JP5252365B2 - Function activation / recovery method of lysozyme - Google Patents
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Description
本発明は、不活性リゾチームの機能賦活・回復方法に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性なリゾチーム、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、失活したリゾチームをβ型ゼオライト（ゼオライトベータと記載することがある。）及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングさせ、該リゾチーム固有の本来機能を賦活・再生させることを可能とする不活性リゾチームの機能賦活・回復方法、及び該方法を利用した活性リゾチームの製造方法に関するものである。 The present invention relates to a method for activating / recovering the function of inactive lysozyme, and more specifically, since the higher-order structure is not formed, the lysozyme is inactive, or the steric structure is changed due to a certain cause, and deactivated. The lysozyme is refolded using a refolding buffer containing a β-type zeolite (sometimes referred to as zeolite beta) and a redox agent, and the intrinsic function unique to the lysozyme can be activated and regenerated. The present invention relates to a method for activating / recovering the function of active lysozyme and a method for producing active lysozyme using the method.
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。 It is not a gene that actually acts and works in vivo, but a protein made from them. Therefore, elucidation and analysis of protein functions and structures are extremely important, for example, directly related to disease treatment and drug discovery. For this reason, various proteins are synthesized and produced by various methods, their structures are examined, and action mechanisms and roles in the living body are elucidated. Now, it is well known that the functions of proteins are determined not only by the sequence and chain length of the amino acids constituting them, but also by the ordered three-dimensional structure (higher order structure) taken by them.
タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。 Protein synthesis is generally performed using expression systems such as Escherichia coli, insect cells, and mammalian cells. In the synthesis by insect cells and mammalian cells, the resulting protein is often soluble, with a higher order structure controlled, an ordered three-dimensional structure. However, these methods have a drawback that the operation of separation and purification is very complicated, and it takes time to obtain the target protein, resulting in an increase in cost and an extremely small amount of protein to be obtained.
これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。 In contrast, protein synthesis by E. coli is easy to operate, requires less time to obtain the target protein, and does not cost much. For this reason, at present, a method using E. coli into which a gene code responsible for the synthesis of a target protein is incorporated has become the mainstream of protein synthesis, and a production process is being established.
ところが、ヒトなど高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序がなく、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわちアミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。 However, when proteins from higher organisms such as humans are synthesized in the E. coli expression system, the amino acid binding sequence and number, that is, the amino acid chain length, can be obtained as designed, but the three-dimensional structure is not ordered and high. A protein whose secondary structure is not controlled, that is, an insoluble protein called an inclusion body in which amino acid chains are entangled is obtained.
当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。 As a matter of course, the inclusion body of this insoluble protein does not have the desired function and performance and does not exhibit activity. For this reason, in the production process using E. coli, it is necessary to unwind the inclusion body, prepare a higher-order structure, and convert it into a soluble protein having an ordered three-dimensional structure, that is, refolding (rewinding) the inclusion body. This type of refolding is an extremely important technique that can be applied not only to the production of proteins by E. coli, but also to the regeneration of proteins that have been inactivated due to certain causes such as thermal history.
従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されている。しかし、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多い。現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。 Conventionally, this refolding has been extensively studied and various methods have been proposed. However, most of them often have only low chances of refolding, and have only been able to obtain favorable results for certain limited proteins (especially specific proteins with low molecular weight). At present, this refolding is not an efficient and economical method with generality, universality and high refolding rate applicable to various proteins.
最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを、界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＦｏｌｄＩｔキット）である。 The most commonly used refolding operation from the oldest is dialysis and dilution. In the former, protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or denaturing agent, and this is dialyzed against a buffer solution that does not contain a surfactant or denaturing agent, thereby reducing the concentration of the surfactant or denaturing agent. (Typical example: FoldIt kit manufactured by Hampton Research).
一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを、単に希釈して行くことで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるものである。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のＳｏｄｉｕｍ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、巻き戻す方法（非特許文献１参照）等、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。 On the other hand, in the latter, the protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or a denaturing agent, and then simply diluted, thereby reducing the concentration of the surfactant or the denaturing agent to cause refolding. Although these are general, other methods include dissolving a glutathione S-transferase fusion protein in a sodium N-lauroyl sarcosinate solution of a surfactant, diluting it with 1-2% Triton X-100, and rewinding ( There is also a method of refolding using a diluent such as Non-Patent Document 1).
透析と希釈の両方に対し、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ等の、極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められているに過ぎず（非特許文献２参照）、この方法は、試行錯誤法の域にとどまっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、他のタンパク質に適用するとほとんどうまくいかないのが通例である。 Disposable kits are commercially available from Hampton Research for both dialysis and dilution. These procedures include Ligand binding domains glutamate and kainate receptors, Lysozyme, Carbon Anhydrase Limited at Carbonic Anhydrase Limited at It is not an exaggeration to say that this method is only in the area of trial and error, since it is only recognized that folding occurs (see Non-Patent Document 2). Thus, even if it happens to be successful, it usually does not work well when applied to other proteins.
リフォールディングに、吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは、必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では、満足できる結果が得られないのが通常である。 The use of an adsorption separation column for refolding has also been tried. When a protein denatured with urea / guanidine hydrochloride, thioredoxin is subjected to gel filtration, the protein is unwound during gel filtration (see Non-Patent Document 3). However, with this method, refolding is not always sufficient and other proteins usually do not give satisfactory results.
構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャペロンを用いる場合は、それが、ある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。 When a protein that has been solubilized with 8M urea is adsorbed to a column that is fixed with a molecular chaperone GroEL, which is a kind of protein that promotes unwinding of a protein with a broken structure, and eluted with a solution containing 2M each of potassium chloride and urea, Rewinding of the eluted protein occurs (see Non-Patent Document 4). However, these are only recognized with very limited proteins such as Cyclophilin A. In particular, when a molecular chaperone is used, since it is a certain type of template, it is not useful at all if it does not conform to the shape of the template.
また、リフォ−ルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、ＧｒｏＥＬ 、ＤｓｂＡ（大腸菌のｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰＰＩ （ｈｕｍａｎ ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こることも報告されている（非特許文献５参照）。しかしながら、これについては、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５等の特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑で、コスト高となるという問題もある。 In addition, a protein Scorpion toxin 5 modified with guanidine hydrochloride on a resin simultaneously fixed with three kinds of proteins considered to be involved in promoting refolding, GroEL, DsbA (disulphide oxididerductase of E. coli) and PPI (human proline cis-trans isomerase). It is also reported that when protein is mixed, this protein rewinding occurs on the resin (see Non-Patent Document 5). However, regarding this, in addition to the drawbacks that can be applied only to specific proteins such as Scorpion toxin Cn5, there is also a problem that the preparation of a resin in which three types of proteins are immobilized is complicated and costly.
カラム上の固定物質として、巻き戻しタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。該方法の適用が、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑で、コスト高となることは、前記方法と同じである。 In some cases, a metal chelate is used in place of the unwinding protein as an immobilizing substance on the column. When a His6-tag fusion protein dissolved and modified with an aqueous solution containing guanidine hydrochloride and urea is adsorbed on a resin to which nickel chelate is fixed and washed with a buffer solution containing no denaturant, the fusion protein is unwound (non-patented). Reference 6). The application of this method is limited to this protein, and the preparation of the resin is complicated and the cost is the same as in the above method.
