JP5252366B2 - Lactate dehydrogenase (LDH) function activation and recovery method - Google Patents
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Description
本発明は、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性な乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、失活した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をβ型ゼオライト（ゼオライトベータと記載することがある。）及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングさせ、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）固有の本来機能を賦活・再生させることを可能とする不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法、及び該方法を利用した活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法に関するものである。 The present invention relates to a method for activating / restoring the function of inactive lactate dehydrogenase (LDH). More specifically, the present invention relates to an inactive lactate dehydrogenase (LDH), which is inactive because a higher-order structure is not formed. The steric structure is changed due to the species, and the inactivated lactate dehydrogenase (LDH) is refolded using a refolding buffer containing β-type zeolite (sometimes referred to as zeolite beta) and arginine, Functional activation / recovery method of inactive lactate dehydrogenase (LDH) that enables activation and regeneration of intrinsic functions inherent to lactate dehydrogenase (LDH), and active lactate dehydrogenase (LDH) using the method ).
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。 It is not a gene that actually acts and works in vivo, but a protein made from them. Therefore, elucidation and analysis of protein functions and structures are extremely important, for example, directly related to disease treatment and drug discovery. For this reason, various proteins are synthesized and produced by various methods, their structures are examined, and action mechanisms and roles in the living body are elucidated. Now, it is well known that the functions of proteins are determined not only by the sequence and chain length of the amino acids constituting them, but also by the ordered three-dimensional structure (higher order structure) taken by them.
タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。 Protein synthesis is generally performed using expression systems such as Escherichia coli, insect cells, and mammalian cells. In the synthesis by insect cells and mammalian cells, the resulting protein is often soluble, with a higher order structure controlled, an ordered three-dimensional structure. However, these methods have a drawback that the operation of separation and purification is very complicated, and it takes time to obtain the target protein, resulting in an increase in cost and an extremely small amount of protein to be obtained.
これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。 In contrast, protein synthesis by E. coli is easy to operate, requires less time to obtain the target protein, and does not cost much. For this reason, at present, a method using E. coli into which a gene code responsible for the synthesis of a target protein is incorporated has become the mainstream of protein synthesis, and a production process is being established.
ところが、ヒトなど高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序がなく、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわちアミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。 However, when proteins from higher organisms such as humans are synthesized in the E. coli expression system, the amino acid binding sequence and number, that is, the amino acid chain length, can be obtained as designed, but the three-dimensional structure is not ordered and high. A protein whose secondary structure is not controlled, that is, an insoluble protein called an inclusion body in which amino acid chains are entangled is obtained.
当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。 As a matter of course, the inclusion body of this insoluble protein does not have the desired function and performance and does not exhibit activity. For this reason, in the production process using E. coli, it is necessary to unwind the inclusion body, prepare a higher-order structure, and convert it into a soluble protein having an ordered three-dimensional structure, that is, refolding (rewinding) the inclusion body. This type of refolding is an extremely important technique that can be applied not only to the production of proteins by E. coli, but also to the regeneration of proteins that have been inactivated due to certain causes such as thermal history.
従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されている。しかし、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多い。現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。 Conventionally, this refolding has been extensively studied and various methods have been proposed. However, most of them often have only low chances of refolding, and have only been able to obtain favorable results for certain limited proteins (especially specific proteins with low molecular weight). At present, this refolding is not an efficient and economical method with generality, universality and high refolding rate applicable to various proteins.
最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを、界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＦｏｌｄＩｔキット）である。 The most commonly used refolding operation from the oldest is dialysis and dilution. In the former, protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or denaturing agent, and this is dialyzed against a buffer solution that does not contain a surfactant or denaturing agent, thereby reducing the concentration of the surfactant or denaturing agent. (Typical example: FoldIt kit manufactured by Hampton Research).
一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを、単に希釈して行くことで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるものである。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のＳｏｄｉｕｍ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、巻き戻す方法（非特許文献１参照）等、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。 On the other hand, in the latter, the protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or a denaturing agent, and then simply diluted, thereby reducing the concentration of the surfactant or the denaturing agent to cause refolding. Although these are general, other methods include dissolving a glutathione S-transferase fusion protein in a sodium N-lauroyl sarcosinate solution of a surfactant, diluting it with 1-2% Triton X-100, and rewinding ( There is also a method of refolding using a diluent such as Non-Patent Document 1).
透析と希釈の両方に対し、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ等の、極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められているに過ぎず（非特許文献２参照）、この方法は、試行錯誤法の域にとどまっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、他のタンパク質に適用するとほとんどうまくいかないのが通例である。 Disposable kits are commercially available from Hampton Research for both dialysis and dilution. These procedures include Ligand binding domains glutamate and kainate receptors, Lysozyme, Carbon Anhydrase Limited at Carbonic Anhydrase Limited at It is not an exaggeration to say that this method is only in the area of trial and error, since it is only recognized that folding occurs (see Non-Patent Document 2). Thus, even if it happens to be successful, it usually does not work well when applied to other proteins.
リフォールディングに、吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは、必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では、満足できる結果が得られないのが通常である。 The use of an adsorption separation column for refolding has also been tried. When a protein denatured with urea / guanidine hydrochloride, thioredoxin is subjected to gel filtration, the protein is unwound during gel filtration (see Non-Patent Document 3). However, with this method, refolding is not always sufficient and other proteins usually do not give satisfactory results.
構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャペロンを用いる場合は、それが、ある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。 When a protein that has been solubilized with 8M urea is adsorbed to a column that is fixed with a molecular chaperone GroEL, which is a kind of protein that promotes unwinding of a protein with a broken structure, and eluted with a solution containing 2M each of potassium chloride and urea, Rewinding of the eluted protein occurs (see Non-Patent Document 4). However, these are only recognized with very limited proteins such as Cyclophilin A. In particular, when a molecular chaperone is used, since it is a certain type of template, it is not useful at all if it does not conform to the shape of the template.
また、リフォ−ルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、ＧｒｏＥＬ 、ＤｓｂＡ（大腸菌のｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰＰＩ （ｈｕｍａｎ ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こることも報告されている（非特許文献５参照）。しかしながら、これについては、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５等の特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑で、コスト高となるという問題もある。 In addition, a protein Scorpion toxin 5 modified with guanidine hydrochloride on a resin simultaneously fixed with three kinds of proteins considered to be involved in promoting refolding, GroEL, DsbA (disulphide oxididerductase of E. coli) and PPI (human proline cis-trans isomerase). It is also reported that when protein is mixed, this protein rewinding occurs on the resin (see Non-Patent Document 5). However, regarding this, in addition to the drawbacks that can be applied only to specific proteins such as Scorpion toxin Cn5, there is also a problem that the preparation of a resin in which three types of proteins are immobilized is complicated and costly.
