JP5188806B2 - 卵母細胞の成熟のためのｉｌ−１７の使用 - Google Patents

Description

本出願は、２００４年９月３０日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６１４,７７３号（本明細書中で引用文献により組み込まれる）の利益を主張する。

本発明は、一般的に生殖生物学に関する。より詳細には、本発明はインビトロでの受精の方法における改善に関する。

卵母細胞のインビトロでの受精（ＩＶＦ）は、様々な形態の雌性及び雄性不妊を克服するのに用いられる広く実用的な医療技術であり、その結果不妊カップルに提供される。標準的なＩＶＦ処置は、卵母細胞の成熟を誘導する外因性ホルモンを用いた、女性患者の排卵誘発（ＣＯＨ）に基づいている。この処置は、典型的には、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト又は患者自身の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモンを抑制するアンタゴニストを投与することにより開始される。その後、外因性ゴナドトロピン（ＦＳＨ及び／又はＬＨ）の注入へと続き、多数の排卵前卵胞への発達を確実にする。排卵の直前に、多数のインビボで成熟させた卵母細胞を卵巣から取り除く。単離した成熟卵母細胞はその後受精させ、発達した胚を４〜８細胞分裂期に子宮に戻す前に、典型的に３〜６日間培養する。

ＣＯＨ処置は、５組のカップルの約１組のカップルにおいて成功せず、多嚢胞卵巣障害の女性などの多くの女性には薦められていない。更に、ＣＯＨ処置において用いられる外因性ホルモン処理は、卵胞の発達及び卵胞の成熟を過剰に刺激し得る。ＣＯＨ患者の一部は、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）に罹患し、これは重度の潜在的な致命的状態である。結果として、ＣＯＨを受ける女性は、毎日の卵巣の超音波検査及び血中ホルモン測定により厳密に観察されなければならない。

ＣＯＨを用いる標準的なＩＶＦ処置の制限により、様々な代替のプロトコルが提案されてきた。ＣＯＨプロトコルの危険性、副作用及び経済的不利益を軽減する１つの方法は、インビボでの卵母細胞の成熟が後に続く未熟細胞の回収に関連する。この方法においては、女性は刺激を受けず、又は軽減した刺激を受け、回収した卵母細胞をインビトロでのホルモン処理にかける。卵母細胞のインビトロでの成熟（ＩＶＭ）は、典型的には投与する外因性ホルモンの量を減少又は無くすことを可能にし、その結果議論された問題を軽減する。

ＩＶＦの成功にも関わらず、不妊処置の改善された方法に対する顕著な必要性が存在する。特に、インビトロで卵母細胞を成熟させる方法を開発する顕著な必要性が存在する。

発明の概要
当業界が必要としているものは、ＯＨＳＳの発生を軽減するＩＶＦプロトコルである。このプロトコルは、卵母細胞の成熟のために投与される外因性ホルモンの量を減少させ又は無くすはずである。本発明は、これらの必要性を満たす。

卵母細胞は、未熟卵母細胞を含んで成る組成物を調製することによりインビトロで成熟させることができる。その後、ＩＬ−１７をその組成物に添加し、それにより卵母細胞の成熟を誘導することができる。成熟した卵母細胞は、成熟卵母細胞を精子と接触させることにより胚を産生するのに用いることができる。出産まで胚を保持することができる女性の子宮に、胚を移植することができる。ＩＬ−１７は、任意のＩＬ−１７型サイトカイン、例えばＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆ、であることができる。

発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１７がインビトロでの卵母細胞の成熟を誘導するという発見に関する。ＩＬ−１７を用いて卵母細胞の成熟を誘導することにより、ＩＶＦ処理プロトコルにおいて投与する外因性ホルモンの量を減少させることができる。

１．インビトロでの成熟
ＩＬ−１７は卵母細胞のインビトロでの成熟に用いることができる。

ａ．卵母細胞
卵母細胞が、発達の時期、例えば早期腔卵胞及び腔卵胞（これらに限定されない）にある間に、未熟卵母細胞を女性から取り除くことができる。

未熟卵母細胞は、外因性ホルモン治療を受けていない女性から取り除くことができる。或いは、未熟卵母細胞は、外因性ホルモン治療を受けた女性から取り除くことができる。女性には、ホルモン、例えばＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧ（これらに限定されない）を投与しておくことができる。ホルモンは、組み合わせにおいて又は任意の順序で連続的に投与しておくことができる。

