JP5242552B2

JP5242552B2 - 抗ウイルス剤

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Publication number: JP5242552B2
Application number: JP2009506204A
Authority: JP
Inventors: 愼亮佐野; 尊子深川; 裕一山田; 税増田; 華子志村
Original assignee: Hokkaido University NUC; Nippon Soda Co Ltd
Current assignee: Hokkaido University NUC; Nippon Soda Co Ltd
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-19
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2028-03-19
Also published as: US20100216981A1; JPWO2008117523A1; EP2127675A4; EP2127675A1; US8680158B2; WO2008117523A1; US20120041072A1

Description

本発明は、新規な作用機構を有するＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤及び抗ウイルス剤に関する。

地球上には極めて多数の病原性ウイルスが蔓延しており、これらの感染によって、ヒトをはじめとする動物や農作物等の有用植物などの種々の生物が人的被害又は経済的被害に見舞われている。病原性ウイルスの感染によるウイルス病として、例えば、イネ萎縮ウイルスの感染によるイネの萎縮病、タバコモザイクウイルスの感染によるトマトのモザイク病、インフルエンザウイルスの感染によるヒトのインフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスの感染によるヒトのＢ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染による後天性免疫不全症候群などが挙げられる。

病原性ウイルスが植物や動物の宿主生物に感染すると、これに対抗して宿主生物は様々な生体防御機構を発動してウイルスの増殖を抑制したり、病徴を軽減したりする。この防御機構のひとつに転写後遺伝子発現抑制（Post Transcriptional Gene Silencing、以下ＰＴＧＳと略す）がある。ＰＴＧＳは、ウイルス等の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘導され、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が配列特異的に分解される現象である。ＰＴＧＳは植物や動物の高等生物だけでなく、原生動物や真菌に至る多くの生物種で保存されている機構であり、動物のような免疫機構を持たない植物では特に重要な防御機構と考えられている。すなわち、ＰＴＧＳを誘導するｄｓＲＮＡが細胞内のヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒまたはその類縁酵素によってｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）と呼ばれる２１塩基から２４塩基程度の短いＲＮＡに分解され、さらにＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）と呼ばれるヌクレアーゼ複合体に取り込まれ、ｓｉＲＮＡと相同な配列のｍＲＮＡを切断することで、ウイルス等の標的タンパク質の発現が抑制される機構である。

病原性ウイルスの多くは、宿主生物が備えているＰＴＧＳ機構に対抗して、このＰＴＧＳを抑制するサプレッサータンパク質（ＰＴＧＳサプレッサータンパク質、以下ＰＴＧＳ−ＳＰと略す）をコードしていることが近年明らかになった（例えば特許文献１）。さらに、このＰＴＧＳ−ＳＰの大半はｓｉＲＮＡと直接結合することでＰＴＧＳを抑制していることが報告されている（例えば非特許文献１）。

植物ウイルスが発現するＰＴＧＳ−ＳＰとしては、例えば、ポティウイルス（Potyvirus）属のウイルスのＨＣ−Ｐｒｏ（非特許文献２参照）、ククモウイルス（Cucumovirus）属のウイルスの２ｂ（非特許文献３参照）、ポテックス（Potexvirus）属のウイルスのｐ２５（非特許文献４参照）、トムブスウイルス（Tombusvirus）属のウイルスのｐ１９（非特許文献５参照）、カルモウイルス（Carmovirus）属のウイルスのコートタンパク質（非特許文献６参照）等が報告されている。

前述のウイルス病による被害を軽減させるために、ウイルス病の予防・治療剤の開発が多く試みられている。例えば、インフルエンザに対する有効な治療剤として、アマンタジン等のＭ２イオン−チャンネル阻害剤や、ザナミビルリン酸やオセルタミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤が知られている。これらのＭ２イオン−チャンネル阻害剤やノイラミニダーゼ阻害剤は、インフルエンザウイルスの増殖や他の細胞への感染を阻害することによってインフルエンザの治療効果を発揮すると考えられている。また、後天性免疫不全症候群に対する有効な治療剤としては大別してアジドチミジンやジダノシン等の逆転写酵素阻害剤や、リトナビルやインディナビル等のプロテアーゼ阻害剤が知られ、これら薬剤の多剤併用療法により顕著な効果を挙げ、先進諸国においては死亡者数が激減している。

しかし、これらのインフルエンザや後天性免疫不全症候群の治療剤には副作用も知られており、ウイルスの変異性による薬剤耐性ウイルスが出現することは不可避であると考えられていることから、別の作用機構を有する新たな抗ウイルス剤の開発が求められている。さらにウイルスに対する薬剤は、核酸に類似した構造を持つ一部の薬剤を除き、対象とするウイルス病以外には適用されない。また、ワクチンの接種は有効ではあるが、感染前に予め接種する必要があり、抗体ができるまでに時間を要することや、ウイルスは抗原となる部分が変異を起こし易いという問題がある。さらに、治療剤やワクチンは対象とするウイルス病以外には適用されないことから、ウイルスの種類毎にウイルス病の治療剤を開発する必要があった。

一方、植物のウイルス病に対して様々な防除方法が開発されてきた。ウイルス病に対する抵抗性品種の育種選抜や、茎頂培養や熱処理によるウイルスフリー化、選抜した弱毒ウイルスの処理による病原性ウイルスの感染抑制、形質転換によりウイルス耐性を付与した植物体の利用などが挙げられる。また、農薬としては、植物の抵抗性を誘導する殺菌剤やウイルスの媒介昆虫等を対象とした殺虫剤の使用が挙げられる。