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程で、タンパク質が巻き戻るとの報告もある（非特許文献７〜９参照）。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂなどで成功しているに過ぎない。しかも、この方法は、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。 When β-cyclodextrin or cycloamylose is used as an artificial chaperone, and the protein denatured with a surfactant is mixed into this chaperone solution, the surfactant takes up and is removed by the artificial chaperone. There is also a report (refer nonpatent literature 7-9). However, this method is only successful with carbonic anhydride B and the like. Moreover, this method is not a method that can be repeated, but is expensive.
一方、本発明者らは、これまで、ＺＳＭゼオライトやゼオライトベータ（例えば、非特許文献１０、１１、特許文献１、２参照）等のゼオライトへのバイオポリマーの吸着現象（非特許文献１２参照）について、研究を続けてきた過程で、ゼオライトベータを用いたタンパク質巻き戻し材料を開発することに成功した（特許文献３）。 On the other hand, the present inventors have so far taken the adsorption phenomenon of biopolymers to zeolites such as ZSM zeolite and zeolite beta (see, for example, Non-Patent Documents 10 and 11, and Patent Documents 1 and 2) (see Non-Patent Document 12). In the process of continuing research, we succeeded in developing a protein unwinding material using zeolite beta (Patent Document 3).
前述のように、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現系は、コスト、スケールアップの容易さ等から、医学的、産業的に有用なタンパク質を大量に生産する技術として最も注目される重要技術となっている。しかしながら、外来タンパク質を大量に発現させると、しばしば異常な立体構造を持ち、活性のないタンパク質が封入体として菌体内に蓄積する現象が観察される。そこで、該封入体から正しい立体構造及び活性を持ったタンパク質を得るためのリフォールディング技術の発展が望まれている。 As described above, the recombinant protein expression system using Escherichia coli is an important technology that attracts the most attention as a technology for mass production of medically and industrially useful proteins because of its cost and ease of scale-up. It has become. However, when a large amount of foreign protein is expressed, a phenomenon is often observed in which a protein having an abnormal three-dimensional structure and inactive protein accumulates as an inclusion body. Therefore, development of a refolding technique for obtaining a protein having a correct three-dimensional structure and activity from the inclusion body is desired.
リフォールディングを行う際には、バッファーｐＨ、温度、添加剤の種類等、タンパク質ごとに条件検討を行う必要がある。また、分泌タンパク質等には、立体構造の安定化にシステイン残基間のＳ−Ｓ結合を必要とするものがあり、その場合、リフォールディングによる正しい立体構造の形成に加え、適切なＳ−Ｓ結合の形成が必要となる。 When performing refolding, it is necessary to examine conditions for each protein, such as buffer pH, temperature, type of additive, and the like. Some secreted proteins and the like require an SS bond between cysteine residues to stabilize the three-dimensional structure. In this case, in addition to the formation of the correct three-dimensional structure by refolding, an appropriate SS Bond formation is required.
本発明者らは、これまで、ゼオライトベータを用いて、タンパク質のリフォールディングを効率よく行わせることに成功し、更に、ゼオライトを用いたタンパク質のリフォールディングにおける汎用性の検討の一環として、各種不活性タンパク質の機能賦活・回復化を種々試みてきた。しかし、リフォールディング技術は適用可能なタンパク質が特定のものに限られており、リフォールディング技術が有効か否かは適用対象のタンパク質との関係で好適な条件が設定し得るか否かにかかっている。ゼオライトベータによるリフォールディング技術を含めて、リゾチームについては、従来法では高効率のリフォールディング手法が確立されておらず、当技術分野では、分子内にＳ−Ｓ結合を４個持つ卵白リゾチームのリフォールディングを可能とする新しいリフォールディング手法の開発が強く要請されていた。 The present inventors have so far succeeded in efficiently performing protein refolding using zeolite beta, and, as part of the examination of versatility in protein refolding using zeolite, Various attempts have been made to activate and restore the function of active proteins. However, refolding technology is limited to specific proteins, and whether refolding technology is effective depends on whether suitable conditions can be set in relation to the target protein. Yes. With regard to lysozyme, including refolding technology using zeolite beta, a high-efficiency refolding method has not been established in the conventional method, and in this technical field, reconstitution of egg white lysozyme having 4 S—S bonds in the molecule has been established. There has been a strong demand for the development of a new refolding technique that enables folding.
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、不活性リゾチームの機能賦活・回復方法として有用な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を積み重ねた結果、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを用いた新しい不活性リゾチームの機能賦活・回復方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、不活性リゾチームの機能賦活・回復方法及び該方法を用いた活性リゾチームの製造方法を提供することを目的とするものである。 Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive research and development with the goal of developing a new refolding technique useful as a function activation / recovery method of inactive lysozyme in view of the above-described conventional technology. As a result, the inventors succeeded in establishing a new function activation / recovery method of inactive lysozyme using a refolding buffer containing β-type zeolite and a redox agent, and completed the present invention. An object of the present invention is to provide a method for activating and recovering the function of inactive lysozyme and a method for producing active lysozyme using the method.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）リゾチームの機能を賦活・回復する方法であって、
１）変性リゾチームに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させること、２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ ４ ＋ 若しくはＮａ ＋ フォームにしたゼオライトを使用し、上記酸化還元剤として、システイン及び／又はシスチンを含むバッファーを用いて、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いて少なくても１０時間を上回る時間インキュベーションすることによりリゾチームのリフォールディングを行い活性リゾチームを回収することでリゾチームの機能を賦活・回復させること、を特徴とするリゾチームの機能賦活・回復方法。
（２）０．５Ｍ以上で２Ｍ以下の濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）の入ったリフォールディングバッファーを用いる、前記（１）に記載のリゾチームの機能賦活・回復方法。
（３）リゾチームが、不活性乃至低活性のリゾチームである、前記（１）又は（２）に記載のリゾチームの機能賦活・回復方法。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載のリゾチームの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性リゾチームに適用して機能を賦活・回復させた活性リゾチームを回収することを特徴とする活性リゾチームの製造方法。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A method for activating / recovering the function of lysozyme,
1) denaturation of lysozyme, beta type zeolite, and added refolding buffer containing a redox agent, by incubating a certain time at a given temperature, thereby activating and recovering the function of lysozyme perform refolding of lysozyme, 2 In this case, NH 4 + or Na + form zeolite is used as the β-type zeolite , and Gdn-HCl and arginine are used as the redox agent using a buffer containing cysteine and / or cystine. be activated and recovering the function of lysozyme by recovering active lysozyme perform refolding of lysozyme by incubation period greater than 10 hours less with refolding buffer, functional vehicles lysozyme characterized by And recovery method.
( 2 ) The function activation / recovery method of lysozyme according to (1) above, wherein a refolding buffer containing Gdn-HCl (Guanidine-HCl) at a concentration of 0.5 M or more and 2 M or less is used.
( 3 ) The function activation / recovery method of lysozyme according to (1) or (2) above, wherein the lysozyme is inactive or low-activity lysozyme.
( 4 ) recovering active lysozyme whose function has been activated / recovered by applying the function activation / recovery method of lysozyme according to any one of (1) to ( 3 ) to inactive or low-activity lysozyme A method for producing active lysozyme.
本発明は、リゾチームの機能を賦活・回復する方法であって、リゾチームに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させることを特徴とするものである。本発明では、酸化還元剤として、システイン及び／又はシスチンを含むバッファーを用いること、β型ゼオライトが、Ｎａ＋フォームにしたゼオライトであること、を好ましい実施の態様としている。 The present invention is a method for activating / recovering the function of lysozyme, comprising adding a refolding buffer containing β-type zeolite and a redox agent to lysozyme and incubating the lysozyme at a predetermined temperature for a certain period of time. Folding is performed to activate / recover the function of lysozyme. In the present invention, it is a preferred embodiment that a buffer containing cysteine and / or cystine is used as the redox agent, and that the β-type zeolite is a zeolite in Na + form.