カラム上の固定物質として、巻き戻しタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。該方法の適用が、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑で、コスト高となることは、前記方法と同じである。 In some cases, a metal chelate is used in place of the unwinding protein as an immobilizing substance on the column. When a His6-tag fusion protein dissolved and modified with an aqueous solution containing guanidine hydrochloride and urea is adsorbed on a resin to which nickel chelate is fixed and washed with a buffer solution containing no denaturant, the fusion protein is unwound (non-patented). Reference 6). The application of this method is limited to this protein, and the preparation of the resin is complicated and the cost is the same as in the above method.
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程で、タンパク質が巻き戻るとの報告もある（非特許文献７〜９参照）。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂなどで成功しているに過ぎない。しかも、この方法は、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。 When β-cyclodextrin or cycloamylose is used as an artificial chaperone, and the protein denatured with a surfactant is mixed into this chaperone solution, the surfactant takes up and is removed by the artificial chaperone. There is also a report (refer nonpatent literature 7-9). However, this method is only successful with carbonic anhydride B and the like. Moreover, this method is not a method that can be repeated, but is expensive.
一方、本発明者らは、これまで、ＺＳＭゼオライトやゼオライトベータ（例えば、非特許文献１０、１１、特許文献１、２参照）等のゼオライトへのバイオポリマーの吸着現象（非特許文献１２参照）について、研究を続けてきた過程で、ゼオライトベータを用いたタンパク質巻き戻し材料を開発することに成功した（特許文献３）。 On the other hand, the present inventors have so far taken the adsorption phenomenon of biopolymers to zeolites such as ZSM zeolite and zeolite beta (see, for example, Non-Patent Documents 10 and 11, and Patent Documents 1 and 2) (see Non-Patent Document 12). In the process of continuing research, we succeeded in developing a protein unwinding material using zeolite beta (Patent Document 3).
遺伝子工学の発達により、学術的、産業的に有用と考えられるタンパク質を大腸菌体内で大量に生産することは非常に容易になった。しかしながら、大腸菌内で大量発現した組換えタンパク質は本来あるべき立体構造を維持できず、生化学的な活性を失い、封入体と呼ばれる不溶性の構造体に移行してしまうことが多い。封入体となってしまったタンパク質の活性を回復するためには、塩酸グアニジンなどの変性剤を用いてタンパク質を一旦可溶化した後、適当な条件下で変性剤を除くことによって、正しい立体構造となるように巻き戻すリフォールディング操作が必要となる。 With the development of genetic engineering, it has become very easy to produce large quantities of proteins that are considered to be academically and industrially useful in E. coli. However, recombinant proteins expressed in large quantities in Escherichia coli cannot maintain their original three-dimensional structure, lose biochemical activity, and often migrate to insoluble structures called inclusion bodies. In order to recover the activity of the protein that has become an inclusion body, the protein is once solubilized with a denaturing agent such as guanidine hydrochloride, and then the correct three-dimensional structure is obtained by removing the denaturing agent under appropriate conditions. A refolding operation for rewinding is necessary.
本発明者らは、これまで、ゼオライトベータを用いて、タンパク質のリフォールディングを効率よく行わせることに成功し、更に、ゼオライトを用いたタンパク質のリフォールディングにおける汎用性の検討の一環として、各種不活性タンパク質の機能賦活・回復化を種々試みてきた。しかし、リフォールディング技術は適用可能なタンパク質が特定のものに限られており、リフォールディング技術が有効か否かは適用対象のタンパク質との関係で好適な条件が設定し得るか否かにかかっている。ゼオライトベータによるリフォールディング技術を含めて、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）については、従来法では高効率のリフォールディング手法が確立されておらず、当技術分野では、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを可能とする新しいリフォールディング手法の開発が強く要請されていた。 The present inventors have so far succeeded in efficiently performing protein refolding using zeolite beta, and, as part of the examination of versatility in protein refolding using zeolite, Various attempts have been made to activate and restore the function of active proteins. However, refolding technology is limited to specific proteins, and whether refolding technology is effective depends on whether suitable conditions can be set in relation to the target protein. Yes. For lactate dehydrogenase (LDH), including refolding technology using zeolite beta, a highly efficient refolding method has not been established in the conventional method, and in this technical field, lactate dehydrogenase (LDH) refolding has not been established. There has been a strong demand for the development of a new refolding technique that enables folding.
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法として有用な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を積み重ねた結果、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いた新しい不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法及び該方法を用いた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法を提供することを目的とするものである。 Under such circumstances, the present inventors have aimed to develop a new refolding technique useful as a function activation / recovery method of inactive lactate dehydrogenase (LDH) in view of the above prior art. As a result of intensive research and development, we succeeded in establishing a function activation / recovery method of a new inactive lactate dehydrogenase (LDH) using a refolding buffer containing β-type zeolite and arginine. It came to be completed. An object of the present invention is to provide a method for activating / recovering the function of inactive lactate dehydrogenase (LDH) and a method for producing active lactate dehydrogenase (LDH) using the method.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復する方法であって、
１）変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを行い可溶化した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のβ型ゼオライトへの吸着と該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能の賦活・回復をさせる、
２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ ４ ＋ 若しくはＮａ ＋ フォームにしたゼオライトを使用し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と０．３Ｍ以上で１Ｍ未満の濃度のアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行い遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収してその機能を賦活・回復させる、ことを特徴とする乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（２）０．１％以上で０．４％以下の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の入ったリフォールディングバッファーを用いる、前記（１）に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（３）０．３Ｍから０．５Ｍの濃度のアルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いる、前記（１）に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（４）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が、不活性乃至低活性の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に適用して機能を賦活・回復させた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収することを特徴とする活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A method for activating / recovering the function of lactate dehydrogenase (LDH),
1) modified lactate dehydrogenase (LDH), beta type zeolite, and the refolding buffer containing arginine added, by incubating a certain time at a predetermined temperature, allowed perform refolding of lactate dehydrogenase (LDH) It causes the activation-recovery function of solubilizing and adsorption and lactic dehydrogenase to the β-type zeolite of lactate dehydrogenase (LDH) (LDH),
2) At that time, NH 4 + or Na + form zeolite is used as the β-type zeolite , and a refolding buffer containing polyethylene glycol (PEG) and arginine at a concentration of 0.3 M or more and less than 1 M is used. A method for activating / recovering the function of lactate dehydrogenase (LDH), comprising recovering lactate dehydrogenase (LDH) released by refolding and activating / recovering the function.
( 2 ) Functional activation / recovery of lactate dehydrogenase (LDH) according to (1) above using a refolding buffer containing polyethylene glycol (PEG) at a concentration of 0.1% to 0.4% Method.
( 3 ) 0 . The function activation / recovery method of lactate dehydrogenase (LDH) according to (1) above, using a refolding buffer to which arginine at a concentration of 3M to 0.5M is added.
