JP5216575B2

JP5216575B2 - モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及びリポ多糖の定量方法

Info

Publication number: JP5216575B2
Application number: JP2008503835A
Authority: JP
Inventors: 源一郎杣; 裕之稲川; 千恵河内; 孝志西澤; 晃子本田
Original assignee: Biomedical Research Group Inc
Current assignee: Biomedical Research Group Inc
Priority date: 2006-03-05
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2027-03-02
Also published as: JPWO2007102442A1; WO2007102442A1

Description

本発明は、グラム陰性細菌の細胞壁構成成分である、種々のリポ多糖を識別、定量、又は捕獲するためのモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を利用したリポ多糖の定量方法に関する。

（１）リポ多糖について：リポ多糖は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）と称されるグラム陰性細菌の細胞表層に局在する物質である。基本構造はリピドＡと呼ばれる脂質に糖鎖（コア多糖、Ｏ抗原多糖等）が結合した、糖脂質である（非特許文献１）。糖鎖部分の糖の種類と繰り返し回数は菌種によって異なる。リピドＡ部分も、菌種により異なる構造をとることが知られている。即ちＬＰＳは由来する微生物により構造が異なる。ＬＰＳは免疫賦活などの生物活性を持つことが知られている（非特許文献１）。しかしながらＬＰＳの構造が、由来する微生物により異なることを反映して、その生物活性もＬＰＳの種類により大きく異なることが知られている（非特許文献１）。近年、ＬＰＳが持つ生物活性を利用して、疾病予防・健康維持を達成することに注目が集まっている（非特許文献２）。また慣用的に摂取されあるいは暴露されるＬＰＳが健康維持に重要な意義を持つことも報告されている（非特許文献３）。このような場合には、摂取されあるいは暴露されあるいは利用するＬＰＳの構造に依存した生物活性を明確にすることは勿論のこと、最終利用形態である例えば食品、スキンケア商品、医薬部外品、医薬、飼料、日用品などにどのようなＬＰＳがどれほど含まれるか、即ち、含まれる或いは配合されるＬＰＳの質と量を特定する必要があることは言うまでもない。

ところでＬＰＳは由来する微生物により異なることが知られているので、特定のＬＰＳのみを識別する技術が必要となるが、特定のＬＰＳを認識し、定量することは一般には容易ではない。従来ＬＰＳ一般の測定にはリムラス反応が用いられる。リムラス反応は、カブトガニの血球ライセートがＬＰＳと反応し、凝固することを応用したものであり、利便性を高めたキットも市販されている（非特許文献４）。しかしながら、リムラス反応は、ＬＰＳの微細な構造を反映したものではなく、例えばカルジオリピンなどの糖脂質とも反応するなど、特異性はきわめて低く、特定のＬＰＳにのみ反応するものではない。

一般的に特定の構造のみを高い特異性をもって認識しうる物質のひとつにモノクローナル抗体がある（非特許文献５）。これまでにも、大腸菌ＬＰＳの脂質部分を認識するモノクローナル抗体は公知であるし、他にもサルモネラ菌などのＬＰＳに対するモノクローナル抗体は公知となっている。しかるに、モノクローナル抗体は個々の物質に対して偶発的に得られることが判っており、そのようなモノクローナル抗体の生物学的性質を予想することは不可能である。したがって、大腸菌やサルモネラ菌ＬＰＳに対してモノクローナル抗体が得られている事実は、他の微生物由来のＬＰＳに対するモノクローナル抗体の構造や生物学的性格を推定させることにならないし、この事実が他の微生物ＬＰＳの抗体を取得できることを容易に推認できることにもならないことはいうまでもない。勿論、大腸菌やサルモネラ菌ＬＰＳに対するモノクローナル抗体を用いて、その他の微生物、例えば食用素材に共生している微生物あるいは食品製造に用いられあるいは食用に供せられる微生物に存在するＬＰＳを特異的に識別することはできない。