また、本発明では、所定濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）の入ったリフォールディングバッファーを用いること、アルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いること、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させること、を好ましい実施の態様としている。更に、本発明は、上記のリゾチームの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性リゾチームに適用して機能を賦活・回復させた活性リゾチームを回収することからなる活性リゾチームの製造方法の点に特徴を有するものである。 In the present invention, a refolding buffer containing a predetermined concentration of Gdn-HCl (Guanidine-HCl) is used, a refolding buffer containing arginine is used, and a refolding buffer containing Gdn-HCl and arginine is used. Thus, refolding to activate / recover the function of lysozyme is a preferred embodiment. Furthermore, the present invention is characterized by a method for producing active lysozyme, which comprises recovering active lysozyme whose function has been activated / recovered by applying the function activation / recovery method of lysozyme to inactive or low activity lysozyme It is what has.
本発明では、機能賦活の対象として、例えば、不活性乃至低活性のリゾチーム、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したリゾチームが用いられる。本発明では、これらのリゾチームをゼオライトベータ（β型ゼオライト）で処理して該リゾチームの立体構造をリフォールディングすることにより、該リゾチーム固有の本来機能の賦活・回復を行う。 In the present invention, for example, inactive to low activity lysozyme or lysozyme deactivated due to a certain cause such as heat history is used as the target of function activation. In the present invention, these lysozymes are treated with zeolite beta (β-type zeolite) to refold the three-dimensional structure of the lysozyme, thereby activating / recovering the original functions unique to the lysozyme.
賦活操作は、通常、該リゾチームを、変性剤や界面活性剤等を含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該リゾチームをゼオライトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で行われる。 In the activation operation, usually, the lysozyme is first dispersed and dissolved in a solution containing a modifier, a surfactant, etc., and then mixed with a solution containing zeolite beta, or injected into a zeolite beta packed column. The procedure is performed by adsorbing to zeolite beta and then desorbing the protein from zeolite beta.
本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオライトベータ、及び、例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等のものであれば同様に使用することができる。 Examples of the zeolite beta used as the functional activator in the present invention include unfired zeolite beta and, for example, calcined zeolite beta obtained by calcining synthetic zeolite beta at 300 to 500 ° C. for 3 to 10 hours. It is not a thing, but if it is equivalent to these, it can be used similarly.
ゼオライトベータに吸着前のリゾチームの分散溶媒としては、好適には、例えば、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該リゾチームと反応を起こさないもの、及び、該リゾチームの立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールを挙げることができる。 As a dispersion solvent of lysozyme before adsorption to zeolite beta, for example, water is preferably used. However, the present invention is not necessarily limited to this, and basically there is no problem as long as it does not cause a reaction with the lysozyme and does not change the three-dimensional structure of the lysozyme into an unintentional form. In such a case, these solvents can be used alone or mixed with water. Typical examples of this type of solvent include monohydric and polyhydric alcohols.
該リゾチームの吸脱着は、一般には、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、で行われる。 The adsorption / desorption of the lysozyme is generally performed in the presence of a denaturing agent, a surfactant, a pH adjusting agent, a refolding factor, etc. in order to easily unwind the entangled protein chain length and facilitate rewinding. Done.
この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００やＦｉｃｏｌ１４００等を挙げることができる。 Typical examples of this type of modifier, surfactant, pH adjuster, and refolding factor include, for example, guanidine hydrochloride, trisaminomethane hydrochloride, polyethylene glycol, cyclodextrin, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethersulfonic. acid (HEPES), polyphosphoric acid, sucrose, glucose, glycerol, inositol, Dextran T-500, Ficol 1400 and the like.
また、該リゾチームの脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には該リゾチームの脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。置換吸着で該リゾチームの脱着を促す物質には、一般的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤やハロゲン化アルカリ等の塩が用いられるが、これらに限定されるものではなく、カラムクロマトグラフィーでの溶離に用いられるもの等、種々のものが使用可能である。 In addition, substitution adsorption is generally used for desorption of the lysozyme, but basically any operation can be applied as long as it does not hinder the function activation after desorption of the lysozyme, and it is particularly limited. It is not something. Therefore, pH change, temperature change, etc. can be used, and these and substitution adsorption can be used together. As a substance that promotes desorption of the lysozyme by displacement adsorption, a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) or a salt such as an alkali halide is generally used, but is not limited thereto. Various things such as those used for elution in column chromatography can be used.
以上述べてきた、不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を発揮するリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータとしては、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ（例えば、商品名ＨＳＺ−９３０ＮＨＡ、東ソー社製）、文献等に従い自前で合成・調製したゼオライトベータ（Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）２０２．参照）、それらを、焼成して得られるゼオライトベータが挙げられる。 As a typical example of the zeolite having the BEA structure, so-called zeolite beta, which constitutes the refolding agent that exhibits the activity activating function of the inactive protein and the ability to unwind the denatured protein as described above, typical examples of the zeolite beta are: (For example, trade name HSZ-930NHA, manufactured by Tosoh Corporation), zeolite beta synthesized and prepared in accordance with literatures etc. (see Zeolites, Vol. 11 (1991) 202.), and zeolite beta obtained by calcining them. Can be mentioned.
該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム含有骨格置換ゼオライトベータ等が挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には、全て該機能・能力を有しており、該ゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。 Zeolite beta having ammonium and ammonium such as various aliphatic and / or aromatic ammonium in the space of the zeolite, and framework-substituted zeolite beta in which a part of the framework silicon forming the zeolite is changed to another metal The ammonium-containing skeleton-substituted zeolite beta and the like can be mentioned. Basically, any zeolite having a skeleton structure of zeolite beta has all the functions and abilities, and the zeolite beta is listed here. However, the present invention is not necessarily limited thereto.
該ゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般にはケイ素と酸素、あるいはケイ素とアルミニウムと酸素であるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ、及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性リゾチームの活性賦活機能を行うリフォ−ルディング剤となり得る。 The elements that form the framework of the zeolite beta are generally silicon and oxygen, or silicon, aluminum, and oxygen, but the zeolite beta in which a part of silicon or aluminum is substituted with other elements, and the pores in the pores Substituted zeolite beta containing ammoniums can also be a refolding agent that performs the activity-activating function of inactive lysozyme.
該ゼオライトベータの骨格ケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的にゼオライトベータの構造を破壊しないものであればいずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性並びに変性リゾチームのリフォールディング剤となり得ることは同様である。 Typical examples of the zeolite beta that can be replaced with the framework silicon include aluminum, boron, phosphorus, gallium, tin, titanium, iron, cobalt, copper, nickel, zinc, chromium, vanadium, and the like. It is not limited to these, and any one that basically does not destroy the structure of zeolite beta may be used. Further, regarding the substitution amount, any substitution amount may be used as long as it does not destroy the structure of zeolite beta, and the substitution zeolite beta can be a refolding agent for inert and modified lysozyme. is there.
本発明では、リフォールディング剤は、ＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータ単味、又はゼオライトベータとそれを支持する基材（支持体）とから構成することができる。前者は、支持体無しで、後者は、支持体付きである。一般的に言って、ゼオライトという物質は、自己焼結性が乏しいため、単味単独では成形しにくいことが多いので、リフォールディング剤の作製、すなわち形態・形状の設計・制御に関しては、前者に比べ後者が、予め形が整えられた支持体上にゼオライトベータを固定・被覆すること等が可能なため、自由度が高く、有利である。 In this invention, a refolding agent can be comprised from the zeolite of BEA structure, what is called a zeolite beta simple substance, or a zeolite beta and the base material (support body) which supports it. The former is without a support and the latter is with a support. Generally speaking, the substance called zeolite is poorly self-sintering, so it is often difficult to form by itself, so the production of the refolding agent, that is, the design and control of the shape and shape, In comparison, the latter is advantageous in that it has a high degree of freedom because it is possible to fix and coat zeolite beta on a pre-shaped support.
