JP5213265B2 - Ｌｏｘ−１発現調節剤の評価又は選択方法 - Google Patents

Description

本発明は、Lox-1発現調節剤の評価又は選択方法に関する。

血管内皮細胞が血管全体の機能を調節している重要な細胞であることが、近年の研究により明らかになっている。例えば、血管内皮から放出される代表的な血管弛緩物質である一酸化窒素（ＮＯ）は、血管の恒常性を保つ上で特に重要な要素である。ＮＯは、動脈硬化の過程で起こる平滑筋の増殖、白血球の接着、血小板の凝集に対して抑制的に働き、また高血圧や高脂血症、糖尿病などの病態を有し、動脈硬化の危険性のあるヒトや動物では、血管内皮からのＮＯ放出が減少していることが知られている。

動脈硬化を基盤とした心血管疾患等の循環器疾患は，血管内皮傷害からはじまる炎症性疾患としてとらえることができる。これまでの基礎的及び臨床研究より、糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満といった冠動脈危険因子の存在下では、酸化ストレスが亢進していることが見出されている。酸化ストレスは活性酸素産生系と消去系との不均衡にて生じ、亢進した酸化ストレスは血管内皮傷害の直接的な要因となる。またＬＤＬの酸化的修飾により生成された酸化ＬＤＬもまた、内皮機能障害を引き起こす。従って、酸化ＬＤＬは内皮機能障害因子として循環器疾患の病因となる。

これらの酸化ＬＤＬの作用には、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（lectin-like oxidized LDL receptor-1：LOX-1）が関与していることが知られている。また、LOX-1の発現は炎症性サイトカインや、高血圧、高脂血症、糖尿病などの動脈硬化の危険因子によって容易に亢進することから、LOX-１は動脈硬化の進行にも関与している可能性がある。さらにLOX-１は酸化ＬＤＬのほかに酸性リン脂質を介して血栓形成に何らかの形で関わっている可能性がある。LOX-１の活性化を抑制することができれば、血管内皮細胞の機能障害を抑制し、ひいては糖尿病、循環器疾患、メタボリックシンドローム等の疾患を予防又は治療できる可能性がある。

従来、LOX-１発現量を調節する物質を評価する方法としては、培養細胞を用いるin vitroでの方法が知られている（特許文献１、２）。あるいは、高血圧モデル動物を用いるin vivoでの方法によりLOX-１発現量を測定することができる（非特許文献１）。しかし、モデル動物を用いる場合、生体内でのLOX-１発現量をより直接的に評価できるという利点がある一方で、動物が高血圧を発症するまでに少なくとも数週間飼育する必要があるため、評価結果を得るまでに多大な時間を要するという欠点があった。

特開２００７−３２０９５６号公報 特開２００７−２９７３８１号公報

Nagase et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 237:496-498, 1997

本発明は、in vivoでレクチン様酸化ＬＤＬ受容体（lectin-like oxidized LDL receptor-1：LOX-1）の発現を調節する物質を簡易且つ迅速に評価又は選択する方法を提供することに関する。

本発明者らは、睡眠障害モデル動物において、LOX-1の発現が睡眠障害負荷後、短期間で顕著に増加すること、当該モデルを用いることによりLOX-1発現調節剤の迅速な評価又は選択が可能となることを見出した。

すなわち、本発明は、下記の１）〜４）に係るものである。
１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（LOX-1）発現調節剤の評価又は選択方法。
（Ａ）被験物質を実験動物に投与する工程
（Ｂ）当該動物に睡眠障害を負荷する工程
（Ｃ）当該動物におけるLOX-1発現量を測定し、その変化を評価する工程
２）睡眠障害の負荷がレム睡眠阻害である１）記載の方法。
３）レム睡眠阻害がプラットホーム法による睡眠阻害である２）記載の方法。
４）実験動物がラット又はマウスである１）〜３）のいずれか１に記載の方法。

本発明によれば、睡眠障害モデル動物を用いることにより、生体内のLOX-1発現に影響を調節し得る物質を短期間にスクリーニングすることが可能になる。本発明の方法は、高血圧モデル動物を使用する従来のスクリーニング方法と比較してより迅速且つ簡便である。また本発明によれば、高価な高血圧モデル動物を使用する必要がないためより安価なスクリーニングが実現できる。従って、本発明は、血管内皮障害、及びそれに起因する動脈硬化、脳血管疾患や心血管疾患等の循環器疾患、メタボリックシンドローム等の各種疾患の予防又は改善剤の簡便、迅速且つ安価なスクリーニング法として有用である。

