1.40-1.50, 1.53-1.63, 1.65-1.80 [8H, m, (CH2)4], 1.93-2.11 (m 2H), 2.80-2.96 (M, 2H), 3.30, 3.70 (2s, 3H, N-CH3), 4.10-4.60 (m, 6H), 4.79, 5.30 (2H, 2組のdd, CH2CO2), 5.53 (1H, m), 7.24-7.29, 7.31-7.38, 7.56-7.60(5H, m, Ph) ppm。
・エステルの加水分解
化合物(e)および(f)を等モル比の0.1 N NaOHと混合した。混合物を室温で３時間撹拌して、対応するラセミ体両性イオン生成物、(8)および(9)、を水溶液 (無色、pH 約6.5) 状態で得た。化合物(8)は(2R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩である。化合物(9)は(2R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩である。
・(8a)、(8b)および(9a)、(9b)のHPLC分離
(8)および(9)の水溶液は、それぞれ２種類の異性体(8a)、(8b)および(9a)、(9b)を2：1の比率で含んでいたが、それらはHPLCにより分離することができた。HPLCシステムは、Spectra Physics (カリフォルニア州サンノゼ) SP 8810 アイソクラティックポンプ、SP 8450 UV/Vis 検出器 (波長は230 nmに設定)、SP 4290 積分器、およびSupelco Discovery RP アミドC16 カラムから構成されていた。移動相は、30：70のアセトニトリルと水とから構成された。流量1 mL/minで100μLを注入して、保持時間は(8a)および(9a) については7.2分、(8b)および(9b) については8.5分であった。各異性体に対応する流出液を集め、溶媒を蒸発させて、次のような最終の両性イオン異性体(8a)、(8b)および(9a)、(9b)を得た。
・(2R,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(8a)：白色粉末。1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.30-1.65 (m, 8H), 2.02-2.12 (m, 1H), 2.20-2.60 (brs, 1H), 2.60-2.80 (m, 1H), 2.82-2.92 (m, 1H), 3.30 (s, 3H), 3.55-3.65 (m, 1H), 3.72-3.82 (m, 1H), 3.90-4.05 (m, 2H), 4.10-4.15 (m, 1H), 5.38-5.45 (m, 1H), 7.15-7.20 (m, 1H), 7.32-7.38 (m, 2H), 7.55-7.62 (m, 2H)。
・(2R,1'S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(8b)：1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.30-1.75 (m, 8H), 2.02-2.10 (m, 1H), 2.10-2.40 (brs, 2H), 2.70-2.80 (m, 1H), 2.80-2.90 (m, 1H), 2.95 (s, 3H), 3.55-3.65 (m, 2H), 3.85-4.0 (m, 3H), 4.05-4.10 (m, 1H), 5.38-5.45 (m, 1H), 7.15-7.20 (m, 1H), 7.25-7.30 (m, 2H), 7.50-7.60 (m, 2H)。
・(2R,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(9a)：白色粉末。1H NMR (CDCl3, 500MHz): 1.30-1.65 (m, 8H), 2.02-2.12 (m, 1H), 2.50-2.60 (m, 1H), 2.78-2.88 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.65-4.05 (m, 4H), 4.15-4.30 (brs, 2H), 5.30-5.40 (m, 1H), 7.13-7.23 (m, 1H), 7.26-7.32 (m, 2H), 7.55-7.60 (m, 2H)。
・(2R,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(9b)：白色粉末。1H NMR (CDCl3, 500MHz): 1.30-1.70 (m, 8H), 1.90-1.98 (m, 1H), 2.65-2.70 (m, 1H), 2.85-2.90 (m, 1H), 3.15 (s, 3H), 3.65-3.90 (m, 4H), 4.05-4.10 (M, 1H), 4.15-4.22 (brs, 1H), 5.35-5.42 (m, 1H), 7.18-7.23 (m, 1H), 7.27-7.32 (m, 2H), 7.53-7.58 (m, 2H)。
・絶対立体配置の決定
核オーバーハウザー効果 (NOE) を利用して生成物(8b)の絶対立体配置を同定した。化合物をCDCl3に溶解し、2D 1H-1H NOESYスペクトルをMercury-300BBにより求めた。
・２Ｓ異性体の合成
・cis-(2S,5S)-2-(tert-ブチル)-5-フェニル-1,3-ジオキソラン-4-オン、(10)
S(+)-マンデル酸のヘキサン懸濁液 (50 g, 328 mmol) にピバロアルデヒド (pivaldehyde) (42.7 ml, 396 mmol)、次にトリフルオロメタンスルホン酸 (1.23 ml, 14 mmol) を添加した。この混合物を36℃に加温し、反応を、出発物質が検出されなくなるまで５時間TLCで追跡した。混合物を次いで室温に冷却し、8％NaHCO3水溶液を添加した。水層を除去し、有機層をNa2SO4で乾燥した。濾過および溶媒の除去後に、62.17gの粗生成物が得られた。この粗生成物の再結晶により、44.71 gの純cis-(2S,5S)-2-(tert-ブチル)-5-フェニル-1,3-ジオキソラン-4-オンが針状結晶として収率88％で得られた。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.08 (s. 9H), 5.24 (s, 1H), 5.33 (s, 1H), 7.40-7.46 (m, 5H) ppm。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 23.6, 34.4, 77.0, 109.3, 127.0, 128.7, 129.2, 133.4, 147.2。
・cis-(2S,5S)-2-(tert-ブチル)-5-フェニル-5-シクロペンチル-1,3-ジオキソラン-4-オン、(11)
−78℃で、リチウムビス(トリメチルシリル)アミドのヘキサン溶液 (120 ml, 120 mmol, 1.0M ヘキサン中) を化合物(10) (25g, 113.5 mmol, 100 mlの乾燥THF中に溶解) に加え、１時間撹拌した後、臭化シクロペンチル (25 g, 168 mmol) を加えた。この反応混合物を−78℃に４時間保持した後、室温まで徐々に昇温させ、一晩続けた。反応の完了をTLCにより追跡した。撹拌しながら、この混合物に10％NH4Cl溶液 (25 ml) を添加した。その後、混合物を10％NH4Cl溶液 (200 ml) を入れた分液漏斗に投入した。水層を捨て、有機層をNa2SO4で乾燥した。溶媒を除去して粗生成物を得た。この粗生成物を次いでヘキサンから再結晶させると、純生成物(11) (20.36 g, 収率63％、白色結晶) が得られた。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.15 (s, 9H), 1.55-1.95 (m, 8H), 2.74 (m, 1H), 5.62 (s, 1H), 7.44-7.56 (m, 3H), 7.88-7.91 (n, 2H) ppm。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 23.5, 24.5, 25.3, 26.6, 35.6, 50.9, 83.2, 110.6, 124.9, 127.5, 127.9, 138.9, 173.7。
・S(+)-シクロペンチルマンデル酸、(12)
メタノール100 mlおよび水50 ml中のcis-(2S,5S)-2-(tert-ブチル)-5-シクロペンチル-5-フェニル-1,3-ジオキソラン-4-オン (14.35 g, 50 mmol)の溶液に、KOH 15 gをゆっくり加えた。この混合物を3〜4時間加熱 (65℃) 撹拌して還流させた後、室温まで冷却し、メタノールを除去した。残った水溶液に酢酸エチル100 mlを加えた後、3N HClでpH 1に酸性化した。この混合物を分液漏斗に投入し、有機層を分離した。水層を酢酸エチル (50 ml) で２回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、溶媒を除去して、黄色味を帯びた組成物13.44 gを得た。これを再結晶すると、S(+)-シクロペンチルマンデル酸(12)の純生成物 (6.89 g, 収率62％、白色結晶)が得られた。1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.28-1.75 (m, 8H), 2.94 (m, 1H), 7.24-7.34 (m, 3H), 7.62-7.68 (m, 2H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 25.9, 26.3, 26.4, 26.9, 47.1, 79.2, 125.8, 127.7, 128.2, 140.8, 180.9。
・S(+)-シクロペンチルマンデル酸メチル、(13)
DMF (60 ml)中のS(+)-シクロペンチルマンデル酸(12) (5.5 g, 25 mmol)および炭酸カリウム (8.61 g, 63 mmol) の溶液に、ヨウ化メチル (10.6 g, 75 mmol) を添加した。この混合物を室温で３時間撹拌した後、水に投入し、ヘキサンで３回抽出した。乾燥したヘキサン抽出液を蒸発させると、純生成物S(+)-シクロペンチルマンデル酸エステル(13) (5.85 g, 100％、透明油状物)が得られた。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.32-1.61 [8H, m, (CH2)4], 2.90 [1H, p, CHC(OH)], 3.76 (s, 3H), 3.78 (s, 1H), 7.25-7.35 (m, 3H), 7.63-7.65 (m, 2H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 25.9, 26.2, 26.3, 26.8, 47.1, 53.2, 79.1, 125.8, 127.3, 128.0, 141.6, 176.0。
・(R)-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン、(R)-(3)
100 mlのフラスコに、4 gの(R)-3-ヒドロキシピロリジン塩酸塩、50 mlのTHF、および1.3 gのNaOHを加え、20分間撹拌した。その後、1.1 gのパラホルムアルデヒドおよび4.8 gのギ酸 (90％) を加えた。この混合物を、固体がすべて消失するまで、２時間還流下で加熱撹拌した (60℃)。この混合物を０℃に冷却し、6.5 mlの10N NaOH溶液と混合し (pH 約10)、酢酸エチル (50 ml) で２回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥した。乾燥した有機層を蒸発させると、(R)-(3)の黄色みを帯びた油状生成物 (3.0 g, 92％)が得られた。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.65-1.75 (m, 1H), 2.15-2.36 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.55-2.59 (m, 2H), 2.76-2.85 (m, 1H), 4.30-4.40 (m, 1H), 4.8-5.10 (brs, 1H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 35.4, 41.9, 54.7, 64.9, 70.9。
・(S)-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン、(S)-(3)
(S)-(3)の合成は、出発物質が(S)-3-ヒドロキシピロリジン塩酸塩であったことを除いて(R)-(3)の合成と同じであった。得られた生成物(S)-(3) (3.10 g, 95％)もやはり油状物であった。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.50-1.60 (m, 1H), 2.05-2.30 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.40-2.50 (m, 2H), 2.70-2.80 (m, 1H), 4.25-4.30 (m, 1H), 4.80 (brs, 1H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 35.4, 41.9, 54.7, 64.9, 70.9。
・(3R) N-メチル-3-ピロリジニル-(S)-シクロペンチルマンデレート、(14)
ディーン・スターク凝縮器を取り付けた250 mlの三つ口フラスコ中で、S(+)-シクロペンチルマンデル酸メチル(13) (2 g, 8.8 mmol)、(R)-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン(R)-(3) (2 g, 20 mmol)、およびヘプタン100 mlの混合物を、20 mlのヘプタンが留去されてしまうまで加熱撹拌した (110℃)。温度を25℃に下げ、ナトリウム約0.003 gを添加した。蒸留を続けながら、混合物を再び110℃に３時間加熱撹拌した。１時間目の時点で追加のナトリウム片 (0.002 g) を添加した。その間、反応体積を一定に保持するような割合で追加のヘプタンを加えた。得られた混合物を０℃に冷却し、水5 mlと混合し、有機層を分離した。有機層を3N HClで抽出した。酸抽出液を5N NaOHでアルカリ性 (pH 10) にした後、エーテルで３回抽出した。乾燥したエーテル溶液 (Na2SO4で) を蒸発させると、透明油状の生成物(14) (1.6 g, 61.5％)が得られた。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.28-1.80 [m, 9H], 2.15-2.25 (m, 1H), 2.30-2.40 (m, 1H), 2.37 (s, 3H),2.65-2.80 (m, 3H), 2.90-3.00 (m, 1H), 3.85(1H, brs, OH), 5.22(m, 1H), 7.20-7.35 (m, 3H), 7.64-7.70 (m, 2H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 26.0, 26.4, 26.5, 26.7, 32.1, 42.0, 47.1, 54.8, 62.0, 76.5, 79.1, 125.8, 127.3, 128.0, 141.7, 175.3。