該ゼオライトベータの形態・形状につては、例えば、チップ状、膜状、ペレット状、ビーズ状等、該ゼオライトベータの利用方法・使用形態に応じて、適宜選定される。特に、支持体付き該ゼオライトベータでは、ゼオライトベータの固定・被覆を種々の形状、例えば、板、球、円筒、チューブ、カラム、溝、Ｕ字路等の支持体上に、前記方法等で行うことができるので、該ゼオライトベータの形状を如何様にも所望の形にすることができるという利点がある。この場合の支持体については、ガラス、石英、アルミナ、シリカ、コージェライトやムライト等の種々のセラミックス、濾紙等のセルロース、テフロン（登録商標）、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ペット）等、種々の有機ポリマーを挙げることができる。 The form and shape of the zeolite beta are appropriately selected according to the utilization method and use form of the zeolite beta, such as a chip shape, a membrane shape, a pellet shape, and a bead shape. In particular, in the zeolite beta with a support, the zeolite beta is fixed and coated on the support in various shapes, for example, a plate, a sphere, a cylinder, a tube, a column, a groove, a U-shaped path, or the like by the above method. Therefore, there is an advantage that the shape of the zeolite beta can be changed to any desired shape. For the support in this case, glass, quartz, alumina, silica, various ceramics such as cordierite and mullite, cellulose such as filter paper, Teflon (registered trademark), nylon, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate (pet), etc. Various organic polymers can be mentioned.
本発明において、変性還元リゾチームは、ゼオライトと混ぜると、急速に吸着される。また、６Ｍの高濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）存在下においても変性還元リゾチームは強く吸着される。また、リゾチームの活性回復に酸化還元剤の存在は必須である。酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にリゾチームが回収されるが、このことは、まず、リゾチームが凝集しない正しい立体構造を持った状態で溶出され、次に、酸化還元剤によってＳ−Ｓ結合が形成されることを示唆している。 In the present invention, the modified reduced lysozyme is rapidly adsorbed when mixed with zeolite. In addition, the modified reduced lysozyme is strongly adsorbed even in the presence of 6M high-concentration Gdn-HCl (Guanidine-HCl). In addition, the presence of a redox agent is essential for the recovery of lysozyme activity. Lysozyme is recovered in the refolding buffer regardless of the presence or absence of the redox agent, but this is first eluted in the correct three-dimensional structure in which the lysozyme does not aggregate, and then S This suggests that a -S bond is formed.
また、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度の上昇とともにリゾチームの回収率が増加することから、リゾチームのリフォールディングは、ゼオライトから脱着後に起きるものと考えられる。Ｇｄｎ−ＨＣｌが２Ｍを超えると、活性回収率が急速に低下していることから、回収率と回復率のバランスを考えると、２Ｍ前後のＧｄｎ−ＨＣｌの入ったリフォールディングバッファーが好適である。 Moreover, since the recovery rate of lysozyme increases with an increase in the concentration of Gdn-HCl, it is considered that refolding of lysozyme occurs after desorption from zeolite. When Gdn-HCl exceeds 2M, the activity recovery rate decreases rapidly. Therefore, considering the balance between recovery rate and recovery rate, a refolding buffer containing about 2M Gdn-HCl is preferable.
リゾチームの吸着量について調べたところ、リゾチームの回収率は、ゼオライトとリフォールディングバッファーの比率に比例していることが示唆された。活性回復は、低回収率のサンプルでは高く、その後、下がって一定になることから、活性回復については、溶出されたタンパク質においては一定であるものと考えられる。リフォールディング時間については、タンパク質の溶出と活性回復がパラレルでないこと、ゼオライトを除いた後にインキュベーションしても徐々に活性回復が増加することから、正しいＳ−Ｓ結合が形成されるのに時間が掛かる可能性があることが示唆される。 When the amount of lysozyme adsorbed was examined, it was suggested that the recovery rate of lysozyme was proportional to the ratio of zeolite to refolding buffer. Activity recovery is high for low recovery samples and then decreases and becomes constant, so activity recovery is considered constant for the eluted protein. As for the refolding time, it takes time for the correct SS bond to be formed because the protein elution and the activity recovery are not parallel, and the activity recovery gradually increases even after incubation after removing the zeolite. It is suggested that there is a possibility.
アルギニン添加により、リゾチームの回収率が増加し、また、Ｇｄｎ−ＨＣｌと相乗効果を示す。このことから、アルギニンは、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、リゾチームの凝集防止に有効であり、Ｇｄｎ−ＨＣｌと組み合わせることにより、更に、多くのリゾチームを回収することができる。ゼオライトに飽和吸着量に近い量の変性還元リゾチームを吸着させ、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーでリフォールディングを行って、活性リゾチームの最大回収濃度について調べたところ、リフォールディングバッファー量が０．７５ｍｌの時、約０．９ｍｇ／ｍｌの活性リゾチームが回収され、希釈法では０．１ｍｇ／ｍｌ程度が限界であることを考えると、本発明のリフォールディング法は、希釈法と比べて優れた方法であることが分かる。 Addition of arginine increases the recovery rate of lysozyme and shows a synergistic effect with Gdn-HCl. Thus, arginine is effective in preventing lysozyme aggregation even in refolding with zeolite, and by combining with Gdn-HCl, more lysozyme can be recovered. The amount of modified reduced lysozyme close to the saturated adsorption amount was adsorbed on the zeolite, refolded with a refolding buffer containing Gdn-HCl and arginine, and the maximum recovery concentration of active lysozyme was examined. In the case of .75 ml, about 0.9 mg / ml of active lysozyme is recovered, and considering that the limit is about 0.1 mg / ml in the dilution method, the refolding method of the present invention is superior to the dilution method. It can be seen that
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）β型ゼオライトを用いた変性リゾチームの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
（２）変性リゾチームの活性を高活性で回復させることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
（３）活性リゾチームの回収率と活性回復率のバランスを高めたリフォールディング技術を提供することができる。
（４）アルギニン及びＧｄｎ−ＨＣｌとを組み合わせて、活性リゾチームの回収率を向上させたリゾチームのリフォールディング方法を提供することができる。
（５）封入体としての活性のないリゾチームから正しい立体構造及び活性を持った活性リゾチームを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。
（６）他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性リゾチームのリフォールディング技術を提供することができる。
（７）希釈法、透析法の欠点である、大量のバッファーを必要とし、リフォールディングしたタンパク質の濃度が低いといった欠点を改善できる、シンプルに高効率でリフォールディングを行わせることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
The present invention has the following effects.
(1) A new function activation / recovery method for modified lysozyme using β-type zeolite can be established and provided.
(2) A refolding technique capable of recovering the activity of denatured lysozyme with high activity can be provided.
(3) It is possible to provide a refolding technique that improves the balance between the recovery rate of active lysozyme and the activity recovery rate.
(4) By combining arginine and Gdn-HCl, a method for refolding lysozyme with improved recovery of active lysozyme can be provided.
(5) A refolding technique for obtaining active lysozyme having a correct steric structure and activity from inactive lysozyme as an inclusion body can be provided.
