JP5185479B2

JP5185479B2 - New enzyme

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Publication number: JP5185479B2
Application number: JP2000578432A
Authority: JP
Inventors: デイヴィッドジェームズスクイレル; メレニージェーンマーフィー; レイチェルルイーズプライス; クリストファーロビンロウ; ピータージョンホワイト; ローレンスカーロティシ; ジェームスオウガスタスヘンリーマーレー
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1999-10-26
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2019-10-26
Also published as: EP2368976A1; EP2071023A2; EP1479763A3; EP2366779B1; WO2000024878A2; EP2071023B1; AU2004202276A1; EP1479763B1; ES2319520T3; DK1124944T3; DK1479763T3; EP2366778A1; AU6357399A; WO2000024878A3; EP1124944B1; JP2012161325A; GB2345913A; JP5951325B2; EP2366780B1; EP2366779A1

Abstract

A protein having luciferase activity and at least 60% similarity to luciferase from Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, Hotaria paroula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia nayako or Photinus pennsylanvanica, wherein in the sequence of the enzyme, at least one of (a) the amino acid residue corresponding to residue 214 in Photinus pyralis luciferase; (b) the amino acid residue corresponding to residue 232 in Photinus pyralis luciferase; (c) the amino acid residue corresponding to residue 295 in Photinus pyralis luciferase; (d) the amino acid residue corresponding to amino acid 14 of the Photinus pyralis luciferase; (e) the amino acid residue corresponding to amino acid 35 of the Photinus pyralis luciferase; (f) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 105 of the Photinus pyralis luciferase; (g) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 234 of the Photinus pyralis luciferase; (h) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 420 of the Photinus pyralis luciferase; (i) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 310 of the Photinus pyralis luciferase; is different to the amino acid which appears in the corresponding wild type sequence and wherein the luciferase enzyme has increased thermostability as compared to an enzyme having the amino acid of the corresponding wild-type luciferase at this position.

Description

【０００１】
本発明は、新規酵素、特に対応の野生型酵素と比較して増加した熱安定性を有する変異ルシフェラーゼ酵素、アッセイにおける前記酵素の使用及び前記酵素を含む試験キットに関する。
ホタルのルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ^２＋及び分子酸素の存在下、光の生成を伴うルシフェリンの酸化を触媒する。この反応は約０．８８の量子収率を有する。前記ルシフェラーゼの発光特性は、ＡＴＰレベルを測定する種々の発光（luminometric）アッセイにおける前記酵素の使用を導く。前記のアッセイの例には、EP-B-680515及びWO96/02665の記載に基づくアッセイが含まれる。
ルシフェラーゼは、昆虫の体、特にホタル又はツチボタル等の甲虫から直接得ることができる。ルシフェラーゼが得られる特定の種には、ニホンゲンジボタル又はケイケ（KEIKE）ボタル、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）及びルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、東欧ホタルであるルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）、北米ホタルであるフォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）並びにツチボタルであるラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）が含まれる。ルシフェラーゼを得ることができるその他の種は、Ye ら., Biochimica et Biophysica Acta, 1339 （1997） 39-52に記載されている。Vivianiら, Biochemistry, 38, （1999） 8271-8279に記載される更なる種は、フィリキソシックス（Phrixothrix）（レールロードワーム（railroad-worms））である。