未熟卵母細胞は、超音波検査及び吸引を含む（これらに限定されない）方法により、女性から取り除くことができる。未熟卵母細胞は、単離の後に凍結保存し、インビトロでの成熟の時期に解凍することができる。

ｂ．成熟
単離した未熟卵母細胞は、ＩＬ−１７サイトカインを含んで成る培地中でインキュベートすることができる。培地は、任意の生理学的に許容される培地、例えばＴＣＭ １９９、αＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ Ｆ１０（これらに限定されない）であることができる。培地は、任意に１又は複数の因子、例えばＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及び自己加熱不活性化血清又は卵胞液（これらに限定されない）を更に含んで成ることができる。

未熟卵母細胞は、約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６又は７２時間（これらに限定されない）、約３７℃〜約３９℃（これらに限定されない）で、培地中でインキュベートすることができる。卵母細胞は、顕微鏡下での卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）、卵丘拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、中期ＩＩプレート形成（ＭＩＩ）、又は極体押し出し（これらに限定されない）の外観検査を含む方法によって、証明したように成熟が起こるまで、卵母細胞をインキュベートすることができる。

ｃ．胚産生
成熟卵母細胞は、インビトロで精子と共にインキュベートし、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍａｒｔｉｎ Ｌｄｕｎｅｔｚ Ｌｔｄ．， Ｌｏｎｄｏｎ）（その内容は、引用文献により本明細書中に組み込まれている）に記載されている標準的なインビトロでの受精を用いて哺乳動物の胚を産生することができる。胚は、出産まで胚を保持することができる女性の子宮に移植することができる。

２．ＩＬ−１７
ＩＬ−１７は、構造的に関連したサイトカインのファミリーである。ＩＬ−１７サイトカインは、様々なタイプの細胞、例えば線維芽細胞、内皮細胞、及び上皮細胞において多面的生物活性を示す。ＩＬ−１７サイトカインの代表的な例としては、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ− １７Ｂ、ＩＬ− １７Ｃ、ＩＬ− １７Ｄ、ＩＬ− １７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆが挙げられる。ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ− １７Ｂ、ＩＬ− １７Ｃ、ＩＬ− １７Ｄ、ＩＬ− １７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆのアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、変異型又はそれらの組み合わせであることができる。アナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ又は変異型は、ＩＬ−１７と少なくとも７５％、８０％、８５％。９０％又は９５％の配列の同一性を有することができる。ＩＬ−１７サイトカインは、保存されたＣ末端領域を共有し、異なるＮ末端セグメントを有し得る。ＩＬ−１７サイトカインは、ジスルフィド結合により結合し得る、ホモ二量体であることができる。ＩＬ−１７は、ヒトＩＬ−１７であることができる。

本明細書中で用いる場合、ＩＬ−１７との関連で用いる場合には、「アナログ」という用語は、１つ以上の非標準的なアミノ酸又は従来のアミノ酸の組からの他の構造的な変異型を含んでなるペプチド又はポリペプチドを意味する。

本明細書中で用いる場合、ＩＬ−１７との関連で用いる場合には、「誘導体」という用語は、一次構造（アミノ酸及びアミノ酸アナログ）以外が異なるペプチド又はポリペプチドを意味する。例として、誘導体は、グリコシル化（翻訳後修飾の１つの形態）されることにより異なり得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、異種系における発現により、グリコシル化パターンが存在し得る。少なくとも１つの生物学的活性が保持されるならば、これらのペプチド又はポリペプチドは本発明の誘導体である。他の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ末端又はＣ末端を有する融合ペプチド又は融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチド又はポリペプチド、脂質部分と結合したペプチド又はポリペプチド、アルキル化ペプチド又はポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基により他のペプチド、ポリペプチド又は化学物質に結合したペプチド又はポリペプチド、及び当業界で理解される更なる修飾型があげられるが、これらに限定されない。

本明細書中で用いる場合、ＩＬ−１７との関連で用いる場合には、「フラグメント」という用語は、約８〜５０アミノ酸長のペプチドを意味する。フラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸長であることができる。

本明細書中で用いる場合、ＩＬ−１７との関連で用いる場合には、「ホモログ」という用語は、共通の進化的先祖を共有するペプチド又はポリペプチドを意味する。

本明細書中で用いる場合、ＩＬ−１７との関連で用いる場合には、「変異型」という用語は、アミノ酸の挿入、欠損、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の目的に関して、「生物学的活性」としては、特異的抗体により結合される能力が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、以下の非限定的な実施例により説明される複数の側面を有する。