( 4 ) The lactate dehydrogenase (LDH) according to any one of (1) to ( 3 ), wherein the lactate dehydrogenase (LDH) is an inactive or low activity lactate dehydrogenase (LDH). Function activation / recovery method.
( 5 ) The function activation / recovery method of lactate dehydrogenase (LDH) according to any one of (1) to ( 4 ) above is applied to inactive or low activity lactate dehydrogenase (LDH) to activate the function. A method for producing active lactate dehydrogenase (LDH), comprising recovering recovered active lactate dehydrogenase (LDH).
本発明は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復する方法であって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを行い乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復させることを特徴とするものである。本発明では、β型ゼオライトが、ＮＨ４ ＋若しくはＮａ＋フォームにしたゼオライトであること、を好ましい実施の態様としている。 The present invention is a method for activating / recovering the function of lactate dehydrogenase (LDH), wherein a refolding buffer containing β-type zeolite and arginine is added to lactate dehydrogenase (LDH) at a predetermined temperature. By incubating for a certain period of time, lactate dehydrogenase (LDH) is refolded to activate / recover the function of lactate dehydrogenase (LDH). In the present invention, a preferred embodiment is that the β-type zeolite is a zeolite made into NH 4 + or Na + form.
また、本発明では、所定濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の入ったリフォールディングバッファーを用いること、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行い乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復させること、を好ましい実施の態様としている。更に、本発明は、上記の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に適用して機能を賦活・回復させた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収することからなる活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法の点に特徴を有するものである。 In the present invention, a refolding buffer containing polyethylene glycol (PEG) at a predetermined concentration is used, and a refolding buffer containing polyethylene glycol (PEG) and arginine is used for refolding to perform lactate dehydrogenase (LDH). Activating / recovering these functions is a preferred embodiment. Furthermore, the present invention is an active lactate dehydrogenase whose function is activated / restored by applying the above-described method for activating / restoring the function of lactate dehydrogenase (LDH) to an inactive or low activity lactate dehydrogenase (LDH). It is characterized by a method for producing active lactate dehydrogenase (LDH) comprising recovering (LDH).
本発明では、機能賦活の対象として、例えば、不活性乃至低活性の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が用いられる。本発明では、これらの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をゼオライトベータ（β型ゼオライト）で処理して該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の立体構造をリフォールディングすることにより、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）固有の本来機能の賦活・回復を行う。 In the present invention, for example, inactive to low activity lactate dehydrogenase (LDH) or lactate dehydrogenase (LDH) inactivated due to a certain cause such as heat history is used as the target of function activation. In the present invention, the lactate dehydrogenase (LDH) is treated with zeolite beta (β-type zeolite) to refold the three-dimensional structure of the lactate dehydrogenase (LDH). ) Activating / recovering intrinsic functions.
賦活操作は、通常、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を、変性剤や界面活性剤等を含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をゼオライトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で行われる。 In the activation operation, usually, the lactate dehydrogenase (LDH) is first dispersed and dissolved in a solution containing a denaturant, a surfactant, etc., and then mixed with a solution containing zeolite beta, or applied to a zeolite beta packed column. The injection is performed by adsorbing the lactate dehydrogenase (LDH) to zeolite beta and then desorbing the protein from zeolite beta.
本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオライトベータ、及び、例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等のものであれば同様に使用することができる。 Examples of the zeolite beta used as the functional activator in the present invention include unfired zeolite beta and, for example, calcined zeolite beta obtained by calcining synthetic zeolite beta at 300 to 500 ° C. for 3 to 10 hours. It is not a thing, but if it is equivalent to these, it can be used similarly.
ゼオライトベータに吸着前の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の分散溶媒としては、好適には、例えば、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と反応を起こさないもの、及び該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールを挙げることができる。 For example, water is preferably used as a dispersion solvent of lactate dehydrogenase (LDH) before adsorption onto zeolite beta. However, the present invention is not necessarily limited to this, and it must be one that does not react with lactate dehydrogenase (LDH) and that does not change the three-dimensional structure of lactate dehydrogenase (LDH) into an unintentional form. Basically, there is no problem. In such a case, these solvents can be used alone or mixed with water. Typical examples of this type of solvent include monohydric and polyhydric alcohols.
該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の吸脱着は、一般には、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、で行われる。 The adsorption / desorption of the lactate dehydrogenase (LDH) is generally performed by using a denaturant, a surfactant, a pH adjuster, a refolding factor in order to easily unwind the entangled protein chain length and to easily unwind the protein chain length. In the presence of etc.
この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００やＦｉｃｏｌ１４００等を挙げることができる。 Typical examples of this type of modifier, surfactant, pH adjuster, and refolding factor include, for example, guanidine hydrochloride, trisaminomethane hydrochloride, polyethylene glycol, cyclodextrin, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethersulfonic. acid (HEPES), polyphosphoric acid, sucrose, glucose, glycerol, inositol, Dextran T-500, Ficol 1400 and the like.
また、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。置換吸着で該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の脱着を促す物質には、一般的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤やハロゲン化アルカリ等の塩が用いられるが、これらに限定されるものではなく、カラムクロマトグラフィーでの溶離に用いられるもの等、種々のものが使用可能である。 In general, substitution adsorption is used for desorption of the lactate dehydrogenase (LDH), but basically, it is an operation that does not hinder the function activation after the desorption of the lactate dehydrogenase (LDH). Any operation is applicable and is not particularly limited. Therefore, pH change, temperature change, etc. can be used, and these and substitution adsorption can be used together. In general, surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS) and salts such as alkali halides are used as substances that promote the desorption of lactate dehydrogenase (LDH) by displacement adsorption. However, various materials such as those used for elution in column chromatography can be used.
以上述べてきた、不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を発揮するリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータとしては、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ（例えば、商品名ＨＳＺ−９３０ＮＨＡ、東ソー社製）、文献等に従い自前で合成・調製したゼオライトベータ（Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）２０２．参照）、それらを、焼成して得られるゼオライトベータが挙げられる。 As a typical example of the zeolite having the BEA structure, so-called zeolite beta, which constitutes the refolding agent that exhibits the activity activating function of the inactive protein and the ability to unwind the denatured protein as described above, typical examples of the zeolite beta are: (For example, trade name HSZ-930NHA, manufactured by Tosoh Corporation), zeolite beta synthesized and prepared in accordance with literatures etc. (see Zeolites, Vol. 11 (1991) 202.), and zeolite beta obtained by calcining them. Can be mentioned.
該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム含有骨格置換ゼオライトベータ等が挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には、全て該機能・能力を有しており、該ゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。 Zeolite beta having ammonium and ammonium such as various aliphatic and / or aromatic ammonium in the space of the zeolite, and framework-substituted zeolite beta in which a part of the framework silicon forming the zeolite is changed to another metal The ammonium-containing skeleton-substituted zeolite beta and the like can be mentioned. Basically, any zeolite having a skeleton structure of zeolite beta has all the functions and abilities, and the zeolite beta is listed here. However, the present invention is not necessarily limited thereto.
該ゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般にはケイ素と酸素、あるいはケイ素とアルミニウムと酸素であるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ、及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性賦活機能を行うリフォ−ルディング剤となり得る。 The elements that form the framework of the zeolite beta are generally silicon and oxygen, or silicon, aluminum, and oxygen, but the zeolite beta in which a part of silicon or aluminum is substituted with other elements, and the pores in the pores Substituted zeolite beta containing ammoniums can also be a refolding agent that performs the activity-activating function of inactive lactate dehydrogenase (LDH).
該ゼオライトベータの骨格ケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的にゼオライトベータの構造を破壊しないものであればいずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性並びに変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング剤となり得ることは同様である。 Typical examples of the zeolite beta that can be replaced with the framework silicon include aluminum, boron, phosphorus, gallium, tin, titanium, iron, cobalt, copper, nickel, zinc, chromium, vanadium, and the like. It is not limited to these, and any one that basically does not destroy the structure of zeolite beta may be used. Further, regarding the substitution amount, any substitution amount may be used as long as it does not destroy the structure of zeolite beta. The substitution zeolite beta is an inert and modified lactate dehydrogenase (LDH) refolding agent. The same can be said.
本発明では、リフォールディング剤は、ＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータ単味、又はゼオライトベータとそれを支持する基材（支持体）とから構成することができる。前者は、支持体無しで、後者は、支持体付きである。一般的に言って、ゼオライトという物質は、自己焼結性が乏しいため、単味単独では成形しにくいことが多いので、リフォールディング剤の作製、すなわち形態・形状の設計・制御に関しては、前者に比べ後者が、予め形が整えられた支持体上にゼオライトベータを固定・被覆すること等が可能なため、自由度が高く、有利である。 In this invention, a refolding agent can be comprised from the zeolite of BEA structure, what is called a zeolite beta simple substance, or a zeolite beta and the base material (support body) which supports it. The former is without a support and the latter is with a support. Generally speaking, the substance called zeolite is poorly self-sintering, so it is often difficult to form by itself, so the production of the refolding agent, that is, the design and control of the shape and shape, In comparison, the latter is advantageous in that it has a high degree of freedom because it is possible to fix and coat zeolite beta on a pre-shaped support.
該ゼオライトベータの形態・形状につては、例えば、チップ状、膜状、ペレット状、ビーズ状等、該ゼオライトベータの利用方法・使用形態に応じて、適宜選定される。特に、支持体付き該ゼオライトベータでは、ゼオライトベータの固定・被覆を種々の形状、例えば、板、球、円筒、チューブ、カラム、溝、Ｕ字路等の支持体上に、前記方法等で行うことができるので、該ゼオライトベータの形状を如何様にも所望の形にすることができるという利点がある。この場合の支持体については、ガラス、石英、アルミナ、シリカ、コージェライトやムライト等の種々のセラミックス、濾紙等のセルロース、テフロン（登録商標）、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ペット）等、種々の有機ポリマーを挙げることができる。 The form and shape of the zeolite beta are appropriately selected according to the utilization method and use form of the zeolite beta, such as a chip shape, a membrane shape, a pellet shape, and a bead shape. In particular, in the zeolite beta with a support, the zeolite beta is fixed and coated on the support in various shapes, for example, a plate, a sphere, a cylinder, a tube, a column, a groove, a U-shaped path, or the like by the above method. Therefore, there is an advantage that the shape of the zeolite beta can be changed to any desired shape. For the support in this case, glass, quartz, alumina, silica, various ceramics such as cordierite and mullite, cellulose such as filter paper, Teflon (registered trademark), nylon, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate (pet), etc. Various organic polymers can be mentioned.
塩酸グアニジンによって可溶化したＬＤＨとβ型ゼオライトを混合し、吸着等温線を測定したところ、β型ゼオライト１ｇ当たり、最大で２００ｍｇ程度のＬＤＨが吸着した。ＬＤＨ溶液のｐＨと塩濃度の影響を検討したところ、タンパク質溶液に高濃度のＮａＣｌ含まれていると、ＬＤＨの等電点より高いｐＨ域において、わずかに吸着量が低下する。しかし、ＮａＣｌによる影響は限定的であり、基本的には、疎水的な相互作用によって吸着されていることが推定された。 When LDH solubilized with guanidine hydrochloride and β-type zeolite were mixed and the adsorption isotherm was measured, a maximum of about 200 mg of LDH was adsorbed per 1 g of β-type zeolite. When the influence of pH and salt concentration of the LDH solution was examined, if the protein solution contains a high concentration of NaCl, the adsorption amount slightly decreases in a pH range higher than the isoelectric point of LDH. However, the influence by NaCl was limited, and it was estimated that it was adsorbed basically by hydrophobic interaction.
ＬＤＨが吸着したβ型ゼオライトを、塩酸グアニジンを含まない緩衝液で洗浄しても、ＬＤＨは遊離せず、β型ゼオライトに保持される。また、ＰＥＧ２００００とアルギニンを含む緩衝液とβ型ゼオライトを混合したところ、遊離してくるＬＤＨ量は、０．１％以上のＰＥＧ２００００により最大に達し、同時に、０．３Ｍ以上のアルギニンが含まれることが必要であった。可溶性のＬＤＨを回収するためには、ＰＥＧ２００００によって、疎水性相互作用を弱め、アルギニンによって、ＬＤＨの再凝集を防止することが有効である。 Even when the β-type zeolite adsorbed with LDH is washed with a buffer solution not containing guanidine hydrochloride, LDH is not liberated and is retained in the β-type zeolite. In addition, when a buffer containing PEG 20000 and arginine and β-type zeolite are mixed, the amount of liberated LDH reaches the maximum with 0.1% or more of PEG 20000 and at the same time contains 0.3M or more of arginine. Was necessary. In order to recover soluble LDH, it is effective to weaken the hydrophobic interaction with PEG 20000 and prevent reaggregation of LDH with arginine.
可溶性のタンパク質として回収されたＬＤＨの円二色性スペクトルを測定したところ、２０９，２２２ｎｍ付近にトラフを持つスペクトルが得られるが、これは、タンパク質に特徴的な立体構造を反映したシグナルであり、ＬＤＨが、本来の立体構造を回復したものと推察される。 When a circular dichroism spectrum of LDH recovered as a soluble protein was measured, a spectrum having a trough in the vicinity of 209 and 222 nm was obtained, which is a signal reflecting a three-dimensional structure characteristic of the protein, It is inferred that LDH has recovered the original three-dimensional structure.