本発明者らは、食用素材に共生している微生物あるいは食品製造に用いられあるいは食用に供せられる微生物、とりわけグラム陰性細菌に注目して、これら微生物に存在するＬＰＳは経口・経皮投与で安全・安心な物質で有るとともに、極めて優れた免疫賦活作用を示すことを報告してきた（特許文献１）。また、上記発明を基盤として、種々の疾病予防・健康維持を目的とした商品が提供できることも示した（特許文献２）。これら商品を提供し所定の効果を上げることを考えれば、それぞれの製品に含まれるＬＰＳを特定し、その含有量を測定することで、製品の効果を明らかにする、あるいは配合する特定のＬＰＳ質及び量が所定の効果を上げる上で過不足ないことを確認する必要があることは言うまでもない。この目的を達成するためには特定の微生物に由来したＬＰＳに対するモノクローナル抗体が取得できることが望ましい。本発明者らは以上の観点に立ち、食用素材に共生している微生物、好ましくは、パントエア菌、パントエア・ディスペルサ、酢酸菌、アセトバクター、グルコノバクター、フラテウリア、グルコノ酸菌、キサントモナス、ザイモモナスなど、あるいは食品製造に用いられあるいは食用に供せられる微生物、好ましくは、パントエア菌、パントエア・ディスペルサ、酢酸菌、アセトバクター、グルコノバクター、フラテウリア、グルコノ酸菌、キサントモナス、ザイモモナスなどのグラム陰性菌に注目して特定のＬＰＳに対するモノクローナル抗体の作成に成功し、さらに、該モノクローナル抗体を用いたリポ多糖の定量法を確立することに成功し本発明を完成したものである。以下に詳細に実施例を記載する。本は発明は当該実施例記載のグラム陰性菌のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
特願２００５−３４２９７１ＷＯ２００５／０３０９３８ Christian A, Ulrich Z, Trends in Glycoscience and Glycotechnology14, 69-86 (2002) 杣源一郎薬学研究の進歩研究成果報告書１６：７−２２（２０００）呉艶玲、山崎暁子、毛暁全、白川太郎化学と生物４４２１−２６（２００６） Nakamura T, et al. Eur. J. Biochem. 176, 89-94 (1988) Ed Harlow、David Lane,Antibodies Alaboratory manual Chapter6 p141-142 (1988) ColdSpring Harbor Laboratory

特定のＬＰＳの構造に依存した生物活性を明確にするためには、最終利用形態である例えば食品、スキンケア商品、医薬部外品、医薬、飼料などにどのようなＬＰＳがどれほど含まれるかを特定することが必要となる。そこで本発明は、含まれる又は配合されるＬＰＳの質と量を特定するためのモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、該ＬＰＳの質と量を特定することができるリポ多糖の定量法を提供することを、目的とする。

本発明のハイブリドーマは、受託番号がＮＩＴＥＢＰ−３２５、ＮＩＴＥＢＰ−３２６、ＮＩＴＥＢＰ−３２７、ＮＩＴＥＢＰ−３２８、ＮＩＴＥＢＰ−３２９又はＮＩＴＥＢＰ−３３０であることを特徴とする。

また、本発明のモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマによる産生されることを特徴とする。

また、本発明のリポ多糖の定量方法は、上記モノクローナル抗体を用いることによって特定の微生物に存在するリポ多糖を定量することを特徴とする。

特定のＬＰＳの構造に依存した生物活性を明確にするために、最終利用形態である例えば食品、スキンケア商品、医薬部外品、医薬、飼料などにどのようなＬＰＳがどれほど含まれるか、即ち、含まれる或いは配合されるＬＰＳの質と量を特定できる。このことにより該製造物の効果・効能を明らかにすることが可能となる。

本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００６−０５８７７９の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

（ＬＰＳｐ特異的なモノクローナル抗体の樹立）
抗原として、各種加熱死菌を使用した。免疫のスケジュールは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１回目抗原投与後、２週間ずつの間隔を開け、２回目以降の抗原投与の２日から３日目に採血し、ＬＰＳｐ（細菌パントエア・アグロメランスに存在するＬＰＳ）を含む各種菌体抽出物に対する抗体価を測定することとした。二次抗体には、アルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、Ｍ、Ａを用いることとした。ここで動物に対して抗体価の上昇が認められればモノクローナル抗体の取得は可能である。実施例に関してはＬＰＳｐについてのものを述べるが、ＬＰＳｐに限定したものではなく、請求項１乃至４に記載した微生物や根粒を形成するグラム陰性細菌であれば同様に適応できる。

