JP4423381B2 - Protein unwinding material - Google Patents
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Description
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活剤（リフォールディング剤）に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化し失活したタンパク質を、リフォールディングさせ、該タンパク質固有の本来機能を賦活・再生させる能力を有する物質・材料、及び該物質・材料を利用した不活性タンパク質の活性化、すなわち、活性タンパク質の製造・生産に関するものである。本発明は、例えば、生化学品、医薬品製造の技術分野において、大腸菌等の遺伝子発現系を利用して生産した高次構造未形成タンパク質を、リフォールディングさせ、該タンパク質の本来の機能・活性を賦活させることが可能な新しい物質・材料、並びにそれを用いる新しい機能賦活方法を提供するものとして有用である。従来、大腸菌等の発現系で得られるタンパク質は、一般には、立体構造が無秩序であり、該タンパク質の持つ本来の機能・物性を持たず、活性を示さないという問題があったが、本発明の物質・材料は、上記タンパク質に代表される不活性タンパク質の機能・活性を賦活させ、所定の機能・活性を有するタンパク質へと再生させることを可能とする、革新的タンパク質製造・生産技術を提供するものである。 The present invention relates to a function activator (refolding agent) of an inactive protein, and more specifically, an inactive protein because a higher-order structure is not formed, or a three-dimensional structure is changed due to a certain cause. Substances / materials that have the ability to refold inactivated proteins and activate / regenerate the original functions inherent to the proteins, and activation of inactive proteins using the substances / materials, that is, production / production of active proteins It is about production. The present invention, for example, in the technical fields of biochemicals and pharmaceutical production, refolds a higher-order unformed protein produced using a gene expression system such as Escherichia coli so that the original function / activity of the protein is improved. The present invention is useful for providing a new substance / material that can be activated and a new function activation method using the same. Conventionally, proteins obtained by expression systems such as Escherichia coli generally have a problem that the three-dimensional structure is disordered, the protein does not have the original functions and properties, and does not exhibit activity. Substances and materials provide innovative protein production and production technologies that can activate the functions and activities of inactive proteins typified by the above-mentioned proteins and regenerate them into proteins with the specified functions and activities. Is.
生体内で実際的に作用し、働くのは、遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが、活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは、周知のこととなっている。 It is not a gene but a protein made from them that actually acts and works in the body. Therefore, elucidation and analysis of protein functions and structures are extremely important, for example, directly related to disease treatment and drug discovery. For this reason, it is actively carried out to synthesize and produce various proteins by various methods, investigate their structures, and elucidate their action mechanisms and roles in vivo. Now, it is well known that the functions of proteins are determined not only by the sequence and chain length of the amino acids that constitute them, but also by their ordered three-dimensional structure (higher order structure).
タンパク質の合成は、一般には、例えば、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。 Protein synthesis is generally performed using an expression system such as, for example, Escherichia coli, insect cells, or mammalian cells. In the synthesis by insect cells and mammalian cells, the resulting protein is often soluble, with a higher order structure controlled, an ordered three-dimensional structure. However, these methods have a drawback that the operation of separation and purification is very complicated, and it takes time to obtain the target protein, resulting in an increase in cost and an extremely small amount of protein to be obtained. In contrast, protein synthesis by E. coli is easy to operate, requires less time to obtain the target protein, and does not cost much. For this reason, at present, a method using E. coli into which a gene code responsible for the synthesis of a target protein is incorporated has become the mainstream of protein synthesis, and a production process is being established.
ところが、ヒトなどの高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわち、アミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には、秩序が無く、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわち、アミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。 However, when proteins from higher organisms such as humans are synthesized in an E. coli expression system, the protein is obtained as designed with respect to the binding order and number of amino acids, that is, the amino acid chain length. In addition, a protein whose higher-order structure is not controlled, that is, an insoluble protein called an inclusion body in which amino acid chains are entangled is obtained. As a matter of course, the inclusion body of this insoluble protein does not have the desired function and performance and does not exhibit activity. For this reason, in the production process using E. coli, it is necessary to unravel the inclusion body, prepare a higher-order structure, and convert it into a soluble protein having an ordered three-dimensional structure, that is, refolding (rewinding) the inclusion body.
この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質、特に、分子量の低い特定タンパク質、に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い、効率的で経済的な方法とはなっていない。 This type of refolding is an extremely important technique that can be applied not only to proteins produced by E. coli, but also to the regeneration of proteins that have been inactivated due to certain causes such as thermal history. Therefore, this refolding has been actively studied and various methods have been proposed, but most of them have a low refolding rate and a certain limited protein, particularly a specific protein having a low molecular weight. In many cases, the results of this refolding are only accidentally favorable, and at present, this refolding can be applied to various proteins, is general, universal, and has a high refolding rate. It is not an efficient and economical method.
最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例、ＦｏｌｄＩｔキット、FoldIt Kit: Hampton Research社製）である。一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを単に希釈して行くことで界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるもの（典型例、ＦｏｌｄＩｔキット、FoldIt Kit: Hampton Research社製）である。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（Sodium N-lauroyl sarcosinate）溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のトリトンＸ−１００（Triton X-100）で希釈し巻き戻す方法（非特許文献１参照）など、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。 The most commonly used refolding operation from the oldest is dialysis and dilution. In the former, the protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or denaturant and dialyzed against a buffer solution that does not contain a surfactant or denaturant to reduce the concentration of the surfactant or denaturant. Refolding (typical example, FoldIt kit, FoldIt Kit: manufactured by Hampton Research). On the other hand, in the latter case, after the protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or a denaturant, the concentration of the surfactant or the denaturant is decreased by simply diluting the protein and the protein is refolded (typically, FoldIt). Kit, FoldIt Kit: manufactured by Hampton Research. These are common, but in addition, the glutathione S-transferase fusion protein is dissolved in a surfactant solution of sodium N-lauroyl sarcosinate and dissolved in 1-2% Triton X-100. There is also a method of refolding using a diluent such as a method of diluting and rewinding with (Triton X-100) (see Non-Patent Document 1).