しかしながら、これらの酵素をコードする多くの遺伝子がクローニングされかつ配列決定されているので、組換えＤＮＡ技術を使用しても製造することができるだろう。前記酵素をコードする組換えＤＮＡ配列を使用して、大腸菌（E.coli）等の微生物を形質転換し、所望の酵素生成物を発現させる。
野生型及び組換え型ルシフェラーゼの熱安定性は、約３０℃、特に３５℃を超える温度に曝露したときにその活性が急速に消失する程度である。この不安定性は、高い周囲温度下で酵素を保存するか又は、例えば反応速度を高くするために高温反応条件下アッセイを行うときに問題を起こす。
増加した熱安定性を有する変異ルシフェラーゼはEP-A-524448及びW095/25798より既知である。前者は、ニホンボタルのルシフェラーゼにおいてスレオニン残基をイソロイシン残基で置換することにより部位２１７に変異を有する変異ルシフェラーゼを記載している。後者は、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼと６０％をこえる類似性を有するが、フォティナス・ピラリスの部位３５４のアミノ酸残基又はルシオラ種の部位３５６に対応するアミノ酸残基がグルタメート以外になるように変異している変異ルシフェラーゼを記載している。
【０００２】
本件出願人は、増加した熱安定性をもたらし、かつ当該技術分野において既知の変異体を補完する更なる変異体を見いだした。
本発明は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ（Hotaria paroula）、ピロフォラス・プラギオフタラマス（Pyrophorus plagiophthalamus）、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ（Pyrocoelia nayako）、フォティナス・ペンシランヴァニカ（Photinus pennsylanvanica）又はフィリキソシックス由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、前記酵素の配列において、
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基、
のなかの少なくとも１つが対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、前記ルシフェラーゼ酵素は、当該部位に特定種の対応野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素を提供する。
【０００３】
好ましくは、前記タンパク質はルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有している。
特に、前記タンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、野生型ルシフェラーゼの配列、例えばフォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス（グリーン−ＬｕｃＧＲ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス（イエローグリーンＬｕｃＹＧ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス（イエロー−ＬｕｃＹＥ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス（オレンジ−ＬｕｃＯＲ）、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ、フォティナス・ペンシランヴァニカＬＹ、フォティナス・ペンシランヴァニカＫＷ、フォティナス・ペンシランヴァニカＪ１９又はフィリキソシックス・グリーン（Ｐｖ_ＧＲ）若しくはレッド（Ｐｈ_ＲＥ）の配列を実質的に有する。但し、前記タンパク質は、野生型酵素のアミノ酸とは異なるように操作された１以上、例えば１００までのアミノ酸残基、好ましくはせいぜい５０、より好ましくはせいぜい３０のアミノ酸を含んでいてもよい。
特に、基質Ｄ−ルシフェリン（４，５−ジヒドロ−２−［６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル］−４−チアゾールカルボン酸）を使用して光放射を生じることができる種に由来する生物発光酵素は、本発明の変異体酵素の基礎を形成するだろう。
実施例によると、本発明のルシフェラーゼは、フォティナス・ピラリスのルシフェラーゼ配列を実質的に有し、かつ、以下の変化のうちの少なくとも１つを有している。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基に変化している、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基がイソロイシン以外に変化している、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基がロイシン以外に変化している、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基がアラニン以外に変化している、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸以外に変化している、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がセリン以外に変化している、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外に変化している。
【０００４】
本発明のタンパク質がルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来酵素の配列を実質的に有する場合、以下の変化のうちの少なくとも１つを有する。
（ａ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基礎とする配列では）グリシン以外であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基礎とする配列では）アスパラギン以外である。
（ｂ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がセリン以外である。
（ｃ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基がロイシン以外である。
（ｄ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外である。
（ｅ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がリジン以外である。
（ｆ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又は、ルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。