また、得られたＬＤＨの脱水素活性を測定したところ、十分な活性の回復がみられたが、これは、ＬＤＨがリフォールドして、生化学的に活性なタンパク質として得られたことを示す。これらは、タンパク質が吸着する担体として、β型ゼオライトを用いることによって、リフォールディングに必要な緩衝液の交換を、簡便かつ速やかに行うことが可能となることを示している。 Further, when the dehydrogenation activity of the obtained LDH was measured, a sufficient recovery of activity was observed, indicating that LDH was refolded and obtained as a biochemically active protein. . These show that by using β-type zeolite as a carrier on which protein is adsorbed, it is possible to easily and quickly exchange a buffer solution necessary for refolding.
乳酸菌ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の遺伝子を大腸菌用タンパク質発現ベクターを用いて、大腸菌に導入することによって、組換え体タンパク質として大腸菌体内で大量発現させると、標準的な培養条件下で大量発現させたＬＤＨは、そのほとんどが、生化学的に不活性な不溶性の封入体へと移行する。 Lactic acid bacteria lactobacillus plantarum-derived lactate dehydrogenase (LDH) gene is introduced into Escherichia coli using a protein expression vector for Escherichia coli and expressed in a large amount in Escherichia coli as a recombinant protein. Most of the LDH expressed in a large amount is transferred to insoluble inclusion bodies that are biochemically inactive.
可溶化したＬＤＨのゼオライトへの吸着を試みると、ベータ型ゼオライト１ｇ当たり、２００ｍｇ前後のＬＤＨが吸着されることが分かった。また、ＬＤＨとゼオライトの混合を開始後、一定時間ごとにβ型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を測定したところ、ＬＤＨは、極めて速やかに（一時間以内）吸着されることが分かった。 When adsorption of solubilized LDH onto zeolite was attempted, it was found that about 200 mg of LDH was adsorbed per 1 g of beta zeolite. Further, when the amount of LDH adsorbed on the β-type zeolite was measured at regular intervals after mixing of LDH and zeolite was started, it was found that LDH was adsorbed very quickly (within one hour).
次に、ＬＤＨが溶けている緩衝液のｐＨや、含まれている塩（塩化ナトリウム）が、ＬＤＨの吸着に影響を与えるかどうか検討したところ、緩衝液に多量の塩化ナトリウム（５００ｍＭ）が含まれる場合、高いｐＨ域において、ＬＤＨの吸着量がわずかに低下することが分かった。境目となるｐＨは、ＬＤＨの等電点（ｐＨ５．０−５．５）とほぼ一致していることから、β型ゼオライトへの吸着には、イオン交換的な相互作用も働いている可能性が考えられる。しかしながら、その影響は限定的であり、ＬＤＨの吸着において、主となる作用機構は、タンパク質とβ型ゼオライト間の疎水的な相互作用であるものと予想される。 Next, when the pH of the buffer solution in which LDH is dissolved and whether the salt (sodium chloride) contained affects the adsorption of LDH, the buffer solution contains a large amount of sodium chloride (500 mM). It was found that the amount of LDH adsorbed slightly decreased in the high pH range. Since the pH at the boundary is almost the same as the isoelectric point of LDH (pH 5.0-5.5), there is a possibility that an ion-exchange interaction also works for adsorption on β-type zeolite. Can be considered. However, the effect is limited, and it is expected that the main mechanism of action in the adsorption of LDH is a hydrophobic interaction between protein and β-type zeolite.
ＬＤＨとβ型ゼオライトの間には、疎水的相互作用が働いていると考えられることから、相互作用を弱める効果のある化合物を含む緩衝液を用いることで、吸着されたＬＤＨをゼオライトから遊離させることができると考え、そのような化合物として、分子量２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて検討したところ、ＰＥＧの濃度を上げるにしたがって遊離してくるＬＤＨの量は増え、およそ０．１％以上のＰＥＧにより最大量に達することが分かった。また、ＬＤＨが遊離するためには、最低０．３Ｍ以上のアルギニンが同時に存在することが必要であることが分かった。回収率だけを考慮する場合、アルギニンの濃度が高ければ高いほど、高い収率でＬＤＨが得られる。 Since it is considered that a hydrophobic interaction is acting between LDH and β-type zeolite, the adsorbed LDH is released from the zeolite by using a buffer containing a compound having an effect of weakening the interaction. As such a compound, when it was examined using polyethylene glycol (PEG) having a molecular weight of 20000, the amount of LDH released increases as the concentration of PEG increases, and it is about 0.1% or more. It was found that the maximum amount was reached with PEG. It was also found that at least 0.3 M or more arginine must be present at the same time in order to release LDH. When considering only the recovery rate, the higher the concentration of arginine, the higher the yield of LDH.
次に、ゼオライトに吸着した可溶化ＬＤＨ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）、及びゼオライトに吸着した活性型ＬＤＨ（Ｎａｔｉｖｅ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）は、いずれも、完全に立体構造が失われている。一方、可溶化した状態でβ型ゼオライトに吸着した後、ＰＥＧとアルギニンの作用により遊離してきたＬＤＨ（Ｒｅｆｏｌｄｅｄ）は、ある程度の立体構造を回復している（リフォールディング）している。 Next, the three-dimensional structure of the solubilized LDH (Denatured on zeolite) adsorbed on the zeolite and the active LDH (Native on zeolite) adsorbed on the zeolite are completely lost. On the other hand, LDH (Refolded) liberated by the action of PEG and arginine after adsorbed to β-type zeolite in a solubilized state has recovered a certain degree of steric structure (refolding).
収率に関しては、アルギニンの濃度が高いほど良好な高い収量が得られたが、酵素活性は下がってしまう。また、アルギニンの濃度が低い場合（０．３Ｍ）、良好な酵素活性をもつＬＤＨが得られるものの、その収率は低い。また、アルギニンの濃度が低く、遊離してくるＬＤＨの量が少ないときはＰＥＧの濃度が高くてもＬＤＨの比活性は低下しないようであるが、ＬＤＨが大量に遊離してくるようなアルギニンの濃度においては、高濃度のＰＥＧがＬＤＨの活性を下げる傾向がある。すなわち、ＬＤＨの再凝集を防ぐために、最低限のアルギニン（０．３から０．５Ｍ）と、十分な量のＬＤＨを遊離できる濃度のＰＥＧ（０．１％）を添加することで、リフォールドした活性型ＬＤＨを最も効率的に得ることができる。 As for the yield, the higher the arginine concentration, the better the yield, but the lower the enzyme activity. In addition, when the concentration of arginine is low (0.3 M), LDH having good enzyme activity is obtained, but the yield is low. Also, when the concentration of arginine is low and the amount of liberated LDH is small, the specific activity of LDH does not seem to decrease even if the concentration of PEG is high. In concentration, high concentrations of PEG tend to reduce the activity of LDH. That is, in order to prevent reaggregation of LDH, refolding can be achieved by adding a minimum amount of arginine (0.3 to 0.5 M) and a sufficient amount of PEG (0.1%) that can release LDH. The activated LDH can be obtained most efficiently.