透析と希釈の両方に対し、Hampton Research社から使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、グルタミン酸及びカイニン酸受容体リガンド結合領域（Ligand binding domains from glutamate and kainate receptors）、リゾチーム（Lysozyme）、 炭酸脱水酵素Ｂ（Carbonic anhydrase B）などの、極めて限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められている(非特許文献２参照)に過ぎず、試行錯誤法の域に留まっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、それを他のタンパク質に適用すると、ほとんどうまくいかないのが通例である。 Disposable kits are commercially available from Hampton Research for both dialysis and dilution, and these procedures involve the use of ligand binding domains from glutamate and kainate receptors, lysozyme. Refolding has been observed to occur with very limited proteins such as carbonic anhydrase B (see Non-Patent Document 2), and remains in the area of trial and error. It is no exaggeration to say. Thus, even in the case of a method that happens to be successful, it usually does not work well when applied to other proteins.
リフォールディングに、吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では、満足できる結果が得られないのが通常である。構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。しかし、これらは、サイクロフィリンＡ（Cyclophilin A）など、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャペロンを用いる場合は、それがある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものでは、まったく役に立たないというのが実情である。 The use of an adsorption separation column for refolding has also been tried. When protein thioredoxin denatured with urea / guanidine hydrochloride is subjected to gel filtration, rewinding occurs during gel filtration (see Non-Patent Document 3). However, with this method, refolding is not always sufficient and other proteins usually do not give satisfactory results. When a protein that has been solubilized with 8M urea is adsorbed to a column that is fixed with a molecular chaperone GroEL, which is a kind of protein that promotes unwinding of a protein with a broken structure, and eluted with a solution containing 2M each of potassium chloride and urea, Rewinding of the eluted protein occurs (see Non-Patent Document 4). However, these are only found in very limited proteins such as Cyclophilin A. In particular, in the case of using a molecular chaperone, since it is a certain type of template, it is in fact not useful at all if it does not conform to the shape of the template.
また、リフォ−ルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、ＧｒｏＥＬ、大腸菌由来のＤｓｂＡ（ジスルフィド酸化還元酵素：disulfide oxidereductase）及びヒト由来ＰＰＩ（human proline cis-trans isomerase）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質サソリ毒Ｃｎ５（Scorpion toxin Cn5）を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こること（非特許文献５参照）も報告されている。しかしながら、これについては、サソリ毒Ｃｎ５（Scorpion toxin Cn5）などの、特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が、煩雑でコスト高となるという問題もある。 In addition, hydrochloric acid is added to a resin in which three proteins, GroEL, Escherichia coli-derived DsbA (disulfide oxide reductase) and human-derived PPI (human proline cis-trans isomerase) are simultaneously fixed. It has also been reported that when a protein scorpion toxin Cn5 denatured with guanidine is mixed, the protein rewinds on the resin (see Non-Patent Document 5). However, regarding this, in addition to the disadvantage that can be applied only to specific proteins such as scorpion toxin Cn5, there is also a problem that the preparation of a resin in which three kinds of proteins are immobilized is complicated and expensive.
カラム上の固定物質として、巻き戻し促進タンパク質の代わりに、金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したHis6-タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。本法の適用が、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑でコスト高となることは同じである。 In some cases, a metal chelate is used as an immobilizing substance on the column instead of the unwinding promoting protein. When a His6-tag fusion protein dissolved and modified with an aqueous solution containing guanidine hydrochloride and urea is adsorbed on a resin to which nickel chelate is fixed and washed with a buffer solution that does not contain a denaturant, the fusion protein unwinds (non-patented). Reference 6). The application of this method is limited to this protein, and the preparation of the resin is complicated and expensive.
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質が巻き戻るとの報告（非特許文献７〜９参照）もある。しかし、この方法は、炭酸脱水酵素Ｂ（carbonic anhydrase B ）などで成功しているに過ぎない。しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。 When β-cyclodextrin or cycloamylose is used as an artificial chaperone and a protein denatured with a surfactant is mixed into this chaperone solution, the surfactant is taken up by the artificial chaperone and the protein is unwound in this process. There are also reports (see Non-Patent Documents 7 to 9). However, this method is only successful with carbonic anhydrase B (carbonic anhydrase B). Moreover, it is not a method that can be repeated, but is expensive.
一方、本発明者らは、これまで、ゼオライトベータ（例えば、非特許文献１０、特許文献１参照）などのゼオライトへのバイオポリマーの吸着現象について、研究を続けてきた（非特許文献１１）。 On the other hand, the present inventors have continued research on the adsorption phenomenon of biopolymers to zeolite such as zeolite beta (see, for example, Non-Patent Document 10 and Patent Document 1) (Non-Patent Document 11).
このように、従来、種々のリフォールディングの方法やリフォールディング機能を有する物質・材料が報告されているが、これらの方法・物質材料には、上記のような問題があるのが実情であり、そのため、当技術分野においては、鎖長の長短を問わず、種々の高次構造未形成及び変性・失活タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性の高い、しかも繰り返し使用可能な、低コストの、高効率のリフォールディング物質・材料並びに方法、すなわち、経済的で高性能なリフォールディング技術を開発することが急務の課題となっていた。 As described above, various refolding methods and substances / materials having a refolding function have been reported in the past, but these methods / materials have the above-mentioned problems. Therefore, in this technical field, regardless of the length of the chain, it is applicable to various types of unstructured and denatured / inactivated proteins. It has been an urgent task to develop a highly efficient refolding material / material and method, that is, an economical and high-performance refolding technology.