（ｇ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。
（ｈ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外である。
（ｉ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基本とする配列では）スレオニン以外であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基本とする配列では）バリン以外である。
【０００５】
熱安定性を増強させる全ての場合における特定の置換アミノ酸は、以下に説明されるようなルーチンの方法により決定することができる。それぞれの場合において、異なる置換が熱安定性の増強を引き起こすだろう。当業者に理解されるように、置換は、天然又は適切な変異体タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により行うことができるだろう。この場合において本発明は熱安定性と関連するタンパク質の同定と関連する。
しかしながら、一般的には、野生型のアミノ酸とは異なる性質を有するアミノ酸で置換することを考慮することが好ましい。したがって、ある場合においては、親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基（逆も又同様）で好ましく置換するだろう。同様に、酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基で置換するだろう。
例えば、本発明のタンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ酵素と少なくとも６０％の類似性を有し、その配列内に以下の変化のうち少なくとも１つを有し、野生型ルシフェラーゼ酵素と比較して増加した熱安定性を有している。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はスレオニン以外である。
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はイソロイシン以外である。
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、例えば、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合、フェニルアラニン以外である。
【０００６】
種々のルシフェラーゼの全ての配列は、高度に保存されて、これら酵素間で有意な程度の類似性を有していることを示す。このことは、配列を調査して最も類似している領域を検出することにより酵素配列間の対応領域が容易に決定可能であることを示している。必要ならば、種々の配列間対応領域又は特定のアミノ酸を決定するために市販のソフト（例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループの「Bestfit」、Devereuxら（1984） Nucleic Acid Research 12: 387-395を参照のこと）を使用することができる。代替又は追加として、対応の酸を、文献：L. Yeら, Biochim. Biophys Acta 1339 (1997) 39-52により決定することができる。前記文献で使用する番号方式（numbering system）は、本件出願で使用した番号方式の基礎を形成する。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基の可能な変化について、極性アミノ酸スレオニンは、非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するスレオニン残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。より好ましい置換はシステインによるものである。しかしながら、この部位における異なる極性残基、例えばアスパラギンも、当該部位にスレオニンを有する対応の酵素の熱安定性を増強するだろう。
野生型ルシフェラーゼ酵素においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、グリシン（ルシオラ・ミングレリカ、ホタリア・パロウラ）、アスパラギン（ピロフォラス・プラギオフタラマス、ＧＲ、ＹＣ、ＹＥ及びＯＲ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロセリア・ナヤコ、フォティナス・ペンシランヴァニカＬＹ、ＫＷ、Ｊ１９）及びセリン（フィリキソシックス・ルシフェラーゼの部位２１１）が含まれる。非極性又は異なる非極性側鎖、例えばアラニン及びシステインで置換することは有利であろう。
【０００７】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基の可能性のある変化について、非極性アミノ酸であるイソロイシンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどで適切に置換される。野生型の配列においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、セリン及びアスパラギン（それぞれ、フィトシックス・グリーン（Phritothix green）及びレッド（Phritothix red）における対応の２２９番目の部位におけるバリン又はアラニンと同じ）が含まれる。適切には、これらの極性残基は、非極性残基、例えば前記にて概略を述べたものにより置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応する残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスの残基２３４に対応する残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。このことは、野生型配列に対するアミノ酸の変化を示している。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう（これは、フィリキソシックス・ルシフェラーゼの残基２９２に対応する）。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるフェニルアラニン又はロイシンである。これらは異なる非極性アミノ酸で改変される。例えば、フォティナス・ピラリスでは、非極性アミノ酸フェニルアラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン又はシステインにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するフェニルアラニン残基についての特に好ましい置換はロイシンによるものである。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基又はルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６（フィリキソシックス由来ルシフェラーゼではアミノ酸残基１３）に対応するアミノ酸残基における変異も可能である。このアミノ酸残基（通常はフェニルアラニンであるが、ロイシン、セリン、アルギニン又はある場合ではチロシンであってもよい）は、異なるアミノ酸、特に異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン、好ましくはアラニンへ適切に改変するだろう。