(6) An inactive lysozyme refolding technique capable of performing refolding with higher efficiency than other methods can be provided.
(7) Refolding that can improve the simple and highly efficient refolding, which can solve the disadvantages of dilution method and dialysis method that require a large amount of buffer and the concentration of refolded protein is low. Technology can be provided.
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。 Next, the present invention will be specifically described based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
本実施例では、卵白リゾチーム（ＭＷ １４０００）を５０ｍＭ ＤＴＴを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌで変性還元させた後に、β型ゼオライトに吸着させた。５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５で洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＰＥＧ２００００、酸化還元剤としてシステイン及びシスチンを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行わせた。遠心によりゼオライトを分離した後、上清中のリゾチーム活性及びタンパク質濃度を測定した。 In this example, egg white lysozyme (MW 14000) was denatured and reduced with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 50 mM DTT, 0.5 M NaCl, and 6 M guanidine-HCl, and then adsorbed onto β-type zeolite. Wash with 5 mM Tris-HCl pH 7.5, add 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 0.5 M NaCl, 0.5 M PEG 20000, and refolding buffer containing cysteine and cystine as redox agents for a certain time at 4 ° C. Incubation allowed lysozyme refolding. After separating the zeolite by centrifugation, the lysozyme activity and protein concentration in the supernatant were measured.
酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にリゾチームが回収された。しかしながら、酸化還元剤を含むバッファーを添加した時のみ、リゾチーム活性の回復がみられた。このことから、酸化還元剤は、リゾチームの活性回復に必須であることが分かった。次に、リフォールディングのタイムコースを調べたところ、反応開始後２時間で吸着させたリゾチームの７０％が溶出された。更に、活性回復を調べたところ、反応開始から徐々に活性回復率が増加していき、１６時間でプラトーに達した。一般的に、タンパク質のフォールディングは、非常に早い反応であるので、ゼオライトによるリゾチームのリフォールディング反応は、早い反応であるゼオライトからのリゾチームの脱離とそれに続く立体構造の回復、及び遅い反応である分子内Ｓ−Ｓ結合の構築の２つの段階からなることが示唆された。以下に、実験法方法とその結果を具体的に説明する。 Lysozyme was recovered in the refolding buffer with or without redox agent. However, recovery of lysozyme activity was observed only when a buffer containing a redox agent was added. From this, it was found that the redox agent is essential for recovering the activity of lysozyme. Next, when the time course of refolding was examined, 70% of the lysozyme adsorbed 2 hours after the start of the reaction was eluted. Furthermore, when activity recovery was examined, the activity recovery rate gradually increased from the start of the reaction and reached a plateau in 16 hours. In general, protein folding is a very fast reaction, so the lysozyme refolding reaction by zeolite is a fast reaction, lysozyme removal from zeolite, followed by steric structure recovery, and slow reaction. It was suggested that it consists of two stages of intramolecular S—S bond construction. Hereinafter, the experimental method and the results will be described in detail.
１．実験
（１）実験材料と方法
β型ゼオライト（ＣＰ８１１Ｅ−１５０）は、Ｚｅｏｌｙｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＵＳＡ）より購入した。卵白リゾチーム、グアニジン塩酸塩（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、アルギニン、システイン塩酸塩一水和物、シスチンは、和光純薬工業株式会社より購入した。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ乾燥菌体は、シグマアルドリッチ株式会社より購入した。その他の薬品は、特級グレードを使用した。
1. Experiment (1) Experimental Material and Method β-type zeolite (CP811E-150) was purchased from Zeolist International (USA). Egg white lysozyme, guanidine hydrochloride (Gdn-HCl), Dithiothreitol (DTT), arginine, cysteine hydrochloride monohydrate, and cystine were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Micrococcus lysodeikticus dry cells were purchased from Sigma-Aldrich Corporation. Other chemicals used special grades.
（２）ゼオライトのＮａ＋フォームへのイオン交換
β型ゼオライト（ＣＰ８１１Ｅ−１５０）を５５０℃で１２時間焼成後、５０ｇを８００ｍｌの１Ｍ ＮａＮＯ３溶液に懸濁し、約１６時間スターラーで撹拌した。吸引ロート（桐山）でろ過後、新しい１Ｍ ＮａＮＯ３溶液に再懸濁し、約１６時間スターラーで撹拌した。この操作を３回繰り返した。吸引ろ過したゼオライトを１Ｌの超純水で１時間撹拌後、ろ過することを４回繰り返して洗浄した後に、６０℃で一晩乾燥させた。本実施例においては、すべて、Ｎａ＋フォームにしたゼオライトを使用した。
(2) Ion Exchange of Zeolite to Na + Foam β-type zeolite (CP811E-150) was calcined at 550 ° C. for 12 hours, and 50 g was suspended in 800 ml of 1M NaNO 3 solution and stirred with a stirrer for about 16 hours. After filtration with a suction funnel (Kiriyama), it was resuspended in a fresh 1M NaNO 3 solution and stirred with a stirrer for about 16 hours. This operation was repeated three times. The suction-filtered zeolite was washed with 1 L of ultrapure water for 1 hour and then repeatedly filtered four times, and then dried at 60 ° C. overnight. In this example, all zeolites in Na + foam were used.
（３）リゾチームの変性還元
卵白リゾチームを、５０ｍＭ ＤＴＴを含む変性バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ）約２０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、室温で１６時間インキュベーションした。０．４５μｍフィルター（ミリポア）でろ過し、タンパク質濃度を測定した後に、１ｍｌずつ１．５ｍｌチューブに分注した。液体窒素で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
(3) Denaturation and reduction of lysozyme Egg white lysozyme was dissolved to a concentration of about 20 mg / ml in a denaturation buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 6 M Gdn-HCl) containing 50 mM DTT. Incubated for 16 hours. After filtration through a 0.45 μm filter (Millipore) and measuring the protein concentration, 1 ml was dispensed into a 1.5 ml tube. Quick frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
（４）リゾチームの活性測定
２０μｌのリゾーチームサンプルを９６穴プレートに加え、２００μｌの基質溶液（１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．６ｍｇ／ｍｌ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ乾燥菌体）を分注した。直ちに、モデル６８０マイクロプレートリーダー（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）でＯＤ４５０の減少を３０秒ごとに２０回測定した。なお、各測定の前に５秒間撹拌を行った。活性は、測定開始から３０秒後から２５０秒後までの傾きで表し、活性回復率は、同じ濃度のネイティブなリゾチームの活性を１００％とて算出した。
(4) Activity measurement of lysozyme 20 μl of lysozyme sample was added to a 96-well plate, and 200 μl of substrate solution (100 mM phosphate buffer, pH 7.0, 0.1 mg / ml BSA, 0.6 mg / ml Micrococcus lysodeikticus dry cell) ) Was dispensed. Immediately, the decrease in OD450 was measured 20 times every 30 seconds with a model 680 microplate reader (BioRad Laboratories, Inc.). In addition, it stirred for 5 second before each measurement. The activity was expressed as a slope from 30 seconds to 250 seconds after the start of measurement, and the activity recovery rate was calculated with the activity of native lysozyme at the same concentration as 100%.
（５）タンパク質定量
サンプルをトリクロロ酢酸で沈殿させた後に、ＳＤＳ−Ｒｅａｇｅｎｔ（０．１Ｍ ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）に溶解した。このサンプル溶液をＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてマニュアルに従って測定した。なお、スタンダードとして、リゾチームを使用した。
(5) Protein quantification Samples were precipitated with trichloroacetic acid and then dissolved in SDS-Reagent (0.1 M NaOH, 5% SDS). This sample solution was measured according to the manual using BCATM Protein Assay Kit (Pierce). In addition, lysozyme was used as a standard.