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上述の課題を解決することが可能な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を進めると共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等バイオポリマーの、ゼオライト等金属酸化物上への吸着状況を詳細に調べ（前記非特許文献１１参照）、タンパク質の分離精製材料並びに方法を鋭意研究している過程で、ＢＥＡ構造のゼオライト、すなわち、ゼオライトベータが変性タンパク質の巻き戻し機能を有することを見出し、ゼオライトベータからなるリフォールディング剤を開発するに至った。更に、本リフォールディング剤が、大腸菌等の発現系で生産した高次構造未形成タンパク質、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質等、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む、種々の立体構造無秩序タンパク質等の巻き戻しにも適用できることを認め、本発明に係る、一般性、普遍性の高いタンパク質のリフォールディング技術を完成するに到った。本発明は、新規タンパク質巻き戻し材料を提供することを目的とするものである。 Under such circumstances, the present inventors proceeded with intensive research and development with the goal of developing a new refolding technology capable of solving the above-mentioned problems in view of the above-described conventional technology, In the process of studying in detail the adsorption status of biopolymers such as DNA, RNA and proteins onto metal oxides such as zeolite (see Non-Patent Document 11), and conducting earnest research on protein separation and purification materials and methods, It has been found that a zeolite having a structure, that is, zeolite beta has a function of unwinding a denatured protein, and has led to the development of a refolding agent comprising zeolite beta. Furthermore, the refolding agent contains a large protein having a molecular weight exceeding 100,000, such as a protein having no higher-order structure produced in an expression system such as Escherichia coli, or a protein inactivated due to a certain cause such as thermal history, Recognizing that the present invention can be applied to unwinding various three-dimensional disordered proteins, etc., the present inventors have completed the protein refolding technique with high generality and universality according to the present invention. An object of the present invention is to provide a novel protein unwinding material.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の、高次構造を整え、活性にするタンパク質巻き戻し機能を有するリフォールディング剤であって、該リフォールディング剤が、ＢＥＡ構造のゼオライト（ゼオライトベータ）から構成され、該ゼオライトベータが、アンモニウムイオン、有機アンモニウムイオン及び／又は尿素を含むことを特徴とするタンパク質リフォールディング剤。
（２）有機アンモニウムイオンが、モノ、ジ、トリ及び／又はテトラアルキルアンモニウムイオン（アルキル基は、メチル、エチル、プロピル又はブチル）であることを特徴とする、前記（１）に記載のリフォールディング剤。
（３）タンパク質変性剤、界面活性剤及び／又はリフォールディングバッファーの存在下で、タンパク質の巻き戻しが行われる、前記（１）に記載のリフォールディング剤。
（４）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、大腸菌の発現系で生産されたタンパク質であることを特徴とする、前記（１）に記載のリフォールディング剤。
（５）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、熱履歴の原因で失活したタンパク質であることを特徴とする、前記（１）に記載のリフォールディング剤。
（６）ゼオライトベータの骨格構造が、酸素とそれ以外の１種又は２種以上の元素からなることを特徴とする、前記（１）に記載のリフォールディング剤。
（７）ゼオライトベータの骨格構造が、ケイ素及び酸素、又はケイ素、アルミニウム及び酸素からなることを特徴とする、前記（６）に記載のリフォールディング剤。
（８）溶液中に分散したタンパク質と接触することにより、タンパク質巻き戻し機能を発揮する、前記（１）から（７）のいずれかに記載のリフォールディング剤。
（９）溶液中の前記タンパク質を、該リフォールディング剤との混合、又は該リフォールディング剤充填カラムへの注入により、吸着させ、しかる後、脱着させる操作で該タンパク質の巻き戻しを起こさせる、前記（１）から（８）のいずれかに記載のリフォールディング剤。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A refolding agent having a protein unwinding function that adjusts and activates a higher order structure of a protein that is inactive due to disordered higher order structure, the refolding agent comprising a zeolite having a BEA structure ( A protein refolding agent, characterized in that the zeolite beta comprises ammonium ions, organic ammonium ions and / or urea .
( 2 ) The refolding according to ( 1 ) above, wherein the organic ammonium ion is a mono, di, tri and / or tetraalkylammonium ion (the alkyl group is methyl, ethyl, propyl or butyl). Agent.
( 3 ) The refolding agent according to (1), wherein the protein is unwound in the presence of a protein denaturant, a surfactant, and / or a refolding buffer.
( 4 ) The refolding agent according to (1) above, wherein the protein that is inactive due to disordered higher order structure is a protein produced in an expression system of E. coli.
( 5 ) The refolding agent according to (1) above, wherein the protein that is inactive due to disordered higher order structure is a protein inactivated due to thermal history.
( 6 ) The refolding agent according to (1) above, wherein the framework structure of zeolite beta is composed of oxygen and one or more other elements.
( 7 ) The refolding agent according to ( 6 ) above, wherein the framework structure of zeolite beta is composed of silicon and oxygen, or silicon, aluminum and oxygen.
( 8 ) The refolding agent according to any one of (1) to ( 7 ), wherein the refolding agent exhibits a protein unwinding function by contact with a protein dispersed in a solution.
( 9 ) The protein in the solution is adsorbed by mixing with the refolding agent or injected into the column packed with the refolding agent, and then the protein is unwound by desorption. The refolding agent according to any one of (1) to ( 8 ).
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の、ゼオライトベータからなるリフォールディング剤の対象となるタンパク質は、高次構造が整っていない不活性なタンパク質全てであるが、特に、大腸菌等の発現系で得られる立体構造が無秩序なタンパク質、いわゆるインクルージョンボディ、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質である。本発明のリフォールディング剤は、該タンパク質の該リフォールディング剤への吸着・脱離過程で、該タンパク質の立体構造をリフォールディングし、該タンパク質本来の機能の賦活・付与を行うが、該リフォールディング剤の本能力は、必ずしもそれに限定されるものではなく、通常、次のような操作で発揮される。換言すれば、次のような操作で不活性タンパク質の機能賦活が行われる。まず、該タンパク質を、変性剤や界面活性剤などを含む溶液に分散溶解し、この後、本発明のリフォールディング剤を含む溶液との混合や、本リフォールディング剤充填カラムへの注入により、該タンパク質を本リフォールディング剤に吸着させ、次いで、本リフォールディング剤から該タンパク質を脱着させる手順で行われる。
Next, the present invention will be described in more detail.
The proteins targeted by the refolding agent comprising zeolite beta according to the present invention are all inactive proteins having no higher-order structure, and in particular, proteins with disordered three-dimensional structures obtained in expression systems such as Escherichia coli It is a protein that has been inactivated due to a certain cause such as a so-called inclusion body or thermal history. The refolding agent of the present invention refolds the three-dimensional structure of the protein in the process of adsorption / desorption of the protein to the refolding agent, and activates / provides the original function of the protein. This ability of the agent is not necessarily limited thereto, and is usually exhibited by the following operation. In other words, functional activation of the inactive protein is performed by the following operation. First, the protein is dispersed and dissolved in a solution containing a denaturing agent, a surfactant, etc., and then mixed with a solution containing the refolding agent of the present invention or injected into a column packed with the refolding agent. The protein is adsorbed on the refolding agent, and then the protein is desorbed from the refolding agent.