・(3S) N-メチル-3-ピロリジニル-(S)-シクロペンチルマンデレート、(15)
(R)-(3)の代わりに(S)-(3)を使用したこと以外は(14)の合成と同じ手順に従って、(15)の透明油状生成物 (2.33 g, 89.6％) を得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.24-1.70 (m, 9H), 1.80-1.88 (m, 1H), 2.25-2.40 (m, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.55-2.70 (m, 2H), 2.75-2.82 (m, 1H), 2.90-3.00 (m,1H), 3.95 (1H, bs, OH), 5.22 (m, 1H), 7.24-7.40 (m, 2H), 7.64-7.69 (m, 5H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 26.0, 26.3, 26.4, 26.7, 32.6, 42.0, 47.1, 54.9, 61.6, 76.4, 79.2, 125.8, 127.3, 128.0, 141.7, 175.2。
・(2S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(メトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(16) [化合物(h)]
乾燥アセトニトリル30 ml中の化合物(14) (0.6 g, 1.96 mmol) を、室温でブロモ酢酸メチル (1.0 g, 6.4 mmol) と混合した。この混合物を３時間撹拌した。アセトニトリルを蒸発させると粗生成物が得られた。この粗生成物を少量の塩化メチレンに溶解した後、乾燥エチルエーテル100 ml中に投入して沈殿を得た。この手順を３回繰り返して、化合物(h)を生成物 (0.81 g, 89％、白色粉末) として得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.30-1.70 (m, 8H), 1.82-1.95 (brs, 1H), 2.10-2.20 (m, 1H), 2.75-2.90 (m, 2H), 3.25, 3.60 (2s, total 3H, N-CH3), 3.75, 3.79 (2s, total 3H, O-Me), 4.10-4.60 (m, 4H), 4.92, 5.35 (2AB, total 2H, N-CH2-COOMe), 5.52-5.58 (m, 1H), 7.23-7.38 (m, 3H), 7.56-7.60 (m, 2H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 25.8, 25.9; 26.3, 26.4; 26.4, 26.5; 27.0, 27.0; 29.8, 30.1; 45.9, 46.8; 50.2, 51.4; 53.2, 53.2; 62.2, 63.2; 64.6, 64.7; 69.6, 69.7; 72.8, 73.1; 79.4, 79.6; 125.7, 125.7; 127.6, 127.9; 128.2, 128.4; 141.0, 141.2; 165.3, 165.5; 173.9, 174.2。
・(2S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(メトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(17) [化合物(i)]
化合物(14)の代わりに化合物(15)を使用したことを除いて、化合物(h) に対するのと同じ手順に従って、生成物の化合物(i) (0.8 g, 88％、白色粉末) を得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.30-1.75 (m, 8H), 1.80-1.90 (brs, 1H), 2.15-2.30 (m, 1H), 2.78-2.95 (m, 2H), 3.10, 3.65 (2s, total 3H, N-CH3), 3.75, 3.78 (2s, total 3H, O-Me), 4.15-4.52 (m, 4H), 4.85, 5.38 (2AB, total 2H, N-CH2-COOMe), 5.50-5.58 (m, 1H), 7.23-7.38 (m, 3H), 7.56-7.66 (m, 2H)。13C NMR (CDCl3, 300 MHz): 25.8, 25.9; 26.2, 26.3; 26.3, 26.4; 26.8, 26.9; 29.4, 29.6; 45.6, 46.9; 50.1, 51.4; 53.1, 53.1; 62.2, 63.3; 64.8, 64.8; 69.5, 69.8; 72.8, 73.2; 79.4, 79.6; 125.6, 125.9; 127.6, 127.9; 128.2, 128.4; 140.7, 141.1; 165.2, 165.5; 173.9, 174.2。
・エステルの加水分解とHPLC分離
2S-異性体の(18a), (18b), (19a)および(19b) (白色粉末) を得るのに用いた手順は、2R-異性体の(8a), (8b), (9a)および(9b) に対するものと同じであった。
・(2S,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(18a)：1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.30-1.65 (m, 8H), 2.02-2.45 (m, 2H), 2.82-2.90 (m, 1H), 3.10-3.18 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.50-4.05 (m, 6H), 5.34-5.40 (m, 1H), 7.23-7.38 (m, 3H), 7.50-7.68 (m, 2H)。
・(2S,1'S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(18b)：1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.45-1.85 (m, 9H), 2.05-2.15 (m, 1H), 2.80-2.90 (m, 1H), 3.00-3.10 (m, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.70-3.80 (m, 1H), 3.90-4.10 (m, 4H), 4.22-4.35 (m, 1H), 5.50-5.60 (m, 1H), 7.36-7.55 (m, 3H), 7.72-7.80 (m, 2H)。
・(2S,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(19a)：1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.20-1.65 (m, 8H), 1.95-2.10 (m, 1H), 2.20 (brs, 1H), 2.40-2.50 (m, 1H), 2.78-2.90 (m, 1H), 3.15 (s, 3H), 3.70-3.90 (m, 2H), 3.96-4.20 (m, 4H), 5.38-5.50 (m, 1H), 7.20-7.38 (m, 3H), 7.55-7.65 (m, 2H)。
・(2S,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩、(19b)：1H NMR (CDCl3, 300MHz): 1.35-1.70 (m, 8H), 2.00-2.15 (m, 1H), 2.70-2.90 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 3.42 (brs, 1H), 3.58-3.68 (m, 2H), 3.80-3.95 (m, 3H), 4.08-4.18(m, 1H), 5.38-5.48 (m, 1H), 7.20-7.40 (m, 3H), 7.55-7.62 (m, 2H)。
・受容体結合親和性
ソフト型抗コリン作動性異性体およびそれらの両性イオン代謝産物異性体、ならびにグリコピロレートおよびN-メチルスコポラミンの受容体結合試験は、Applied Cell Science Inc. (メリーランド州ロックビル) から得たプロトコルに従って、アッセイ緩衝液 (リン酸緩衝食塩水, PBS, Ca++またはMg++無添加、pH 7.4) 中のN-[3H]-メチルスコポラミン (NMS) により実施した。この緩衝液にエステラーゼ阻害剤として10 mM NaF溶液を添加した。アッセイ混合物 (0.2 ml)は、20μlの希釈された受容体膜 (受容体タンパク質：M1, 38μg/ml; M2, 55μg/ml; M3, 27μg/ml;およびM4, 84μg/ml) を含有していた。結合試験のためのNMSの最終濃度は0.5 nMであった。比結合は、M1およびM2については5μMアトロピンの、M3およびM4については1μMアトロピンの存在下および不存在下での[3H] NMS結合の差ととして定義された。インキュベーションは室温で２時間行った。アッセイは、Whatman GF/Cフィルター (0.5％ポリエチレンイミンに一晩予備浸漬) を通した濾過で終えた。このフィルターをその後、1 mlの氷冷緩衝液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 0.9% NaCl) により６回洗浄し、バイアルに移し、シンチバース (Scintiverse) 5 mlを添加した。検出はPackard 31800 液体シンチレーション分析器 (Packard Instrument Inc., イリノイ州ダウナーズグローブ)で実施した。
結合実験で得られたデータは、
式： [3H] NMS 結合率(％)＝100 - [100xn/k/(1 + xn/k)]
に当てはめて、ヒル係数、n を求め、次いで、
式： [3H] NMS 結合率(％)＝100 - [100xn/IC50/(1 + xn/IC50)]
に当てはめて、IC50を求めた (xは、試験化合物の濃度)。ChengおよびPrusoff の方法(8) に基づいて、式：Ki ＝ IC50/(1 + L/Kd) (式中、Lは放射性リガンドの濃度) から Ki を求めた。IC50 は特定の放射性リガンド結合の50％阻害を引き起こす薬剤濃度を意味し、そして、Kdは放射性リガンド・受容体複合体の解離定数を意味する。データは、Scientistソフトウェア (MicroMath Inc., ユタ州ソルトレイクシティ) を用いて、非線形最小二乗曲線フィッティング処理によって解析した。
・ｐＡ 2 値の測定
体重約400 gの雄性モルモットをHarlan Inc. (インディアナ州インディアナポリス)から入手し、一晩絶食させた。動物を断頭により致死させ、回腸 (盲腸より5 cm上の領域) を分離し、摘出した。回腸を2.5 cmの小片に切り、タイロード液と0.1 mM 臭化ヘキサメトニウムとの混合液30 mlを入れたオルガン浴中に懸架した。このオルガン浴には常時酸素を通気し、37℃に保持した。回腸短冊片の一端はオルガン浴の底部の固定サポートに、他端は2〜10 g範囲で動作する等尺力トランスデューサ (TRN001型、Kent Scientific Corp., コネチカット州) にそれぞれ取り付けた。回腸短冊片は2 gの張力に保持し、カルバコールを作用薬として使用した。回腸は、継続的にカルバコールの用量 (2×10-4〜2×10-3M 水溶液を10〜20μL) を添加していくと累増的に収縮した。収縮をフィジオグラフ装置 (Kipp & Zonen Flarbed Recorder, オランダ) に記録した。最大反応が得られたら、回腸を３回洗浄し、適当な濃度の拮抗薬 (試験する抗コリン作動性化合物) を含有する新しいタイロード液に取り替えた。カルバコールを添加する前に、各拮抗薬に対して10分間の平衡化時間を与えた。各実験において５〜６の異なる濃度を使用し、シルド(Schild)プロットを用いてｐＡ2値を得た。各拮抗薬に対して４回の試験を実施した。
・in vivo 散瞳試験
８種類の完全分割された両性イオン異性体の散瞳効果を、ウサギの眼において、グリコピロレート、トロピカミド、(±) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩 [(±)-GA] および (2R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩 [(2R)-GA] のそれと比較した。体重約3.5 kgの健康な雄性ニュージーランド白ウサギ４匹を使用した。100μLの各種濃度の試験化合物の水溶液 (pH 6.5) を眼に投与した。化合物溶液を片方の眼に投与し、対照として用いた他方の眼には水を投与した。実験は照明と温度が管理された室内で行った。適当な時間間隔で両眼の瞳孔径を記録した。各時点と零時点との瞳孔径の差(％)を、処置した眼と対照の眼の両方について算出し、散瞳反応として記録した。対照の眼の散大の監視は、全身性吸収が起こったか否かを調べるためであった。散瞳反応−時間曲線下面積 (AUCeff) を台形公式により算出し、それを用いて試験化合物の活性および作用持続時間を比較した。
・統計解析
受容体結合親和性およびｐＡ2値は、スチューデントｔ-検定を用いて比較した。散瞳活性 (最大反応Ｒmax％と効果曲線下面積 AUCeff) は、ANOVAを用いて比較した。ｐ＜0.05の有意レベルを全例において使用した。
結果と考察
・合成
５種類のソフト型抗コリン作動性エステル異性体と８種類の両性イオン代謝産物の酸異性体が新たに合成された。2Rジアステレオ異性体 [化合物(e)、(f)、(g) 、(8a)、(8a)、(8b)、(9a)および(9b)] は、下記の合成経路により得られた。
Figure 0005257073