しかし、抵抗性品種の育種は長期間を要し、耐性ウイルスの出現が不可避であり、茎頂培養などによるウイルスフリー化も完全ではない。弱毒ウイルスを利用したウイルス病防除の効果は高いが、安定した弱毒ウイルスの作出は困難であり、同一種あるいは近縁種のウイルスにしか効果はない。抵抗性誘導剤の効果は不安定であり、ウイルスの媒介昆虫を予防的に防除する殺虫剤の大量散布は環境汚染に繋がるだけでなく、ウイルスに感染した植物の治療効果は期待できない。

一方、植物のウイルス病に対する抗ウイルス剤の逼迫性と市場規模は、ヒトのウイルス疾患に対する抗ウイルス剤のそれよりもかなり小さいため、ヒトのウイルス疾患に対する抗ウイルス剤、例えば抗ＨＩＶ薬や抗インフルエンザ薬等に費やされる開発費よりもかなり開発費を抑えたとしても、その費用を回収できない可能性が高い。加えて、前述のように既存のワクチンや抗ウイルス剤は対象ウイルスにしか効果が期待できず、耐性ウイルスの出現が不可避であることから、植物のウイルス病に対する抗ウイルス剤の開発はこれまでほとんど進んでいなかった。

特開２００４−３４４１１０号公報 Goto K.,et al., Plant Cell Physiol.2007, 48, 1050-60 Anandalakshmi R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1998, 95, 13079-13084 Brigneti G., et al., EMBO J., 1998, 17, 6739-6746 Voinnet O., et al., Cell, 2000, 103, 157-167 Baulcombe DC., et al., Trends Biochem Sci. 2004, 29, 279-81 Qu F., et al., J. Virol. 2003, 77, 511-522

上記で述べた既存のウイルス病防除方法に代わる、従来とは異なる作用機構を有し、より実用的でより安全な防除方法を提供することが求められている。本発明の課題は、従来とは異なる作用機構を有するウイルス病防除剤を提供することにある。

本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ＰＴＧＳ−ＳＰとｓｉＲＮＡとの結合を阻害してＰＴＧＳ−ＳＰの機能を阻害することによって、適用対象となる生物に毒性や強い影響を与えることなく、ウイルス病の被害を軽減する治療効果や強い病原性を発揮する強毒ウイルスを弱毒ウイルス化する効果が得られることを見出し、さらに、実際に各種のＰＴＧＳ−ＳＰの機能を抑制する化合物の効果を実際に検討することによって、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、
［１］ＰＴＧＳを誘導する性質及びＰＴＧＳサプレッサータンパク質に結合する性質を有し、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質と結合するとＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質αと、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質との結合を阻害する活性を有する化合物を含有するＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤や、
［２］物質αがｓｉＲＮＡであることを特徴とする［１］に記載のＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤や、
［３］化合物が、下記式（１）〜（６）で表される環式ケトン化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする［１］又は［２］に記載のＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤に関する。

また、本発明は、
［４］化合物が、クロコン酸と過酸化水素との反応生成物であることを特徴とする［１］又は［２］に記載のＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤や、
［５］ＰＴＧＳを誘導する性質及びＰＴＧＳサプレッサータンパク質に結合する性質を有し、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質と結合するとＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質αと、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質との結合を阻害する活性を有する化合物を有効成分とする抗ウイルス剤や、
［６］物質αがｓｉＲＮＡであることを特徴とする［５］に記載の抗ウイルス剤や、
［７］化合物が、式（１）〜（６）で表される環式ケトン化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする［５］又は［６］に記載の抗ウイルス剤に関する。

さらに、本発明は、
［８］化合物が、クロコン酸と過酸化水素との反応生成物であることを特徴とする［５］又は［６］に記載の抗ウイルス剤に関する。

プロトプラスト法による本発明化合物７のＣＭＶ−２ｂに対する阻害活性を示すグラフである。サイレンシング植物法による発明化合物７のＣＭＶ−２ｂに対する阻害活性を示す写真である。病徴検定法による本発明化合物７の抗ウイルス活性を示すグラフである。

本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤は、ＰＴＧＳ−ＳＰと物質α（ＰＴＧＳを誘導する性質及びＰＴＧＳ−ＳＰに結合する性質を有し、ＰＴＧＳ−ＳＰと結合するとＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質）との結合を阻害する活性を有する化合物（以下、「本発明における化合物」ともいう）を含有することを特徴とする。物質αとＰＴＧＳ−ＳＰとの結合を阻害すると、ＰＴＧＳ−ＳＰが抑制する物質αの機能、すなわちＰＴＧＳを誘導する機能を復活させることができる。そのため、本発明における化合物を用いると、ウイルスによるＰＴＧＳ抑制作用を低減させることができ、その結果ウイルスの毒性が軽減されたり、ウイルスの増殖が抑制される等して、抗ウイルス効果が得られる。