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）β型ゼオライトを用いた変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
（２）変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を高活性で回復させることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
（３）活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の回収率と活性回復率のバランスを高めたリフォールディング技術を提供することができる。
（４）アルギニン及びポリエチレングリコールとを組み合わせて、活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の回収率を向上させた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング方法を提供することができる。
（５）封入体としての活性のない乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）から正しい立体構造及び活性を持った活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を得るためのリフォールディング技術を提供することができる。
（６）他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング技術を提供することができる。
（７）希釈法、透析法の欠点である、大量のバッファーを必要とし、リフォールディングしたタンパク質の濃度が低いといった欠点を改善できる、シンプルに高効率でリフォールディングを行わせることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
The present invention has the following effects.
(1) A new function activation / recovery method for modified lactate dehydrogenase (LDH) using β-type zeolite can be established and provided.
(2) It is possible to provide a refolding technique that can restore the activity of modified lactate dehydrogenase (LDH) with high activity.
(3) It is possible to provide a refolding technique that improves the balance between the recovery rate of active lactate dehydrogenase (LDH) and the activity recovery rate.
(4) By combining arginine and polyethylene glycol, a method for refolding lactate dehydrogenase (LDH) with improved recovery of active lactate dehydrogenase (LDH) can be provided.
(5) A refolding technique for obtaining active lactate dehydrogenase (LDH) having the correct three-dimensional structure and activity from inactive lactate dehydrogenase (LDH) as an inclusion body can be provided.
(6) An inactive lactate dehydrogenase (LDH) refolding technique capable of performing refolding with higher efficiency than other methods can be provided.
(7) Refolding that can improve the simple and highly efficient refolding, which can solve the disadvantages of dilution method and dialysis method that require a large amount of buffer and the concentration of refolded protein is low. Technology can be provided.
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。 Next, the present invention will be specifically described based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
本実施例では、乳酸菌由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を大腸菌内で大量発現させた。封入体として回収したＬＤＨを、６Ｍ塩酸グアニジンを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で可溶化した。可溶化したＬＤＨとβ型ゼオライトを室温で２時間混合した後、塩酸グアニジンを含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でβ型ゼオライトを洗浄した。続けて、分子量２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）とアルギニンを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）とβ型ゼオライトを混合し、緩衝液中に遊離してくるＬＤＨの濃度、円二色性スペクトル、及び酵素活性を測定した。酵素活性は、ピルビン酸を基質、還元型ＮＡＤＨを補酵素とした脱水素反応におけるＮＡＤＨの吸光度の減少を測定した。以下に、実験法方法とその結果を具体的に説明する。 In this example, lactic acid dehydrogenase (LDH) derived from lactic acid bacteria was expressed in large amounts in E. coli. LDH recovered as inclusion bodies was solubilized with Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 6M guanidine hydrochloride. The solubilized LDH and β-type zeolite were mixed at room temperature for 2 hours, and then the β-type zeolite was washed with a Tris-HCl buffer solution containing no guanidine hydrochloride. Subsequently, polyethylene glycol (PEG 20000) having a molecular weight of 20000 and MES buffer solution (pH 5.5) containing arginine and β-type zeolite are mixed, and the concentration of LDH released in the buffer solution, circular dichroism spectrum, and Enzyme activity was measured. The enzyme activity was determined by measuring the decrease in NADH absorbance in a dehydrogenation reaction using pyruvic acid as a substrate and reduced NADH as a coenzyme. Hereinafter, the experimental method and the results will be described in detail.
（ゼオライトを用いた乳酸脱水素酵素のリフォールディング）
（１）乳酸脱水素酵素の生産
乳酸菌ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の遺伝子を、大腸菌用タンパク質発現ベクターｐＥＴ１００にサブクローニングした。その発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入することによって、ヒスチジンタグ付きの組換え体タンパク質として、大腸菌体内で大量発現させた。
(Refolding of lactate dehydrogenase using zeolite)
(1) Production of lactate dehydrogenase The lactate dehydrogenase (LDH) gene derived from the lactic acid bacterium lactobacillus plantarum was subcloned into the protein expression vector pET100 for Escherichia coli. The expression vector was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) to be expressed in large quantities in Escherichia coli as a histidine-tagged recombinant protein.
標準的な培養条件下で大量発現させたＬＤＨは、そのほとんどが生化学的に不活性な不溶性の封入体へと移行した。大腸菌を破砕後、遠心分離によって回収された封入体を、変性剤入りの緩衝液（６Ｍ 塩酸グアニジン，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）中で可溶化し、ヒスチジンタグに対するアフィニティクロマトグラフィーを用いて、ＬＤＨを精製した。 Most of the LDH expressed in large amounts under standard culture conditions transferred to insoluble inclusion bodies that were biochemically inactive. After disruption of E. coli, inclusion bodies recovered by centrifugation are solubilized in a buffer solution containing a denaturing agent (6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl), and affinity for the histidine tag. LDH was purified using chromatography.
（２）可溶化したＬＤＨのゼオライトへの吸着
可溶化したＬＤＨを、変性剤入りの緩衝液（６Ｍ 塩酸グアニジン，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、様々な濃度に調整した。そのタンパク質溶液とβ型ゼオライトをサンプル管に入れ、室温で転倒混和した。２時間後、サンプル管を遠心し（３０００×ｇ、１０分）、β型ゼオライトと上清を分離した後、上清に残ったタンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。
(2) Adsorption of solubilized LDH onto zeolite Solubilized LDH was used at various concentrations using a buffer solution containing a denaturant (6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl). Adjusted. The protein solution and β-type zeolite were placed in a sample tube and mixed by inversion at room temperature. After 2 hours, the sample tube was centrifuged (3000 × g, 10 minutes) to separate the β-type zeolite and the supernatant, and then the concentration of the protein remaining in the supernatant was measured by the Bradford method.
上清のタンパク質濃度から、β型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を算出し、吸着等温線を測定した。その結果、ベータ型ゼオライト１ｇ当たり、２００ｍｇ前後のＬＤＨが吸着されることが分かった。図１に、ＬＤＨのβゼオライトに対する吸着等温線を示す。また、ＬＤＨとゼオライトの混合を開始後、一定時間ごとにβ型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を測定したところ、ＬＤＨは、極めて速やかに（一時間以内）吸着されることが分かった。図２に、ＬＤＨがβ型ゼオライトに吸着される速度を示す。 The amount of LDH adsorbed on the β-type zeolite was calculated from the protein concentration in the supernatant, and the adsorption isotherm was measured. As a result, it was found that about 200 mg of LDH was adsorbed per 1 g of beta zeolite. FIG. 1 shows an adsorption isotherm for β zeolite of LDH. Further, when the amount of LDH adsorbed on the β-type zeolite was measured at regular intervals after mixing of LDH and zeolite was started, it was found that LDH was adsorbed very quickly (within one hour). FIG. 2 shows the rate at which LDH is adsorbed on the β-type zeolite.