図式２に示すように、まず、臭化シクロペンチルマグネシウムとベンゾイルギ酸とからラセミ体シクロペンチルマンデル酸(1)を合成した。このラセミ体の酸を、この酸と(-)-ストリキニンとの間で生成させた塩の結晶化の繰返しにより光学分割した。左旋性 (−22.5°) の光学的に純粋な遊離酸 R(-)-(1)が、水酸化ナトリウム溶液による塩の塩基性化とその後の塩酸による酸性化によって回収された。室温のDMF中でR(-)-(1)をヨウ化メチルおよび炭酸カリウムによりメチル化すると、2R(-) シクロペンチルマンデル酸メチル R(-)-(2)が生成した。R(-)-(2)のエステル交換反応を、R-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン、(R)-(3) (R-3-ヒドロキシピロリジンからパラホルムアルデヒドおよびギ酸との反応により調製) により行うと(3R)-N-メチル-3-ピロリジニル・2R-シクロペンチルマンデレート(4)が生成し、またはS-3-ヒドロキシ-N-メチルピロリジン、(S)-(3) (S-3-ヒドロキシピロリジンからパラホルムアルデヒドおよびギ酸との反応により調製) により行うと(3S)-N-メチル-3-ピロリジニル・2R-シクロペンチルマンデレート(5)が生成した。
化合物(4)または(5)をアセトニトリル中でブロモ酢酸メチルまたはエチルにより第四級化すると、(6) [化合物(e)]、(7a) [化合物(f)]、および(7b) [化合物(g)]が得られた。これらはいずれも、窒素キラル中心のために、2：1 (R：S＝2：1)の比率で２種類のジアステレオ異性体を有することが、1H NMRスペクトルに示された。(6) [化合物(e)]および(7a) [化合物(f)]の加水分解により、それらの両性イオン内部塩(8)および(9)が得られた。各両性イオン内部塩もまた2：1の比率で２種類のジアステレオ異性体を有しており、それらをHPLCにより分離して、両性イオン異性体(8a), (8b)および(9a), (9b)を得ることができた。
1H NMRから、(8a), (8b)および(9a), (9b)はキラル窒素に基づくジアステレオ異性体の対であることが明らかとなった。これらの異性体の絶対立体配置を同定するために、(8b)を選んで、核オーバーハウザー効果 (NOE) を検討するためにCDCl3に溶解した。2D 1H-1H NOESYスペクトルは、窒素に結合したメチル基はピロリジニウム環の３位の水素と同じ側にあることを示した。従って、この窒素の立体配置はS形態となり、(8b)の絶対立体化学は、(2R,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩であると証明された。従って、(8a)は、(2R,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩；(9a)は、(2R,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩；そして(9b)は、(2R,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩であった。
Groverおよび共同研究者は、(S)-マンデル酸から出発した５工程での(S)-シクロペンチルマンデル酸の高度に立体選択的な合成を前に報告した [J. Org. Chem. 65: 6283-6287 (2000)]。かれらの手順の変更により、３工程で純粋なS(+)-シクロペンチルマンデル酸が良好な収率で得られた。図式３に示すように、S(+)-マンデル酸をトリフルオロメタンスルホン酸触媒の存在下でピバルデヒド (ピバロアルデヒド) と反応させると、cis-(2S,5S)-2-(tert-ブチル)-5-フェニル-1,3-ジオキソラン-4-オン(10)が約90％の収率で得られた。−78℃で、(10)をリチウムビス(トリメチルシリル)アミドで脱プロトン化し、次いで臭化シクロペンチルを添加すると、cis-(2S,5S)-2-(tert-ブチル)-5-シクロペンチル-5-フェニル-1,3-ジオキソラン-4-オン(11)が生成した。(11)の水酸化カリウムによる塩基性加水分解と続く塩酸による酸性化とによって、目的とする(S)-(+)-シクロペンチルマンデル酸(12)が生成した。この工程の後、メチル化、エステル化、第四級化および加水分解を含む、(8a), (8b), (9a), および(9b)の場合と同じ手順に従って、最終目的物である４種類の両性イオン異性体、即ち、(2S,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩(18a) [2S1'R3'R-GA]；(2S,1'S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩(18b) [2S1'S3'R-GA]；(2S,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩(19a) [2S1'R3'S-GA]；(2S,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(カルボキシメチル)-1-メチルピロリジニウム内部塩(19b) [2S1'S3'S-GA]、が得られた。これらはNMRにより特性決定された。
Figure 0005257073
・受容体結合試験
ヒトクローン化ムスカリン受容体サブタイプＭ1〜Ｍ4を用いた放射性リガント結合アッセイにより測定した本ソフト型類似物の受容体結合親和性ｐＫiを表４に示す。
Figure 0005257073
新たに合成された異性体のｐＫiを、ラセミ体および2R異性体型の親ソフト薬剤 [メチルエステル化合物(c)およびエチルエステル化合物(d)]、ラセミ体および2R異性体型のGA (両性イオン型代謝産物)、ならびにグリコピロレートおよびN-メチルスコポラミンのそれと比較した。ラセミ体型の化合物(a)および(b)のｐＫiは、それらの対応する2R異性体より低い受容体結合親和性を示し (後者の8.7〜9.5に対して7.8〜8.3)、これらの受容体では立体特異性が重要であることが確認された。これらの2R異性体の効力は、グリコピロレートの効力 (8.7〜9.9) およびN-メチルスコポラミンの効力 (9.2〜9.9) に似ている。ラセミ体化合物(a)の2および3'キラル中心での分割により、ｐＫi値が、それぞれ9.0〜9.5、7.9〜8.9、7.0〜7.6および6.0〜6.5の４種類の立体異性体、化合物(e)、(f)、(h)および(i)が得られた。これらの数値は、メチルエステル異性体の中で、2R異性体が対応する2S異性体より効力が高いだけでなく、3'R異性体が3'S異性体より効力が高いことも示している。エチルエステルである化合物(j)の2R3'S異性体は、メチルエステルの2R3'S異性体と同様に、8.2〜8.7のｐＫi値を示した。
同じ表に、Ｍ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性の算出値も示した。Ｍ3／Ｍ2サブタイプ選択性を示さないという、先に報告したメチルおよびエチルエステルの2R異性体 [化合物(c)および(d)] の場合とは異なり、メチルおよびエチルエステルの2R3'S異性体である化合物(e)および(j)は、有意に増大したＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性 (ｐ＜0.01、等分散を仮定したｔ-検定)を示す。Ｍ2親和性に対するＭ3親和性の倍率は、化合物(e)の場合で5.0±1.1倍、化合物(j)の場合は2.8±0.8倍であった。このことは、キラル中心3'の立体配置がこの種のソフト型抗コリン作動薬の安全性プロファイルに重要な役割を果たしている可能性を示す。
先に得られたラセミ体(±)GAおよび異性体2R-GAの受容体結合ｐＫiも表４に示す。親のエステル型ソフト薬剤の加水分解により生成した酸性部分はその薬剤を不活性化するというソフト薬剤の設計原理と一致して、両性イオンはそれらの対応する親エステルより活性がかなり低いことが判明した。例えば、(±)-GAのｐＫiは5.5〜6.4であるのに対して、化合物(a)は7.8〜8.3、化合物(b)は7.3〜7.9；そして2R-GAのｐＫiは7.5〜8.2であるのに対して、化合物(d)は8.9〜9.5、化合物(d)は8.7〜8.9 (3〜4)であった。先に述べたように、両性イオン代謝産物も、その構造における電子分布が中性の活性な抗コリン作動薬のそれにやや似ているために、いくらかの活性を保持している。
この試験では、この種の抗コリン作動薬の立体特異性／立体選択性のより良好な像を得るために、検討のためのモデル化合物として両性イオン形態を選択した。これは、両性イオンGAは、そのラセミ体とその2R異性体形態のいずれも、非常に可溶性が高く、水溶液 (緩衝液または生物学的媒質、pH 6〜8) 中で安定であったためである。また、2R-GAは局所部位 (例、ウサギの眼) で活性あることが認められ、尿から急速に未変化のまま排出されることができた (ラットのi.v.投与後のｔ1/2は10〜15分)。
表４において、±GAの完全に分割された８種類の異性体である2R1'R3'R-GA, 2R1'S3'R-GA, 2R1'R3'S-GA, 2R1'S3'S-GA, 2S1'R3'R-GA, 2S1'S3'R-GA, 2S1'R3'S-GA, 2S1'S3'S-GAのｐＫiは4.5〜8.6の広い範囲内であった。いずれの場合も、2R異性体は2S異性体より効力が高く、1'S異性体は1'R異性体より効力が高い。3'Rおよび3'S異性体の相対的な効力は、キラル中心２の立体配置に依存して変動し、例えば次のようであった: 2R1'R3'S＞2R1'R3'Rおよび2R1'S3'S＞2R1'S3'R；ただし2S1'R3'R＞2S1'R3'Sおよび2S1'S3'R＞2S1'S3'S。また、前のメチルエステル異性体の場合と同様に、酸の2R異性体の中では、2R3'S異性体 (2R1'R3'Sおよび2R1'S3'S) が最も高いＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性 (5.2〜5.5倍) を示した。2S異性体はＭ3／Ｍ2選択性を示さなかった。従って、この種の抗コリン作動薬のＭ3／Ｍ2選択性に対するキラル中心2および3'立体配置 (2R3'S) の重要性が実証された。
各キラル中心に基づく相対的な立体選択性 (倍率) を示すために、各対応する異性体対の結合活性の比を算出し、結果を表５に示す。表示した結果は、表４における受容体結合親和性、ｐＫiから算出した相対的効力 (倍率) である。2R異性体と2S異性体との間の受容体結合親和性の差は顕著である (メチルエステル異性体では27〜447倍、両性イオン異性体では6〜4467倍)。
メチルエステルの3'R異性体 (キラル中心１が未分割、2R3'Rおよび2S3'Rメチルエステル) は、それらの対応する3'S異性体 (2R3'Sおよび2S3'Sメチルエステル) より高活性 (1.5〜12.9倍) であった。しかし、酸では、3'S異性体は必ずしも対応する3'R異性体より高活性ではなかった。例えば、2R異性体では、3'S＞3'R '(2R1'R3'S＞2R1'R3'Rおよび2R1'S3'S＞2R1'S3'R) であったが、2S異性体では3'R＞3'S (2S1'R3'R＞2S1'R3'Sおよび2S1'S3'R＞2S1'S3'S) であった。また、2R1'R3'Sと2R1'R3'Rとの間には、2R1'S3'Sと2R1'S3'Rとの間より著しい差が(前者が8.7〜14.1倍に対して後者が1.0〜2.0倍)、そして2S1'R3'Rと2S1'R3'Sとの間には、2S1'S3'Rと2S1'S3'Sとの間より著しい差がある(前者が11.0〜23.4倍に対して後者が4.1〜6.8倍)。
これらの結果は、キラル中心3'に基づく活性が残り２つのキラル中心2および1'の立体配置により影響されうることを示している。８個全ての両性イオン異性体 (３個すべてのキラル中心が分割されている) を比較すると、すべての場合において1'S異性体が対応する1'R異性体より高活性である (1.8〜22.4倍) ことをはっきり示している。
Figure 0005257073
いずれの場合も、ヒル係数(n)は１から非常に異なってはいなかった。このことは、一般に、薬剤−受容体相互作用が作用の法則に従っていて、結合が１つのサイトのみで起こったことを示している。
ｐＡ 2 試験
ｐＡ2値はモルモット回腸収縮アッセイから求めた。このアッセイは、作用薬−反応曲線において右方に２倍のシフトを生ずる拮抗薬のモル濃度の負対数を表示するもので、抗コリン作動性親和性 (Ｍ3ムスカリン受容体の) の標準的な機能試験である。本試験のソフト型抗コリン作動薬について、van Rossum [Arch. Int. Pharcodyn. 143: 299-330 (1963)] の方法による作用薬としてカルバコールを用いた回腸縦方向収縮から得られたｐＡ2値を表４に示す。
ｐＡ2値は一般に、Ｍ3受容体結合試験で得られたｐＫi値に匹敵しうる。新たに開発された両性イオン異性体のｐＡ2値は、2R配置と2S配置との間で有意に異なっていた (それぞれ6.32〜7.45と＜4〜5.69、ｐ＜0.01、等分散を仮定したｔ-検定)。上に報告した2R異性体 (2R-GA) と同様に、完全分割された2R異性体 (2R1'R3'R-GA, 2R1'S3'R-GA, 2R1'R3'S-GA,および2R1'S3'S-GA) のｐＡ2値は、親化合物である対応する2Rエチルおよびメチルエステル型ソフト薬剤のそれより1〜2だけ小さく、これらの両性イオン型化の活性が1〜2桁小さいことを意味している。一部の両性イオン代謝産物異性体が温和な活性を保持しているのは、恐らく、中性の高活性抗コリン作動薬の構造に似た空間的に近い構造によるものである。活性な2R異性体では、2R1'R3'R-GAがより低い値 (6.32) を示したが、残りは全て類似した温和な収縮活性 (約7.15〜7.45) を示した。
・散瞳活性
完全分割された８個の両性イオン異性体の散瞳効果を、(±)-GA、2R-GA、グリコピロレートおよびトロピカミドのそれと、ウサギin vivo試験で比較した。100μlの局所投与後、散瞳反応を瞳孔サイズの変化率(％)として適当な時間間隔で記録した。最大反応 (Ｒmax、投与後30分〜1時間での瞳孔サイズの変化率) および反応時間曲線下面積 (AUCeff 0-168h)を表６に示す。
Figure 0005257073
上の結果は、in vitro試験と同様に、2R異性体が2S異性体よりずっと効力が高い (2Sの用量を0.4％に高めても) こと、および2R1'R3'R-GAは残り３つの2R異性体より効力が低いことを示している。図４に、0.1％での４つの2R異性体および１つの1'S異性体 (最も高活性のS異性体) の活性−時間プロファイルを示す。最も強力な３つの2R異性体の0.1％の用量での瞳孔散大効力は、0.05〜0.1％のグリコピロレートおよび0.5％のトロピカミドのそれに類似しているが、ソフト薬剤の設計原理に見合って、それらの作用持続時間は、「ハード」型のグリコピロレートよりずっと短く (それぞれAUC 200〜300と2500)、トロピカミドのそれよりもやや短かった。図５に示すように、2R1'S3'R-GA (最も高活性の両性イオン異性体) およびグリコピロレートの活性はそれぞれ10時間および144時間持続した。