（ＰＴＧＳ−ＳＰタンパク質）
本発明におけるＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤がターゲットとするＰＴＧＳ−ＳＰは、いずれかの種類のウイルスに由来するタンパク質であって、１種又は２種以上の生物のＰＴＧＳを抑制する能力を有するタンパク質であれば特に制限はされず、前述の生物としては、植物や動物を好ましく挙げることができ、植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ等の穀類、ダイズ、ラッカセイ等の豆類、ジャガイモ、サツマイモ等のイモ類、ダイコン、ニンジン、キャベツ、レタス、ナス、キュウリ、トマト等の野菜類、リンゴ、ナシ、カンキツ等の果樹類などの食用作物：バラ、カーネーション、キク等の花卉類、アイビー、アジアンタム等の観葉植物、マツ、サクラ等の樹木などの非食用作物をより好ましく例示することができ、動物としては、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等の哺乳動物やトリをより好ましく挙げることができる。

本発明におけるＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤がターゲットとするＰＴＧＳ−ＳＰとして具体的には、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ：Turnip mosaic virus）等のポティウイルス（Potyvirus）属のウイルスのＨＣ−Ｐｒｏ、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ：Cucumber mosaic virus）等のククモウイルス（Cucumovirus）属のウイルスの２ｂ、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ：Potato virus X）等のポテックス（Potexvirus）属のウイルスのｐ２５、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ：Tomato bushy stunt virus）等のトムブスウイルス（Tombusvirus）属のウイルスのｐ１９、カーネーション斑紋ウイルス（ＣａｒＭＶ：CaＲＮＡtion mottle virus）等のカルモウイルス（Carmovirus）属のウイルスのコートタンパク質などの植物を自然宿主とするウイルス由来のＰＴＧＳ−ＳＰ；ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ：Human immunodeficiency virus) 等のレンチウイルス(Lentivirus) 属のウイルスのｔａｔ（Genbank Accession
No.NC_001802や；Genbank Accession No. NC_001722）、Ａ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＡＶ：Influenza A virus）等のインフルエンザＡウイルス（Influenzavirus A）属のウイルスのＮＳ１（Genbank Accession
No.NC_002020）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＢＶ：Influenza B virus）等のインフルエンザＢ
ウイルス（Influenzavirus B）属のウイルスのＮＳ１（Genbank Accession No.NC_002211）、Ｃ型インフルエンザウイルス（ＦＬＵＣＶ：Influenza C virus）等のインフルエンザＣウイルス（Influenzavirus C）属のウイルスのＮＳ１などの動物（特に哺乳動物）を自然宿主とするウイルス由来のＰＴＧＳ−ＳＰなどを好ましく例示することができる。

上記に例示した公知のＰＴＧＳ−ＳＰ以外でも、ＰＴＧＳ−ＳＰとして機能するタンパク質であるなら、本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤のターゲットとなりうる。
ある特定のタンパク質がＰＴＧＳ−ＳＰであるかどうかは、任意の遺伝子に対してＰＴＧＳを人為的に誘導した細胞にそのタンパク質を同時に発現させるなどし、そのタンパク質を発現させなかった場合に比べて、任意の遺伝子がＰＴＧＳから復帰するかどうかを調べることにより確認することができる。ＰＴＧＳの低下は、ＰＴＧＳのターゲットとなる遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量の低下、あるいはそのターゲットタンパク質自体の蓄積量の低下を検出することにより確認することができる。
例えば、アグロバクテリウムを用いて、ＧＦＰ（Green florescence protein）遺伝子を植物葉の細胞間隙に注入し、ＧＦＰ遺伝子のＰＴＧＳを一過的に発現させるアグロインフィルトレーション法で確認することができる。ＰＴＧＳ−ＳＰ候補のウイルス遺伝子を同時に発現させ、ＧＦＰの発光が観察された場合はこのウイルス遺伝子がＰＴＧＳ−ＳＰと同定される。あるいは、植物葉のプロトプラストを用いて、ＧＦＰ遺伝子のＰＴＧＳを一過的に発現させるプロトプラスト法でも確認できる。この場合、ＧＦＰ遺伝子等はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により直接プロトプラストに取り込まれ、ＧＦＰの発光の有無により同定することができる。

（物質α）
本発明における物質αは、いずれかのＰＴＧＳ−ＳＰと結合する性質を有し、いずれかの生物の細胞内においてＰＴＧＳを誘導する性質を有し、かつ、前記ＰＴＧＳ−ＳＰと結合すると自身のＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質である限り特に制限されないが、核酸であることが好ましく、ウイルス由来のｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡ等のＲＮＡであることがより好ましく、ｓｉＲＮＡであることがさらに好ましい。ＲＮＡである物質αとして具体的には、ウイルス由来のＲＮＡ配列又はその一部を例示することができ、ウイルス由来の２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡをより好ましく例示することができる。

本発明における物質αであるｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡの配列は、特に制限されないが、抗ウイルス効果を得る対象となるウイルスの核酸もしくはその核酸から転写されたＲＮＡの配列に相当する配列又はその一部の配列であることが好ましく、抗ウイルス効果を得る対象となるウイルスの核酸もしくはその核酸から転写されたＲＮＡの配列に相当する２０〜２７塩基の配列であることがより好ましく、抗ウイルス効果を得る対象となるウイルスの核酸もしくはその核酸から転写されたＲＮＡの配列に相当する２１〜２３塩基の配列であることがより好ましい。
ｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの物質αがＰＴＧＳ−ＳＰと結合するかどうかは、後述の表面プラズモン共鳴法、１分子蛍光分析法、ゲルシフトアッセイ法、熱変性法などの方法を利用することにより確認することができる。また、ｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの物質αがＰＴＧＳ−ＳＰと結合したときにそのＰＴＧＳを誘導する性質が低下するかどうかは、任意の遺伝子に対してＰＴＧＳを人為的に誘導した細胞にＰＴＧＳ−ＳＰを発現させ、同時に特定の物質を存在させることによって、その物質が存在しなかった場合に比べて細胞内のＰＴＧＳが促進されているかどうかを調べることにより確認することができる。