細胞融合は、定法に従いポリエチレングリコール法を用い、ハイブリドーマの取得を行った。ミエローマにはＰ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３−Ａ６３−Ａｇ８−Ｕ１）を用い、細胞融合の比率はミエローマと脾細胞を１対５とした。融合細胞を９６穴プレートで培養し、ＬＰＳｐに対する抗体を産生するハイブリドーマのみをＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法で選択（１次スクリーニング）した。ついで抗体のＬＰＳｐ部位特異性は、ＬＰＳｐと大腸菌ＬＰＳをそれぞれ固相化したプレートを用いて検討することとした。Ｏ抗原部分、コア多糖部分に対する抗体を産生するハイブリドーマを優先的に選択し（２次スクリーニング）、８種のハイブリドーマを得た。得られた８種の内６種が、ＬＰＳｐに対して特異的に反応するモノクローナル抗体であることを明らかにした。８種の内、残りの２種類は、合成リピドＡを含む全てのＬＰＳに対して同程度の強度の反応が認められたことから、リピドＡ部分に対するモノクローナル抗体と推定された。ＬＰＳｐに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ2種について、腹水化を行い、両クローン共に抗体価の高い腹水を得た。本実施例の第二の目的とした、ＬＰＳｐに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた、ＬＰＳｐを特異的に定量するＥＬＩＳＡ法の確立に関しては、ＬＰＳｐに対して特異的に反応する２種類の抗体でLPSｐを挟み込むサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、高純度ＬＰＳｐのみでなく、他のＬＰＳの代表として用いた大腸菌ＬＰＳの共存下においても、ＬＰＳｐを特異的に定量することが可能であり、さらに、ＬＰＳｐを添加する予定の米糠からの抽出液中においてもＬＰＳｐの定量が可能であることを明らかにした。

今回得た、モノクローナル抗体は、種々の実験系においてＬＰＳｐの特異的な検出に役立つものと期待される。具体的には、飼料中に含まれるＬＰＳｐ含量のＥＬＩＳＡによる定量法、ｐｇオーダーの濃度であることが予想される消化管等から吸収されたＬＰＳｐの生体試料中の濃度を定量可能とするＥＬＩＳＡによる定量法、インビボ、インビトロでのＬＰＳｐの生物活性の中和、細胞表面、細胞内、組織内等でのＬＰＳｐの局在、ＬＰＳｐに特異的に結合する因子の検索、パントエア・アグロメランスの検出等が考えられる。同様の方法を用いて酢酸菌特異的ＬＰＳ、キサントモナス菌特異的ＬＰＳ等食用となるグラム陰性菌或いは食用植物に共生するグラム陰性菌特異的ＬＰＳに対するモノクローナル抗体を樹立した。

パントエア・アグロメランスLPS特異的モノクローナル抗体
（１）パントエア・アグロメランスLPS特異的モノクローナル抗体の作成
１：免疫源の調製
パントエア・アグロメランスの菌体を生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌになるように懸濁し８０℃、３０分間加熱したものを加熱死菌とした。

２：感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）の作製
１で得た加熱死菌の完全フロイトアジュバントエマルジョンを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に一匹当り１×１０^８個投与した。２回目以降は加熱死菌の不完全フロイトアジュバントエマルジョンを、２週間間隔で３回腹腔内に投与した。最終免疫は、細胞融合の３日前に加熱死菌を腹腔内に一匹当り１×１０^８個投与した。

３：細胞融合
（Ａ）ミエローマ細胞の調製
ミエローマとして８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株化細胞であるＰ３Ｕ１細胞を用いた。Ｐ３Ｕ１細胞は予め１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２日おきに継代培養しておいた。

継代培養１日目のＰ３Ｕ１細胞を５０ｍｌ遠心管に移し、１０００ｒｐｍ、室温で７分間遠心した。上清液を取り除き、沈澱したＰ３Ｕ１細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。以上の操作で調製したＰ３Ｕ１細胞を次の細胞融合に用いた。

（Ｂ）感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）の調製
実施例１の２：に記載する方法に従って免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから無菌的に脾臓を摘出し、直径６ｃｍのプラスチックシャーレに入れた。このプラスチックシャーレにＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍｌ注ぎ入れ、摘出した脾臓を洗った。別に５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を入れた直径６ｃｍのプラスチックシャーレを２枚用意し、この中でさらに２回洗った。以上の洗浄操作をさらにクリーンベンチ内で同様に繰り返した。最後に移したシャーレの中で脾臓をつぶし、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させた。この細胞懸濁液を１５ｍｌの遠心管に移し、１０００ｒｐｍ、室温で７分間遠心し、上清を取り除いた。沈澱した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌに懸濁させ、そのまま室温で３分間静置した。遠心管の底に沈んだ組織片を吸い取らないように細胞懸濁液を５０ｍｌ遠心管に移した。以上の操作で調製した感作細胞群を次の細胞融合に用いた。