これらの結果は、一部の2R両性イオン異性体でも良好な薬理学効果を達成することができ、これらの異性体は身体から急速に排出されうることを示している。さらに、活性な2R両性イオン異性体は、閉眼、流涙、粘液分泌といった観察可能な刺激反応、ならびに局所投与中の眼内圧変化を全く引き起こさなかった。また、他の慣用の抗コリン作動薬とは異なり、これらの2R両性イオン異性体は反対側の (水で処置された) 眼の瞳孔散大を誘発しなかった。このことは全身性副作用が皆無または少ないことを示している。従って、これらのソフト薬剤は安全で、望ましくない副作用の著しい低減の可能性を有する短時間作用型抗コリン作用薬として有望である。
・結論
グリコピロレートに基づいてN-置換ソフト型抗コリン作動薬であるメチルおよびエチルエステル類およびそれらの両性イオン型代謝産物の各種異性体を合成し、分離した。それらの薬理活性ををin vitroおよびin vivoで評価した。受容体結合 (ｐＫi) の結果は、立体特異性および立体選択性がこれらのソフト型抗コリン作動薬では非常に重要であることを示している。これらの化合物の構造に提示されたキラル中心は３個であった。受容体結合活性の最も顕著な向上は2R立体配置で認められ、次いで1'Sであった。3'Rおよび3'Sの活性は、他の２つのキラル中心の立体配置により影響されることがあった。Ｍ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性の向上は、2R3'S立体配置、次いで2R3'Rにおいて最も顕著に認められた。キラル中心1'の立体配置はＭ3／Ｍ2ムスカリン受容体サブタイプ選択性には影響を示さなかった。
匹敵しうる結果がモルモット回腸アッセイ (ｐＡ2) からも得られた。両性イオン異性体に対するウサギ散瞳試験でもこれらの抗コリン作動薬の立体特異性がさらに確認された。８種類の両性イオン異性体の薬理学的効力は、2R1'S3'S＝2R1'S3'R＝2R1'R3'S＞2R1'R3'R＞2S1'S3'R＞2S1'S3'S＝2S1'R3'R＞2S1'R3'S (スチューデントｔ-検定、ｐ＜0.05)であると決定された。ウサギの眼に局所投与 (0.1％) すると、一部の2R-両性イオン異性体 (2R1'S3'S、2R1'S3'Rおよび2R1'R3'S) はグリコピロレートおよびトロピカミドに似た散瞳効力を示した。しかし、それらの散瞳効果は持続時間がかなり短く、反対側の水で処置された眼には瞳孔の散大を誘発しなかった。このことは、それらのソフトの性質に見合って、それらが局所的に活性であって、全身性副作用を引き起こすには効力が低く、安全であることを示している。これらのグリコピロレート系ソフト型抗コリン作動薬の有用性および安全性は従って、ここにさらに証明されたことになる。
さらなる合成および生物学的試験
下に示す一連の純粋な立体異性体ソフト型グリコピロレート類似物(3)、(4)および(5)を、キラル中間体を使用し、合成の最後の第四級化工程において生成した立体異性体を慎重に分離することによって合成した。生成物の立体化学は、各種の1Dおよび2D NMR技法を用いて解明した。合成された新たな化合物の抗コリン作動活性は、受容体結合試験により、さらに摘出された器官での試験の実施およびin vivo試験により測定した。受容体結合は、より高級なアルキルエステル系列では、(2R,1'R,3'R)および(2R,1'S,3'S)異性体が最も高い受容体親和性を示す化合物であることを示した。また、アルキル鎖の長さに制限があることも実証された。In vitro摘出器官の実験は、受容体結合の結果とよく相関した。また、in vivo試験は、本化合物のソフトな特性を示した。
最も有効な抗コリン作動性化合物の１つはグリコピロレート [3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1,1-ジメチルピロリジニウム・ブロミド、下記の(1)] である。この化合物は第四級Ｎ原子を含有し、その電荷のために、これは脂質膜を通過することが妨げられ、そのため、例えばアトロピンと比べて、グリコピロレートはCNS-関連副作用が少ない。この分子は２つのキラル中心を含有する：アシル基の２位とピロリジニルオキシ部分の３’位である。従って、この化合物は、(2R,3'R)、(2R,3'S)、(2S,3'R)、(2S,3'S) という４種類の立体異性体の形態で存在しうる。販売されている本薬剤は立体異性体の混合物であるが、(2R,3'R)形態は臭化リトロピロニウム (Ritropirronium) として知られている。
Figure 0005257073
下の式(2)、(3)および(6)の化合物のようなグリコピロレートのソフト型類似物は、３個のキラル中心 [親分子の２つのキラル中心に加えて、２つの異なる置換基を有する第四級窒素も非対称(不斉)] を含んでおり、これらについても既に上述し、予期されたソフトな特性を有することを示した。この特性は、比較的短い作用持続時間と低い全身性副作用により現れている。さらに、エステル(2)および(3)の酵素加水分解によって対応する両性イオン型の酸(6)が生成し、これがラットではずっと活性が低く、すぐに排出されることが示された。最初に合成したソフト型類似物は可能な８種類全ての立体異性体の混合物であるか、或いは(R)形態のシクロペンチルマンデロイル単位を含み、残り２つのキラル中心はラセミ形態のままである４種類の立体異性体の混合物のいずれかであった。
Figure 0005257073
化合物(2)および(3)の有利な生物学的試験の結果を考えると、いずれかの純粋な立体異性体型のものが残りのものに対して何らかの利点を有するかどうか、という疑問が出てきた。従って、本研究の目的は、ソフト型グリコピロレート類似物(3)、(4)および(5)の純粋な立体異性体を合成および試験し、同時にＲとしてより高級なアルキル基が抗コリン作動活性の程度および時間的推移に及ぼす影響を検討することであった。従って、主な目標分子はヘキシルエステル(4)およびオクチルエステル(5)の純立体異性体であった。ただし、シクロペンチルマンデロイル単位のC-2の立体配置は(R) に固定した。これは文献データが(R)-シクロペンチルマンデロイル誘導体はそれらの(S)-対応分子より抗コリン作動活性が高いこと示していたからである。これは、２つのキラル中心 (ピロリジニルオキシ部分のN-1'およびC-3') だけ、従って、４種類の立体異性体だけを考慮に入れればよいことを意味していた。また、比較のために、エチルエステル(3)の類似の純立体異性体も合成した。
純立体異性体の合成
目標化合物は、主要中間体(10) (図式４を参照) のブロモ酢酸エステル、それぞれ(11)、(12)および(13) による第四級化により調製された。ここで、化合物(10)は、(2R,3'S)および(2R,3'R) ジアステレオマーの混合物として (方法Ａ) または個々ののジアステレオマーとして (方法Ｂ) のいずれかで使用した。
化合物(10)のジアステレオマー混合物は、最初は、公知方法である(R)-メチル・シクロペンチルマンデレート(8)のラセミ体1-メチル-3-ピロリジノール [(R,S)-(9)]によるエステル交換反応により調製した。後になって、(R)-シクロペンチルマンデル酸(7)と(R,S)-(9)との光延 (ミツノブ) 反応条件下での直接結合によりずっと高い収率を達成しうることが判明した。他方、(10)の個々のジアステレオマーは次の２つの異なる経路を経て得られた。即ち、上述したような(R)-メチル・シクロペンチルマンデレート(8)の(S)-1-メチル-3-ピロリジノール [(S)-(9)]によるエステル交換反応は、C-3'の立体配置を維持したまま進行し、(2R,3'S)-(10)を生じた。これに対し、(R)-シクロペンチルマンデル酸(7)と同じ(S)-(9)とのミツノブ反応条件下での直接結合は (C-3'の立体配置の反転によって)、(2R,3'R)-(10)を生じた。
Figure 0005257073
次に、方法Ａでは、(2R,3'S)-(10)と(2R,3'R)-(10)との混合物をそれぞれブロモ酢酸エステル(12)および(13)で第四級化すると、N-1'に新たなキラル中心の生成を生じて、それぞれ目標化合物(4a〜4d)および(5a〜5d)の４種類の立体異性体の混合物が生成した。各種のクロマトグラフィーおよび結晶化法の組合わせによる個々の立体異性体への分離は部分的にしかできなかった (下の実験の説明を参照)。
純立体異性体の分離は、もう一方の手法の場合はより単純であった。方法Ｂでは、(2R,3'S)-(10)をそれぞれブロモ酢酸エステル(11)および(12)で第四級化すると、２種類の立体異性体、即ち、それぞれ化合物(3)および(4)の両方の(2R,1'R,3'S)および(2R,1'S,3'S)バージョンのもの、しか生成せず、これらの化合物の分離はあまり困難を伴わずに達成された。他方、上記と完全に同様にして、(2R,3'R)-(10)から出発した第四級化は、他方の対の異性体、即ち、それぞれ最終生成物(3)および(4)の(2R,1'R,3'R)および(2R,1'S,3'R)バージョン、の生成を生じた。最後に、12種類の目標化合物 (3a〜3d、4a〜4dおよび5a〜5d)のうち、２対の化合物、即ち、3a＋3bとさらに5a＋5bは、分離不可能な化合物として得られたが、他の全ての立体異性体は純粋な状態で単離できた。(3a〜3d)は本書ではそれぞれ化合物(k), (l), (m)および(n)とも呼ばれ；(4a〜4d)は本書ではそれぞれ化合物(o), (p), (q)および(r)とも呼ばれ；(5a〜5d)は本書ではそれぞれ化合物(s), (t), (u)および(v)とも呼ばれることに留意されたい。
構造解明と立体化学の帰属
新たな目標化合物の構造および立体化学を詳細なNMRの検討により解明し、サンプルの純度はHPLCにより確認した。個々の立体異性体の帰属について、４種類の異性体ヘキシルエステル(4a〜4d)を例にとって下に例示する。完全な1Hおよび13C NMRシグナル帰属は、1H, 13C, DEPTおよび二次元1H,1H-COSY, 1H,1H-TOCSYおよび1H,13C-HSQC相関実験を適用することにより行われた。特性 1Hおよび13C 化学シフトは表７にまとめて示す。異性体(4a〜4d)の化学シフトが非常に類似していることから、構造の単純な区別は可能ではなかった。+NCH3 および +NCH2COOR の化学シフトだけが特徴的な差を示した。立体化学を明らかにするため、一次元選択的NOESY、二次元ROESYおよびNOESYスペクトルを利用して、プロトン間距離が５Å未満であるとの証拠を得た。図式５の二重矢印は、検出された関連NOE 1H／1H 立体的近接を示す。
Figure 0005257073
Figure 0005257073
化合物(4b) における +NCH3 シグナルの選択的照射は、Hcis-4'およびortho水素シグナルでのNOE強度増強を生じた。これは明らかに1'S立体配置と、同時にO-アシル部分の図示された好ましい立体配座を実証していた。(4a) における NCH3 シグナルの照射は、ピロリジン環と同じ側に位置する水素原子Htrans-2'のみをマークした。化合物(4d)の場合、ROESYスペクトルにおける強い +NCH3/H-3' クロスピークの出現が1'S立体配置の証拠を与えたのに対し、H-3'/Hortho応答はO-アシル基の立体配座を明らかにした。
化合物(4c)では、不都合なシグナル重複 (例、+NCH3 と H-4'trans) のために、二次元測定はうまくいかない。この場合は、一次元選択的NOESYを再び利用した。Hortho水素原子を照射すると、小さいが顕著なNOEが +NCH3 シグナルで観察された。これは上に描かれた立体配置および立体配座と一致する。
ピロリジン環の擬回転 (pseudorotation) および化合物(4a〜4d)の高い柔軟性のために、配座平均化構造が予想される。これにもかかわらず、+NCH3シグナルの異常なアップフィールド (upfield) シフト (3.24および3.03 ppm) は、芳香環の平面より上方に位置する水素原子がより小さな化学シフトを示すという芳香環の周知の異方性シールディング効果により説明されうる。この化合物(4a)および(4d)の NCH2 (cis) 水素原子のより小さな化学シフト (4aでは4.74; 4.86、4bでは4.52; 4.69) は、相対的な立体配置に合致している。芳香環が窒素原子の方を向くという化合物(4a〜4d)の立体配座の優先性は、フェニル基のπ系による窒素原子の正電荷の安定化に合致している。
生物学：抗コリン作動活性の評価
・受容体結合
上記のソフト型グリコピロレート類似物(3a〜3d)、(4a〜4d)および(5a〜5d)のムスカリン受容体に対する親和性の評価を、リガンドとして [3H]QNBを、受容体供給源としてラット皮質膜標品を用いて実施した。これらの化合物のムスカリン受容体 (主にこの標品中のＭ1) に対する親和性 (表８にまとめて示す) は、参照化合物であるグリコピロレート (Ｋi＝0.8 nM) およびアトロピン (Ｋi＝1.9 nM) の親和性より１〜２桁小さいことが判明したが、本発明の化合物は、なお強力なムスカリン受容体の拮抗薬であった。この相互作用の性質は、急峻なヒル傾斜により特徴づけられ、その値は拮抗薬作用を表示する１に近かった。
純立体異性体間の作用の差はヘキシル系列内において最もはっきり認められた。この場合には４種類の可能な立体異性体がすべて純粋状態で分離されたからである。化合物(4b) (2R,1'S,3'S)および(4c) (2R,1'R,3'R)は同程度に、(4a) (2R,1'R,3'S)または(4d) (2R,1'S,3'R)よりも約４倍は活性が高かった。同じ傾向は、より活性が低いオクチル系列 (5b, 5c) の場合にも、残りの２つの異性体 (5a＋5d) は混合物として試験したものの、明らかに認められた。
上記の(2R,1'S,3'S)および(2R,1'R,3'R)化合物は、より大きな第四級化基 (CH2COOR) をシクロペンチルマンデロイルオキシ部分に対してtrans位置に含んでおり、このことから、立体的により混み合っていないというこれらの異性体の性質が、立体的により混み合っているcis異性体に比べて受容体親和性がより高いということに寄与していると推測される。
Figure 0005257073
 他方、エチルエステル系列では、異性体(3c) (2R,1'R,3'R)および(3d) (2R,1'S,3'R)、即ち、シクロペンチルマンデロイルオキシ部分がα位でピロリジン環に結合している化合物類がより高い親和性を有しており、この場合は、より小さなCH2COOEt基の立体的位置が受容体親和性にはあまり影響を及ぼさないことを示している。
受容体結合に及ぼすエステル基のアルキル鎖長の影響は、炭素数６の部分までは無視できるようであったが、より長い鎖長を使用する場合には、鎖長が既に受容体結合に影響を及ぼしていた (ヘキシル系列とオクチル系列の全体を比較)。
・摘出器官を用いたex vivo実験
モルモット気管および回腸アッセイにおけるｐＡ2値の測定は予想された結果を生じた
。両方の摘出器官標品における受容体結合実験で一致して、アトロピンおよびグリコピロレートは、受容体親和性が著しく異なる化合物を代表するように選択した本発明の選ばれたグリコピロレート類似物より高活性であった (表９)。エチルおよびヘキシル側鎖含有化合物 (3cおよび4b) は、実質的に同程度に有効であったが、オクチル鎖含有エステルはより弱い活性を示した。
Figure 0005257073