（本発明の阻害剤）
本発明における阻害剤として使用する化合物は、物質αと、ＰＴＧＳ−ＳＰとの結合を阻害する活性を有するものである限り特に制限されず、抗体等のタンパク質や核酸などの化合物も含まれる。本発明における化合物として、具体的には、以下の表１に示される化合物又はその誘導体を好ましく例示することができる。
これ等の化合物は環式ケトン化合物であるが、化合物番号７及び８は、合成例１又は２で合成されたクロコン酸と過酸化水素との反応生成物である。表１に示された化合物以外の本発明における化合物は、後述の本発明の評価系を用いたスクリーニング（in vitroスクリーニング方法およびin vivoスクリーニング方法）よって容易に特定することができる。

これ等の化合物のうち、好ましくは、化合物番号５，６，７，８，１２，１３，１４，２０の化合物である。

前述の表１の化合物のうち、化合物番号７及び８は新規化合物であり、化合物番号７，８以外の化合物は市販されている。

これらの化合物又はその誘導体は、適当な化合物を原料化合物として公知の反応を行うことにより合成することができる。特に、上記化合物番号７及び８については、後述の実施例に具体的に記載された方法等により合成することができる。
本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤は、本発明における化合物を１種のみ含有していてもよいし、２種以上を含有していてもよい。

（本発明の抗ウイルス剤）
本発明の抗ウイルス剤は、本発明の化合物を有効成分とすることを特徴とする。本発明の抗ウイルス剤を用いると、ＰＴＧＳ−ＳＰが抑制する物質αの機能、すなわちＰＴＧＳを誘導する機能を復活させることができる。このような作用機作で本発明のウイルス剤は、強毒ウイルスによるＰＴＧＳの抑制を低減させることができ、その結果ウイルスの増殖が抑制されたり、ウイルスの毒性が軽減される等して、抗ウイルス効果を発揮する。

本発明の抗ウイルス剤は、本発明における化合物を１種のみを有効成分として含有していてもよいし、２種以上を有効成分として含有していてもよい。また、本発明の抗ウイルス剤は、本発明における化合物のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害活性を阻害しない限り、ウイルスに対する生物の一般的な抵抗性を促進する物質をさらに含有していることがより優れた抗ウイルス剤を得る観点から好ましい。ウイルスに対する宿主生物の抵抗性を促進する物質としては特に制限されないが、ウイルスに対する植物の抵抗性を促進する物質としては、抵抗性誘導剤として知られている殺菌剤のプロベナゾール、チアジニル、あるいは、イソニコチン酸、サリチル酸、アスコルビン酸等を好ましく例示することができる。

本発明の抗ウイルス剤は、本発明における化合物のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害活性を阻害しない限り他の任意の成分を含有していてもよい。他の任意成分としては、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の稀釈剤、賦形剤等を例示することができる。

本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤や抗ウイルス剤の剤型は特に制限されず、対象として用いる生物に合わせて錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、軟膏剤、吸入剤、噴霧剤等から適宜選択することができる。ＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤や抗ウイルス剤の使用量は、使用態様、対象として用いる生物、含有される本発明の化合物の種類等により左右されるため一概にいうことはできないが、当業者であれば適当な使用量を適宜決定することができる。

本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤や抗ウイルス剤の使用方法は特に制限されず、当業者であれば、それらの剤に含有される本発明の化合物の性質や、対象として用いる生物の種類等に応じて適宜決定することができる。対象として用いる生物が動物の場合は、例えば経口投与、静脈注射、筋肉注射、経膣投与、経皮塗付、吸入などによる使用方法を好ましく例示することができ、対象として用いる生物が植物の場合は、例えば、茎葉散布、浸漬処理、土壌潅注、種子消毒、くん煙などによる使用方法を好ましく例示することができる。

本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤や抗ウイルス剤の使用量についても特に制限されず、当業者であれば、対象として用いる生物の種類や、使用方法等に応じて適宜決定することができる。特に、対象として用いる生物が動物である場合は、対象として用いる生物の年齢、体重、症状、投与方法等により適宜選択することができる。

（スクリーニング法）
１）in vitroスクリーニング方法
本発明における化合物のin vitroスクリーニング方法は、物質αとＰＴＧＳ−ＳＰの結合を阻害する程度を指標とする評価方法や、ＰＴＧＳ−ＳＰとの特異的な結合を測定する評価方法である限り、特に制限されない。試験化合物が、物質αとＰＴＧＳ−ＳＰとの結合を阻害するか否か、あるいは該結合をどの程度阻害するかについては、例えば、１分子蛍光分析法や表面プラズモン共鳴法あるいは、ゲルシフトアッセイ法、二面偏波干渉法、光熱変換分光法、水晶発振子マイクロバランス法等の公知の方法などを利用することにより定量的に測定し、評価することができる。１分子蛍光分析法は、試料の固定化が不要であり、生体内に近い溶液系の条件で多検体処理が可能であるが、化合物の自家蛍光に妨害を受け易い欠点がある。表面プラズモン共鳴法は試料の固定化を必要とするが、化合物の自家蛍光の影響を受けない。ゲルシフトアッセイ法は多検体処理には不適であるが、試料の固定化が不要で、化合物の自家蛍光の影響を受けない利点がある。