実施例１
マウス卵丘−卵母細胞複合体の単離
ＰＭＳＧ（５ＩＵ／雌性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ３６７２２２）は、７〜８週齢のＣＤ−１雌性マウス（３５トータル；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を準備するのに用いた。マウスは、進行性の低酸素血症により４８時間後に屠殺した。アルコール（７０％）を、動物の腹部領域に適用してその部分を消毒し、毛による試料の汚染も減少させた。腹部切開を行い、腹腔を露出させた。卵管に接続した卵巣を、子宮角及び内臓脂肪症から取り除いた。卵巣／卵管試料を、３ｍｌのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ １１４１５−０６４）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １６０００−０４４）を含む１５ｍｌチューブ（１０／チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ４３００５２）に置いた。卵巣／卵管試料を３７℃で保持した。

その後、卵巣／卵管試料をペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ ３５３００４、６０×１５ｍｍ）に移した。１ｍｌのツベルクリン注射器に取り付けた一組のハサミと針（２７ゲージ）を用いて、実体顕微鏡（サーモプレート加熱ステージを有するＮｉｋｏｎ ＳＭ２−８００）下で、卵巣及び卵管を脂肪パッドから取り除き、２〜３ｍｌの新鮮な培地（Ｌ−１５＋１０％ ＦＣＳ）で満たした新しいペトリ皿に置いた。ＣＯＣを針による各卵巣の機械的破裂により回収し、２〜３ｍｌの新鮮な培地（Ｌ−１５＋１０％ ＦＣＳ）で満たした新しいペトリ皿に置いた。

実施例２
マウス卵丘−卵母細胞複合体のインビトロでの卵丘拡張におけるＩＬ−１７の効果
同種細胞質を有する卵丘−無傷卵母細胞を、低倍率（２０〜３０×）の実体顕微鏡を用いて、実施例１に記載のとおりに調製したＣＯＣから選択し、マウス（ｍｏｕｔｈ）ガラスピペットを用いて、ウエルミネラルオイルあたりに９０μｌの培地（１０％ ＦＣＳを含むαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ３２５７１−０３６）及びＰｅｎＳｔｒｅｐ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５１４０−１２２））を含む９６−ウエルプレート（２／ウエル）に移した。ＣＯＣを９６−ウエルプレートに添加する前に、プレート中の培地を、空気中に５％のＣＯ₂を含む加湿したインキュベーター中で３７℃において１時間事前に平衡化した。

異なる形態のＩＬ−１７を、各ウエルの最終体積が１００μｌとなるように、各ウエルに１０μｌの体積で添加した。各プレートは、４つのウエルの「ネガティブコントロール」（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳ）及び４つのウエルの「ポジティブコントロール」（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳとＥＧＦ（５ ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｅ−９６４４））を含んでいた。１つの試験あたり２つのプレート（重複）を用いて、１つの試験タンパク質あたり２つのウエルを提供した。試験における１：５０の最終希釈のために試験プレートにタンパク質を添加する前に、ＩＶＭ培地（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳ）にタンパク質を１：５で希釈した。

処理したＣＯＣを含むプレートを、空気中に５％のＣＯ₂を含む加湿したインキュベーター中で３７℃において１８時間インキュベートした。その後、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡を用いて各ＣＯＣを視覚的に検査し、卵丘細胞によるムコイド細胞外マトリクス（卵丘拡張の指標）の形成を同定した。卵丘拡張の割合を、各処理群において用いた全部のＣＯＣと比較した、拡張した卵丘の数として規定した。以下の表１に示すように、試験した各形態のＩＬ−１７は、最初の試験において８０％のＣＯＣの拡張を誘導した。

その後、最初の試験において試験した各ＩＬ−１７タンパク質を、再確認試験において試験した。表２の再確認試験からの結果は、試験した各形態のＩＬ−１７が少なくとも８０％のＣＯＣの拡張を誘導したことを示す。

最初の試験及び再確認試験の両方において、ネガティブコントロール（ＥＧＦを含まない）又はポジティブコントロール（ＥＧＦを含む）のプレートは、それぞれ常に０％又は１００％の拡張であった（データは示さない）。