 ・in vivo実験
・ラットにおけるカルバコール誘導徐脈
選択された新規化合物の徐脈防護効果は、それらの受容体結合親和性およびそれらの摘出器官実験での活性の両方と同様であった。同じように、それらのin vivo活性 (図６) はグリコピロレート (GP) のそれより低かったが、より重要なことは、それらの作用持続時間が親化合物のそれより顕著に短かったことであり、それらの潜在的なソフトな特徴を示している。
実験
・化学
融点はBoetius顕微鏡で求めた値で、未補正である。化合物の純度はTLCプレート (シリカゲル、Merck) で試験した。スポットは紫外光下および／またはヨウ素蒸気への露出により視覚化した。NMRスペクトルは、500/125 MHz (1H/13C) で動作するBruker Avance 500 分光計を用いて、CDCl3, DMSO-d6またはCD3OD溶液中で記録した。化学シフトはδスケールで示し、TMS参照であった。1Dおよび2D NMR実験に対するパルスプログラムはBrukerソフトウェアライブラリーからとった。構造解明およびNMRシグナル帰属のために、1H, 13C, DEPT-135、選択的1D-NOESY、1H,1H-COSY, 1H,1H-TOCSY, 1H,13C-HSQC, 1H,13C-HMBC, 1H,1H-ROESYおよび1H,1H-NOESYスペクトルを記録した。
化合物(3)、(4)および(5)の分析用HPLCは、1 ml/min流量で動作する510型アイソクラティックポンプと、注入容積10μlのWISPプログラマブル自動注入器と、プリセット波長220 nmの486型シングルチャネル可変波長UV検出器とから構成される、Waters (マサチューセッツ州ミルフォード) HPLCシステムを用いて実施した。適用したHPLC固定相は150×4 mmサイズのProntosil 120 C18 AQ 5μmカラムであった。カラム温度：40℃。最適移動相は、30 mM酢酸アンモニウム／MeOH／アセトニトリルの混合液で、混合比は化合物(3) については55／17.5／27.5 (v/v/v)、化合物(4)では34／16／55 (v/v/v)、化合物(5)では18／20／60 (v/v/v)であった。
2-シクロペンチルマンデル酸(7)の鏡像異性体純度は、Nucleosil Chiral-1 5μm、250×4 mm キラルHPLCカラムでのキラルリガンド交換クロマトグラフィーにより求めた。移動相は、0.5 mM CuSO4／アセトニトリル 97／3 (v/v)、流量：1 ml/min、カラム温度：60℃、検出波長：220 nmであった。個々の鏡像異性体の保持時間は、それぞれ13.5分 (R)および15.5分(S)であった。認められた選択性は1.18であった。
(R)-2-シクロペンチルマンデル酸 [(R)-(7)] は、ラセミ体の酸を(-)-シンコニジンにより光学分割して得た。(R)-メチル 2-シクロペンチルマンデレート [(R)-(8)] は文献記載のように合成し、(R,S)-および(S)-1-メチル-3-ピロリジノール [それぞれ(R,S)-(9)および(S)-(9)] は、それぞれ(R,S)-および(S)-リンゴ酸から出発して、前述したように２段階で合成した。ブロモ酢酸エチル(11)はAldrichから購入したが、同種のブロモ酢酸n-ヘキシル(12)およびn-オクチル(13)は、対応するアルコールと臭化ブロモアセチルとの反応により合成した。元素分析の実測値は±1％の範囲内で計算値と一致した。
・第四級化目標化合物(3)、(4)および(5)の合成
・方法Ａ
(2R,3'R)-(10)と(2R,3'S)-(10)との混合物 (1.0 mM) を、アセトニトリル (12 ml)中のアルキル化剤(12)または(13) (2.0 mM) と一緒に室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を蒸発させ、生成物を下に各化合物について個別に述べた方法により単離した。
・方法Ｂ
アセトニトリル (5 ml)中の(2R,3'R)-(10)または(2R,3'S)-(10) (0.3 mM) とアルキル化剤(11)または(12) (0.6 mM) との混合物を、上記方法Ａにおいて述べたように反応させ、粗生成物を単離した。
・(2R,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(3a) [化合物(k)] および
(2R,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(3b) [化合物(l)]
(2R,3'S)-(10)から出発して、上記方法Ｂに従った。得られた粗生成物を、クロロホルム−メタノール9:1で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、(3a)および(3b)を分離不能な混合物として単離した。収率：54％、融点163℃、(3a)／(3b)比 (1H-NMR)：4:1。
(3a) 1H NMR (CDCl3) d 3.68 (3H, s, NCH3), 4.78 (1H, d, NCH2), 4.89 (1H, d, NCH2), 5.55 (1H, m, H-3’); (3b) 1H NMR (CDCl3) d 3.27 (3H, s, NCH3), 5.26 (1H, d, NCH2), 5.30 (1H, d, NCH2), 5.51 (1H, m, H-3’)。
・(2R,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(3c) [化合物(m)] および
(2R,1'S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(エトキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(3d) [化合物(n)]
(2R,3'R)-(10)から出発して、上記方法Ｂに従った。生成物(3c)および(3d)を、クロロホルム−メタノール9:1で溶離する粗生成物のシリカゲルクロマトグラフィーにより分離した。
(3c): 収率：19％, 融点98℃, 純度 (HPLC): 93％。
1H NMR (CDCl3) d 1.29 (3H, t, CH 3 CH2O), 2.24 (1H, m, Hc-4’), 2.94 (1H, m, HC-C-2), 3.02 (3H, s, NCH3), 3.07 (1H, m, Ht-4’), 3.88 (1H, m, Hc-2’), 4.13 (1H, m, Hc-5’), 4.23 (2H, q, CH3 CH 2 O), 4.46 (1H, m, Ht-5’), 4.56 (1H, m, Ht-2’), 5.10 (1H, d, NCH2), 5.22 (1H, d, NCH2), 5.56 (1H, m, H-3’), 7.28 (1H, t, Php), 7.37 (2H, t, Phm), 7.58 (2H, d, Pho)。
(3d): 収率：28％, 融点70℃, 純度 (HPLC): 96％。
1H NMR (CDCl3) d 1.33 (3H, t, CH 3 CH2O), 2.24 (1H, m, Hc-4’), 3.66 (3H, s, NCH3), 4.65 (1H, d, NCH2), 4.74 (1H, d, NCH2), 5.54 (1H, m, H-3’), 7.27 (1H, t, Php), 7.35 (2H, t, Phm), 7.59 (2H, d, Pho)。
・(2R,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-ヘキシルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(4a) [化合物(o)] および (2R,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-ヘキシルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(4b) [化合物(p)]
(2R,3'S)-(10)から出発して、上記方法Ｂに従った。生成物(4a)および(4b)を、クロロホルム−メタノール9:1で溶離する粗生成物のシリカゲルクロマトグラフィーにより分離した。
(4a): 収率：18％, 融点146℃, 純度 (HPLC): 93％。
(4b): 収率：23％, 融点125-128℃, 純度 (HPLC): 96％。
NMRデータについては上記の(4a〜4b)を参照。
・(2R,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-ヘキシルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(4c) [化合物(q)] および (2R,1'S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-ヘキシルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(4d) [化合物(r)]
(2R,3'R)-(10)から出発して、上記方法Ｂに従った。生成物(4c)および(4d)を、クロロホルム−メタノール9:1で溶離する粗生成物のシリカゲルクロマトグラフィーにより分離した。
(4c): 収率：20％, 融点138℃, 純度 (HPLC): 98％。
(4d): 収率：55％, 融点116℃, 純度 (HPLC): 95％。
NMRデータについては上記の(4c〜4d)を参照。
別の方法として、上記方法Ａに従って化合物(4a〜4d)を合成した後、生成物(4b)および(4c)は後述するようにして純品状態で単離することができたが、(4a)および(4d)は分離不能な混合物の状態で得られた。すなわち、粗生成物を酢酸エチルと共に摩砕すると、混合物(4a+4d) [化合物(o)および(r)]が固体として得られた (収率: 42％)。母液を濃縮乾固し、残渣をクロロホルム−メタノール9:1で溶離するカラムクロマトグラフィーにより精製した。その後、クロロホルム−メタノール9:1で展開する分取用薄層クロマトグラフィーにより、化合物(4b) (収率: 12％) [化合物(p)]および(4c) (収率: 6％) [化合物(q)]が分離された。
・(2R,1'R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-オクチルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(5a) [化合物(s)]、(2R,1'S,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-オクチルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(5b) [化合物(t)]、(2R,1'R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-オクチルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(5c) [化合物(u)]、および (2R,1'S,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-(n-オクチルオキシカルボニルメチル)-1-メチルピロリジニウム・ブロミド、(5d) [化合物(v)]
上記方法Ａに従い、クロロホルム−メタノール9:1で溶離するリカゲルカラムクロマトグラフィーによる粗生成物の精製により、化合物(5a)および(5d) [化合物(s)および(v)] を、TLCおよびHPLCによる分離が不可能な混合物の状態で得た。一方、化合物(5b) [化合物(t)] および化合物(5c) [化合物(u)] は、クロロホルム−メタノール9:1で展開する最終的な分取用薄層クロマトグラフィーにより分離できた。
(5a)および(5d)の混合物：収率：47％, (5a)/(5d)比：(1H-NMR): 1:1。
(5a) 1H NMR (CDCl3) d 2.10 (1H, m, Hc-4’), 3.64もしくは3.67 (3H, s, NCH3), 4.71 (1H, d, NCH2), 4.81 (1H, d, NCH2);
(5d) 1H NMR (CDCl3) d 2.28 (1H, m, Hc-4’), 3.64 or 3.67 (3H, s, NCH3), 4.54 (1H, d, NCH2), 4.67 (1H, d, NCH2)。
(5b): 収率：10％, 融点30℃, 純度 (HPLC): 86％。1H NMR (CDCl3) d 0.90 (3H, t, CH 3 CH2), 2.00 (1H, m, Hc-4’), 2.93 (1H, m, HC-C-2 and 1H, m, Ht-4’), 3.27 (3H, s, NCH3), 4.10 (1H, m, Hc-5’), 4.18 (2H, t, CH3 CH 2 ), 4.18 (1H, m, Hc-2’), 4.29 (1H, m, Ht-5’), 4.58 (1H, m, Ht-2’), 5.16 (2H, s, br, NCH2), 5.56 (1H, m, H-3’), 7.27 (1H, t, Php), 7.35 (2H, t, Phm), 7.57 (2H, d, Pho)。
(5c): 収率：7.5％, 純度 (HPLC): 93％。1H NMR (CDCl3) d 0.89 (3H, t, CH 3 CH2), 2.28 (1H, m, Hc-4’), 2.93 (1H, m, HC-C-2), 2.53 (3H, s, NCH3), 3.05 (1H, m, Ht-4’), 3.86 (1H, m, Hc-2’), 4.12 (1H, m, Hc-5’) 4.16 (2H, t, CH3 CH 2), 4.30 (1H, m, Ht-5’), 4.50 (1H, m, Ht-2’), 4.97 (1H, d, NCH2), 5.10 (1H, d, NCH2), 5.58 (1H, m, H-3’), 7.27 (1H, t, Php), 7.38 (2H, t, Phm), 7.59 (2H, d, Pho)。
・(2R,3'R)および(2R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-メチルピロリジン [(2R,3'R)-(10)および(2R,3'S)-(10)]の混合物
テトラヒドロフラン (4 ml) 中の(R)-(7) (1.5 mM)、(R,S)-(9) (1.64 mM) およびトリフェニルホスフィン (1.5 mM) の混合物に、室温でテトラヒドロフラン (1 ml) 中のアゾジカルボン酸ジイソプロピル (1.5 mM) の溶液を滴下した。この反応混合物を室温で２時間撹拌し、溶媒を減圧除去した。残渣を酢酸エチル中に懸濁させ、1N塩酸で抽出した。得られた水溶液を5N水酸化ナトリウム水溶液でアルカリ性にした後、エーテルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮すると、表記化合物が無色油状物として得られた。収率：87％、純度(HPLC)：97％ (２つの未分割ピークの合計面積)。