【０００８】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５又はルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７に対応するアミノ酸残基（その他のルシオラ種及びフィリキソシックスにおけるアミノ酸３８に対応する）における変異も有効であろう。このアミノ酸は野生型酵素間で変化し、この部位におけるロイシン（フォティナス・ピラリス）だけでなく、リジン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、グルタミン及びアスパラギン酸も含まれるだろう。適切には、この部位におけるアミノ酸残基は、非極性アミノ酸残基又は異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。この部位における好ましいアミノ酸はアラニンであり、これは野生型酵素とは異なるものである。
フォティナス・ピラリス由来配列の部位１４に対応するアミノ酸における変異及び／又はフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基における変異は、好ましくはこの酵素における唯一の変異ではない。これらの変異は、前記で定義したその他の変異、特にフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１４、３９５又は２３２に対応する部位における変異を適切に伴う。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼにおける残基１０５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基（フィリキソシックスにおける残基１０２）の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるアラニン又はグリシンであり、フィリキソシックスではセリンであろう。これらのアミノ酸は異なる非極性アミノ酸により適切に改変される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、非極性アミノ酸アラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン等により適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの残基１０５に対応するアラニン残基についての特に好ましい置換はバリンによるものである。
【０００９】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６（フィリキソシックスにおける残基２３１）に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸はアスパラギン酸又はグリシンであり、ある場合においてはグルタミン又はスレオニンである。これらは、非極性アミノ酸又は異なる非極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、アミノ酸残基アスパラギン酸は、非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するフェニルアラニン残基の置換に特に好ましいのはグリシンによるものである。非極性アミノ酸残基、例えばグリシンが（例えば、ルシオラ由来ルシフェラーゼにおいて）この部位に存在する場合、グリシンは異なる非極性アミノ酸により適切に置換されるだろう。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２（フィリキソシックス・グリーンにおける残基４１７及びフィリキソシックス・レッドにおける残基４１８）に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸は無電荷極性アミノ酸であるセリン又はスレオリン又はグリシンである。これらは、異なる無電荷極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、セリンは、アスパラギン、グルタミン、スレオニン又はチロシン、特にスレオニンにより適切に置換される。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。この部位におけるアミノ酸は既知のルシフェラーゼタンパク質の間で変化し、フォティナス・ピラリス、ピロセリア・ナヤコ、ラムピリス・ノクチルカ及びある形態のフォティナス・ペンシランヴァニカ由来ルシフェラーゼではヒスチジンであり、ルシオラ・ミングレリカ、ホタリア・パロウラ及びフィリキソシックス（アミノ酸残基３０７）由来ルシフェラーゼではスレオニンであり、ルシオラ・クルシアタ及びルシオラ・ラテラリスではバリンであり、あるピロフォラス・プラギオフタラマス由来ルシフェラーゼではアスパラギンである。したがって、一般的に、この部位におけるアミノ酸は親水性アミノ酸であり、これを異なるアミノ酸残基に換えて、酵素の熱安定性を増加させてもよい。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するヒスチジン残基に対する特に好ましい置換はアルギニンによるものである。
【００１０】
酵素内にその他の変異が存在していてもよい。例えば、好ましい態様では、タンパク質は、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸３５４に対応する部位（ルシオラ由来ルシフェラーゼにおける部位３５６及びフィリキソシックス由来ルシフェラーゼの部位３５１）にグルタミンから、特にグリシン、プロリン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変化したアミノ酸を有する。適切には、この部位におけるアミノ酸はトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパラギンであり、特に好ましくはリジン又はアルギニンである。この変異はWO 95/25798に記載されている。