１分子蛍光分析法とは、標識した蛍光分子の分子数や強度等を共焦点レーザー顕微鏡で測定することにより、標識した蛍光分子の挙動の変化を検出し、２種類の物質の分子間相互作用を解析する手法である。１分子蛍光分析法によるスクリーニングは、例えば、ＰＴＧＳ−ＳＰと、蛍光標識した物質αと、試験化合物とを含むサンプル溶液を、オリンパス社のＭＦ２０などの１分子蛍光分析法の測定装置によって、標識した物質αの挙動の変化を検出することにより行うことができる。

表面プラズモン共鳴法とは、薄金膜上に固定した分子の重さの変化等によって生じる屈折率の変化をモニターして、２種類の物質の分子間相互作用を解析する手法である。表面プラズモン共鳴法によるスクリーングは、例えば、センサーチップ表面に物質αを固定化して、ＰＴＧＳ−ＳＰと試験化合物とを含むサンプル溶液を、Biacore社の測定装置などによって、センサーチップに固定した物質αとＰＴＧＳ−ＳＰが結合することで生じる分子の重量変化を、溶液の屈折率変化として検出することにより行うことができる。

ゲルシフトアッセイ法とは、２種類の高分子物質を混合し、電気泳動を行うことで、泳動バンドの位置や濃度から２種類の物質が結合しているかどうかを解析する手法である。例えば、標識した物質αとＰＴＧＳ−ＳＰと試験化合物とを含むサンプル溶液を、汎用装置によってポリアクリルアミドゲル電気泳動することでスクリーングすることができる。物質αとＰＴＧＳ−ＳＰが結合すると分子量が大きくなるので泳動は遅れ、化合物によって物質αとＰＴＧＳ−ＳＰの結合が阻害されると物質αの泳動は速くなることから、これら泳動バンドの位置や量を比較することによって結合の程度を解析することができる。

２）in vivoスクリーニング方法
本発明における化合物のin vivoスクリーニング方法としては、ＰＴＧＳ−ＳＰの機能を阻害する程度を指標とする評価方法である限り特に制限されない。試験化合物がＰＴＧＳ−ＳＰの機能を阻害するか否かについては、例えば、アグロインフィルトレーション法やプロトプラスト法、あるいは花色の変化を指標としたサイレンシング植物法、植物の幼苗を用いてウイルス病の病徴を調査する病徴検定法などがある。

アグロインフィルトレーション法とは、一過的な形質転換用のアグロバクテリウムを用い、例えばＧＦＰ遺伝子とＰＴＧＳ−ＳＰのウイルス遺伝子を植物葉の細胞間隙に同時に注入し、ＰＴＧＳが機能した場合はＧＦＰ蛍光が消失し、ウイルスのＰＴＧＳ−ＳＰが機能した場合はＧＦＰ蛍光が観察されることを利用した方法である。さらに、試験化合物を遺伝子の注入する前後に処理することで、ＧＦＰ蛍光が消失した場合はＰＴＧＳ−ＳＰの機能を化合物が阻害したと判定できる。

プロトプラスト法とは、アグロインフィルトレーション法と同様の原理に基づいた方法である。すなわち、植物葉の代わりにプロトプラストを用い、ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＰＴＧＳ−ＳＰのウイルス遺伝子をポリエチレングリコールによって直接プロトプラストに取り込ませ、ＰＴＧＳが機能した場合はルシフェラーゼ活性の発光が消失し、ウイルスのＰＴＧＳ−ＳＰが機能した場合は発光が強くなることを利用している。プロトプラストに試験化合物を処理することで、ルシフェラーゼ活性の発光が無処理よりも有意に減少した場合はＰＴＧＳ−ＳＰの機能を化合物が阻害したと判定できる。

サイレンシング植物法とは、花の全体または一部が白くなった品種を用い、ＰＴＧＳ−ＳＰをもつ植物ウイルスを感染させると花色が変化することを利用した方法である。すなわち、多くの白い花は色素の遺伝子が自然のＰＴＧＳによって発現が抑制されていることを利用したもので、ウイルスの感染によって、ＰＴＧＳによる色素発現の抑制が解除され、色素遺伝子が発現する結果、白色から赤色や青色になる。ここに、処理した化合物がウイルスのＰＴＧＳ−ＳＰの機能を阻害すると、花色は白色に戻ることで阻害効果を判定できる。

植物の幼苗を用いた病徴検定法とは、ウイルス病の病徴を観察して化合物の抗ウイルス効果を判定する方法である。すなわち、植物の幼苗に激しい病徴を示す植物ウイルスを接種する前後に、化合物を処理し、抗ウイルス効果を病徴の程度によって判定する方法である。
３）スクリーニングのためのＰＴＧＳ−ＳＰ及び物質αの調製法