（Ｃ）細胞融合
（Ａ）で調製したＰ３Ｕ１細胞と（Ｂ）で調製した感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）を、Ｐ３Ｕ１細胞（細胞数）：感作細胞群（細胞数）＝１：５の割合で混和し、室温にて１０分間静置した。その後、１０００ｒｐｍ、室温で5分間遠心し上清を除去した。細胞の入った遠心管を回転させながら、細胞数２×１０^８個あたり１ｍｌ容量の５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を添加し、そのまま５０秒間回転を続けた。引き続き遠心管を回転させながら、１５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、さらに２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。細胞懸濁液を軽く混和し内溶液を均一にし、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を取り除き、細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン入りの培地に懸濁させた（感作細胞として２×１０^６個／ｍｌとした）。この細胞懸濁液を０．２ｍｌ／ウエルとなるように９６穴平底プレートにまいた。３７℃、５％ＣＯ_２下で静置しながら、７日間培養した。

４：ハイブリドーマの選択
３：で得られたハイブリドーマ細胞について、以下の操作を行った。
９６穴イムノプレートにＬＰＳｐ、大腸菌ＬＰＳを０．０５ｍｌ／ウエル入れ、４℃で一晩放置した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．３〜７．７、日水製薬製）に０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬工業製、Ｔｗｅｅｎ２０相当品）を添加した溶液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を入れ、室温で１時間放置し、抗体その他のタンパクの非特異的吸着を防止する。その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ウエルに、３：で得られたハイブリドーマ培養上清液０．０５ｍｌを入れ、室温で１時間放置した。次いで、該ウエルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したアルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、Ｍ、Ａ免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を０．０５ｍｌ／ウエルに入れ、室温で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌになるようにｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業製）を基質緩衝液に溶解した溶液を０．１ｍｌ／ウエル入れ、室温で１時間放置した後、２規定の水酸化ナトリウム水溶液０．０５ｍｌ／ウエルを入れてプレートミキサーで混和して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍの吸光度を測定した。上記測定により、ＬＰＳｐ、大腸菌ＬＰＳに対する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。

５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。

具体的には、４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの細胞数を数え、１個／０．２ｍｌ／ウエルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭｃｏｎｄｉｍｅｄＨ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまきこみ、３７℃、５％ＣＯ_２下で１０〜１４日間培養した。

得られたクローンを４に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、８種のモノクローナル抗体産生細胞が得られた。得られた８種の内６種が、ＬＰＳｐに対して特異的に反応するモノクローナル抗体であることを明らかにした。この６種のモノクローナル抗体の内、４種類（３２−Ｇ２、４−Ｅ１１（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−３２９）、２０−Ａ８、４９−Ｆ２）はＩｇＧであった。残りの２種類（８６−Ｆ１１、３４−Ｇ２（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−３３０））はＩｇＭであった。８種の内、残りの２種類（２９−F7,１０３−C3）は、合成リピドＡを含む全てのＬＰＳに対して同程度の強度の反応が認められたことから、リピドＡ部分に対するモノクローナル抗体と推定され、両抗体ともＩｇＭであった。

（２）パントエア・アグロメランスLPS特異的モノクローナル抗体を用いた定量試験
本発明のモノクローナル抗体を用いて、高純度のＬＰＳｐ標品の定量性について検討した。その後、他の種類のＬＰＳとＬＰＳｐが共存した場合においても、ＬＰＳｐを特異的に定量することが可能かどうかについて検討した。

具体的には、９６穴イムノプレートに実施例１の３：で得られたモノクローナル抗体３４−G２を０．０５ｍｌ／ウエル入れ、４℃で一晩放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３％ＢＳＡを入れ、室温で１時間放置し、抗体その他のタンパクの非特異的吸着を防止する。その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ウエルに段階希釈した高純度のＬＰＳｐを含むＰＢＳ溶液０．０５ｍｌを入れ、室温で１時間放置した。次いで、該ウエルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、実施例１の３：で得られたモノクローナル抗体４−Ｅ１１を０．０５ｍｌ／ウエル入れ、室温で１時間放置した。次いで、該ウエルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したアルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を０．０５ｍｌ／ウエルに入れ、室温で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌになるようにｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業製）を基質緩衝液に溶解した溶液を０．１ｍｌ／ウエル入れ、室温で１時間放置した後、２規定の水酸化ナトリウム水溶液を０．０５ｍｌ／ウエルを入れてプレートミキサーで混和して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＬＰＳｐが１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度であれば定量的に測定できた（表１）。このデータからＬＰＳｐ量と吸光度との関係は
吸光度値＝−７Ｅ−０６（ＬＰＳｐ濃度）^２＋０．００９３（ＬＰＳｐ濃度）
で表すことが出来た。
決定係数は、回帰分析によりＲ^２＝０．９９５であった。
この式から、未知のサンプル溶液の吸光度のデータに基づきサンプルのＬＰＳｐ含量を測定出来る。

