JP5216072B2 - 神経細胞特異的な逆行性輸送ベクター - Google Patents
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Description
[態様1]
(1)HIV-1のgag 及びpol遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(2)HIV-1のアクセサリー遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(3)目的遺伝子を含むトランスファープラスミド;及び
(4)エンベロープ遺伝子として、狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメインのN末端領域及び水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G)の細胞外ドメインのC末端領域から成る融合細胞外ドメイン、RV-G又はVSV-Gの膜貫通ドメイン、並びに、VSV-Gの細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、を含む逆行輸送性ウィルスベクター調製用キット。
[態様2]
態様1のウィルスベクター調製用キット、及び、宿主細胞を含む、プロデューサー細胞作製用キット。
[態様3]
態様1のウィルスベクター調製用キットに含まれる、パッケージングプラスミド、トランスファープラスミド、及び、エンベローププラスミドを感染細胞にコトランスフェクションさせることから成る、プロデューサー細胞の作製方法。
[態様4]
態様3で得られたプロデューサー細胞。
[態様5]
態様3のプロデューサー細胞を培養し、培養上清からウィルス粒子を回収することからなる、ウィルスベクターの製造方法。
[態様6]
態様5の方法によって製造された、神経細胞への選択的な逆行性輸送能を有するウィルスベクター。
[態様7]
態様6のウィルスベクターを動物の神経終末部に感染させ、該ウィルスベクターが該神経の軸索を逆行性に輸送されることにより脳内の標的領域にある該神経の神経細胞体に選択的に導入し、目的とする遺伝子を該神経細胞体内で発現させることから成る、遺伝子導入方法。
[態様8]
態様6のウィルスベクターを活性成分として含有する、遺伝子治療剤。
[態様9]
態様7方法で導入された目的遺伝子が標的領域における細胞の染色体に組み込まれ発現することを含む、脳疾患の遺伝子治療方法。
[態様10]
狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメインのN末端領域及び水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G)の細胞外ドメインのC末端領域から成る融合細胞外ドメイン、RV-G又はVSV-Gの膜貫通ドメイン、並びに、VSV-Gの細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドから成る、レンチウィルスベクターのシュードタイプ化用のエンベロープ。
[態様11]
態様10の融合ポリペプチドから成るエンベロープをコードする遺伝子。
[態様12]
態様11の遺伝子を含むエンベローププラスミド。
かかるウィルスベクターは、以下の調製用キットを用いて調製することが出来る:
(1)HIV-1のgag 及びpol遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(2)HIV-1のアクセサリー遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(3)目的遺伝子を含むトランスファープラスミド;及び
(4)エンベロープ遺伝子として、狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメインのN末端領域及び水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G)の細胞外ドメインのC末端領域から成る融合細胞外ドメイン、RV-G又はVSV-Gの膜貫通ドメイン、並びに、VSV-Gの細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、を含む逆行輸送性ウィルスベクター調製用キット。
「発現制御下」とは、所定のアミノ酸配列をコードしたDNAが、所定の条件下で、そのアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させる能力を有するという意味である。所定のアミノ酸配列をコードしたDNAが発現調節配列の発現制御下に結合されていると、そのDNAは、所定の条件下で、所定のタンパク質を発現するということになる。ここで、「発現調節配列」とは、他の核酸配列の発現を調節する核酸配列のことを意味しており、他の核酸配列の転写、及び、好ましくは翻訳をも制御及び調節する。発現調節配列には、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン(すなわちATG)、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドンが含まれる。
本発明のウィルスベクターを、St. Jude Children’s Research Hospital のArthur Nienhuis博士によって開発されたHIV-1ベクター系を利用して調製した。即ち、gag及び pol遺伝子を含むパッケージングプラスミド(pCAGkGP1.1R)、アクセサリー遺伝子を含むパッケージングプラスミド(pCAG4-RTR2)、及び、目的遺伝子として緑色蛍光蛋白質(GFP)を含むトランスファープラスミド(pCL20c-MSCV-GFP)を使用した。
同様に、エンベローププラスミドとしてVSV-G及び RV-Gを用いて比較用のウィルスベクターを作製した。