本発明におけるＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤がターゲットとするＰＴＧＳ−ＳＰは、前述したGenBankのアクセッションナンバーの配列情報に基づいてＰＣＲを行なうこと等の汎用的な手法を用いて取得することができる。
例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞などを用いた発現系、若しくは小麦胚芽由来やウサギ網状赤血球由来の無細胞タンパク質合成系などにおいての発現が可能である。
大腸菌を用いた場合は、任意の大腸菌発現用ベクターに、目的とするＰＴＧＳ−ＳＰをコードする配列にタグ配列を付加して挿入し、これを任意の大腸菌株に形質転換してＰＴＧＳ−ＳＰを発現させることができる。そして付加したタグの種類に基づき、常法に従ってＰＴＧＳ−ＳＰを精製することが好ましい。例えば、ＴＢＳＶのｐ１９の場合はＨｉｓ−ｔａｇを付加したり、ＴＡＶ（Tomato aspermy virus）の２ｂ（ＴＡＶ−２ｂ）やＨＩＶのｔａｔの場合はＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）を付加したりすることで、ＰＴＧＳ−ＳＰを容易に精製することができ、評価系に問題なく使用することができる。

本発明においては、ＰＴＧＳ−ＳＰの代わりにその部分構造を持つ合成ペプチドを用いても、評価系に使用することができる。合成ペプチドは、前述したＰＴＧＳ−ＳＰの配列情報に基づき、強塩基性アミノ酸のアルギニンやリシンが一次元的に数個以上連続または近接する部分を含み、２０〜４０塩基のペプチドをＦｍｏｃ法もしくはＢｏｃ法を用いた固相合成法等の汎用的な手法を用いて取得することができる。

本発明においては、ＰＴＧＳ−ＳＰの代わりにその部分構造を持つ合成ペプチドは、その長さや配列を変異させても、ｓｉＲＮＡとの結合阻害評価系に使用することができる。ｓｉＲＮＡとの結合試験に使用される変異ペプチドは、強塩基性アミノ酸のアルギニンまたはリシンが一次元的に３個以上連続または近接するように配列することが必要である。例えば、ＨＩＶのｔａｔの場合はＮ末側の４９番目から連続するアルギニンやリシンが重要であり、５２番目、５３番目、５５番目のアルギニンのどれかひとつでも中性アミノ酸のロイシンに変換するとｓｉＲＮＡとの結合能は低下し、２個以上をロイシンに変換すると結合能は失われる。これらのアルギニンを同じ強塩基性アミノ酸のリシンに全て変換しても結合能は維持される。一方、７８番目のアルギニンのように独立して存在するアルギニンの場合は中性アミノ酸のロイシンに変換しても結合能は維持される。
また、物質αであるｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡなどの核酸は、ＰＣＲを行なうこと等の汎用的な手法を用いて取得することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（化合物の合成）
合成例１（化合物７の調製）
クロコン酸３．０ｇを純水３０ｍｌに溶解し、室温下で３０％過酸化水素水を１．２ｇ加え、反応液を２０−３０℃で３日間攪拌した。反応液を減圧濃縮して化合物７を２．６ｇ得た。^１３Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ_２Ｏ) δ 178.6、129.5、75.7

合成例２（化合物８の調製）
クロコン酸５．０ｇを純水５０ｍｌに溶解し、室温下で３０％過酸化水素水を２．０ｇ加え、反応液を１００℃で２４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮して化合物８を３．３ｇ得た。^１３Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ_２Ｏ) δ 195.3、193.9、180.5、178.7、176.7、161.7、151.3、150.0、129.7、75.8、73.1、72.5、59.9、45.9、39.8

（化合物のスクリーニング）
１ビオチン標識したｓｉＲＮＡの作成
２１塩基からなる１本鎖のＲＮＡ（センス鎖：配列番号１）を用意し、この配列の３’末端をビオチン化した。次に、このセンス鎖と相補的な２１塩基からなる１本鎖のＲＮＡ（アンチセンス鎖：配列番号２）をアニーリングし、これを精製することで、ビオチン標識した２１塩基対のｓｉＲＮＡを作成した。

２ＰＴＧＳ−ＳＰの作成
１）ＴＢＳＶ−ｐ１９の作成
スクリーニングに用いたＴＢＳＶのＰＴＧＳ−ＳＰであるｐ１９(Genbank
Accession No. NC_001554)は、以下のようにして発現、精製した。すなわち、コールドショック発現用ベクター pCold I DNA(TaKaRa)にp19とflag-tagを繋いだコンストラクトを作成し、大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。０．１ｍＭのＩＰＴＧ
存在下、１５℃、２４時間培養して発現を誘導させ、集菌して菌体を破壊した。遠心分離した上清をベクター由来のHis-tagを利用し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いてイミダゾール２００ｍＭ〜５００ｍＭで抽出した。発現したp19は抗flag抗体を用いて確認し、抽出画分のp19を精製した。

２）ＴＡＶ−２ｂの作成
スクリーニングに用いたＴＡＶの２ｂ (Genbank Accession No. NC_003838)は以下のようにして発現、精製した。すなわち、pMAL-c2X (Bio Labs)ベクターにTAV-2bとflag-tag配列を繋げたコンストラクトpMAL-TAV2b-flagを作成し、これを大腸菌ＪＭ109株に形質転換して３７℃ ＬＢ／Ａｍｐ培地で培養した。０．３ｍＭのＩＰＴＧで２時間発現を誘導後、遠心分離した菌体を洗浄し、緩衝液に再懸濁した。これをホモジナイザーで破砕し、遠心分離した上清画分をアミロースリジンカラムに通し１０ｍＭマルトースで溶出させ、ＭＢＰ融合TAV-2ｂを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでMBP-TAV2ｂ-flagの発現を確認後、Factor XaでMBPとTAV2ｂ-flag間を切断し、flagカラムで精製し、TAV2ｂ-flag画分を取得した。