(2R,3'R)-(10)および(2R,3'S)-(10)の1：1混合物。1H NMR (CDCl3) d 2.35および2.39 (3H, s, NCH3), 2.56および2.68 (1H, m, Hc-2’), 2.94 (1H, m, HC-C-2), 3.75 (1H, s, HO-C-2), 5.24 (1H, m, H-3’), 7.27 (1H, t, Php), 7.36 (2H, t, Phm), 7.67 (2H, d, Pho)。
・(2R,3'S) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-メチルピロリジン(2R,3'S)-(10)
公知のFrankoおよびLunsfordの方法に従って、メチルエステル(R)-(8)を(S)-(9)とのエステル交換反応に供した。収率：28％、純度 (HPLC)：97％。1H NMR (CDCl3) d 2.39 (3H, s, NCH3), 2.68 (1H, m, Hc-2’), 2.94 (1H, m, HC-C-2), 3.79 (1H, s, br, HO-C-2), 5.24 (1H, m, H-3’), 7.27 (1H, t, Php), 7.35 (2H, t, Phm), 7.67 (2H, d, Pho)。
・(2R,3'R) 3-(2-シクロペンチル-2-フェニル-2-ヒドロキシアセトキシ)-1-メチルピロリジン(2R,3'R)-(10)
上述したように光延(ミツノブ)反応条件下で(R)-(7)を(S)-(9)と結合させた。収率：49％、純度 (HPLC)：95％。1H NMR (CDCl3) d 2.34 (3H, s, NCH3), 2.93 (1H, m, HC-C-2), 3.78 (1H, m, HO-C-2), 5.23 (1H, m, H-3’), 7.27 (1H, t, Php), 7.34 (2H, t, Phm), 7.67 (2H, d, Pho)。
生物学：試験方法
・受容体結合アッセイ
ムスカリン受容体への[3H]キヌクリジニルベンジレート ([3H]QNB: Amersham, 42.0 Ci/mmol) の結合を、Barloccoら (1997) に既述のように若干変更されたYamamuraおよびSnyder (1974) の方法に従って測定した。
略述すると、雄性Sprague-Dawleyラット (180〜220 g) を断頭し、大脳皮質を摘出し、白質を捨てた。モーター駆動ガラスホモジナイザーを用いて、プールした組織を10倍量の氷冷50 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.4) 中でホモジナイズ処理した。得られたホモジネートを４℃、30,000 gで10分間遠心分離した。生じたペレットを上と同じ緩衝液により再懸濁によって２回洗浄した後、４℃、30,000 gで10分間遠心分離した。最終ペレットを10倍量のTris-HCl緩衝液中に再懸濁させ、使用まで−20℃で保管した。タンパク質含有量は、標準としてウシ血清アルブミンを用いてBradfordの方法 (1976) により求めた。
全ての結合実験において、膜 (0.25 mg/ml タンパク質)、放射性リガンドおよび競合薬剤は、最終量が1 mlの50 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.4) 中、25℃で60分間インキュベーションした。飽和の検討のために、膜を0.01〜2 nM [3H]QNBと共にインキュベーションした。競合実験では、放射性リガンドの最終濃度は0.2 nMであり、競合薬剤は８倍濃度にした。非特異的結合は1μM アトロピンで測定した。インキュベーションはBrandel Cell Harvesterを用いたWhatman GF/B フィルター上での急速減圧濾過により終結させた。サンプルを直ちに３×４mlの氷冷Tris-HCl緩衝液で洗浄し、6 mlのシンチレーション液中に置いた。放射能は液体シンチレーション計数により推定した。
データは少なくとも３回の反復実施した実験の平均±標準偏差である。GraphPad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., 米国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて、データの線形および非線形回帰分析を行った。飽和結合パラメータ (ＫdおよびＢmax) は、変換された飽和結合データの線形回帰分析により求めた。競合結合等温線を非線形回帰により分析して、IC50値とヒルズ傾斜 (Hills slope)の推計値を導出した。IC50値は、ChengおよびPrusoffの式 (1973) に従ってＫi値に転換させた。
・モルモット気管および回腸アッセイ(ｐＡ 2 値測定)
気管標品は、PreussおよびGoldie (1999) に既に詳述されているようにして作製された。略述すると、雄性Dunkin-Hartleyモルモット (280〜300 g) から気管を摘出し、環状標品 (幅2〜3 mm) を、95％ O2／5％ CO2 で通気されたクレブス重炭酸緩衝液を入れたオルガン浴中に500 mgの静止張力下に懸架させた。等尺性張力の変化を、ワタナベ・リコーダに連結した力−変位トランスデューサ (Experimetria, ハンガリー、ブダペスト) により測定した。累積濃度−効果曲線が、拮抗薬の不存在下および存在下でカルバコールに対して作製された。各動物において、２つの標品が時間対照 (time control) として (即ち、拮抗薬の不存在下での反復カルバコール曲線) として使用され、残り２つの標品は、２種類の異なる濃度の拮抗薬の存在下での反応を試験するために使用された。
拮抗薬は作用薬濃度：効果曲線の測定開始の30分前にオルガン浴に添加された。カルバコールに対する拮抗薬に関してシルド (Schild) プロットを作製し、ｐＡ2値ならびに傾斜の推測値を得た。
筋層間神経叢が付着している回腸の細長い筋肉短冊片 (ストリップ) も雄性モルモット (200〜400 g) から調製した。回盲弁に隣接した10 cm部分で小腸セグメント (8〜10 cm) を摘出した。細長い筋肉短冊片は、回腸全体のセグメントを1 mlピペットの上に載せ、その外側の細長い筋肉層を綿棒で優しく裂くことにより得た。この細長い筋肉短冊片を3〜4 cmの断片にカットした。得られた短冊片を37℃のタイロード液を入れたオルガン浴中に、500 mgの静止張力下で懸架させた。収縮は上記と同じ歪み計システムで等尺的に記録し、ワタナベ型ポリグラフ上に登録した。組織は30分間放置して平衡化させた。濃度を増大させつつアセチルコリンを添加することにより、作用薬に対する用量−反応曲線を作製した。用量は１分の接触時間で10分間隔で付与した。40分の平衡化時間の後、標品を拮抗薬と共に20分間インキュベーションし、アセチルコリンに対する２回目の濃度−反応曲線を作製した。作用薬 (Ach) は10分間隔で非累積的に添加した (濃度範囲：10-10 〜10-5 M)。拮抗薬は、個々の試験化合物に応じて、10-8〜10-5Mの濃度範囲で適用した。
反応は等尺性張力の変化として測定し、最初の濃度−反応曲線で得られた最大反応の％として算出した。拮抗薬効力の決定は、log (DR-1)対-log M拮抗薬濃度のシルド両対数 (二重対数) プロットを作製することにより行い、このプロットの傾斜 (勾配) を算出した。プロットの傾斜が１(unity) から有意に異なっていない場合には、相互作用は本質的に競合的であると認められ、拮抗薬効力をｐＡ2値として表した (Arunlakshana & Schild, 1959)。プロットの傾斜が１から有意に異なる場合には、Ariens & Van Rossum (1957) の方法を用いて、非競合的拮抗薬の特性決定のためにｐＤ'値を求めた。統計有意性はANOVA、続いてDunnett検定により評価した。
・カルバコール誘導徐脈に対する拮抗薬効果
既にJuhaszら (1998) により詳述されている実験手順に従った。体重300〜350 gの雄性Sprague-Dawleyラットをペントバルビタールナトリウム (50 mg/kg i.p.) により麻酔した。15分の安定化時間の後、基底心電図 (ECG) 記録を開始した。針電極を麻酔したラットの足に皮下挿入し、ワタナベ記録計に接続した。心拍数 (１分あたり) の記録を、試験化合物の投与前、投与中、および投与後に、基本ECGパラメータが25 mm/secの紙送り速度で基底状態に戻るまで行った。すべての薬剤は頸静脈への直接注射により投与した。抗コリン作動薬は時間０においてほぼ薬力学等価量 (0.2、2.0μmol/kg) で投与し、カルバコール (5〜8μg/kg) は−5、5、10、15、20、30、45、60分の時点で注射した。
チオトロピウム誘導体の合成および生物学的試験
・化合物の構造
Figure 0005257073
b) 新規チオトロピウム類似物の合成
不活性代謝産物手法に従って、代謝感受性エステル官能基をチオトロピウム分子に導入して、新規ソフト型抗コリン作動性類似物を得た。シュウ酸ジメチル(XI)と2-チエニルマグネシウムブロミド [(XII)、下記の図式６を参照] との公知のグリニャール反応によって中間体(XIII)を調製した。化合物(XIII)に次いで、ナトリウム金属を触媒とするスコピン(XIV)との公知のエステル交換反応を受けさせると、対応するエステル(XV)が生成した。最後にブロモ酢酸エチルとの第四級化によって目標化合物(II) (R＝Et) が得られた。
2-チエニルマグネシウムブロミドは、エーテル中でマグネシウムと2-ブロモオチオフェンとから常法により調製した。スコピン(XIV)は、GB 1,469,781 (1974) に記載されているように、スコポラミン臭化水素酸塩から、エタノール中でホウ水素化ナトリウムにより処理することによって、中程度の収率で得られた。
Figure 0005257073
上記のソフト型臭化チオトロピウム類似物の合成は、単一の異性体を70％の収率で生じた。TLCの結果は、最後の第四級化工程の反応混合物中におけるさらなる新規成分をなにも示さなかった。NMR (二次元ROESY法) により、エトキシカルボニルメチル基はオキシラン環に近い方に位置することを示すことができた。この知見はやや予想外である。なぜなら、N-メチルの方がオキシラン環に向いているもう一方の異性体の方が、立体的混雑性が小さいと思われるからである。
二次元ROESY実験で得られた化合物(w)の立体化学 (数値は1H化学シフトと結合定数を示し、二重矢印は立体的近接性を示す)：
Figure 0005257073
・6β,7β-エポキシ-3β-ヒドロキシ-8-エトキシカルボニルメチル-8-メチル-1αH,5αH-トロパニウム・ブロミド・ジ-2-チエニルグリコレート、化合物(w)の合成
図式６において式(XV)で示されるスコピンエステルを上述のようにして、またはEP 418716 (USP 5,610,163に対応) に記載のような従来法により調製した。その後、このスコピンエステル (70 mg, 0.18 ml) を2 mlのアセトンに溶解した。ブロモ酢酸エチル (150μl, 0.45 mM) を加え、混合物を20℃で８日間反応させた。溶媒を減圧蒸発させ、水8 mlを加え、有機物をクロロホルムで抽出した。目的とする第四級塩は水相中にあり、凍結乾燥により得た。収量：70 mg (70％)。融点115℃。Al2O3での薄層クロマトグラフィー：Rf＝0.3 (CHCl3-CH3OH, 4:1) (4 ml 3回)。生成物の化合物(w)は、上の図式６に示した構造式(II)で示される。
・6β,7β-エポキシ-3β-ヒドロキシ-8-メチル-8-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルメチル)-1αH,5αH-トロパニウム・ブロミド・ジ-2-チエニルグリコレート、化合物(x)の合成
無水アセトニトリル3 ml中のスコピンエステル(XV) (0.5 mM) に、1.5 mMのブロモ酢酸トリクロロエチルを加えた。この混合物をアルゴン下で３日間撹拌し、アセトニトリルを減圧下で除去した。得られた油状残渣に水15 mlを加え、クロロホルムで抽出した (5 mlで３回)。水溶液を凍結乾燥すると、目的生成物が白色固体として得られた。収量：257 mg (79％)。融点105℃、Rf＝0.65 (CHCl3-CH3OH, 4:1)。生成物は下記構造式で示される。
Figure 0005257073
・6β,7β-エポキシ-3β-ヒドロキシ-8-カルボキシメチル-8-メチル-1αH,5αH-トロパニウム・ジ-2-チエニルグリコレート内部塩、化合物(aa)の合成
酢酸 (1.5 ml) 中の化合物(x) 0.35 mMおよびZn粉末 (0.6 mM) の懸濁液を３時間撹拌した。この混合物に、水 (2 ml) とクロロホルム (2 ml) とを加え、濾過した。溶媒を減圧蒸発させ、水3 mlを加えて、得られた溶液を凍結乾燥した。得られた粗生成物をメタノール (2 ml) に溶解し、Sephadex LH-20でのクロマトグラフィーにより精製した。得られた油状物をメタノール (2 ml) に溶解し、酢酸エチル (1 ml) で沈殿させると、固体生成物の化合物(aa)が得られた。収量：67 mg (38％)、融点158-165℃ (分解)。Rf＝0.45 (CHCl3-CH3OH, 4:1) 酸化アルミニウム上。生成物は下記構造式で示される。
Figure 0005257073
薬理学
１：受容体結合アッセイ
試験化合物の親和性の評価を、リガンドとして[3H]QNBを、受容体供給源としてラット皮質膜標品を用いて実施した。エチルエステル型化合物(w)は、ムスカリン受容体 (主にこの標品中のＭ1) に高い親和性 (表10) で結合したが、この親和性は参照化合物に比べると数桁小さかった。１に近い急峻なヒル傾斜は、その作用の拮抗薬性を示している。
Figure 0005257073
２：摘出器官を用いた実験
摘出気管実験では、化合物(w)の抗ムスカリン効果の測定を、モルモットの気管環状標品を用いて実施した。この場合、平滑筋収縮はムスカリンＭ3コリン受容体により主に媒介されるが、Ｍ2受容体の活性化も収縮発現に関与する。化合物(w)は本試験において優れた活性を示した。この化合物はアトロピンより高活性で、臭化イプラトロピウムよりわずかに有効性が低かった (表11)。
Figure 0005257073
３：麻酔ラットにおけるカルバコール誘導徐脈に及ぼす抗コリン作動薬の拮抗薬効果の測定
コリン様作用薬であるカルバコールの静脈内投与は、麻酔ラットに洞性徐脈 (ECGのPPサイクル長およびPRサイクル長の増大) を生じる。主にムスカリンＭ2受容体により媒介されるこの効果は、抗コリン作動薬の事前投与により防止することができる。化合物(w)の徐脈防護効果を、この系においてアトロピンおよび臭化イプラトロピウムのそれと比較した。図７を参照。化合物(w)は等モル用量のアトロピンより活性が低く、1/10用量の臭化イプラトロピウムよりやや活性が低かった。このことは、化合物(w)がムスカリンＭ1またはＭ3受容体よりＭ2受容体に対する親和性が低い可能性があることを意味している。図７を参照。