これらのプラスミドを含むウィルスベクター溶液を、HEK293T細胞(10-cm ディッシュ、18枚)へリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。48時間培養後、培養上清よりウィルス粒子を回収し、遠心し、これを0.45 μmセルロースフィルターでろ過した。次に、ベクター粒子を遠心分離(10,000 X g、16-18時間)によって回収し、1 mlのPBSに懸濁した。懸濁液をSepharose Q FFイオン交換カラムクロマログラフィーにかけ、PBSで洗浄後、0-1.5 M NaClの直線勾配により溶出し、分画を260/280 nmの吸光度でモニターした。ベクター粒子を含む分画を集め、限外濾過フィルターを用いて濃縮し、-80℃で保存した。
動物の飼育及び取り扱い操作は福島県立医科大学の動物実験委員会が制定したガイドラインに基づき実施した。
12週齢マウス(C57BL/6J)をペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg, i.p.)で麻酔し、上記で作製したベクターを含む溶液(4.8 X 1010 copies/ml)を、マウスの脳内(線条体)に脳定位固定装置を利用して、マウス脳アトラス(PAXINOS, G., and FRANKLIN, K.B.J. (2001). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd edn. (Academic Press, San Diego))に従い、マイクロインジェクションポンプに連結したガラスマイクロインジェクションキャピラリーを介して線条体(striatum)の背部領域(dorsal region)にトラック上2箇所、1箇所あたり 2 μl の溶液を注入した(0.1 μl/min)。ブレグマ(bregma)からの前後(anteroposterior)、内外側(mediolateral)、及び背腹(dorsoventral)の方向の座標は、夫々、0.50 、2.00及び2.50/3.25(mm)であった。
FuG-Cベクターの注入部位における神経細胞とグリア細胞への遺伝子導入効率を解析した。各ウィルスベクター(VSV-G, RV-G, FuG-C)(1.2 X 1010 copies/ml) をマウス線条体内に注入した後、脳切片を作製し溶液 (1.2 X 1010 コピー/ml) を実施例2と同様にマウスの線条体に注入後、線条体の切片を作製し、神経細胞のマーカーであるNeuNとGFPあるいはグリア細胞のマーカーであるGFAPとGFPの二重免疫染色を行った(図5)。線条体の神経細胞とグリア細胞への遺伝子導入効率を評価するために、まず、全NeuN+ 細胞数あたりのGFP+/NeuN+ 二重陽性細胞数、及び、全GFAP+ 細胞数あたりのGFP+/GFAP+ 二重陽性細胞数の割合を求めた。GFP+/NeuN+ 二重陽性細胞数の割合は、VSV-G-, RV-G-, FuG-Cベクターで、それぞれ81.7 + 2.9%, 21.4 + 1.8%, 及び6.2 + 1.4% であった (n = 4)。FuG-Cベクターの線条体神経細胞への遺伝子導入効率は、他のベクターに比較して顕著に低下したANOVA, Tukey HSD, p < 0.001 vs VSV-G, p < 0.01 vs RV-G)。一方、GFP+/GFAP+ 二重陽性細胞数の割合は、VSV-G-, RV-G-, FuG-Cベクターで、それぞれ5.9 + 0.7%, 71.5 + 3.6%, 及び0.3 + 0.03%であった (n = 4)。したがって、グリア細胞への遺伝子導入はほとんど観察されなかった。これらの結果は、FuG-Cベクターは主に逆行性輸送を介して神経細胞へ選択的に遺伝子導入されることを示している。
VSV-Gベクターは神経幹細胞への高い遺伝子導入効率を示すことが知られている。脳室周囲領域 (SVZ) に局在する神経幹細胞への各種ベクターの遺伝子導入特性について解析した。ウィルスベクター溶液 (1.2 X 1010 コピー/ml)をマウスのSVZに注入後、脳切片を作製し、神経幹細胞のマーカーとしてGFAPを用い、GFAPとGFPの二重免疫染色を行った(図6A)。VSV-GあるいはRV-Gベクターを注入した場合、導入遺伝子の発現はSVZにおける多数のGFAP陽性神経幹細胞に観察された。一方、FuG-Cベクターを用いた場合は、これらの神経幹細胞への遺伝子導入はほとんど認められなかった。また、分裂性細胞を検出するために、BrdUを投与して標識し、1週間後に脳切片を作製しBrdUとGFPとの二重免疫染色をおこなった(図6B)。VSV-GあるいはRV-Gベクターを注入した場合、導入遺伝子の発現はSVZにおける多数の分裂性細胞に観察されたが、FuG-Cベクターを用いた場合は、これらの分裂細胞への遺伝子導入はほとんど認められなかった。これらの結果から、FuG-Cベクターの神経幹細胞及び分裂細胞への遺伝子導入は非常に低頻度であることが示された。
アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法による免疫染色用に、クライオスタットを用いて横断切片(マウス用:厚さ30 μm)を調製し、ウサギ抗GFPポリクローナル抗体(Molecular Probes, Eugene, OR:1:2,000 希釈)でインキュベートし、更に、ビオチニル化ヤギ抗ウサギIgG抗体(Vector Laboratories, Burlingame, CA:1:1,000希釈)とインキュベートした。免疫反応シグナルはVectastain Elite ABC キット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)で視覚化した。
前脳及び中脳を通る一連の切片を使用して、上記のアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法による免疫染色を実施した。各脳領域における免疫染色された細胞の数はコンピュータ操作による画像プログラム(NIH Image 1.62, National Institutes of Health, Bethesda, MD)で計測した。ベクター注入部位における線条体細胞の同定の為に、代表的な切片を用いて二重免疫蛍光組織化学染色を行った。各動物において、対象領域内の免疫染色細胞数を画像プログラムにより計測した。各動物からの8〜10個の切片を使用して計測し、切片辺りの平均を計算した。