３）合成ペプチドの作成
ＰＴＧＳ−ＳＰの部分構造を持つ合成ペプチドとして、前述したＰＴＧＳ−ＳＰの配列情報に基づき、ＨＩＶのｔａｔに含まれる強塩基性アミノ酸のアルギニンが複数個連続または近接する部分を含むペプチド（配列番号３）をデザインした。実際の合成はペプチド合成受託会社（バイオロジカ社）で行ない、９８％精製度のペプチドを入手した。

３スクリーニング
１）表面プラズモン共鳴法
ＢｉａｃｏｒｅＸ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）装置を用い、ストレプトアビジンで修飾されたＳＡセンサーチップに前述の３’末端をビオチン標識した２１塩基対のｓｉＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）溶液を５μｌ／ｍｉｎで注入し、センサーチップに固定化した。スクリーニングに用いる試験化合物はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水に溶解し、最終化合物濃度が２５ｐｐｍになるように調製した。ＰＴＧＳ−ＳＰのｐ１９またはＴＡＶ−２ｂはＢｉａｃｏｒｅ用緩衝液（０．０１ＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４, ０．１５ＭＮａＣｌ,３ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、最終濃度を約１０μｇ／ｍｌになるように調整した。試験化合物とＰＴＧＳ−ＳＰを混合し、遠心分離した上清に牛血清アルブミンを加え、透析膜（PIERCE社製7000MWCO）で４℃２時間透析した後、前述の濃度になるように調製して試験化合物のサンプル溶液を得た。ＢｉａｃｏｒｅＸ装置を該手順書によって操作し、センサーチップに固定化したｓｉＲＮＡとＰＴＧＳ−ＳＰの結合に及ぼす試験化合物の影響を測定した。ビオチンを標識していないフリーのｓｉＲＮＡ（最終濃度0.1μＭ）を陽性対照として、化合物無添加の阻害率を０％、陽性対照の阻害率を１００％として、試験化合物の結合阻害率を算出した。本発明化合物のｐ１９またはＴＡＶ−２ｂに対する結合阻害活性を表２に示した。

２）ゲルシフトアッセイ法
スクリーニングに用いる試験化合物はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水に溶解し、最終化合物濃度が１００ｐｐｍになるように調製した。ゲルシフトアッセイキット(LightShift Chemiluminescent EMSA Kit,Pierce社製）を用い、ＢＳＡを０．００５％添加した緩衝液中にｔａｔの合成ペプチド(５００ｎＭ)と試験化合物溶液を混合して２５℃３０分間振盪した後、ビオチン標識ｓｉＲＮＡ（５００ｐＭ）を混合し、さらに２５℃３０分間振盪した。各サンプルを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ナイロンメンブレンに１時間転写した。メンブレンをブロッキングした後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで処理し、ルミノール・ペルオキシド基質溶液を加えて反応させ、Ｘ線フィルムを重ねて約２分間感光した。泳動されたフリーのビオチン標識ｓｉＲＮＡまたは合成ペプチドと結合したビオチン標識ｓｉＲＮＡのバンドの位置と濃度から、試験化合物の結合阻害率を算出し、本発明化合物のｔａｔの合成ペプチドに対する結合阻害活性を表２に示した。

３）プロトプラスト法
タバコ（Nicotiana benthamiana）苗の裏面表皮を剥離して、酵素液（２％セルラーゼＲＳ，０．５％マセロザイムＲ１０，０．５Ｍマンニトール）中に２５℃約６時間静置した。これを２重ガーゼでろ過し、マンニトール(０．４Ｍ)の添加と遠沈（３００ｒｐｍ，２ｍｉｎ）を３回繰り返してプロトプラストを得た。このプロトプラストにＰＥＧ法で下記の４種類の核酸、すなわち、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ（Fluc）の発現プラスミド、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）の発現プラスミド、サイレンシングを引き起こすためのホタルルシフェラーゼ(Fluc) のｄｓＲＮＡ、及びＰＴＧＳ−ＳＰのＣＭＶ−２ｂをトランスフェクションし、約２４時間培養した後、プロトプラストを破砕して細胞内で発現したFlucとRlucの各タンパク質の発現量を発光として測定した。供試化合物は培養前に所定濃度になるように添加し、化合物の有無によるFluc/Rluc比で阻害活性を判定した。
本発明化合物７のＣＭＶ−２ｂに対する阻害活性を図１に示した。縦軸はレポーター遺伝子のホタルルシフェラーゼの発色量を示し、化合物７の濃度依存的に発光量が低下した。