次に、ＬＤＨが溶けている緩衝液のｐＨや、含まれている塩（塩化ナトリウム）が、ＬＤＨの吸着に影響を与えるかどうか検討した。ｐＨの調整は、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５，４．５）、又はリン酸緩衝液（ｐＨ５．５，６．５）、又はトリスヒドロキシ塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５，８．５）を用いた。塩化ナトリウムは、１００ｍＭ又は５００ｍＭになるように調整した。 Next, it was examined whether the pH of a buffer solution in which LDH is dissolved or whether the contained salt (sodium chloride) affects the adsorption of LDH. The pH can be adjusted by adjusting 0.1 M acetate buffer (pH 3.5, 4.5), phosphate buffer (pH 5.5, 6.5), or trishydroxy hydrochloride buffer (pH 7.5, 8). .5) was used. Sodium chloride was adjusted to 100 mM or 500 mM.
また、すべての緩衝液には、変性剤として、６Ｍのグアニジン塩酸が含まれる。調整した緩衝液にＬＤＨを溶かし、サンプル管中でβ型ゼオライトと混合した。室温で２時間転倒混和した後、β型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を測定した。その結果、緩衝液に多量の塩化ナトリウム（５００ｍＭ）が含まれる場合、高いｐＨ域においてＬＤＨの吸着量がわずかに低下することが分かった。図３に、ＬＤＨの吸着に関するｐＨ、塩化ナトリウム濃度の影響を示す。 In addition, all buffer solutions contain 6M guanidine hydrochloride as a denaturing agent. LDH was dissolved in the prepared buffer and mixed with β-type zeolite in a sample tube. After mixing by inverting at room temperature for 2 hours, the amount of LDH adsorbed on the β-type zeolite was measured. As a result, it was found that when the buffer solution contains a large amount of sodium chloride (500 mM), the adsorption amount of LDH slightly decreases in the high pH range. FIG. 3 shows the influence of pH and sodium chloride concentration on LDH adsorption.
境目となるｐＨは、ＬＤＨの等電点（ｐＨ５．０−５．５）とほぼ一致していることから、β型ゼオライトへの吸着には、イオン交換的な相互作用も働いている可能性が考えられる。しかしながら、その影響は限定的であり、ＬＤＨの吸着において、主となる作用機構は、タンパク質とβ型ゼオライト間の疎水的な相互作用であるものと予想される。 Since the pH at the boundary is almost the same as the isoelectric point of LDH (pH 5.0-5.5), there is a possibility that an ion-exchange interaction also works for adsorption on β-type zeolite. Can be considered. However, the effect is limited, and it is expected that the main mechanism of action in the adsorption of LDH is a hydrophobic interaction between protein and β-type zeolite.
（３）吸着されたＬＤＨの溶出
ＬＤＨとβ型ゼオライトの間には、疎水的相互作用が働いていると考えられることから、相互作用を弱める効果のある化合物を含む緩衝液を用いることで、吸着されたＬＤＨをゼオライトから遊離させることができると考えた。そこで、そのような化合物として、分子量２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた。また、遊離したＬＤＨが再び凝集してしまうのを防ぐために、アルギニンも添加物として用いた。
(3) Elution of adsorbed LDH Since it is considered that a hydrophobic interaction is working between LDH and β-type zeolite, by using a buffer containing a compound having an effect of weakening the interaction, It was thought that the adsorbed LDH could be released from the zeolite. Therefore, polyethylene glycol (PEG) having a molecular weight of 20000 was used as such a compound. Arginine was also used as an additive to prevent liberated LDH from aggregating again.
ＬＤＨが吸着したβ型ゼオライトをＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄して変性剤を除いた後、様々な濃度のＰＥＧ、アルギニンを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）と混合し、サンプル管に入れて４℃で一昼夜転倒混和した。サンプル管を遠心（３０００×ｇ、１０分）して上清を分離し、上清に含まれるＬＤＨの量を測定した。 The β-type zeolite adsorbed with LDH was washed with MES buffer (pH 5.5) to remove the denaturing agent, then mixed with MES buffer (pH 5.5) containing various concentrations of PEG and arginine, and sample tubes And mixed by inversion at 4 ° C. all day and night. The sample tube was centrifuged (3000 × g, 10 minutes) to separate the supernatant, and the amount of LDH contained in the supernatant was measured.
ＰＥＧの濃度を上げるにしたがって、遊離してくるＬＤＨの量は増え、およそ０．１％以上のＰＥＧにより最大量に達することが分かった。図４に、ＰＥＧ２００００、アルギニンを添加した緩衝液によって回収されるＬＤＨ量を示す。また、ＬＤＨが遊離するためには、最低０．３Ｍ以上のアルギニンが同時に存在することが必要であることが分かった。回収率だけを考慮する場合、アルギニンの濃度が高ければ高いほど高い収率でＬＤＨが得られた。 It was found that as the concentration of PEG was increased, the amount of liberated LDH increased and reached the maximum with approximately 0.1% or more of PEG. FIG. 4 shows the amount of LDH recovered by the buffer added with PEG 20000 and arginine. It was also found that at least 0.3 M or more arginine must be present at the same time in order to release LDH. When considering only the recovery rate, the higher the concentration of arginine, the higher the yield of LDH.
（４）リフォールディングによって得られたＬＤＨの評価
ＰＥＧとアルギニンを含む緩衝液によって回収されたＬＤＨが、本来の生化学的な機能を取り戻しているかどうかを検討するために、ゼオライトに吸着させる前後のＬＤＨについて、円二色性を測定した。ＬＤＨの構造を反映したＣＤスペクトルの対照として、生化学的に活性型ＬＤＨを用いた。図５に、ＬＤＨの円二色性スペクトルを示す。
(4) Evaluation of LDH obtained by refolding In order to examine whether LDH recovered by a buffer containing PEG and arginine has regained its original biochemical function, before and after adsorption to zeolite. Circular dichroism was measured for LDH. Biochemically active LDH was used as a control for CD spectra reflecting the structure of LDH. FIG. 5 shows the circular dichroism spectrum of LDH.