（６）変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着
ゼオライト２０ｍｇを２ｍｌチューブに分注した。５００μｌの変性バッファーを加え、室温、１０分間ローテーターＲＴ−５０（タイテック）でインキュベートした。次に、５００μｌの４ｍｇ／ｍｌ変性還元リゾチームを加え、更に、室温で一定時間インキュベートした。マイクロ遠心機（ベックマン）で１４０００ｒｐｍ、室温、５分間遠心してゼオライトを沈殿させ、上清に残ったタンパク質濃度を測定した。吸着したたんぱく質量は、最初に加えた量から上清に残った量を引くことによって算出した。
(6) Adsorption of modified reduced lysozyme on zeolite 20 mg of zeolite was dispensed into a 2 ml tube. 500 μl of denaturing buffer was added and incubated at room temperature for 10 minutes with a rotator RT-50 (Tytec). Next, 500 μl of 4 mg / ml denatured reduced lysozyme was added and further incubated at room temperature for a fixed time. The zeolite was precipitated by centrifugation at 14,000 rpm and room temperature for 5 minutes in a microcentrifuge (Beckman), and the protein concentration remaining in the supernatant was measured. The amount of protein adsorbed was calculated by subtracting the amount remaining in the supernatant from the amount initially added.
（７）リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果
ゼオライト５０ｍｇを１０ｍｌチューブに分注した。５００μｌの変性バッファーを加え、室温、１０分間ローテーターＲＴ−５０（タイテック）でインキュベートした。次に、５００μｌの２ｍｇ／ｍｌ変性還元リゾチームを加え、更に、室温で１時間インキュベートした。ＣＦ１２ＲＸ遠心機（日立）で３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心して上清を除いた後、５．５ｍｌの洗浄バッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、懸濁した。
(7) Effect of redox agent on lysozyme refolding 50 mg of zeolite was dispensed into a 10 ml tube. 500 μl of denaturing buffer was added and incubated at room temperature for 10 minutes with a rotator RT-50 (Tytec). Next, 500 μl of 2 mg / ml modified reduced lysozyme was added and further incubated at room temperature for 1 hour. After removing the supernatant by centrifugation at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes in a CF12RX centrifuge (Hitachi), 5.5 ml of washing buffer (5 mM Tris-HCl, pH 7.5) was added and suspended.
更に、３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心して上清を除くという作業を計４回行い、ゼオライトを洗浄した。２ｍｌのリフォールディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％（ｗ／ｖ）ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）２００００，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ システイン，１ｍＭ シスチン）又はシステイン及びシスチンを含まないリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を２ｍｌチューブに移した。更に、１４０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心してサンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。 Further, the operation of removing the supernatant by centrifuging at 3000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes was performed 4 times in total to wash the zeolite. 2 ml of refolding buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 0.5 M NaCl, 0.5% (w / v) polyethylene glycol (PEG) 20000, 1 mM EDTA, 10 mM cysteine, 1 mM cystine) or cysteine and cystine The refolding buffer which did not contain was added and it incubated at 4 degreeC for 16 hours, and refolding was performed. Centrifugation was performed at 3000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a 2 ml tube. Further, the sample was collected by centrifugation at 14,000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes, and the activity and protein concentration of the supernatant were measured.
（８）リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果
ゼオライト５０ｍｇに１ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、２ｍｌのそれぞれの濃度のＧｄｎ−ＨＣｌを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
(8) Effect of Gdn-HCl concentration on lysozyme refolding After 1 mg of modified reduced lysozyme was adsorbed and washed on 50 mg of zeolite, 2 ml of refolding buffer containing Gdn-HCl at each concentration was added, and the effect was increased at 4 ° C. for 16 Refolding was performed by incubation for a period of time. Samples were collected and the supernatant activity and protein concentration were measured.
（９）リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果
ゼオライト５０ｍｇに、０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇの変性還元リゾチームを吸着させ、洗浄後に、それぞれの量の２Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
(9) Effect of the amount of refolding buffer on lysozyme refolding 0.5 mg, 1 mg, and 1.5 mg of denatured reduced lysozyme was adsorbed on 50 mg of zeolite, and after washing, refolding containing each amount of 2M Gdn-HCl. Buffer was added and incubated at 4 ° C. for 16 hours for refolding. Samples were collected and the supernatant activity and protein concentration were measured.
（１０）リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果
ゼオライト５０ｍｇに、１ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、２ｍｌの２Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃でそれぞれの時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
(10) Effect of refolding time of lysozyme refolding After 50 mg of zeolite was adsorbed and washed with 1 mg of modified reduced lysozyme, a refolding buffer containing 2 ml of 2M Gdn-HCl was added and incubated at 4 ° C. for each time. And let me refold. Samples were collected and the supernatant activity and protein concentration were measured.
（１１）リゾチームのリフォールディングのアルギニンの効果
ゼオライト５０ｍｇに、１ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、１ｍｌの０Ｍ、１Ｍ、２Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ及びそれぞれの量のアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。
(11) Effect of arginine on refolding of lysozyme After adsorbing and washing 1 mg of modified reduced lysozyme to 50 mg of zeolite, 1 ml of 0M, 1M, 2M Gdn-HCl and a refolding buffer containing each amount of arginine were added. Refolding was performed by incubation at 4 ° C. for 16 hours. Samples were collected and the supernatant activity and protein concentration were measured.
（１２）最適条件における活性リゾチームの最大回収濃度
ゼオライト５０ｍｇに１．６ｍｇの変性還元リゾチームを吸着、洗浄した後に、それぞれの量の２Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ及び０．５Ｍアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、４℃で１６時間インキュベーションしてリフォールディングを行わせた。サンプルを回収し、上清の活性及びタンパク質濃度を測定した。活性リゾチームの濃度は、回収濃度に活性回復率掛けることにより算出した。
(12) Maximum recovery concentration of active lysozyme under optimum conditions After adsorption of 1.6 mg of modified reduced lysozyme to 50 mg of zeolite and washing, refolding buffer containing each amount of 2M Gdn-HCl and 0.5M arginine was added, Refolding was performed by incubation at 4 ° C. for 16 hours. Samples were collected and the supernatant activity and protein concentration were measured. The concentration of active lysozyme was calculated by multiplying the recovered concentration by the activity recovery rate.
２．結果
（１）変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着
変性還元リゾチームのゼオライトへの吸着を図１（Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）に示す。図１に示すように、変性還元リゾチームは、ゼオライトと混ぜた後、急速に吸着し、２０分でグラフの傾きは緩やかになった。反応開始後１時間で３５ｍｇ／ｇゼオライトのリゾチームが吸着した。このことより、ゼオライトは、６Ｍという高濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ存在下においても、変性タンパク質を強く吸着することが示唆された。
2. Results (1) Adsorption of Modified Reduced Lysozyme on Zeolite Adsorption of modified reduced lysozyme on zeolite is shown in FIG. 1 (Time course of adsorption of lysozyme on zeolite). As shown in FIG. 1, the modified reduced lysozyme adsorbed rapidly after mixing with zeolite, and the slope of the graph became gentle in 20 minutes. One hour after the start of the reaction, 35 mg / g zeolite lysozyme was adsorbed. This suggests that zeolite strongly adsorbs the denatured protein even in the presence of 6 M concentration of Gdn-HCl.