さらに、ＬＰＳｐを含む小麦発酵抽出物（小麦を発酵させて細菌を培養することにより得られるエキス。詳しくは特許文献２参照。）を添加する予定の脱脂米糠と調製米糠より、熱水抽出した液を調製し、既知量のＬＰＳｐ（１６μｇ／ｍｌ）を添加した場合と無添加の場合についてそれぞれ測定した。その結果、脱脂米糠加熱抽出液と調製米糠加熱抽出液ではＬＰＳｐは検出されなかった。また、添加したサンプル量がほぼ１００％回収され１６μｇ／ｍｌになった。以上のことから、他の種類のＬＰＳとＬＰＳｐが共存した場合においても、ＬＰＳｐを特異的に定量することが可能であった（表２）。

（３）パントエア・アグロメランスLPS特異的モノクローナル抗体を用いた応用例
１：飼料中のパントエア・アグロメランスLPSの定量
本発明のモノクローナル抗体を用いた実施例２のＥＬＩＳＡ法に準じて、飼料（ＬＰＳｐを含む小麦発酵抽出物を添加した飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２）中に含まれるＬＰＳｐを特異的に定量可能か検討した。

具体的には、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２（ＬＰＳｐが含まれている）２ｇに蒸留水を加え、３０秒の撹拌（ボルテックスミキサー）を１０回行った後、５分間超音波処理（超音波洗浄機ＡＩＷＡＡＵ−１６Ｃ）を行い、２０ｍｌの懸濁液を調製した。この１ｍｌをマイクロチューブに分注し、微量遠心機にて遠心分離（室温、５０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清（サンプル溶液）を得た。得られたサンプル溶液を、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で３２０倍まで段階希釈し、実施例２と同様にＥＬＩＳＡ法で測定した。また、ＥＬＩＳＡ法による定量の信頼性を確認する目的で、上記のサンプル溶液に標準ＬＰＳｐ溶液を混合したＬＰＳｐ添加サンプル溶液（添加量ＬＰＳｐ濃度：４．０μｇ／ｍｌ）を調製し、測定に供した。さらに、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２からのＬＰＳｐの抽出が確実に行われたことを確認するために１ｇの飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２に１０μｇのＬＰＳｐを添加し、同様に抽出を行い、抽出確認用サンプル溶液を調整した。１００％抽出されれば、基サンプル（サンプル溶液）のＬＰＳｐ量に１μｇ／ｍｌ増加した値になる。

ＬＰＳｐのＥＬＩＳＡ法による測定結果を表３に示した。ＬＰＳｐ算出に用いた計算式は
吸光度値＝−８Ｅ−０５（ＬＰＳｐ濃度）^２＋０．０２３７（ＬＰＳｐ濃度）
決定係数：Ｒ^２＝０．９９９５
であった。

飼料から調整したサンプル溶液のＬＰＳｐ濃度は１．１μｇ／ｍｌと算出され、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２に含まれるＬＰＳｐ量は１１μｇ／ｇとなった。また、ＬＰＳｐ添加サンプル溶液のＬＰＳｐ添加量は４μｇ／ｍｌであり、もとから含まれているＬＰＳｐが１．１μｇ／ｍｌとなったので、理論上のＬＰＳｐ含有値は５．１μｇ／ｍｌとなる。実際の測定値は５．１μｇ／ｍｌとなり、理論値と一致した。また、抽出確認用サンプル溶液のＬＰＳｐ濃度は２．１μｇ／ｍｌとなった。基サンプルが１．１μｇ／ｍｌの濃度なので、添加し抽出された量は１μｇ／ｍｌ分となる。従って、抽出効率（実測抽出ＬＰＳｐ量／添加ＬＰＳｐ量×１００）は１００％であることが示された。