該リフォールディング剤に吸着前の、タンパク質の分散溶媒としては、一般には、それが大腸菌等の発現系で生産されること、タンパク質は、通常、水溶液中で使われることが多く、失活した場合でも水溶液中にあることが多いことから、好ましくは、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該タンパク質と反応を起こさないもの、及び該タンパク質の立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それら溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、例えば、一価及び多価のアルコールやポリエーテル類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 As a protein dispersion solvent before adsorption to the refolding agent, it is generally produced in an expression system such as Escherichia coli, and the protein is usually used in an aqueous solution. However, since it is often in an aqueous solution, water is preferably used. However, the present invention is not necessarily limited to this, and there is basically no problem as long as it does not cause a reaction with the protein and does not change the three-dimensional structure of the protein into an unintentional form. In some cases, these solvents can be used alone or mixed with water. Typical examples of this type of solvent include, but are not limited to, monohydric and polyhydric alcohols and polyethers.
該タンパク質の吸脱着は、一般には、インクルージョンボディなどの、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、及び／又は、タンパク質鎖長中に不本意に生成したＳ−Ｓ結合を切断するために、ある種の還元剤の存在下で行われる。この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、２−［４−（２−オキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperadinyl]ethan sulfonic acid（ＨＥＰＥＳ）)、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、デキストランＴ−５００（Dextran T-500） やフィコール１４００（Ficol1400）などを挙げることができるが、これらに留まるものではなく、同様な作用を持つものはいずれも使用可能である。 The protein adsorption / desorption generally involves denaturing agents, surfactants, pH adjusters, refolding factors, etc. in order to make it easier to unwind and rewind the entangled protein chain length, such as inclusion bodies. And / or in the presence of certain reducing agents in order to cleave S—S bonds formed inadvertently during the protein chain length. Typical examples of this type of modifier, surfactant, pH adjuster, and refolding factor include, for example, guanidine hydrochloride, trisaminomethane hydrochloride, polyethylene glycol, cyclodextrin, 2- [4- (2-oxyethyl)- 1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperadinyl] ethan sulfonic acid (HEPES)), polyphosphoric acid, sucrose, glucose, glycerol, inositol, dextran T-500 (Dextran T-500 500) and Ficol 1400 (Ficol 1400), etc., but are not limited to these, and any of those having the same action can be used.
不本意に生成したS-S結合を切断し、本来の構造に戻す還元剤としては、安価で入手し易いことから、通常は、２−メルカプトエタノールが用いられるが、これに限定されるものではなく、同様な作用を行うものは全て使用可能である。当然のことながら、タンパク質鎖長が解きほぐれやすい場合や、不本意にＳ−Ｓ結合が生成しない場合は、変性剤や界面活性剤、及び／又は防止剤を、必ずしも使う必要がないので、これらの存在は、常に必須とは限らず、状況に応じ適宜選択して用いられる。また、それらを用いる場合も、それらの量は、状況に応じ、適宜決められることになる。 As a reducing agent that cleaves the unintentionally generated SS bond and returns it to its original structure, 2-mercaptoethanol is usually used because it is inexpensive and easily available, but is not limited thereto. Anything that performs the same function can be used. Of course, when the protein chain length is easily unraveled or when the S—S bond is not generated unintentionally, it is not necessary to use a denaturant, a surfactant, and / or an inhibitor. The presence of is not always essential, and is appropriately selected according to the situation. Moreover, also when using them, those quantity will be suitably determined according to a condition.
また、該タンパク質の脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には、該タンパク質の脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化なども用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。更には、置換吸着の際、該タンパク質の脱着を促す物質として、従来から、カラムクロマトグラフィーの溶離では、ハロゲン化アルカリやドデシル硫酸ナトリウムなどの塩が、頻繁に用いられており、これらの併用で顕著な効果が得られる場合も多い。したがって、置換吸着で該タンパク質の脱着を行う際には、これらカラムクロマトグラフィーの溶離に用いられるものなど、種々のものの塩と界面活性剤やリフォールディング因子とを併用することも可能であり、この種の併用塩としては、ここに挙げたものに限定されるものではなく、該タンパク質の脱着後の機能賦活を阻まないものであれば、いずれも使用可能である。 In addition, substitution adsorption is generally used for the desorption of the protein, but basically any operation can be applied as long as it does not hinder the function activation after the desorption of the protein. Is not to be done. Therefore, pH change, temperature change, etc. can be used, and these can be used in combination with displacement adsorption. Furthermore, as a substance that promotes desorption of the protein during substitution adsorption, conventionally, salts such as alkali halides and sodium dodecyl sulfate have been frequently used in column chromatography elution. In many cases, a remarkable effect can be obtained. Therefore, when desorbing the protein by displacement adsorption, various salts such as those used for elution of column chromatography can be used in combination with surfactants and refolding factors. The combined salt of the seed is not limited to those listed here, and any salt can be used as long as it does not hinder the function activation after desorption of the protein.
更に言えば、該タンパク質の、本発明リフォールディング剤への吸着、あるいはそれからの脱着を促すために、上記操作と併用して、種々の付加的操作を行うこともできる。このような操作の典型例には、例えば、超音波やマイクロ波の照射や、磁場や電場の印加がある。以上述べてきた手順・操作により、該リフォールディング剤の持つタンパク質巻き戻し能が高度に発揮されることになり、大腸菌等の発現系を用いて生産した高次構造未形成タンパク質並びにある種の原因で失活したタンパク質に、リフォールディングが起き、それらのタンパク質が本来持つはずの機能が速やかに賦活される。 Furthermore, in order to promote adsorption of the protein to the refolding agent of the present invention or desorption from the protein, various additional operations can be performed in combination with the above operations. Typical examples of such operations include irradiation of ultrasonic waves and microwaves, and application of magnetic fields and electric fields. By the procedures and operations described above, the protein unwinding ability of the refolding agent will be demonstrated to a high degree, and higher-order unstructured protein produced using an expression system such as Escherichia coli and certain causes Refolding occurs in the proteins deactivated in (1), and the functions that those proteins originally have are quickly activated.