変性剤を含む緩衝液で可溶されたＬＤＨ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）は、その立体構造が失われていることにより、２２２ｎｍ付近に観察されるトラフが消失している。ゼオライトに吸着した可溶化ＬＤＨ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）、及びゼオライトに吸着した活性型ＬＤＨ（Ｎａｔｉｖｅ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）は、いずれもシグナルがほとんど検出されず、ゼオライトに吸着されたＬＤＨは、完全に立体構造が失われていることが分かる。 In LDH (Denatured) solubilized in a buffer containing a denaturing agent, the trough observed at around 222 nm disappears due to the loss of its three-dimensional structure. Signals were hardly detected in solubilized LDH (Denatured on zeolite) adsorbed on zeolite and active LDH (Native on zeolite) adsorbed on zeolite. You can see that it is lost.
一方、可溶化した状態でβ型ゼオライトに吸着した後、ＰＥＧとアルギニンの作用により遊離してきたＬＤＨ（Ｒｅｆｏｌｄｅｄ）は、活性型ＬＤＨ（Ｎａｔｉｖｅ）のスペクトルと同様の（２０９，２２２ｎｍ）トラフが観察される。これは、タンパク質に特徴的な立体構造を反映したものであり、ゼオライトから遊離してきたＬＤＨが、ある程度の立体構造を回復している（リフォールディング）していることを示す。 On the other hand, LDH (Refolded) released by the action of PEG and arginine after being adsorbed to β-type zeolite in a solubilized state shows a (209, 222 nm) trough similar to the spectrum of active LDH (Native). The This reflects the three-dimensional structure characteristic of the protein, and shows that LDH released from the zeolite has recovered a certain degree of three-dimensional structure (refolding).
（５）遊離してきたＬＤＨの酵素学的な活性
５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に、ＰＥＧ２００００とアルギニンを添加した緩衝液によって、遊離してきたＬＤＨの乳酸脱水素活性を測定した。図６に、リフォールドしたＬＤＨの乳酸脱水素活性を示す。ＬＤＨは、基質（ピルビン酸）を代謝する際に、ＮＡＤＨを消費する。そこで、ＮＡＤＨの吸収波長（３４０ｎｍ）における吸光度の減少を測定することによって、ＬＤＨの活性が測定できる。２００ｍＭのピルビン酸と２ｍＭのＮＡＤＨを含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）にサンプルを添加したとき、波長（３４０ｎｍ）の吸光度を１秒間に１減少させる活性を１ユニットとして比活性を算出した。
(5) Enzymatic activity of liberated LDH The lactate dehydrogenation activity of liberated LDH was measured with a buffer solution in which PEG 20000 and arginine were added to a 50 mM MES buffer (pH 5.5). FIG. 6 shows the lactic acid dehydrogenation activity of the refolded LDH. LDH consumes NADH when metabolizing a substrate (pyruvic acid). Therefore, the activity of LDH can be measured by measuring the decrease in absorbance at the absorption wavelength (340 nm) of NADH. When a sample was added to a 100 mM MES buffer (pH 5.5) containing 200 mM pyruvate and 2 mM NADH, the specific activity was calculated with the activity of decreasing the absorbance at a wavelength (340 nm) by 1 per second as 1 unit. .
アルギニン濃度が高すぎる（１Ｍ以上）と、乳酸脱水素活性が低かった。収率に関しては、アルギニンの濃度が高いほど、良好な高い収量が得られたが、酵素活性は下がってしまうことが分かる。また、アルギニンの濃度が低い場合（０．３Ｍ）、良好な酵素活性をもつＬＤＨが得られるものの、その収率は低い。 When the arginine concentration was too high (1 M or more), the lactic acid dehydrogenation activity was low. Regarding the yield, it can be seen that the higher the arginine concentration, the better the yield, but the lower the enzyme activity. In addition, when the concentration of arginine is low (0.3 M), LDH having good enzyme activity is obtained, but the yield is low.
また、アルギニンの濃度が低く、遊離してくるＬＤＨの量が少ないときは、ＰＥＧの濃度が高くてもＬＤＨの比活性は低下しないようであるが、ＬＤＨが大量に遊離してくるようなアルギニンの濃度においては、高濃度のＰＥＧがＬＤＨの活性を下げる傾向がある。すなわち、ＬＤＨの再凝集を防ぐために、最低限のアルギニン（０．３から０．５Ｍ）と、十分な量のＬＤＨを遊離できる濃度のＰＥＧ（０．１％）を添加することで、リフォールドした活性型ＬＤＨを最も効率的に得ることができる。 Further, when the concentration of arginine is low and the amount of liberated LDH is small, the specific activity of LDH does not decrease even if the concentration of PEG is high, but arginine that liberates a large amount of LDH. At high concentrations of PEG, high concentrations of PEG tend to reduce LDH activity. That is, in order to prevent reaggregation of LDH, refolding can be achieved by adding a minimum amount of arginine (0.3 to 0.5 M) and a sufficient amount of PEG (0.1%) that can release LDH. The activated LDH can be obtained most efficiently.
以上詳述したように、本発明は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法に係るものであり、本発明により、β型ゼオライトを用いた変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。本発明により、封入体としての活性のない乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）から正しい立体構造及び活性を持った活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を得るためのリフォールディング技術を提供することができる。また、本発明は、他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング技術を提供することを可能にするものとして有用である。 As described above in detail, the present invention relates to a method for activating and recovering the function of lactate dehydrogenase (LDH). According to the present invention, a new modified lactate dehydrogenase (LDH) using β-type zeolite is provided. A function activation / recovery method can be established and provided. The present invention can provide a refolding technique for obtaining active lactate dehydrogenase (LDH) having the correct three-dimensional structure and activity from inactive lactate dehydrogenase (LDH) as an inclusion body. In addition, the present invention is useful as a technique that makes it possible to provide an inactive lactate dehydrogenase (LDH) refolding technique capable of performing refolding with higher efficiency than other methods. .
Claims (5)
１）変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを行い可溶化した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のβ型ゼオライトへの吸着と該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能の賦活・回復をさせる、
２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ ４ ＋ 若しくはＮａ ＋ フォームにしたゼオライトを使用し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と０．３Ｍ以上で１Ｍ未満の濃度のアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行い遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収してその機能を賦活・回復させる、ことを特徴とする乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。 A method for activating / recovering the function of lactate dehydrogenase (LDH),
1) modified lactate dehydrogenase (LDH), beta type zeolite, and the refolding buffer containing arginine added, by incubating a certain time at a predetermined temperature, allowed perform refolding of lactate dehydrogenase (LDH) It causes the activation-recovery function of solubilizing and adsorption and lactic dehydrogenase to the β-type zeolite of lactate dehydrogenase (LDH) (LDH),
2) At that time, NH 4 + or Na + form zeolite is used as the β-type zeolite , and a refolding buffer containing polyethylene glycol (PEG) and arginine at a concentration of 0.3 M or more and less than 1 M is used. A method for activating / recovering the function of lactate dehydrogenase (LDH), comprising recovering lactate dehydrogenase (LDH) released by refolding and activating / recovering the function.
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