・電気刺激モルモット気管における化合物(w)および化合物(aa)の抗コリン作動性効果の時間経過の検討
実験手順：
Takahashi T.ら (Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:1640-1645, 1994) に記載された手順をを若干変更して用いた。
雄性Dunkin-Hartleyモルモット (300〜500 g) を致死させ、気管をすばやく取り出し、酸素通気した普通クレブス緩衝液中に入れた。上皮を取り除き、気管をラセン状に切断して長さ15 mmの短冊片を得た。１匹の動物から２つの短冊片を調製し、緩衝液が入っている10 mlのオルガン浴中で平行なステンレス鋼線の電界電極の間に懸架させた。この緩衝液は95％ O2および5％ CO2で連続通気された。組織を頻繁に洗浄しながら、1.0 gの静止張力下で１時間平衡化させた。
内因性プロスタグランジンの生成を阻止するため、インドメタシン 10-5(M)を試験中ずっと存在させた。実験前に、内因性タキキニン枯渇の目的で、カプサイシン (10-5 M) を添加し、この予備処理後30分でこれを洗い流した。組織はさらに、内因性カテコールアミン類の効果を阻害するために、実験10分前にプロプラノロール (10-6 M) で予備処理した。
等尺収縮性反応を、ワタナベ・ポリグラフに接続された力−変位トランスデューサ(Experimetria, ハンガリー) を用いて測定した。刺激装置 (CRS-ST-01-04、Experimetria) が、原点で40 Vの最大上電圧 (supramaximal voltage)および0.5 msの持続時間の二相方形波衝撃を付与した。刺激は、周波数4 Hzで15秒間の後、100秒の静止期間というサイクルで適用した。等しい大きさの安定な反応が少なくとも４回得られた後、拮抗薬 (最大下用量) を導入し、薬剤の最大効果が認められるまで系内に保持した。その後、試験薬剤を洗い流した。その後も少なくとも６時間または反応が元の反応の約50％に回復するまではさらに刺激を送り続けた。全ての試験について適当な時間管理を並行して実施した。
統計分析
収縮反応は、その個体の最大収縮の％で表した。作用のオフセットｔ1/5またはｔ1/2に関する時間は、試験拮抗薬の洗浄除去 (洗い流し) からコリン作動性反応の20％または50％回復を達成するまでの時間と定義される。
結果
実験中、典型的な軌跡が得られた。電気刺激により連続した安定な長く続く収縮が起こる。抗コリン作動薬を添加すると、阻害が異なる速度で発現し、該化合物の阻害効果は洗浄除去後も非常に異なる時間で持続する。図８に、異なる抗コリン作動性化合物の作用の時間経過を示す。算出された結果は表12にまとめて示す。図９には、試験された化合物の阻害の時間経過を示し、このデータから算出された結果は表13にまとめて示す。
化合物(w)および化合物(aa)のオンおよびオフ間のレートの差は非常に顕著である。
Figure 0005257073
Figure 0005257073
麻酔モルモットのアセチルコリン誘導気管支収縮における化合物の抗コリン作動性作用の検討
・実験手順
雄性Hartleyモルモット (320±120 g) (Charles River) を標準的条件下で収容した。モルモットをウレタン (2 g/kg、腹腔内) で麻酔し、気管にカニューレを挿管し、動物を小動物用呼吸ポンプ (Harvard Apparatus LTD, イギリス、ケント) を用いて呼吸させた。齧歯動物用肺機能記録システム (MUMED、イギリス、ロンドン) を用いて、呼吸背圧を測定し、記録した。薬剤投与のために、右頸静脈にもカニューレを入れた。この外科的準備後、動物を20分間安定化させた。アセチルコリン投与の10分前に、動物を人工呼吸装置から外して、ビヒクル (乳糖 10 mg)または種々の量の薬剤 (同じ量のビヒクル中に懸濁) を気管内投与した。その後、気管を人工呼吸装置に再接続し、肺の動きを監視した。アセチルコリン (10μg/kg) は10分ごとに６回静脈内投与した。
・結果
本発明の化合物(q)および(m)ならびにグリコピロレートは、いずれも本試験で誘発したアセチルコリン誘導気管支収縮に対する防護効果を示した。グリコピロレートは0.01 mg/kgの用量で、一方、化合物(q)および(m)は0.1 mg/kgの用量で投与した。図10を参照。本試験は、一般式(Ia)および(Ib)の化合物の有効性を評価することができる、喘息、慢性閉塞性肺疾患および他の閉塞性気道障害のモデルである。
Balb/cマウスにおける吸入試験化合物の気管支拡張効果の試験
体重範囲19〜22 gの雌性BALB/c マウスを、例えば、Charles River Laboratories (ノースカロライナ州キングストン)から得る。動物は餌と水を随意に摂取する。
エアゾール投与用の化合物を滅菌ダルベッコ・リン酸緩衝食塩水中で調製する。マウスを、カルーセル (回転) 型、鼻だけの露出チャンバーに入れ、ICN SPAG-2ネブライザーを用いて、エアゾール剤を５分間吸入させる。このネブライザーは約0.25 ml／分の流量で平均粒度1.3 ミクロンのエアゾールを発生させる。
10分後および36時間後に、マウスを全身プレチスモグラフ(体積変動記録器) チャンバーに移す。このプレチスモグラフチャンバー内に80 mg/mlのメタコリン (MC) エアゾール剤を５分間投与することにより、マウスに気管支収縮を誘導する。マウスには、80 mg/mlのメタコリンを含有するエアゾール剤を吸入させた後、DPBSビヒクル (ダルベッコ・リン酸緩衝食塩水) で吸入処置するか、あるいは80 mg/mlのメタコリンの後、試験化合物で吸入処置する。呼吸量抵抗に対応する平均息継ぎ増大 (Penh, 肺抵抗) を測定し、Kruskal-Wallis一方向ANOVAを用いて統計解析する。基底状態を求めるため、食塩水エアゾール剤 (メタコリンを含有しない) も別に同じマウスに投与する。
この手順は、一般式(Ia)または(Ib)の化合物の有効性を評価することができる、喘息、慢性閉塞性肺疾患および他の閉塞性気道障害の吸入治療のモデルである。
雌性Sprague-Dawleyラットにおける排尿頻度試験
平均体重約245〜282 gの雌性Sprague-Dawleyラットをウレタン (1.2 g/kg、sc.<皮下>) で麻酔する。正中線切開を行って膀胱を露出させ、膀胱内圧の測定のために23Gカテーテルを膀胱穹窿部内に挿入する。J. Pharmacological Methods, 15, pp. 157-167 (1986) に記載されているように、ノンストップ径膀胱の膀胱内圧測定を、食塩水充填流量0.216 ml/minで使用して、膀胱の充満および排尿特性を評価する。こうして与えられる連続膀胱内圧測定法により、継続した排尿を記録することができる。
初期基底排尿間隔を信頼性よく約12分間測定した後、各種用量の試験化合物を静脈内投与する。これらの記録から、得られた最大圧力の絶対値と排尿頻度とを求める。1〜50 mg/kgの範囲内で絶対排尿圧力に及ぼす試験化合物の影響を示す用量−反応曲線を得ることができる。この手順は、一般式(Ia)または(Ib)の化合物を試験することができる過活動膀胱 (OAB) のモデルである。
以下の例は、抗コリン作動薬による治療に反応性の各種症状を治療するため一般式(Ia)および(Ib)で示される化合物を投与するのに適した多くの処方組成物を例示する。
これらの例において、％は特に指定しない限り重量％である。
薬剤処方組成物の例
例１
錠剤 １錠あたり
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100 mg
乳糖 140 mg
コーンスターチ 240 mg
ポリビニルピロリドン 15 mg
ステアリン酸マグネシウム 5 mg
500 mg
微粉砕された有効物質 (活性物質)、乳糖、およびコーンスターチの一部を混合する。この混合物をふるい分けした後、ポリビニルピロリドンの水溶液で給湿し、混練し、湿式顆粒化し、乾燥する。この顆粒と残りのコーンスターチとステアリン酸マグネシウム一緒にふるい分けし、混合する。この混合物を圧縮して、適当な形状およびサイズの錠剤を製造する。
例２
錠剤 １錠あたり
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 80 mg
乳糖 55 mg
コーンスターチ 190 mg
微結晶セルロース 35 mg
ポリビニルピロリドン 15 mg
ナトリウム・カルボキシメチルデンプン 23 mg
ステアリン酸マグネシウム 2 mg
400 mg
微粉砕された有効物質、コーンスターチの一部、乳糖、微結晶セルロースおよびポリビニルピロリドンを混合し、得られた混合物をふるい分けした後、残りのコーンスターチおよび水で処理して顆粒を形成し、これを乾燥し、ふるい分けする。ナトリウム・カルボキシメチルデンプンおよびステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、混合物を圧縮して、適当なサイズの錠剤を形成する。
例３
アンプル溶液剤
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 50 mg
塩化ナトリウム 50 mg
注射用蒸留水 5 ml
有効物質をそれ自身のpHで、または場合により5.5〜6.5のpHで水に溶解し、溶液を等張にするように塩化ナトリウムを加える。得られた溶液を濾過して発熱物質を除去し、濾液を無菌条件下でアンプルに移し、その後、アンプルを滅菌し、融着により封止する。アンプルは5 mg、25 mgおよび50 mgの有効物質を含有する。
例４
計量型エアゾール剤
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.005
ソルビタン・トリオレート 0.1
モノフルオロトリクロロメタンおよび
ジフルオロジクロロメタン(2:3) を加えて 100
上記懸濁液を慣用の計量弁つきエアゾール容器に移す。好ましくは、１回の噴霧ごとに50μlの懸濁液が送り出される。有効物質は所望により、より高い用量 (例、0.02重量％)で計量することもできる。
例５
溶液剤 (mg/100 ml)
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 330.3 mg
フマル酸フォルモテロール 333.3 mg
塩化ベンザルコニウム 10.0 mg
ＥＤＴＡ 50.0 mg
ＨＣｌ(ln) pH 3.4への十分量
この溶液剤は常法で調製できる。
例６
吸入用粉末剤 (散剤)
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 6μg
フマル酸フォルモテロール 6μg
乳糖一水和物を加えて 25 mg
本吸入用粉末剤は個々の成分を混合することにより常法で製造される。
例７
吸入用粉末剤
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 10μg
乳糖一水和物を加えて 5 mg
本吸入用粉末剤は個々の成分を混合することにより常法で製造される。
本技術分野の公知方法に類似して得られる別の処方組成物
Ａ:吸入用粉末剤
例８
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ブデソニド 200
乳糖 4700
合計 5000
例９
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
プロピオン酸フルチカゾン 125
乳糖 4775
合計 5000
例１０
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
フランカルボン酸モメタゾン xH2O 250
乳糖 4650
合計 5000
例１１
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
シクレソニド 250
乳糖 4650
合計 5000
例１２
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 50
ブデソニド 125
乳糖 4825
合計 5000
例１３
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 50
プロピオン酸フルチカゾン 200
乳糖 4750
合計 5000
例１４
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 75
フランカルボン酸モメタゾン xH2O 250
乳糖 4675
合計 5000
例１５
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 75
シクレソニド 250
乳糖 4675
合計 5000
例１６
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ＳＴ−１２６ 250
乳糖 4650
合計 5000
例１７
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 50
ＳＴ−１２６ 125
乳糖 4825
合計 5000
例１８
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ロテプレドノール・エタボネート 200
乳糖 4700
合計 5000
例１９
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ジクロロ酢酸エチプレドノール
(エチプレドノール・ジクロロアセテート) 200
乳糖 4700
合計 5000
例２０
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ロテプレドノール・エタボネート 125
乳糖 4775
合計 5000
例２１
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 50
ジクロロ酢酸エチプレドノール 125
乳糖 4825
合計 5000
例２２
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ロテプレドノール・エタボネート 200
Δ1-コルチエン酸メチルエステル 200
乳糖 4500
合計 5000
例２３
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ロテプレドノール・エタボネート 200
Δ1-コルチエン酸 200
乳糖 4500
合計 5000
例２４
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 100
ロテプレドノール・エタボネート 125
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 125
乳糖 4650
合計 5000
例２５
成分 １カプセル中μg
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 50
ロテプレドノール・エタボネート 125
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 125