以上述べてきた不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を有する、本発明のリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト（通称ゼオライトベータ、Zeolite Beta）は、ベータゼオライトとも呼ばれ、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ、文献等に従い、自前で合成・調製したゼオライトベータ（非特許文献１０参照）、それらを焼成して得られるゼオライトベータ、該ゼオライトの有する空間中にアンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム類含有骨格置換ゼオライトベータなどが挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には全て該機能・能力を有しており、該リフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。 The zeolite with the BEA structure (commonly known as zeolite beta, Zeolite Beta) that constitutes the refolding agent of the present invention, which has the activity activation function of the inactive protein and the ability to unwind the denatured protein as described above, is also called beta zeolite, Typical examples include, for example, ordinary commercial zeolite beta, zeolite beta synthesized and prepared in accordance with literature, etc. (see Non-Patent Document 10), zeolite beta obtained by firing them, ammonium in the space of the zeolite Zeolite beta having ammoniums such as various aliphatic and / or aromatic ammoniums, framework-substituted zeolite beta in which a part of the skeleton silicon forming the zeolite is changed to another metal, and the ammonium-containing framework-substituted zeolite beta Of zeolite beta As long as it has a case structure, all basically has the functions and capabilities, zeolite beta constituting the refolding agent is not necessarily limited to those listed here.
ところで、本発明のリフォールディング剤を構成するゼオライトベータの該機能・能力は、不活性並びに変性タンパク質の該ゼオライトへの接触、すなわち吸着・脱離、で発揮され、この際には、ゼオライトベータ表面と対象タンパク質との間の親和性が重要となる上に、また、該タンパク質の吸着・脱離は、その分散溶媒、分散溶媒中の変性剤や界面活性剤並びにリフォールディング因子、更には分散溶媒のｐＨなどで影響される場合も多いので、対象とするタンパク質及びそれを含む溶液の成分状況等に応じて、本発明のリフォールディング剤のリフォールディング能は、それを構成する前述の種々のゼオライトベータによって、しばしば異なる。しかしながら、総じて、アンモニウム類を含むゼオライトベータより構成されるリフォールディング剤は、それを含まないものより高いリフォールディング能を示すので、該リフォールディング剤としては、アンモニウム類を含むゼオライトベータ及びアンモニウム類を含む骨格置換ゼオライトベータで構成されるものが好ましいことが、しばしばである。 By the way, the function / capability of the zeolite beta constituting the refolding agent of the present invention is exhibited by inactive and contact of the modified protein with the zeolite, that is, adsorption / desorption. The affinity between the target protein and the target protein is important, and the adsorption / desorption of the protein depends on the dispersion solvent, the denaturing agent and surfactant in the dispersion solvent, the refolding factor, and the dispersion solvent. The refolding ability of the refolding agent of the present invention depends on the protein of interest and the component status of the solution containing the protein, etc. Varies often by beta. However, as a whole, refolding agents composed of zeolite beta containing ammoniums show higher refolding ability than those not containing them, so that the refolding agents include zeolite beta containing ammoniums and ammoniums. Often it is preferred to be composed of a framework-substituted zeolite beta comprising.
該リフォールディング剤の、ゼオライトベータに含有されるべきアンモニウム類としては、該ゼオライトの有する空間中に留まり易いアンモニウム類、例えば、アンモニウムイオン、アルキル基がメチル、エチル、プロピル及びブチルなどのモノ、ジ、トリ及びテトラアルキルアンモニウムイオン、更には、5員環、６員環及７員環の脂肪族アミン及び芳香族アミンのアンモニウムイオン、より詳しくは、ピペリジュムイオン、アルキルピペリジュムイオン、ピリジニウムイオン、アルキルピリジウムイオン、アニリンイオン、Ｎ−アルキルアニリンイオンなどを挙げることができ、また、酸アミドとしての、例えば、フォルムアミド、アセトアミド及びこれらのＮ−アルキル置換体を挙げることができるが、基本的には、ゼオライトベータの有する細孔中に入ることが可能なアンモニウム類であれば、いずれでもよく、ここに例示したアンモニウム類に限定されるものではない。 As the ammoniums to be contained in the zeolite beta of the refolding agent, ammoniums that are likely to remain in the space of the zeolite, for example, ammonium ions, mono- and di-alkyl such as methyl, ethyl, propyl and butyl whose alkyl group is methyl , Tri- and tetraalkylammonium ions, ammonium ions of 5-membered, 6-membered and 7-membered aliphatic amines and aromatic amines, more specifically piperidium ions, alkyl piperidium ions, pyridinium ions, Alkyl pyridium ions, aniline ions, N-alkyl aniline ions and the like can be mentioned, and as acid amides, for example, formamide, acetamide and their N-alkyl substituents can be mentioned. The zeolite beta Any ammonium can be used as long as it can enter the pores it has, and is not limited to the ammoniums exemplified here.
該リフォールディング剤の、ゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般には、ケイ素と酸素、あるいはケイ素と酸素とアルミニウムであるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性タンパク質の活性賦活機能を有する。ゼオライトベータの骨格ケイ素、あるいはアルミニウムと置換可能なものの典型としては、例えば、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウムなどを挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的に、ゼオライトベータの構造を破壊しないものであれば、いずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性、あるいは変性タンパク質のリフォールディング機能を発揮するリフォールディング剤となり得る。 The elements that form the framework of zeolite beta of the refolding agent are generally silicon and oxygen, or silicon, oxygen, and aluminum. However, zeolite beta in which a part of silicon or aluminum is substituted with another element and its The substituted zeolite beta containing the ammoniums in the pores also has an activity activation function for inactive proteins. Typical examples of zeolite beta framework silicon or those that can replace aluminum include boron, phosphorus, gallium, tin, titanium, iron, cobalt, copper, nickel, zinc, chromium, vanadium, and the like. However, the present invention is not limited to these, and basically any one that does not destroy the structure of zeolite beta may be used. Further, regarding the substitution amount, any substitution amount may be used as long as it does not destroy the structure of zeolite beta. The substitution zeolite beta is inactivated or refolded to exert a refolding function of a denatured protein. Can be an agent.
本発明のリフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、いずれも熱安定性、化学安定性に優れており、しかも安価であるうえ、繰り返し使用が可能であるので、本発明のリフォールディング剤及びそれを用いる不活性あるいは変性タンパク質の機能賦活方法は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとって極めて有用であり、その技術的、経済効果は計り知れないものがある。 The zeolite beta constituting the refolding agent of the present invention is excellent in thermal stability and chemical stability, and is inexpensive and can be used repeatedly. Therefore, the refolding agent of the present invention and the The function activation method of the inactive or denatured protein to be used is extremely useful for, for example, biochemical production and pharmaceutical production, and its technical and economic effects are immeasurable.