代替の好ましい態様では、EP-A-052448に記載されるように、タンパク質は、ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７に対応する部位が、疎水性アミノ酸、特にイソロイシン、ロイシン又はバリンに換わったアミノ酸を有している。
タンパク質は、当該タンパク質のルシフェラーゼ活性が過度に妥協しないことを条件に配列内に更に変異を含んでいてもよい。その変異は酵素の特性を適切に増強するか、又は、ある場合においては意図する目的により適するようにする。このことは、更なる変異が熱安定性及び／又はカラーシフト特性及び／又はＡＴＰに対する酵素のＫ_ｍの増強を引き起こすことを意味する。カラーシフトを引き起こす変異の例はWO95/18853に記載されている。Ｋ_ｍ値に影響する変異は例えばWO96/22376及び国際特許出願第PCT/GB98/01026号に記載されている。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明のタンパク質は、１つより多い変異、好ましくは前記の変異の３つすべてを適切に有している。
本発明のタンパク質には野生型及び組換え型ルシフェラーゼ酵素の両方が含まれる。本発明のタンパク質は、前記のとおり野生型酵素に存在するアミノ酸の少なくとも６０％が本発明のタンパク質に存在するという意味で、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼの配列又はその他のルシフェラーゼ酵素の配列と少なくとも６０％の類似性を有する。本発明のタンパク質は前記の野生型酵素に対し、より高い程度類似性、特に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％の類似性を有することができる。このタイプの類似のタンパク質には、対立遺伝子変異体、その他の昆虫種由来のタンパク質及び組換えにより生成した酵素が含まれる。
【００１１】
本発明のタンパク質は、野生型酵素をコードする配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるという点で同定されるだろう。前記の条件は当業者に周知であり、例えばSambrookら（1989） Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに例示されている。一般的には、低ストリンジェント条件は約周囲温度〜約６５℃における３×ＳＳＣとして定義され、高ストリンジェント条件は約６５℃における０．１×ＳＳＣとして定義される。ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウムからなる緩衝液の名称である。３×ＳＳＣは３回の同じ強さのＳＳＣのことである。
特に、本発明の配列と特定の配列との類似性は、Lipman 及び Pearson （Lipman, D.J. & Pearson, W.R. （1985） Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol 227, ppl435-1441）に記載される多重整列化（multiple alignment）法を使用して評価されるだろう。「最適化された」百分率のスコアは、Lipman-Pearsonアルゴリズムについての以下のパラメーター：ｋｔｕｐ＝１、ギャップペナルティー（gap penalty）＝４及びギャップペナルティー長さ（gap penalty length）＝１２を用いて計算されるべきである。類似性を評価する配列は「試験配列」として使用されるべきである。このことは、比較のための塩基配列、例えばフォティナス・ピラリスの配列若しくはYeら、前出に記録された前記のその他の配列又はフィリキソシックスの場合はBiochemistry, 1999, 38, 8271-8279に記載される配列は、参照配列として使用されることを意味する。
本発明の特定の例は、前記の変異を有する野生型ルシフェラーゼ配列である。このタンパク質は少なくとも１つ、好ましくは１つより多くの前記の変位を有している。
更に本発明は前記のルシフェラーゼをコードする核酸を提供する。適切には、前記核酸は当業者に周知の野生型配列に基づくものである。アミノ酸配列に所望の変異を起こす適切な突然変異は、遺伝子コードの知識に基づき容易に明らかになるだろう。
【００１２】
本発明の核酸は、発現ベクター、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御要素の制御下にあるプラスミドへ適切に組み込まれる。これらのベクターを用いて宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えば植物又は動物細胞、特に原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）を形質転換し、当該細胞に所望のルシフェラーゼ酵素を発現させることができる。当該技術分野で周知の条件を使用して、得られた形質転換細胞の培養にルシフェラーゼ酵素を産生させ、次いで培養培地からルシフェラーゼ酵素を分離することができる。細胞が動物又は植物細胞の場合、当該細胞から植物又は動物を繁殖させてもよい。その後、当該植物からタンパク質を抽出してもよい。トランスジェニック動物の場合、タンパク質を乳汁から回収してもよい。ベクター、形質転換細胞、トランスジェニック植物及び動物並びに前記細胞の培養による酵素の生産方法の全ては本発明の更なる側面を形成する。
フォティナス・ピラリスT214A変異ルシフェラーゼを、以下のランダム突然変異誘発により作成した。T214A単一点変異体は野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性を有している。
２つの新規な三重変異ルシフェラーゼ：E354K/T214A/A215L 及び E354K/T214A/I232Aを作成したところ、これらも高い熱安定性を示した。
本発明の範囲内にあるフォティナス・ピラリス変異体酵素の特定の例には以下のものが含まれる。
I232A/E354K
T214A/I232A/E354K
A215L/I232A/E354K
T214A/I232A/E354K/A215L
I232A/E354K/T214A/F295L
I232A/E354K/T214A/F295L/F14A/L35A
I232A/E354K/T214A/F295L/Fl4A/L35A/A215L
A105V
T214A
T214C
T214N
T295L
I232A
F14A
L35A
D234G
S420T
H31OR
又はその他の種のルシフェラーゼに由来するときは、それらのすべての等価物。
三重変異体作成のための変異を、プラスミドｐＥＴ２３上のルシフェラーゼ遺伝子へ、部位特異的突然変異（ＰＣＲ）により導入した。関連する変異を起こすためにＰＣＲ反応へ添加したオリゴヌクレオチドは以下の実施例で与えられたものである。
部位３５４及び２１５における点変異の効果は相加的であることが既に示されている。本発明はより高い熱安定性を与えるために３又はそれより多い変異を組み合わせる可能性を提供する。