更に、本発明は、脳神経疾患の遺伝子治療のための有効な且つ安全性の高い実験技術、及び、病態モデルの作製のための技術を提供するものである。
Claims (28)
- (1)HIV-1のgag 及びpol遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(2)HIV-1のアクセサリー遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(3)目的遺伝子を含むトランスファープラスミド;及び
(4)狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメインのN末端領域及び水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G)の細胞外ドメインのC末端領域から成る融合細胞外ドメイン、RV-G又はVSV-Gの膜貫通ドメイン、並びに、VSV-Gの細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子であって、配列番号2に示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列から成るエンベロープ遺伝子を含むエンベローププラスミド、を含む逆行輸送性ウィルスベクター調製用キット。 - パッケージングプラスミド(1)がpCAGkGP1.1Rであり、パッケージングプラスミド(2)がpCAG4-RTR2であり、且つ、トランスファープラスミドがpCL20c-MSCV-X(ここで、「X」は目的遺伝子を示す)であることを特徴とする、請求項1記載のウィルスベクター調製用キット。
- エンベローププラスミドにおいて、エンベロープ遺伝子がサイトメガロウィルスエンハンサー及びトリβアクチンプロモーターの制御下で発現する、請求項1又は2記載のウィルスベクター調製用キット。
- 融合ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列が配列番号1に示されたものである、請求項3記載のウィルスベクター調製用キット。
- 目的遺伝子がヒトの遺伝子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のウィルスベクター調製用キット。
- 目的遺伝子が脳神経疾患治療用の遺伝子である、請求項5に記載のウィルスベクター調製用キット。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のウィルスベクター調製用キット、及び、宿主細胞を含む、プロデューサー細胞作製用キット。
- 宿主細胞がHEK293T細胞である、請求項7記載のキット。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のウィルスベクター調製用キットに含まれる、パッケージングプラスミド、トランスファープラスミド、及び、エンベローププラスミドを感染細胞にコトランスフェクションさせることから成る、プロデューサー細胞の作製方法。
- 感染細胞がHEK293T細胞である、請求項9記載の作製方法。
- リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションする、請求項9又は10記載の作製方法。
- 請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法で得られたプロデューサー細胞。
- 請求項12記載のプロデューサー細胞を培養し、培養上清からウィルス粒子を回収することからなる、ウィルスベクターの製造方法。
- 請求項13記載の方法によって製造された、神経細胞への選択的な逆行性輸送能を有するウィルスベクター。
- 請求項14記載のウィルスベクターをヒト以外の動物の神経終末部に感染させ、該ウィルスベクターが該神経の軸索を逆行性に輸送されることにより脳内の標的領域にある該神経の神経細胞体に選択的に導入し、目的とする遺伝子を該神経細胞体内で発現させることから成る、遺伝子導入方法。
- 神経終末部が線条体にあり、脳内の標的領域が線条体に投射する脳中枢領域である、請求項15記載の遺伝子導入方法。
- 線条体に投射する脳中枢領域が一次運動皮質、一次体性感覚皮質、視床束傍核、及び/又は、黒質緻密部である、請求項16記載の方法。
- 腹側線条体(側坐核)に投射する脳中枢領域が梨状皮質、鉤状回、扁桃体基底外側核、室傍核前部、視床背内側核、及び/又は、外側視床下部である、請求項16記載の方法。
- 動物が哺乳類である、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳類が霊長類である、請求項19記載の方法。
- 請求項14記載のウィルスベクターを活性成分として含有する、遺伝子治療剤。
- 請求項15〜20のいずれか一項に記載の方法で導入された目的遺伝子が標的領域における細胞の染色体に組み込まれ発現することを含む、脳疾患の遺伝子治療方法。
- 請求項21記載の遺伝子治療剤をヒト以外の動物に投与することを含む、請求項22記載の治療方法。
- 脳疾患がパーキンソン病である、請求項22又は23記載の治療方法。
- 狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメインのN末端領域及び水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G)の細胞外ドメインのC末端領域から成る融合細胞外ドメイン、RV-G又はVSV-Gの膜貫通ドメイン、並びに、VSV-Gの細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドであって配列番号2に示されたアミノ酸配列から成る、レンチウィルスベクターのシュードタイプ化用のエンベロープ。
- レンチウィルスベクターがHIV-1レンチウィルスである、請求項25記載のエンベロープ。
- 請求項25又は26記載の融合ポリペプチドから成るエンベロープをコードする遺伝子。
- 請求項27記載の遺伝子を含むエンベローププラスミド。
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