本発明は、不活性タンパク質の機能を賦活する能力を有する物質・材料であるリフォールディング剤に係わるものであり、本発明によって、１）タンパク質の種類を問わず、広範な不活性タンパク質に対して、それら本来の機能を賦活させる万能的物質・材料、すなわちＢＥＡ構造のゼオライト（ゼオライトベータ）からなるリフォールディング剤を選定することができる、２）本発明のリフォールディング剤に、前記タンパク質、例えば、大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質を接触させることにより、それらタンパク質の本来の機能・活性を、リフォールディングにより賦活させることができる、３）本発明のリフォールディング剤は、インクルージョンボディのタンパク質にも効力を有し、インクルージョンボディの効率的なリフォールディング方法において有用である、４）本発明のリフォールディング剤に接触させ、不活性タンパク質の機能を賦活する方法は、タンパク質を構成するアミノ酸の鎖長・配列を問わず、種々の変性タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的方法である、５）本発明のリフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し使用可能である、６）本発明のリフォールディング剤を用いる不活性タンパク質の機能賦活方法は、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む、種々の立体構造無秩序タンパク質のリフォールディングに適用できる、７）例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと、本発明のリフォールディング剤による不活性タンパク質の機能賦活とを組み合わせることにより、高次構造が制御されて、該タンパク質固有の本来機能が備わったタンパク質を生産する新規の活性タンパク質製造プロセスを提案・確立することができる、という格別の効果が奏される。 The present invention relates to a refolding agent which is a substance / material having the ability to activate the function of an inactive protein. According to the present invention, 1) a wide range of inactive proteins can be used regardless of the type of protein. A universal material / material that activates their original functions, that is, a refolding agent composed of a zeolite having a BEA structure (zeolite beta) can be selected. 2) The protein, for example, By contacting proteins that are inactive because the higher-order structure produced in an expression system such as Escherichia coli is not formed, or proteins that have been inactivated due to a change in the three-dimensional structure due to a certain cause, Function / activity can be activated by refolding 3) Refolding of the present invention Is effective in the inclusion body protein, and is useful in an efficient method of refolding the inclusion body. 4) A method of bringing into contact with the refolding agent of the present invention and activating the function of an inactive protein is as follows: Regardless of the chain length and sequence of amino acids constituting the protein, this is an efficient method with generality, universality, and high refolding rate that can be applied to various denatured proteins. 5) Refolding of the present invention Zeolite beta constituting the agent is low in cost and can be used repeatedly. 6) The method for activating the function of an inactive protein using the refolding agent of the present invention includes a large protein having a molecular weight exceeding 100,000. Can be applied to refolding various conformationally disordered proteins, 7) For example, by combining the protein synthesis process by the expression system of E. coli and the functional activation of the inactive protein by the refolding agent of the present invention, a protein having an inherent function unique to the protein can be obtained by controlling the higher-order structure. The special effect of being able to propose and establish a new active protein production process to produce is produced.
次に、実施例及び比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等によって何ら制約を受けるものではない。 Next, the present invention will be specifically described based on examples and comparative examples, but the present invention is not limited by the following examples.
実施例１〜５８及び比較例１〜２９
以下、本実施例では、大腸菌発現系生産タンパク質及び変性タンパク質の機能賦活を説明するが、本発明は実施例に限定・制限されるものではない。
１）試料等の調製
（ａ）リフォールディング剤
リフォールディング剤（機能賦活剤）として、後記する表1及び２に示した、市販ゼオライトベータ、合成ゼオライトベータ、それらを焼成したゼオライトベータ、各種アンモニウム類含有ゼオライトベータ、骨格置換ゼオライトベータ及び各種アンモニウム類含有骨格置換ゼオライトベータを使用した。比較品として、表５の比較例に列挙した物質を用いた。これらの物質は、ベータ構造を有するゼオライトではない。例えば、比較例１９、２０の物質は合成時間が充分ではなく、ＢＥＡ構造が未形成のシリカ及びシリカ・アルミナで、大半は非晶質構造である。
Examples 1 to 58 and Comparative Examples 1 to 29
Hereinafter, in the present example, functional activation of E. coli expression system production protein and denatured protein will be described, but the present invention is not limited or limited to the example.
1) Preparation of samples, etc. (a) Refolding agent As refolding agents (functional activators), shown in Tables 1 and 2 below, commercially available zeolite beta, synthetic zeolite beta, zeolite beta obtained by firing them, and various ammoniums Containing zeolite beta, framework-substituted zeolite beta and various ammonium-containing framework-substituted zeolite beta were used. As comparative products, the substances listed in Comparative Examples in Table 5 were used. These materials are not zeolites with a beta structure. For example, the materials of Comparative Examples 19 and 20 have insufficient synthesis time, silica and silica-alumina with an unformed BEA structure, and most have an amorphous structure.
（ｂ）変性タンパク質溶液
活性賦活対象タンパク質として、表１及び２のタンパク質及び備考欄に示した内容のＲＰ７０（黄色ショウジョウバエ由来）、Ｐ５３（ヒト由来）等を使用した。
（ｃ）リフォールディングバッファー
一般には、リフォールディングバッファーとして、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５ ／ ０．５Ｍ ＮａＣｌ ／ ２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール ／ ２．５（ｗ／ｖ）％ ポリエチレングリコール ２００００（リフォールディング因子） ／ １（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）の組成の液を用いた。表３、表４及び表６に、用いたリフォールディングバッファーの詳細を示す。
(B) Denatured protein solution As the protein to be activated, RP70 (derived from yellow Drosophila), P53 (derived from human) and the like shown in Tables 1 and 2 and the remarks column were used.
(C) Refolding buffer
Generally, as a refolding buffer, 50 mM HEPES pH 7.5 / 0.5 M NaCl / 20 mM 2-mercaptoethanol / 2.5 (w / v)% polyethylene glycol 20000 (refolding factor) / 1 (v / v)% A liquid having a composition of Tween 20 (surfactant) was used. Tables 3, 4 and 6 show details of the refolding buffer used.