本発明の熱安定性ルシフェラーゼは、シグナル伝達手段としてルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を利用する全ての生物発光アッセイにおいて有利に使用されるだろう。文献において非常に多数のアッセイが知られている。それゆえ、本発明のタンパク質は、前記のアッセイの実行を鑑みて調製されるキット中に、適宜ルシフェリン及び特定のアッセイを行うのに必要なその他の試薬と共に含まれるだろう。
本発明は添付図面を参照した実施例により詳述されるだろう。
【００１３】
実施例１
熱安定性変異ルシフェラーゼの同定
エラー易発性（error-prone）ＰＣＲは、Fromantら, Analytical Biochemistry, 224, 347-353 （1995）により考案されたプロトコルに基づいていた。
本反応におけるｄＮＴＰ混合物は以下の通りであった。
３５ｍＭｄＴＴＰ
１２．５ｍＭｄＧＴＰ
２２．５ｍＭｄＣＴＰ
１４ｍＭｄＡＴＰ
ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
０．５μｌ（５０ｎｇ）プラスミドｐＰＷ６０１ａＪ５４^＊
５．０μｌ１０×ＫＣｌ反応緩衝液
各１μｌのＷ５６及びＷ５７^＋（６０ｐｍｏｌｅの各プライマー）
１μｌＢｉｏｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（５Ｕ）
２μｌｄＮＴＰｓ（前記参照）
１．７６μｌＭｇＣｌ_２（５０ｍＭストック）
１μｌｍＮＣｌ_２（２５ｍＭストック）［反応における終濃度＝３．２６ｍＭ］
３６．７μｌｄＨ_２Ｏ
^*プラスミドｐＰＷ６０１ａＪ５４はｐＰＷ６０１ａ（WO95/25798）の変異体バージョンであり、ＮｄｅＩ部位をＡＴＧ開始コドン前３塩基以内に作成した。これにより、ｐＰＷ６０１ａからｐＥＴ２３ベクターへの容易なクローニングが許容された。
＋プライマー配列：

サイクルのパラメーター配下の通りであった。
９４℃で５分、
次いで９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で５分
のサイクル×１２、
７２℃で１０分間。
【００１４】
ＰＣＲ産物は、Clontech Advantage（登録商標）ＰＣＲ−ピュアキット（pure kit）を使用して反応混合物から精製した。精製産物のアリコートを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて消化した。次いで消化したＰＣＲ産物を、前記Advantageキットで「クリーンアップ（cleaned up）」し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴ２３ａに連結した。
ライゲーション条件：
４μｌｐＥＴ２３ａ（５６ｎｇ）
５μｌＰＣＲ産物（２００ｎｇ）
３μｌ５×ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ反応緩衝液
１μｌＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ（１０Ｕ）
２μｌｄＨ_２Ｏ
ライゲーションは１６℃で一晩行った。
連結したＤＮＡをAdvantage（登録商標）キットを用いて精製し、次いでエレクトロコンピテント（electrocompetent）なＨＢ１０１細胞へエレクトロポレーションした（１ｍｍキュベット、１．８Ｋｖ）。
１１回のエレクトロポレーションを行い、ついで細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＴＹブロスの４０ｍｌに添加した。次いで細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた培養物の全５０ｍｌを使用してプラスミドＤＮＡを精製した。これをライブラリーとした。
ライブラリーのスクリーニング
プラスミドライブラリーのアリコートを使用して大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３細胞をエレクトロポレーションに付した。これらの細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天に撒き、３７℃で一晩増殖させた。
翌日、コロニーを選び、ＬＢ寒天＋ａｍｐプレート上のナイロンフィルターにパッチをつけ（patch）、３７℃で増殖を一晩続けた。翌日、フィルターをルシフェリン溶液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の５００μＭ）で覆った。次いでパッチを暗室で観察した。更なる分析のために２００から１コロニー／パッチを選んだ。
熱安定性変異体の特徴付け
変異体プラスミドを保持する大腸菌クローンを単離した。プラスミドＤＮＡをＡＢＩ配列決定のために調製した。ルシフェラーゼをコードする完全なオープンリーディングフレームを、４つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して配列決定した。配列決定により、ヌクレオチド６４０におけるＡからＧへの単一の点変異が明らかになった。ＡＣＴ（Ｔ）からＧＣＴ（Ａ）へのコドン変化は部位２１４におけるアミノ酸の変化を与えた。
【００１５】
実施例２
三重変異酵素の調製
突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用してｐＭＯＤ１（Ａ２１５Ｌ／Ｅ３５４Ｋ）に同一の変異を作成し、三重変異体ｐＭＯＤ２（Ａ２１５Ｌ／Ｅ３５４Ｋ／Ｔ２１４Ａ）を作成した。この変異もｐＭＯＤ１に唯一のＳａｃＩ／ＳｓｔＩ部位を作成した。
実施例３
更なる三重変異酵素の調製
鋳型としてＴ２１４Ａ変異を有するｐＥＴ２３プラスミドを用いて、以下のプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応により三重変異体Ｔ２１４Ａ／Ｉ２３２Ａ／Ｅ３５４Ｋを作成した。

実施例４
熱安定性２９５変異体の同定
Ｆ２９５変異体を、Fromantら, Analytical Biochemistry, vol 224, 347-353（1995）に記載のエラー易発性ＰＣＲ法を用いて作成した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
０．５μｌ（５０ｎｇ）プラスミドｐＥＴ２３
５．０μｌ１０×ＫＣｌ反応緩衝液
１μｌプライマー１６０ｐｍｏｌの各プライマー
１μｌプライマー２
１μｌＢｉｏｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（５Ｕ）
２μｌｄＮＴＰｓ、混合物中３５ｍＭｄＴＴＰ、１２．５ｍＭｄＧＴＰ、２２．５ｍＭｄＣＴＰ、１４ｍＭｄＡＴＰ
１．７６μｌＭｇＣｌ_２（５０ｍＭストック）
１μｌＭｎＣｌ_２（２５ｍＭストック）［反応中の最終濃度＝３．２６ｍＭ］
３６．７μｌｄＨ_２Ｏ

【００１６】
サイクルのパラメーターは以下の通りであった。