レム睡眠阻害動物の胸部大動脈におけるLOX-1及びCD36発現。

後記実施例に示すとおり、睡眠障害を誘発した動物モデルにおいて、胸部大動脈におけるLOX-1の発現量は睡眠障害負荷後短期間で増加した。一方、同じく酸化ＬＤＬ受容体であるCD36の発現量には変化が生じなかった。すなわち、睡眠障害モデル動物は、生体内でのLOX-1の発現動態を評価するための有用なモデルである。

本発明のLOX-1発現調節剤の評価又は選択方法は、（Ａ）被験物質を実験動物に投与する工程；（Ｂ）当該動物に睡眠障害を負荷する工程；及び（Ｃ）当該動物におけるLOX-1発現量を測定し、その変化を評価する工程、を含むことを特徴とする。本発明において用いられる実験動物としては、睡眠障害のモデルとして使用可能な実験小動物であればよいが、例えばマウス、ラット、モルモット等げっ歯類が好ましい。

工程（Ａ）で動物に投与される被験物質としては、LOX-1発現調節作用を有することが期待される物質であれば、特に限定されない。被験物質の投与時期は、目的に応じて適宜選択すれば良く、実験動物に睡眠障害を負荷する前でも後でもよく、或いは睡眠障害の負荷と並行して行うことでも良い。例えば、被験物質を実験動物に睡眠障害を負荷する前に投与した場合、LOX-1発現抑制剤又はLOX-1発現上昇予防剤を評価又は選択することができ、被験物質を実験動物に睡眠障害を負荷する後に投与した場合、LOX-1発現低下剤又はLOX-1発現上昇改善剤を評価又は選択することができるが、本発明の方法によるLOX-1発現上昇予防・改善剤の評価または選択の手順は上記に限定されない。投与方法は、経口投与、及び経皮投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、尾静脈投与、腹腔内投与等非経口投与の何れでもよいが、好ましくは経口投与である。

工程（Ｂ）において動物に負荷される「睡眠障害」としては、睡眠の生体における意義を検討する目的で考案されている公知の睡眠障害方法によって誘発される睡眠障害が挙げられ、このうちレム睡眠を阻害するものが好ましい。
公知の睡眠障害方法としては、以下に示すような方法が挙げられるが、中でもプラットホーム法を用いるのが好ましい。
１）プラットホーム法（Youngblood BD et al. Physiol Behav. 67(5) 643-649,(1999)）。プラットホーム法は、フラワーポット法とも呼ばれ、代表的な睡眠阻害方法である。この方法は睡眠のなかでもレム睡眠を比較的特異的に阻害できる方法である。この方法は、ケージの中に水を張り、実験動物がのることができる小さな円柱の台（プラットホーム）を設置するものである。動物はプラットホーム上で休むことができるが、レム睡眠に入ると筋肉が弛緩するため体勢が崩れ水面に体が触れることから、動物はノンレム睡眠をとることはできるが、レム睡眠をとることができない状態になる。
具体的な例としては、ラットを用いる場合、直径６〜７ｃｍのステンレス製の円柱をラット飼育用アクリル樹脂性ケージに入れ、円柱の上部より１〜２ｃｍ下まで水を張る。これに、２５０〜４００ｇのラットを１匹ずつ入れ、飼育する。このときラットが餌と飲用水を自由に摂取することができるようにする。

２）トレッドミル又はディスク法（Guzman-Marin R et al. Eur J Neurosci. 22(8):2111-2116 (2005)、Everson CA et al. Am J Physiol Endocrinol Metab. 286:1060-1070 (2004)）。この方法は、ケージの中に、トレッドミル又は回転するディスクを入れておき、定期的にトレッドミルまたはディスクを稼動させることにより、睡眠を阻害する方法である。

３）飼育中に騒音を出して睡眠を阻害する方法（Rabat A et al. Brain Res. 1059:82-92 (2005)）。この方法は、振動数が２０〜３００ヘルツで強さが７０〜８０デシベルの音を不定期にスピーカーより流し、睡眠を阻害するものである。

４）動物に対するハンドリングにより睡眠を阻害する方法（Toru M et al. Pharmacol Biochem Behav. 20(5):757-761 (1984)）。この方法は、動物が睡眠に入ろうとするときに手で触ることにより睡眠を阻害するものである。