２）リフォールディング操作
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに、１００ｍｇのリフォールディング剤を入れ、０．５ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン・２０ｍＭトリスアミノメタン三塩酸塩（TrisHCl）ｐＨ７．５・０．５ＭＮａＣｌ・２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを加えて懸濁した。これに、６Ｍ塩酸グアニジン・２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを加え、氷上で１時間放置し、変性したタンパク質溶液（濃度は０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ加えた。この混合液を、該タンパク質のリフォールディング剤上への吸着を確実にするために、低温室に置かれた旋回培養器（ROTARY CULTURE RCC-100：IWAKI GLASS社製）で、１時間攪拌した。
2) Refolding operation In a 1.5 ml Eppendorf tube, 100 mg of the refolding agent is added, and 0.5 ml of 6 M guanidine hydrochloride / 20 mM trisaminomethane trihydrochloride (TrisHCl) pH 7.5 / 0.5 M NaCl / 20 mM 2- Mercaptoethanol was added and suspended. To this, 6M guanidine hydrochloride · 20 mM 2-mercaptoethanol was added, left on ice for 1 hour, and 0.5 ml of denatured protein solution (concentration: 0.5 to 1.0 mg / ml) was added. In order to ensure adsorption of the protein onto the refolding agent, this mixed solution was stirred for 1 hour in a swirl incubator (ROTARY CULTURE RCC-100: manufactured by IWAKI GLASS) placed in a low temperature chamber.
その後、１００００×ｇで５秒間遠心して、リフォールディング剤を沈殿させ、上澄みを除去した。次に、この沈殿したリフォールディング剤からタンパク質変性剤を完全に除去するために、これを１ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５・２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールで４回洗った後、１００００×ｇで５秒間遠心し、生じた上澄みを捨てた。残ったリフォールディング剤に、１ｍｌのリフォールディングバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、リフォールディング因子及び非イオン系界面活性剤から構成）を加え、懸濁した。 Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 × g for 5 seconds to precipitate the refolding agent, and the supernatant was removed. Next, in order to completely remove the protein denaturant from the precipitated refolding agent, this was washed 4 times with 1 ml of 20 mM TrisHCl pH 7.5 / 20 mM 2-mercaptoethanol, and then centrifuged at 10,000 × g for 5 seconds. The resulting supernatant was discarded. To the remaining refolding agent, 1 ml of refolding buffer (composed of 50 mM HEPES pH 7.5, 0.5 M NaCl, 20 mM 2-mercaptoethanol, refolding factor and nonionic surfactant) was added and suspended.
リフォールディング剤上に吸着した該タンパク質を脱着・溶離させるために、この懸濁液を、再び低温下の旋回培養器（ROTARY CULTURE RCC-100：IWAKI GLASS社製）で攪拌した。その後、１００００×ｇで５秒間遠心して、リフォールディング剤を沈殿させ、該タンパク質を含む上澄みを、新しいエッペンドルフチューブに移し、活性測定（アッセイ）に用いた。
なお、活性測定には、用いたタンパク質の働きに応じた方法を採用した。具体的には、４種の測定、すなわち、ゲルシフトアッセイ、ポリメラーゼアッセイ、リゾチーム活性測定及びトポイソメラーゼI活性測定で行った。
In order to desorb and elute the protein adsorbed on the refolding agent, the suspension was stirred again in a rotating incubator (ROTARY CULTURE RCC-100: manufactured by IWAKI GLASS) at low temperature. Thereafter, the refolding agent was precipitated by centrifuging at 10,000 × g for 5 seconds, and the supernatant containing the protein was transferred to a new Eppendorf tube and used for activity measurement (assay).
In addition, for the activity measurement, a method according to the function of the used protein was adopted. Specifically, four types of measurements were performed: gel shift assay, polymerase assay, lysozyme activity measurement, and topoisomerase I activity measurement.
３）活性測定操作
（ａ）ゲルシフトアッセイ
１ｐｍｏｌの放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドＤＮＡとリフォールディングしたタンパク質を、組成２５ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４・５０ｍＭ ＫＣｌ・２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ・０．１％ＮＰ−４０・１ｍＭＤＴＴ・１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ bovine serum albumin）の溶液中で、氷上３０分インキュベートし、４．５％のポリアクリルアミノゲルで０．５×ＴＢＥのバッファーを使い、４℃で電気泳動した。
タンパク質にＤＮＡ結合性がある（すなわち、活性がある）場合、ＤＮＡにタンパク質が結合し、これにより電気泳動が遅くなりバンドがシフトするので、これにより活性（すなわち、リフォールディング率）を判定した。
3) Activity measurement procedure (a) Gel shift assay Oligonucleotide DNA labeled with 1 pmol of radioisotope and refolded protein were combined with a composition of 25 mM HEPES pH 7.4, 50 mM KCl, 20% glycerol, 0.1% NP-40, 1 mM DTT. -Incubated for 30 minutes on ice in a solution of 1 mg / ml bovine serum albumin, and electrophoresed at 4.5C using a 0.5% TBE buffer with 4.5% polyacrylaminogel.
If the protein has DNA binding (i.e., activity), the protein binds to DNA, which slows electrophoresis and shifts the band, thereby determining activity (i.e., refolding rate).
（ｂ）ポリメラーゼアッセイ
鋳型ＤＮＡとして、ｐｏｌｙ（ｄＡ）ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２〜１８あるいはＤＮアーゼ１（DNase１）−活性化仔牛胸腺ＤＮＡ（activate calf thymus DNA）を使用し、反応液には組成（終濃度）５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５・１ｍＭ ＤＴＴ・１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ・５ｍＭ ＭｇＣｌ2・０．５μＭ ｄＴＴＰ (ｃｏｌｄ)（チミジル酸三リン酸）・[3Ｈ]-ｄＴＴＰ (５ｍＣｉ／ｍｌ：１００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ)のものを用いた。先ず、この反応液の濃度が２倍のもの１０μｌに、タンパク質（酵素）サンプル溶液を加え、懸濁した後３７℃で１時間インキュベートした後、氷上に置き反応を停止させた。
(B) Polymerase assay Poly (dA) oligo (dT) 12-18 or DNase 1 (DNase 1) -activated calf thymus DNA is used as a template DNA, and the composition (final) is used for the reaction solution. Concentration) 50 mM TrisHCl pH 7.5 / 1 mM DTT / 15% glycerol / 5 mM MgCl 2 /0.5 μM dTTP (cold) (thymidylic acid triphosphate) / [ 3 H] -dTTP (5 mCi / ml: 100-500 cpm / pmol) The ones used were used. First, a protein (enzyme) sample solution was added to 10 μl of a double concentration of this reaction solution, suspended, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then placed on ice to stop the reaction.