２：ウエスタンブロットによるパントエア・アグロメランスLPSの検出
本発明のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により、ＬＰＳｐを検出可能か検討した。本発明のモノクローナル抗体が、パントエア・アグロメランスLPS分子に特異的に結合するか否かを明らかにする目的でイムノブロット法を実施した。パントエア・アグロメランスLPS、大腸菌LPSのそれぞれ5μgをサンプル緩衝液と混ぜ、トリシンを用いたドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−PAGE）を行った。泳動後、LPSをゲルからポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（BIO-RAD社製）に、半湿式転写装置（セミドライブロッティング装置：SB-160、タイテック、日本）を用いて、80mAで90分間通電し転写した。転写後、PVDF膜は3%牛血清アルブミン(BSA)含有PBS溶液中で室温にて30分間、非特異的反応の防御（ブロッキング）した。その後、0.05%ツイーン２０(Tween 20)含有トリス緩衝生理食塩水（TBS：20mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl）にて５回洗浄操作を行った。洗浄後、一次抗体としてパントエア・アグロメランスのLPSに対するモノクローナル抗体（抗体番号３２−Ｇ２）を含む培養液を5ml加え、室温で60分間反応させた。その後、0.05%Tween 20含有トリス緩衝生理食塩水（TBS：20mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl）にて5回洗浄操作を行った。洗浄後、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ、Ｍ、Ａ免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を1％BSA含有PBS溶液で1000倍希釈したものを5ml加え室温で60分間反応させた。その後、0.05%Tween 20含有TBSにて５回洗浄操作を行った。洗浄後、発色基質0.0165% 5-ブロモ-4-クロロ-3インドリルリン酸（025-08651、和光純薬、日本）、0.033%ニトロブルーテトラゾリウム（N-6876、シグマ）を含むアルカリフォスファターゼ緩衝液(50mMTris HCl pH9.5、1mM MgCl₂)を5ml加え、青色のバンドが見えてきたところで、蒸留水中にPVDF膜を移し反応を停止した。その結果、パントエア・アグロメランスのLPSを泳動したレーンは青色のバンドが認められた。大腸菌LPSを泳動したレーンでは青色のバンドは認められなかった。以上の結果より、モノクローナル抗体（抗体番号３２−Ｇ２）は、パントエア・アグロメランスのLPSに特異的に結合し、ウエスタンブロッティングでパントエア・アグロメランスのLPSを特異的に検出出来ることが示された。

アセトバクター・アセチLPS特異的モノクローナル抗体
（１）アセトバクター・アセチLPS特異的モノクローナル抗体の作成
１：免疫源の調製
アセトバクター・アセチの菌体を生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌになるように懸濁し８０℃、３０分間加熱したものを加熱死菌とした。
２：感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）の作製
アセトバクター・アセチの菌体を用いて実施例１と同様に行った。
３：細胞融合
実施例１と同様に行った。
４：ハイブリドーマの選択
３：で得られたハイブリドーマ細胞について、実施例１と同様にアセトバクター・アセチＬＰＳに対する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを実施例１と同様に、クローニングした。

得られたクローンを４に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、１０種のモノクローナル抗体産生細胞がアセトバクター・アセチＬＰＳに対して特異的に反応するモノクローナル抗体であることを明らかにした。この１０種のモノクローナル抗体の内、1種類（5A-4/A-8・G-12）はＩｇＧであった。残りの9種類（1A-5/E-10・G-1、1G-10/B-11・E-1、4A-9/F-11・A-5（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−３２５）、5A-5/A-10・A10、5A-6/C-3・D-11、5E-7/E-11・C-12、6A-7/H-3・E-12、6C-9/F-7・E-11（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−３２６）、6G-6/H-3・C-12）はＩｇＭであった。

（２）アセトバクター・アセチLPS特異的モノクローナル抗体を用いた定量試験
本発明のモノクローナル抗体を用いて、高純度のアセトバクター・アセチＬＰＳ標品の定量性について検討した。その後、他の種類のＬＰＳとアセトバクター・アセチＬＰＳが共存した場合においても、アセトバクター・アセチＬＰＳを特異的に定量することが可能かどうかについて検討した。

具体的には、９６穴イムノプレートに実施例２の３：で得られたモノクローナル抗体5/E-10・G-1と5A-4/A-8・G-12を用いて実施例１と同様に行った。その結果、アセトバクター・アセチLPSが1.6ｎｇ／ｍｌ以上の濃度であれば定量的に測定できた（表４）。このデータからアセトバクター・アセチＬＰＳ量と吸光度との関係は
吸光度値＝−6.989Ｅ−05（アセトバクター・アセチLPS濃度）^２＋0.02511（アセトバクター・アセチLPS濃度）＋0.002402
で表すことが出来た。
決定係数は、回帰分析によりＲ^２＝０．９９９５であった。
この式から、未知のサンプル溶液の吸光度のデータに基づきサンプルのアセトバクター・アセチＬＰＳ含量を測定出来る。