４）サイレンシング植物法
天然のＰＴＧＳによって色素の遺伝子発現が抑制され、花に白色のスターを形成するペチュニアの品種を用いた。このペチュニアにＣＭＶ-Ｌ系統を接種、感染させ、天然のＰＴＧＳを完全に抑制したウイルス罹病ペチュニアをＰＴＧＳ−ＳＰ機能の検定植物に用いた。個体差をなくするために、罹病ペチュニアを挿し木で増やして阻害試験に用いた。スクリーニングに用いる試験化合物はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水に溶解し、ＭＥＳ緩衝液でｐＨを５．５〜６．０に調整し、最終濃度を１００〜１０００ｐｐｍにした。本発明化合物の溶液を灌注し、１〜２週間後に開花してくるペチュニアの花色の変化を観察し、白色のスターが復帰するかどうかで化合物のＰＴＧＳ−ＳＰ機能の阻害活性を判定した。
本発明化合物７のＣＭＶ−２ｂに対する阻害活性を図２に示した。
ＣＭＶに感染したペチュニアの花（図２上）に白色のスター模様は認められないが、本発明化合物７を灌注した花（図２中央）には健全花（図２下）と同様に白色のスター模様が復活した。

５）病徴検定法
タバコ（Nicotiana benthamiana）苗の葉裏面に所定濃度に希釈した化合物の溶液を注射器で静かに注入した。ウイルス（ＴＡＶ）感染乾燥葉を１０倍容の０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で摩砕した粗汁液を接種汁液として、化合物を注入したタバコ葉の表面にカーボランダムで有傷塗布した。接種後のウイルス病徴を観察し、化合物の抗ウイルス活性を判定した。
本発明化合物７の抗ウイルス活性を図３に示した。本発明化合物７を処理したタバコの病徴進展が無処理より遅れ、発病が抑制されていることが明らかである。

本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤は、ウイルスが産生するＰＴＧＳ−ＳＰと物質α（ＰＴＧＳを誘導する性質及びＰＴＧＳ−ＳＰに結合する性質を有し、ＰＴＧＳ−ＳＰと結合するとＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質）との結合を阻害することができ、ＰＴＧＳ−ＳＰの機能を低下させることができる。ＰＴＧＳ−ＳＰが関与するＰＴＧＳ抑制作用を低下させることによって、ＰＴＧＳ本来の働きにより生物に感染したウイルスの増殖を抑制したり、ウイルスの毒性を軽減させることができるため、本発明のＰＴＧＳ−ＳＰ結合阻害剤は、抗ウイルス剤として用いることができる。本発明の抗ウイルス剤は、既知の抗ウイルス剤とは別の作用機構を有するため、既知の抗ウイルス剤に対して耐性を有しているウイルスなどに対しても、効果を発揮することが十分に期待される。

また、本発明のウイルス剤は、ＰＴＧＳ−ＳＰとｓｉＲＮＡとの結合を阻害してＰＴＧＳ−ＳＰの機能を阻害するが、病原性ウイルスの多くが共通して有するＰＴＧＳ−ＳＰの機能に作用するため、より広範なウイルスに効果を奏することが予測される。すなわち、ＰＴＧＳ−ＳＰの多くは核酸結合領域と呼ばれる部位でｓｉＲＮＡと結合することが、Ｘ線結晶構造解析などで明らかになっている(非特許文献５)が、特に強塩基性アミノ酸のアルギニンやリシンが一次元的配列または立体的な位置関係において、数個以上連続または近接する部位で結合することが分かった。このような強塩基性のアミノ酸が高い頻度で存在するＰＴＧＳ−ＳＰの部位の存在がｓｉＲＮＡと結合する必要条件であり、病原性ウイルスの持つＰＴＧＳ−ＳＰの共通した特徴であることから、本発明のウイルス剤は広範なウイルスに効果を奏することが予測される。

本発明の抗ウイルス剤を動物に使用した場合、病原性ウイルスを原因とするウイルス病の治療効果が得られ、植物に使用した場合、ウイルス病の激しい被害を低減させ、作物の商品価値と生産性を著しく向上させ得る。

Claims

植物にＰＴＧＳを誘導する性質及び植物ウイルス由来のＰＴＧＳサプレッサータンパク質に結合する性質を有し、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質と結合するとＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質αと、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質との結合を阻害する活性を有する化合物を含有するＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤であって、前記化合物が下記式（１）〜（６）で表される環式ケトン化合物、及びクロコン酸と過酸化水素との反応生成物からなる群から選ばれ、
前記植物ウイルスがポティウイルス（Potyvirus）、ククモウイルス(Cucumovirus)、ポテックス（Potexvirus）、トンブスウイルス（Tombusvirus）及びカルモウイルス（Carmovirus）からなる群から選ばれることを特徴とするＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤。
物質αがｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のＰＴＧＳサプレッサータンパク質結合阻害剤。
植物にＰＴＧＳを誘導する性質及び植物ウイルス由来のＰＴＧＳサプレッサータンパク質に結合する性質を有し、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質と結合するとＰＴＧＳを誘導する性質が低下する物質αと、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質との結合を阻害する活性を有する化合物を有効成分とする抗植物ウイルス剤であって、前記化合物が下記式（１）〜（６）で表される環式ケトン化合物、及びクロコン酸と過酸化水素との反応生成物からなる群から選ばれ、
前記植物ウイルスがポティウイルス（Potyvirus）、ククモウイルス(Cucumovirus)、ポテックス（Potexvirus）、トンブスウイルス（Tombusvirus）及びカルモウイルス（Carmovirus）からなる群から選ばれることを特徴とする抗植物ウイルス剤。
物質αがｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項３に記載の抗ウイルス剤。