乳糖 4700
合計 5000
Ｂ．噴射剤含有吸入用エアゾール剤
（TG 134aは1,1,1,2−テトラフルオロエタンであり、TG 227は1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフロオロプロパンである）
例２６：懸濁液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.050
ブデソニド 0.4
大豆レシチン 0.2
TG 134a：TG 27 (2:3) を加えて 100
例２７：懸濁液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.020
プロピオン酸フルチカゾン 0.3
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 227 を加えて 100
例２８：懸濁液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.020
フランカルボン酸モメタゾン xH2O 0.6
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 227 を加えて 100
例２９：懸濁液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.020
シクレソニド 0.4
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３０：懸濁液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
シクレソニド 0.4
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３１：溶液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
プロピオン酸フルチカゾン 0.2
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３２：溶液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
フランカルボン酸モメタゾン xH2O 0.6
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３３：溶液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
シクレソニド 0.4
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３４：溶液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
ＳＴ−１２６ 0.6
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３５：溶液エアゾール剤
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
ＳＴ−１２６ 0.4
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３６
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.05
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
大豆レシチン 0.2
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例３７
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.020
ロテプレドノール・エタボネート 0.3
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 227 を加えて 100
例３８
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.020
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 227 を加えて 100
例３９
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.020
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例４０
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例４１
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.05
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 0.4
大豆レシチン 0.2
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例４２
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.02
ロテプレドノール・エタボネート 0.3
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 0.3
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 227 を加えて 100
例４３
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.04
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 0.4
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 227 を加えて 100
例４４
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.02
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 0.4
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
例４５
成分 重量％
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.039
ロテプレドノール・エタボネート 0.4
Δ1-コルチエン酸またはΔ1-コルチエン酸
メチルエステル 0.4
無水エタノール 0.5
ミリスチン酸イソプロピル 0.1
TG 134a：TG 227 (2:3) を加えて 100
Ｃ. 眼科用処方組成物
例４６
点眼剤
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.05％ w/v
Tween 80 2.5％ w/v
エタノール 0.75％ w/v
塩化ベンザルコニウム 0.02％ w/v
フェニルエタノール 0.25％ w/v
塩化ナトリウム 0.60％ w/v
注射用蒸留水を加えて 100 容量
例４７
点眼剤
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.04％ w/v
Tween 80 2.5％ w/v
エタノール 0.75％ w/v
塩化ベンザルコニウム 0.02％ w/v
フェニルエタノール 0.25％ w/v
塩化ナトリウム 0.60％ w/v
注射用蒸留水を加えて 100 容量
例４８
点眼剤
一般式(Ia)または(Ib)の化合物、例えば
化合物(d)または(m)または(w) 0.035％ w/v
ポビドン 0.6％ w/v
塩化ベンザルコニウム 0.02％ w/v
エデト酸ナトリウム(米国薬局方) 0.10％ w/v
グリセリン(米国薬局方) 2.5％ w/v
チロキサポール(米国薬局方) 3.0％ w/v
塩化ナトリウム 0.3％ w/v
γ−アミノ酪酸ナトリウム 1.0％ w/v
滅菌蒸留水を加えて 100 容量
上に列挙した成分を混合し、次いでpHをチェックし、必要に応じて水酸化ナトリウムで塩基性化するか、または塩酸で酸性化してpHを5.0〜5.5に調整する。
本発明のさらに別の組成も公知方法を用いて適宜処方することができる。
以上の説明は、各種の好ましいまたは代表的な態様に関して述べたものであり、本発明の技術思想から逸脱せずに各種の変更、置換、省略および変化をなしうることは当業者には認められよう。従って、以上の説明の範囲は、本明細書における最も広い説明および均等物を含む特許請求の範囲の記載によってのみ制限されるものである。
本発明の４種類の化合物のｐＨプロファイルを示す。化合物(a),−○−；化合物(b),−△−,化合物(c),−▲−,および化合物(d),−●−。 加水分解生成物として対応する酸の生成を伴う化学的加水分解の代表的な時間プロファイルである［化合物(d)、ｐＨ７.３、３７℃］。 図３Ａは、１４４時間までのデータを示す、グリコピロレートならびにソフト類似化合物である化合物(c)および化合物(d) [Cpd (c)およびCpd (d)] の薬理学的に等効力の用量での散瞳活性のグラフ（平均値±ＳＤで示す）である。図３Ｂは、最初の２４時間だけのデータを示す、グリコピロレート (GL) ならびにソフト類似化合物である化合物(c)および化合物(d) [Cpd (c)およびCpd (d)] の薬理学的に等効力の用量での散瞳活性のグラフ（平均値±ＳＤで示す）である。 ０.１％濃度の各種両性イオン異性体の７時間にわたる散瞳活性のグラフである。 ０.１％濃度で最も高活性の両性イオン異性体とグリコピロレートの散瞳活性を比較するグラフである。 麻酔下のラットにおけるカルバコール誘導徐脈に及ぼす、エチル、ｎ−ヘキシルおよびｎ−オクチルエステルを含む各種抗コリン作動薬の防護効果を示す、時間（分）に対する１分当たりの心拍数のグラフ（平均値±ＳＤ；ｎ＝３〜５）である (Cpd＝化合物)。 麻酔下のラットにおけるカルバコール誘導徐脈に及ぼす、化合物(w)を含む各種抗コリン作動薬の防護効果を示す時間（分）に対する１分当たりの心拍数のグラフ（ｎ＝３〜６）である (Cpd＝化合物)。 電気刺激されたモルモットの気管に及ぼす、化合物(w)および(aa)を含む各種抗コリン作動薬の作用の時間経過を示すグラフである。 電気刺激されたモルモットの気管に及ぼす、試験薬剤を洗浄除去した後の、化合物(w)および(aa)を含む各種抗コリン作動薬の作用の時間経過を示すグラフである。 所定用量での化合物(q)および(m)ならびにグリコピロレートについての、麻酔下のモルモットにおけるアセチルコリン誘導気管支収縮に対する、気管支収縮（基底に対する％）の時間変化を示すグラフである。

Claims (16)

  1. 下記一般式で示される化合物。
    Figure 0005257073
     式中、Ｒは直鎖もしくは分岐鎖のＣ1 〜Ｃ8 アルキルであり；そしてＸ- は１価の負電荷を持つアニオンである。
  2. Ｘ- が塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩またはｐ−トルエンスルホン酸塩イオンである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｘ - が塩化物、臭化物、４−トルエンスルホン酸塩またはメタンスルホン酸塩イオンである、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｘ - が臭化物イオンである、請求項１に記載の化合物。
  5. ＲがＣ1 〜Ｃ6 直鎖アルキルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
  6. Ｒがエチルであり、Ｘ- がＢｒ- である、請求項１に記載の化合物。
  7. 抗コリン作用に有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と無毒な薬剤に許容されるその担体とを含む薬剤組成物。
  8. 抗コリン作動薬による治療に反応性の疾患の治療用薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  9. 気道の閉塞性疾患の治療用薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  10. 慢性閉塞性肺疾患または喘息の治療用薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  11. 散瞳を引き起こす薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  12. 過活動膀胱の治療用薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  13. 慢性閉塞性肺疾患もしくは喘息または他の気道の閉塞性疾患の治療に有効な組み合わせ量で請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と抗炎症性コルチコステロイド、ベータミメティック剤または抗アレルギー剤とを含む薬剤合剤。
  14. 抗炎症性コルチコステロイドがロテプレドノール・エタボネートまたはエチプレドノール・ジクロロアセテートである、請求項１３に記載の薬剤合剤。
  15. 抗炎症コルチコステロイドがロテプレドノール・エタボネートであり、さらに下記よりなる群から選ばれたロテプレドノール・エタボネートの増強剤を含有する、請求項１４に記載の薬剤合剤：
    (ａ) １１β, １７α−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン−１７β−カルボン酸；
    (ｂ) １１β, １７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１, ４−ジエン−３−オン−１７β−カルボン酸；
    (ｃ) １１β, １７α−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン−１７β−カルボン酸メチル；
    (ｄ) １１β, １７α−ジヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン−１７β−カルボン酸エチル；
    (ｅ) １１β, １７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１, ４−ジエン−３−オン−１７β−カルボン酸メチル；および
    (ｆ) １１β, １７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１, ４−ジエン−３−オン−１７β−カルボン酸エチル。
  16. 慢性閉塞性肺疾患もしくは喘息または他の気道の閉塞性疾患の治療用薬剤の製造における請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の合剤の使用。
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