さらに、既知量のアセトバクター・アセチLPSを脱脂米糠と調整米糠に添加し、熱水抽出した液を調製し、アセトバクター・アセチLPS量を測定した。その結果、脱脂米糠加熱抽出液と調整米糠加熱抽出液ではアセトバクター・アセチLPSは検出されなかった。また、添加したサンプル量がほぼ１００％回収された。以上のことから、他の種類のＬＰＳとアセトバクター・アセチLPSが共存した場合においても、アセトバクター・アセチLPSを特異的に定量することが可能であった（表５）。

（３）アセトバクター・アセチLPS特異的モノクローナル抗体を用いた応用例
１：飼料中のアセトバクター・アセチLPSの定量
本発明のモノクローナル抗体を用いた実施例２のＥＬＩＳＡ法に準じて、飼料（アセトバクター・アセチLPSを含む小麦発酵抽出物を添加した飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２）中に含まれるアセトバクター・アセチLPSを特異的に定量可能か検討した。

具体的には、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２（アセトバクター・アセチLPSが含まれている）を用いて実施例１と同様に行った。アセトバクター・アセチLPSのＥＬＩＳＡ法による測定結果を表６に示した。アセトバクター・アセチLPS算出に用いた計算式は
吸光度値＝-5.706E-05（アセトバクター・アセチLPS濃度）^２＋0.02212（アセトバクター・アセチLPS濃度）＋0.01192
決定係数：Ｒ^２＝0.9996であった。

飼料から調整したサンプル溶液のアセトバクター・アセチLPS濃度は1.0μｇ／ｍｌと算出され、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２に含まれるアセトバクター・アセチLPS量は10μｇ／ｇとなった。また、アセトバクター・アセチLPS添加サンプル溶液のアセトバクター・アセチLPS添加量は4μｇ／ｍｌであり、もとから含まれているアセトバクター・アセチLPSが1.0μｇ／ｍｌとなったので、理論上のアセトバクター・アセチLPS含有値は5.0μｇ／ｍｌとなる。実際の測定値は5.0μｇ／ｍｌとなり、理論値と一致した。また、抽出確認用サンプル溶液のアセトバクター・アセチLPS濃度は2.0μｇ／ｍｌとなった。基サンプルが1.0μｇ／ｍｌの濃度なので、添加し抽出された量は1.0μｇ／ｍｌ分となる。従って、抽出効率（実測抽出アセトバクター・アセチLPS量／添加アセトバクター・アセチLPS量×１００）は100％であることが示された。

キサントモナスLPS特異的モノクローナル抗体
（１）キサントモナスLPS特異的モノクローナル抗体の作成
１：免疫源の調製
キサントモナスの菌体を生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌになるように懸濁し８０℃、３０分間加熱したものを加熱死菌とした。
２：感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）の作製
キサントモナスの菌体を用いて実施例１と同様に行った。
３：細胞融合
実施例１と同様に行った。
４：ハイブリドーマの選択
３：で得られたハイブリドーマ細胞について、実施例１と同様にキサントモナスＬＰＳに対する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを実施例１と同様に、クローニングした。

得られたクローンを４に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、２２種のモノクローナル抗体産生細胞がキサントモナスＬＰＳに対して特異的に反応するモノクローナル抗体であることを明らかにした。この２２種のモノクローナル抗体の内、６種類（1-1A1H9F9, 1-2F5E11F5, 2-2D4G5C1（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−３２８）, 2-4B2G1E6, 2-10D1D1E4, 2-10A10G2B2）はＩｇＧであった。残りの１６種類（1-2G5A6G1, 1-3B6C10H1, 1-3D11G6C2, 1-5F9F11F1, 1-7A1E12F5（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−３２７）, 1-7C6C10G6, 1-7C9C9A8, 1-9F5A9C2, 1-9D11B9E6F5E11, 2-1H8F4B1, 2-3A11F9E11, 2-7G2E1C3, 2-7G10B8A6, 2-8F7F4G4, 2-10A3Ｇ6E5, 2-10E12C11C6）はＩｇＭであった。

（２）キサントモナスLPS特異的モノクローナル抗体を用いた定量試験
本発明のモノクローナル抗体を用いて、高純度のキサントモナスＬＰＳ標品の定量性について検討した。その後、他の種類のＬＰＳとキサントモナスＬＰＳが共存した場合においても、キサントモナスＬＰＳを特異的に定量することが可能かどうかについて検討した。