実施例３
ＩＬ−１７の用量反応試験
実施例２に記載した最初及び再確認試験からの結果に基づいて、用量反応試験をＡＳ９０００４８−６（ＩＬ−１７−６Ｈｉｓ）及びＡＳ９００２６９−１（Ｍｅｔ−ＩＶＫＡ−ＩＬ−１７）に関して実施した。１つのウエルあたりに４〜５個のＣＯＣを含む３つのウエルが各タンパク質濃度に対して指定されたことを除いて、実施例２に記載の方法と類似の方法において用量反応試験を実施した。特定のタンパク質（試験に添加する前に希釈しないものがあった）の濃度に依存して、試験タンパク質の希釈を行い、１：１０の最終濃度とした。

ＡＳ９０００４８−６（ＩＬ−１７−６Ｈｉｓ）及びＡＳ９００２６９−１（Ｍｅｔ−ＩＶＫＡ−ＩＬ−１７）の用量反応試験の結果を、図１及び図２にそれぞれ示す。Ｏｒｉｇｉｎ ７ ＳＲ３ ｖ７．０４７５ （Ｂ４７５）を用いた試験は、ＡＳ９０００４８−６（ＩＬ−１７−６Ｈｉｓ）による卵丘拡張のＥＣ₅₀が０．１５ｎｇ／ｍｌであり、一方ＡＳ９００２６９−１（Ｍｅｔ−ＩＶＫＡ−ＩＬ−１７）による卵丘拡張のＥＣ₅₀が０．４５ｎｇ／ｍｌであったことを示す。

実施例４
ＩＬ−１７サイトカインの試験
異なるＩＬ−１７サイトカインを、実施例２に記載した方法においてインビトロでの卵丘拡張を誘導する能力を試験した。表３〜８から分かるように、ＩＬ− １７Ｂ、ＩＬ− １７Ｃ、ＩＬ− １７Ｄ、ＩＬ− １７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆはインビトロでの卵丘拡張を誘導することができた。更に、ＩＬ− １７Ｂ、ＩＬ− １７Ｄ及びＩＬ−１７Ｆは、ＩＬ−１７Ａと類似の活性を有した。

これらの試験に基づいて、実施例３に記載した方法において、用量反応試験をＩＬ− １７Ｂ、ＩＬ− １７Ｄ及びＩＬ−１７Ｆに関して実施した。用量反応試験の結果を、図３〜５に示す。Ｏｒｉｇｉｎ ７ ＳＲ３ ｖ７．０４７５ （Ｂ４７５）を用いた試験は、ＩＬ− １７Ｂ、ＩＬ− １７Ｄ及びＩＬ−１７Ｆによる卵丘拡張のＥＣ₅₀が、それぞれ１２．３ｎｇ／ｍｌ、７４ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌであったことを示す。

この記載は、上述の実施態様に限定されない。

図１は、示唆した濃度のＡＳ９０００４８−６（ＩＬ−１７−６Ｈｉｓ）で処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。 図２は、示唆した濃度のＡＳ９００２６９−１（Ｍｅｔ−ＩＶＫＡ−ＩＬ−１７）で処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。 図３は、示唆した濃度のＩＬ−１７Ｂで処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。 図４は、示唆した濃度のＩＬ−１７Ｄで処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。 図５は、示唆した濃度のＩＬ−１７Ｆで処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。

Claims (8)

1. ＩＬ−１７又は、ＩＬ−１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドであって、インビトロで未熟卵母細胞の成熟を誘導することができる前記ポリペプチドと、未熟卵母細胞とを接触させることを含んで成る、インビトロで未熟卵母細胞を成熟させる方法。
2. 前記ＩＬ−１７が、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩＬ−１７が、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａである、請求項１に記載の方法。
4. 未熟卵母細胞が、外部ホルモン治療を受けていない女性に由来する、請求項１に記載の方法。
5. 未熟卵母細胞が、外部ホルモン治療を受けた女性に由来する、請求項１に記載の方法。
6. 女性が、ＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるホルモンを投与された、請求項５に記載の方法。
7. ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、自己加熱不活性化血清及び卵胞液から成る群から選択される因子を含んで成る培地中で、前記ＩＬ−１７又は前記ポリペプチドと、未熟卵母細胞とを接触させる、請求項１に記載の方法。
8. （ａ）請求項１に記載の方法により、成熟卵母細胞を産生すること；及び
   （ｂ）前記成熟卵母細胞を、精子を用いて処理すること
   を含んで成る、インビトロで胚を産生する方法（ただし、ヒト胚を産生する方法を除く）。

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