睡眠障害負荷の期間は、睡眠障害の方法によっても異なり、通常１日〜５日程度であるが、プラットホーム法を用いた場合、LOX-1発現は、睡眠障害負荷後２日で有意に増加することから、２日程度であればよい。

工程（Ｃ）におけるLOX-1発現量の測定は、生体から採取した試料中のLOX-1発現量を任意の方法で測定すればよい。試料としては、心血管組織、腎臓、肝臓、筋肉等の組織が挙げられ、血管が好ましい。LOX-1発現量測定法としては、ｍＲＮＡ、タンパク質発現を測定する方法が挙げられ、ｍＲＮＡ発現量の測定が好ましい。発現量の測定方法としては、各種イムノアッセイ、ノサンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、ディファレンシャルデスプレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、プロテインマイクロアレイ、ＳＡＧＥ等の任意の公知の方法が挙げられる。

測定したLOX-1発現量を、被験物質投与前後、あるいは被験物質投与群と被験物質非投与又は対照物質投与群（対照群）の間で比較することで、LOX-1発現に対する被験物質の効果を評価することができる。例えばLOX-1発現量が対照群と比較して被験物質投与群で統計的に有意に高い又は低い場合、該被験物質をLOX-1発現調節剤として評価又は選択することができる。また例えば、LOX-1発現量が対照群と比較して被験物質投与群で統計的に有意に低い場合、該被験物質をLOX-1発現抑制剤として評価又は選択することができる。

斯くして選択されたLOX-1発現調節剤は、生体内におけるLOX-1発現を調節し、結果として生体内における酸化LDLの活性を調節し得る物質である。斯かるLOX-1発現調節剤は、血管内皮細胞の状態の変化によって引き起こされる疾患または症状の予防、治療又は改善に有用である。特に、LOX-1発現抑制剤は、血管内皮細胞障害によって引き起こされる疾患又は症状、例えば、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、脳血管障害、血管狭窄、末梢血管疾患、動脈瘤、高脂血症、高コレステロール血症、肥満、メタボリックシンドローム等の予防、治療又は改善のための医薬品、医薬部外品又は食品に有効成分として配合して使用するための素材となり得るものである。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１：睡眠障害誘発動物におけるLOX-1発現量の測定
１.方法
ＳＤラット（１０〜１１週齢、日本ＳＬＣより購入）を体重が等しくなるように群分けした。レム睡眠阻害群（Ｎ＝６）は、ラットが休息できる直径６．０ｃｍ高さ２．５ｃｍの円柱プラットホームが設置され、プラットホームの１ｃｍ下まで水を張ったケージで個別（１匹/１ケージ）飼育した。コントロール群（Ｎ＝４）は通常のケージで個別飼育した。飼育期間は２日間であった。飼育後、ラットをフォーレン（大日本住友製薬）による深麻酔下で脱血した後、胸部大動脈を採取し、RNAlater(キアゲン)中で使用まで-２０℃で保存した。
保存された胸部大動脈よりRNeasy Mini kit（キアゲン）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡからオリゴｄＴプライマー（インビトロジェン）とMMLV RT（インビトロジェン）を用いて逆転写反応(３７℃、１時間)を行い、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡからTaqMan（登録商標）プローブ及びPCRプライマーを用いたReal-Time fast PCR法によりLOX-1とCD36のｍＲＮＡ発現量を測定した。なお発現量は36B4遺伝子（内部コントロール）量に対する相対値として検出した。またTaqMan（登録商標）プローブ及びPCRプライマーはTaqMan（登録商標）gene expression assay（アプライドバイオシステムズ）提供のものを用いた。使用したTaqMan（登録商標）プローブは以下のとおり：LOX-1; Rn00591116_m1、CD36; Rn00580728_m1、36B4; Rn00821065_g1。

２．結果
コントロール群に比べてレム睡眠阻害群の胸部大動脈ではLOX-1の遺伝子発現量が有意に増加した。一方、CD36遺伝子発現量は有意な変化が認められなかった(図１)。

Claims (4)

1. 以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（LOX-1）発現調節剤の評価又は選択方法。
   （Ａ）被験物質を実験動物に投与する工程
   （Ｂ）当該動物に睡眠障害を負荷する工程
   （Ｃ）当該動物におけるLOX-1発現量を測定し、その変化を評価する工程
2. 睡眠障害の負荷がレム睡眠阻害である請求項１記載の方法。
3. レム睡眠阻害がプラットホーム法による睡眠阻害である請求項２記載の方法。
4. 実験動物がラット又はマウスである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

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