具体的には、９６穴イムノプレートに実施例２の３：で得られたモノクローナル抗体1-7A1E12F5と2-4B2G1E6を用いて実施例１と同様に行った。その結果、キサントモナスLPSが１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度であれば定量的に測定できた（表７）。このデータからキサントモナスＬＰＳ量と吸光度との関係は
吸光度値＝−9.437Ｅ−05（キサントモナスLPS濃度）^２＋0.0266（キサントモナスLPS濃度）＋0.002441
で表すことが出来た。
決定係数は、回帰分析によりＲ^２＝0.9998であった。
この式から、未知のサンプル溶液の吸光度のデータに基づきサンプルのキサントモナスＬＰＳ含量を測定出来る。

さらに、既知量のキサントモナスLPSを脱脂米糠と調整米糠に添加し、熱水抽出した液を調製し、キサントモナスLPS量を測定した。その結果、脱脂米糠加熱抽出液と調整米糠加熱抽出液ではキサントモナスLPSは検出されなかった。また、添加したサンプル量がほぼ１００％回収された。以上のことから、他の種類のＬＰＳとキサントモナスLPSが共存した場合においても、キサントモナスLPSを特異的に定量することが可能であった（表８）。

（３）キサントモナスLPS特異的モノクローナル抗体を用いた定量法の応用例：飼料中のキサントモナスLPSの定量
本発明のモノクローナル抗体を用いた実施例２のＥＬＩＳＡ法に準じて、飼料（キサントモナスLPSを含む小麦発酵抽出物を添加した飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２）中に含まれるキサントモナスLPSを特異的に定量可能か検討した。

具体的には、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２（キサントモナスLPSが含まれている）を用いて実施例１と同様に行った。キサントモナスLPSのＥＬＩＳＡ法による測定結果を表９に示した。キサントモナスLPS算出に用いた計算式は
吸光度値＝-1.172E-05（キサントモナスLPS濃度）^２＋0.008904（キサントモナスLPS濃度）-0.0003557
決定係数：Ｒ^２＝1.000
であった。

飼料から調整したサンプル溶液のキサントモナスLPS濃度は1.0μｇ／ｍｌと算出され、飼料用プレミックスＦＦＰ−ＥＡ２に含まれるキサントモナスLPS量は10μｇ／ｇとなった。また、キサントモナスLPS添加サンプル溶液のキサントモナスLPS添加量は4μｇ／ｍｌであり、もとから含まれているキサントモナスLPSが1.0μｇ／ｍｌとなったので、理論上のキサントモナスLPS含有値は5.0μｇ／ｍｌとなる。実際の測定値は5.0μｇ／ｍｌとなり、理論値と一致した。また、抽出確認用サンプル溶液のキサントモナスLPS濃度は2.0μｇ／ｍｌとなった。基サンプルが1.0μｇ／ｍｌの濃度なので、添加し抽出された量は1.0μｇ／ｍｌ分となる。従って、抽出効率（実測抽出キサントモナスLPS量／添加キサントモナスLPS量×１００）は100％であることが示された。

２：ウエスタンブロットによるキサントモナスLPSの検出
本発明のモノクローナル抗体（抗体番号1-7 A1 E12 F5）を用いたウエスタンブロット法により、キサントモナスLPSを検出可能か実施例１の(3)の2と同様に検討した。その結果、キサントモナスのLPSを泳動したレーンは青色のバンドが認められ、対照に用いた大腸菌LPS、パントエア・アグロメランスLPSとは青色のバンドが認められなかった。以上の結果より、モノクローナル抗体（抗体番号1-7 A1 E12 F5）は、キサントモナスのLPSに特異的に結合し、ウエスタンブロッティングで特異的にキサントモナスのLPSを検出出来ることが示された。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

受託番号がＮＩＴＥＢＰ−３２５、ＮＩＴＥＢＰ−３２６、ＮＩＴＥＢＰ−３２７、ＮＩＴＥＢＰ−３２８、ＮＩＴＥＢＰ−３２９又はＮＩＴＥＢＰ−３３０であることを特徴とするハイブリドーマ。
請求項１記載のハイブリドーマにより産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。
請求項２記載のモノクローナル抗体を用いることによってアセトバクター・アセチ、キサントモナス又はパントエア・アグロメランスのリポ多糖を定量することを特徴とするリポ多糖の定量方法。