その後、正方形に切ったＤＥ８１紙に反応液を滴下し、乾燥させた後、ビーカーの中に移して、未反応ｄＴＴＰを溶解除去するために洗浄した。洗浄は、先ず５％リン酸水素二ナトリウム水溶液で３回行い、次いで、蒸留水で３回、更にエタノールで２回行い、その後、乾燥した。このようにして得た乾燥ＤＥ８１紙を、シンチレーターが入ったバイアルに入れ、シンチレーションカウンターで放射活性（ｃｐｍ）を測定した。酵素サンプルの活性が強いほど、それで合成されるＤＮＡに放射性同位体で標識したｄＴＴＰがより多く取り込まれ、放射性が高くなるので、これによりタンパク質の活性を判定した。 Thereafter, the reaction solution was dropped onto DE81 paper cut into a square, dried, then transferred into a beaker, and washed to dissolve and remove unreacted dTTP. Washing was first performed 3 times with 5% aqueous solution of disodium hydrogenphosphate, then 3 times with distilled water, 2 times with ethanol, and then dried. The dry DE81 paper thus obtained was placed in a vial containing a scintillator and the radioactivity (cpm) was measured with a scintillation counter. The stronger the activity of the enzyme sample, the more dTTP labeled with a radioisotope is incorporated into the DNA synthesized with it, and the radioactivity becomes higher. Thus, the activity of the protein was determined.
（ｃ）リゾチームの活性測定
基質に細菌Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを選び、これを５０ｍＭリン酸バッファーで懸濁し、０．１６ｍｇ／ｍｌ濃度の基質溶液を調製した。この基質溶液４８０μｌに、２０μｌのタンパク質（酵素リゾチーム）溶液を加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
リゾチームは細菌の細胞壁を分解する能力があるので、その能力、すなわち、活性が高いほど吸光度は減少する。リゾチーム活性１ｕｎｉｔは１分間当たりに４５０ｎｍの吸光度が０．００１減少することと定義した。
(C) Activity measurement of lysozyme Bacteria M. Lysodeikticus was selected and suspended in 50 mM phosphate buffer to prepare a substrate solution having a concentration of 0.16 mg / ml. To 480 μl of this substrate solution, 20 μl of protein (enzyme lysozyme) solution was added and incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured.
Since lysozyme has the ability to break down bacterial cell walls, the higher its ability, ie activity, the lower the absorbance. One unit of lysozyme activity was defined as a 0.001 decrease in absorbance at 450 nm per minute.
（ｄ）トポイソメラーゼI活性測定
０．５μｇのｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ｐＢＲ３２２とトポイソメラーゼI（TopoisomeraseＩ）タンパク質を、反応バッファー（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５, １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ β-ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ,０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、３７℃で３０分インキュベーションした後、０．１％ＳＤＳを添加し、反応を停止した。次に、これに０．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（proteinase K）を添加し、３７℃で３０分インキュベーションし、液中のタンパク質トポイソメラーゼIを分解した。この後、この液を１％（ｗ／ｖ）アガロースで電気泳動し、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドでＤＮＡ染色し、ＵＶトランスイルミネーターで上方にシフトしたＤＮＡのバンドを確認することによって、トポイソメラーゼＩ活性測定を行った。
(D) Topoisomerase I activity measurement 0.5 μg of supercoiled pBR322 and topoisomerase I (Topoisomerase I) protein were suspended in a reaction buffer (10 mM TrisHCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 0.5 mM EDTA). After 30 minutes of incubation, 0.1% SDS was added to stop the reaction. Next, 0.5 μg / ml proteinase K was added thereto and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to decompose protein topoisomerase I in the solution. Thereafter, this solution was electrophoresed with 1% (w / v) agarose, stained with 0.5 μg / ml ethidium bromide, and the DNA band shifted upward was confirmed with a UV transilluminator. Topoisomerase I activity was measured.
上記手順・操作で得られた本実施例の結果である、活性（リフォールディング率）、タンパク質回収率等を、表１、表２及び表５に、比較例と共に纏めた。実施例に示されるように、リフォールディングにより、ＤＮＡ結合活性等のタンパク質本来の活性が得られることが分かった。本発明のリフォールディング剤は、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用できる、一般性、普遍性の高いリフォールディング剤として有用であり、その適用は、実施例に示されたタンパク質に限定されるものではなく、任意のタンパク質に適用し得るものである。 The activity (refolding rate), protein recovery rate, and the like, which are the results of this example obtained by the above procedures and operations, are summarized in Table 1, Table 2, and Table 5 together with Comparative Examples. As shown in the Examples, it was found that the original activity of the protein such as DNA binding activity can be obtained by refolding. The refolding agent of the present invention is useful as a general and highly versatile refolding agent that can be applied to various high-order structure unformed and denatured / inactivated proteins, and its application is shown in Examples. The present invention is not limited to proteins, and can be applied to any protein.
以上詳述したように、本発明は、不活性タンパク質の機能賦活剤に係わるものであり、本発明によって、大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質の本来の機能・活性を、リフォールディングにより賦活させることができる。本発明の機能賦活剤を用いた方法は、インクルージョンボディを効率よくリフォールディングする方法として有用である。種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的なリフォールディング剤を提供できる。本発明のリフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し使用が可能である。本発明のリフォールディング剤は、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む、種々の立体構造無秩序タンパク質のリフオールディングに効力を有する。したがって、更なる展開、例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと、本発明のリフォールディング剤並びにその使用法とを組み合わせることにより、高次構造の制御された該タンパク質固有の本来機能が備わったタンパク質を生産する新規の活性タンパク質製造プロセス・システムを構築することができる。 As described above in detail, the present invention relates to a function activator of an inactive protein. According to the present invention, an inactive protein is formed because a higher-order structure produced in an expression system such as Escherichia coli is not formed. Alternatively, the original function / activity of a protein deactivated due to a change in the three-dimensional structure due to a certain cause can be activated by refolding. The method using the functional activator of the present invention is useful as a method for efficiently refolding an inclusion body. It is possible to provide an efficient refolding agent that can be applied to various proteins and has generality, universality, and a high refolding rate. The zeolite beta constituting the refolding agent of the present invention is low in cost and can be used repeatedly. The refolding agent of the present invention is effective for the refolding of various conformationally disordered proteins including large proteins having a molecular weight exceeding 100,000. Therefore, by combining the further development, for example, the protein synthesis process by the expression system of E. coli with the refolding agent of the present invention and the method of using the same, the inherent function inherent to the protein with a higher order structure is provided. New active protein production process systems that produce proteins can be constructed.
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