９４℃で５分間、
次いで９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で５分
のサイクル×１５、
７２℃で１０分間。
ＰＣＲ産物は、Clontech Advantage（登録商標）ＰＣＲ−ピュアキットを使用して反応混合物から精製した。精製産物のアリコートを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて消化した。次いで消化したＰＣＲ産物を、前記Advantageキットで「クリーンアップ」し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴ２３ａに連結した。
ライゲーション条件は以下の通りであった。
５６ｎｇｐＥＴ２３ａ
２００ｎｇＰＣＲ産物
３μｌ５×ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ反応緩衝液
１μｌＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ（１０Ｕ）
ｄＨ２Ｏを用いて、容量を１０μｌにした。
ライゲーションは１６℃で一晩行った。
連結したＤＮＡをAdvantage（登録商標）キットを用いて精製し、次いでエレクトロコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へエレクトロポレーションした（１ｍｍキュベット、１．８Ｋｖ）。１ｍｌのＳＯＣブロスを各エレクトロポレーションに添加し、細胞を回復させ、プラスミドによりコードされる抗生物質耐性遺伝子を発現させた。ライブラリーのアリコートを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天に撒き、細菌を３７℃で一晩増殖させた。ナイロンフィルターディスクで寒天プレートを覆い、コロニーを新鮮なプレートに移した。オリジナルのプレートは室温下に放置し、コロニーを再増殖させた。プレートをナイロンフィルターとともに４２℃で２時間インキュベートし、その後、１００ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０中の５００μＭルシフェリンをスプレーし、暗室中で観察した。
４２℃で２時間後に増殖したことことを基礎に３つの熱安定性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡをこれらのクローンから単離して、配列決定したところ、それぞれの場合においてＦ２９５Ｌ変異が明らかになった。
【００１７】
実施例５
本発明のその他の変異体を、前記及び下記のオリゴヌクレオチドの適切な組み合わせを用いたＰＣＲにより生産した。

実施例６
ルシフェラーゼの精製及び熱不活性化の研究
組換え変異ルシフェラーゼを発現する細胞を増殖させ、破壊し、WO95/25798に記載の通りに抽出し、ルシフェラーゼの無細胞抽出物を得た。
無細胞抽出物を含むエッペンドルフチューブを特に述べない限りは通常４０℃でインキュベートした。野生型ルシフェラーゼの精製調節物（比較目的）を、１０％飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭジチオスレイトール及び０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を含む熱安定性緩衝液中でインキュベートした。設定時間に、チューブを取り出し、氷／水浴中で冷却し、その後、初期活性又は相対生物発光の百分率として計算される残存するアッセイされる活性を測定した。
結果を図２及び図３に示す。図２から、本発明のルシフェラーゼ変異体は既知の変異体と比べて改善された熱安定性を有していることが理解される。
野生型ルシフェラーゼ（ＲＷＴ）に対して劇的に増加した安定性は図３より明らかである。
【００１８】
実施例７
２１４の変異体の活性についての研究
２１４変異体からなるライブラリーを、カセットオリゴ（cassette oligos）を用いた部位特異的突然変異により調製し（図５）、熱安定性変異体を選択し、実施例１と同様にして試験した。３つの特定の熱安定性変異体を、実施例１と同様にして配列決定し、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｃ及びＴ２１４Ｎとして特徴づけた。
Ｔ２１４、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｃ及びＴ２１４Ｎをコードするプラスミドを保持する大腸菌ＸＬ１−ブルーのＯ／Ｎ培養を、Promega溶菌緩衝液を使用して溶解した。５０μｌの液体抽出物を３７℃及び４０℃下、種々の時間で熱不活性化した。１０μｌの加熱抽出物のアリコートを、Promegaライブアッセイ（live assay）緩衝液中で試験した（１００μｌ）。
結果を以下の表に示す。
【００１９】

【００２０】

【００２１】
３つの変異体について４０℃で実験を繰り返した。

【００２２】

【００２３】
これらの結果は、Ｔ２１４Ｃがｒ−ｗｔ（野生型）又はＴ２１４Ａ若しくはＮのいずれかよりも有意に熱安定性が高いことを示している。存在するシステイン残基が多くなる程、熱安定性が悪くなると予想していたので、特性におけるこの変化は予想外のものであった。
実施例８
その他の点変異体の研究
単一の点変異を有するその他のフォティナス・ピラリス変異体のシリーズを、ランダムエラー易発性PCRを使用して調製した（図５）。生成した変異体のスクリーニング及び配列決定の後、その配列決定を、部位特異的突然変異誘発、続く更なる配列決定を用いてチェックした。Ｄ２３４Ｇ、Ａ１０５Ｖ及びＦ２９５Ｌが存在した。これらの変異体の熱安定性は、試験した組換え野生型フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼと同様であった。Promega溶菌緩衝液中タンパク質サンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、その活性を２、５及び１０分後にアッセイした。図４に示す結果は、各変異体が野生型よりも増強された熱安定性を生じることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の変異体の生産に使用するプラスミドを示している。
【図２】図２は、本発明のルシフェラーゼを含むルシフェラーゼについての熱不活性化研究の結果を示している。
【図３】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図４】図４は、その他のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図５】図５は、本発明の変異体酵素の生産に使用したオリゴヌクレオチドを示している。[0001]