（２）リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果
リゾチームのリフォールディングの酸化還元剤の効果を図２（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄｏｘ ｒｅａｇｅｎｔ ｏｎ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に示す。リゾチームは、分子内にＳ−Ｓ結合を４個持つため、変性剤を抜いただけでは活性が回復せず、活性を回復するためには、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、酸化還元剤が必要であるか調べた。
(2) Effect of Redox Agent for Refolding Lysozyme The effect of the redox agent for refolding lysozyme is shown in FIG. 2 (Effect of the redox reagent on refolding of lysozyme). Since lysozyme has four S—S bonds in the molecule, the activity cannot be recovered by simply removing the denaturing agent, and in order to recover the activity, a redox agent is also required for refolding with zeolite. I investigated.
その結果、図２に示すように、酸化還元剤を含むバッファーを添加した時のみ、リゾチーム活性の回復がみられた。このことから、酸化還元剤は、リゾチームの活性回復に必須であることが分かった。また、酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にリゾチームが回収されたが、これは、まずリゾチームが凝集しない状態、おそらく正しい立体構造を持った状態で溶出され、次に、酸化還元剤によってＳ−Ｓ結合が形成されることが示唆された。 As a result, as shown in FIG. 2, recovery of lysozyme activity was observed only when a buffer containing a redox agent was added. From this, it was found that the redox agent is essential for recovering the activity of lysozyme. In addition, lysozyme was recovered in the refolding buffer regardless of the presence or absence of the redox agent, but this was first eluted in a state in which the lysozyme did not aggregate, possibly in the correct three-dimensional structure, and then redox. It was suggested that an SS bond was formed by the agent.
（３）リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果
リゾチームのリフォールディングのＧｄｎ−ＨＣｌ濃度の効果を図３（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｄｎ−ＨＣｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ， ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ（■）， ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄ（●））に示す。図３に示すように、Ｇｄｎ−ＨＣｌの入っていないリフォールディングバッファーでは、タンパク質の回収率が５％以下であった。ある種のタンパク質では、少量のＧｄｎ−ＨＣｌなどの変性剤が、ミスフォールドを抑制してリフォールディング効率を上昇させるので、ゼオライトによるリフォールディングにおいてもＧｄｎ−ＨＣｌの添加が有効であるか調べた。
(3) Effect of Gdn-HCl concentration on lysozyme refolding FIG. 3 shows the effect of Gdn-HCl concentration on lysozyme refolding (■) and effect recovered (ly) in and ●)). As shown in FIG. 3, in the refolding buffer not containing Gdn-HCl, the protein recovery was 5% or less. For certain proteins, a small amount of denaturing agent such as Gdn-HCl suppresses misfolding and increases the refolding efficiency, so it was examined whether the addition of Gdn-HCl is effective in refolding with zeolite.
その結果、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度の上昇と共に回収率が増加した。このことは、Ｇｄｎ−ＨＣｌ濃度が低い条件では、ゼオライトから脱着したリゾチームは、ミスフォールドして凝集していることを示している。つまり、リゾチームのリフォールディングは、ゼオライトから脱着後に起きると考えられた。また、Ｇｄｎ−ＨＣｌが２Ｍを超えると、活性回復率が急速に低下していった。これらのことから、回収率と活性回復率のバランスを考えると、約２ＭのＧｄｎ−ＨＣｌの入ったリフォールディングバッファーが好適であると判断される。 As a result, the recovery rate increased with increasing Gdn-HCl concentration. This indicates that lysozyme desorbed from the zeolite is misfolded and aggregated under the condition where the Gdn-HCl concentration is low. That is, it was considered that refolding of lysozyme occurred after desorption from zeolite. Moreover, when Gdn-HCl exceeded 2M, the activity recovery rate decreased rapidly. From these, considering the balance between the recovery rate and the activity recovery rate, it is judged that a refolding buffer containing about 2 M Gdn-HCl is suitable.
（４）リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果
リゾチームのリフォールディングのリフォールディングバッファー量の効果を図４（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄ（Ａ） ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｂ） ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に示す。図４Ａに示すように、すべてのタンパク質吸着量について、リフォールディングバッファー量が２ｍｌで回収率がプラトーに達した。また、吸着量が１ｍｇ及び２ｍｇで、は回収率が同じであった。この結果より、タンパク質の回収率は、ゼオライトとリフォールディングバッファーの比率に比例していることが示唆された。
(4) Effect of refolding buffer amount of lysozyme refolding FIG. 4 shows the effect of refolding buffer amount of lysozyme refolding (A) and recovery of activity (B) of the lysozyme refolding. Shown in As shown in FIG. 4A, for all protein adsorption amounts, the refolding buffer amount reached 2 ml and the recovery reached a plateau. Moreover, the adsorption rate was 1 mg and 2 mg, and the recovery rate was the same. From these results, it was suggested that the protein recovery rate was proportional to the ratio of zeolite to refolding buffer.
リフォールディングバッファー中の成分のうち、ポリエチレングリコールは、ゼオライトに吸着するので（図示せず）、おそらくポリエチレングリコール量とゼオライトの表面積の比が、回収率を決定するものと考えられる。活性回復は、図４Ｂに示すように、低回収率のサンプルでは高く、その後、下がって一定になった。ただし、タンパク質濃度が低い時は、見かけ上活性が高く出る傾向があることを考慮すると、活性回復については、溶出されたタンパク質においては、一定であると考えられた。 Of the components in the refolding buffer, polyethylene glycol is adsorbed to the zeolite (not shown), and the ratio of the amount of polyethylene glycol to the surface area of the zeolite is considered to determine the recovery rate. Activity recovery was high in the low recovery sample and then decreased and became constant as shown in FIG. 4B. However, considering that the activity tends to be high when the protein concentration is low, the activity recovery was considered to be constant in the eluted protein.
（５）リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果
リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果を図５（Ｔｉｍｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ（■），ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄ（●））に示す。リゾチームのリフォールディングのリフォールディング時間の効果を調べたところ、図５に示したように、リゾチームは、リフォールディングバッファー添加後、直ちにゼオライトから脱着され、反応開始後２時間で吸着させたリゾチームの７０％が溶出された。しかしながら、活性回復は、反応開始から徐々に増加していき、１６時間でプラトーに達した。このことから、リゾチームでは、リフォールディングが完了し、活性のあるタンパク質が形成されるのに１６時間必要であることが分かった。
(5) Effect of refolding time of lysozyme refolding The effect of refolding time of lysozyme refolding is shown in FIG. 5 (Time dependency of resolving of lysozyme, activity recovered (■), and protein yield (●)). When the effect of the refolding time of lysozyme refolding was examined, as shown in FIG. 5, the lysozyme was immediately desorbed from the zeolite after the addition of the refolding buffer and adsorbed 2 hours after the start of the reaction. % Eluted. However, the activity recovery gradually increased from the start of the reaction and reached a plateau in 16 hours. This indicates that lysozyme requires 16 hours for refolding to complete and to form an active protein.
タンパク質の溶出と活性回復がパラレルでない理由としては、ゼオライを除いた後にインキュベーションしても、徐々に活性回復が増加することから（図示せず）、正しいＳ−Ｓ結合が形成されるのに時間が掛かる可能性が示唆された。また、４時間後から１０時間後の間に、一旦、活性回復率が緩やかになり、その後上昇したが、この現象は、リゾチームに特有であるのか、又はゼオライトによるリフォールディングでは共通の現象であるかは定かでない。 The reason why protein elution and activity recovery are not parallel is that the recovery of activity gradually increases even after incubation after removal of zeolii (not shown). It was suggested that there was a possibility of taking. Also, the activity recovery rate once moderated and then increased between 4 hours and 10 hours later, but this phenomenon is peculiar to lysozyme or a common phenomenon in refolding with zeolite. I'm not sure.
（６）リゾチームのリフォールディングにおけるアルギニンの効果
リゾチームのリフォールディングにおけるアルギニンの効果を図６（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄ（Ａ） ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｂ） ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に示す。アルギニンは、タンパク質の凝集を抑制させる作用を持ち、また、側鎖にグアニジル基を持つので、Ｇｄｎ−ＨＣｌと相乗効果を持つことが予測される。そこで、ゼオライトによるリフォールディングにおけるアルギニンの効果及びＧｄｎ−ＨＣｌの影響について調べた。なお、図４の結果より、回収率が低かったリフォールディングバッファー量が１ｍｌの条件で実験を行った。
(6) Effect of arginine in lysozyme refolding The effect of arginine in lysozyme refolding is shown in FIG. 6 (Effect of argon on protein (A) and recovery of activity (B) of lysozyme). Arginine has an action of suppressing protein aggregation and has a guanidyl group in the side chain, and thus is expected to have a synergistic effect with Gdn-HCl. Therefore, the effects of arginine and Gdn-HCl on refolding with zeolite were investigated. From the results shown in FIG. 4, the experiment was performed under the condition that the amount of refolding buffer with a low recovery rate was 1 ml.
図６Ａに示すように、アルギニン添加により、リゾチームの回収率が増加した。また、Ｇｄｎ−ＨＣｌと相乗効果を示した。活性回復については、図６Ｂに示すように、タンパク質が回収される限りは、アルギニン濃度によらず、ほぼ一定であり、Ｇｄｎ−ＨＣｌと違い、リゾチームの活性を阻害しなかった。これらのことより、アルギニンは、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、タンパク質の凝集防止に有効であり、また、Ｇｄｎ−ＨＣｌと組み合わせることにより、更に、多くのタンパク質が回収できることが示された。 As shown in FIG. 6A, the recovery rate of lysozyme increased with the addition of arginine. Moreover, it showed a synergistic effect with Gdn-HCl. As shown in FIG. 6B, the activity recovery was almost constant regardless of the arginine concentration as long as the protein was recovered, and unlike Gdn-HCl, the activity of lysozyme was not inhibited. From these results, it was shown that arginine is effective in preventing protein aggregation during refolding with zeolite, and that more proteins can be recovered by combining with Gdn-HCl.
（７）最適条件における活性リゾチームの最大回収濃度
最適条件における活性リゾチームの最大回収濃度を図７（Ａｃｔｉｖｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｙｉｅｌｄ ｂｙ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に示す。産業スケールでは、コストや設備の問題から、どれだけタンパク質濃度を濃くできるかが重要になってくる。そこで、ゼオライトに飽和吸着量に近い量の変性還元リゾチームを吸着させ、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーでリフォールディングを行わせた時の、活性リゾチームの最大回収濃度について調べた。
(7) Maximum Recovery Concentration of Active Lysozyme under Optimal Conditions The maximum recovery concentration of active lysozyme under optimal conditions is shown in FIG. 7 (Active lysozyme yield by optimal refining condition). On an industrial scale, how much protein concentration can be increased is important due to cost and equipment problems. Therefore, the maximum recovered concentration of active lysozyme was investigated when zeolite was adsorbed with an amount of modified reduced lysozyme close to the saturated adsorption amount and refolded with a refolding buffer containing Gdn-HCl and arginine.
その結果、図７に示したように、リフォールディングバッファー量が０．７５ｍｌの時、約０．９ｍｇ／ｍｌの活性リゾチームが回収された。一般的に、希釈法では０．１ｍｇ／ｍｌ程度が限界であるので、ゼオライトによるリフォールディング法は、希釈法と比べて、優れた方法であると考えられる。 As a result, as shown in FIG. 7, when the amount of refolding buffer was 0.75 ml, about 0.9 mg / ml of active lysozyme was recovered. In general, the dilution method has a limit of about 0.1 mg / ml, so the refolding method using zeolite is considered to be an excellent method compared to the dilution method.
以上の結果より、リゾチームにおいては、Ｎａ＋フォームのβ−型ゼオライト（ＣＰ８１１Ｅ−１５０）１ｇあたり最大約３５ｍｇ吸着し、５０ｍｇのゼオライトに１．６ｍｇの変性還元リゾチームを吸着させた場合、２Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ及び０．５Ｍアルギニンを含むリフォールディングバッファー０．７５ｍｌで、４℃、１６時間リフォールディングを行わせることによって、約０．９ｍｇ／ｍｌの活性タンパク質が回収された。また、ゼオライトによるリフォールディング法は、酸化還元剤が存在するバッファーでも適応可能であり、汎用性があることが示された。また、ゼオライトによるリフォールディング法により、比較的高濃度の活性タンパク質が回収できることが示唆された。 From the above results, when lysozyme adsorbs a maximum of about 35 mg per g of Na + form β-type zeolite (CP811E-150) and 50 mg of zeolite adsorb 1.6 mg of modified reduced lysozyme, 2M Gdn− Approximately 0.9 mg / ml of active protein was recovered by performing refolding with 0.75 ml of refolding buffer containing HCl and 0.5 M arginine at 4 ° C. for 16 hours. Moreover, it was shown that the refolding method using zeolite can be applied even in a buffer in which a redox agent is present, and is versatile. It was also suggested that a relatively high concentration of active protein can be recovered by the refolding method using zeolite.
以上詳述したように、本発明は、リゾチームの機能賦活・回復方法に係るものであり、本発明により、β型ゼオライトを用いた変性リゾチームの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。本発明により、封入体としての活性のないリゾチームから正しい立体構造及び活性を持った活性リゾチームを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。また、本発明は、他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性リゾチームのリフォールディング技術を提供することを可能にするものとして有用である。 As described above in detail, the present invention relates to a function activation / recovery method of lysozyme, and according to the present invention, a new function activation / recovery method of modified lysozyme using β-type zeolite is established and provided. Can do. According to the present invention, it is possible to provide a refolding technique for obtaining active lysozyme having a correct three-dimensional structure and activity from inactive lysozyme as an inclusion body. In addition, the present invention is useful as a technique that makes it possible to provide an inactive lysozyme refolding technique capable of performing refolding with higher efficiency than other methods.
Claims (4)
１）変性リゾチームに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、リゾチームのリフォールディングを行いリゾチームの機能を賦活・回復させること、２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ ４ ＋ 若しくはＮａ ＋ フォームにしたゼオライトを使用し、上記酸化還元剤として、システイン及び／又はシスチンを含むバッファーを用いて、Ｇｄｎ−ＨＣｌとアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いて少なくても１０時間を上回る時間インキュベーションすることによりリゾチームのリフォールディングを行い活性リゾチームを回収することでリゾチームの機能を賦活・回復させること、を特徴とするリゾチームの機能賦活・回復方法。 A method for activating / recovering the function of lysozyme,
1) denaturation of lysozyme, beta type zeolite, and added refolding buffer containing a redox agent, by incubating a certain time at a given temperature, thereby activating and recovering the function of lysozyme perform refolding of lysozyme, 2 In this case, NH 4 + or Na + form zeolite is used as the β-type zeolite , and Gdn-HCl and arginine are used as the redox agent using a buffer containing cysteine and / or cystine. be activated and recovering the function of lysozyme by recovering active lysozyme perform refolding of lysozyme by incubation period greater than 10 hours less with refolding buffer, functional vehicles lysozyme characterized by And recovery method.
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