The present invention relates to novel enzymes, in particular mutant luciferase enzymes with increased thermostability compared to the corresponding wild-type enzyme, the use of said enzymes in an assay and a test kit comprising said enzymes.
Firefly luciferase contains ATP, Mg²⁺And catalyzes the oxidation of luciferin with the production of light in the presence of molecular oxygen. This reaction has a quantum yield of about 0.88. The luminescent properties of the luciferase lead to the use of the enzyme in various luminometric assays that measure ATP levels. Examples of such assays include those based on the descriptions of EP-B-680515 and WO96 / 02665.
Luciferase can be obtained directly from the insect body, in particular beetles such as fireflies or fireflies. Specific species from which luciferase can be obtained include the Japanese or KEIKE firefly, Luciola cruciata and Luciola lateralis, the Eastern European firefly Luciola mingrelica, and the North American firefly. It includes certain Photinus pyralis and the amber firefly Lampyris noctiluca. Other species from which luciferase can be obtained are described in Ye et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1339 (1997) 39-52. A further species described in Viviani et al., Biochemistry, 38, (1999) 8271-8279 is Phrixothrix (railroad-worms).
However, since many genes encoding these enzymes have been cloned and sequenced, they could also be produced using recombinant DNA technology. A recombinant DNA sequence encoding the enzyme is used to transform a microorganism such as E. coli to express the desired enzyme product.
The thermal stability of wild-type and recombinant luciferase is such that its activity rapidly disappears when exposed to temperatures above about 30 ° C, especially above 35 ° C. This instability creates problems when storing the enzyme under high ambient temperatures or when performing the assay under high temperature reaction conditions, for example, to increase the reaction rate.
Mutant luciferases with increased thermostability are known from EP-A-524448 and W095 / 25798. The former describes a mutant luciferase having a mutation at site 217 by replacing a threonine residue with an isoleucine residue in a Japanese firefly luciferase. The latter has more than 60% similarity to the luciferase from Photinas pyralis, Luciola mingleica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, but corresponds to the amino acid residue at site 354 of Photinus pyralis or site 356 of Luciola species A mutant luciferase is described that is mutated so that the amino acid residue is other than glutamate.
[0002]
Applicants have found additional variants that provide increased thermal stability and that complement variants known in the art.
The present invention has luciferase activity and has Phototina pyralis, Luciola mingleica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, Hotaria paroula, Pyrophorus plagiophthalamus, Rampyris A protein having at least 60% similarity to a luciferase from Noctilca, Pyrocoelia nayako, Photinus pennsylanvanica or Filixix, comprising:
(A) an amino acid residue corresponding to amino acid residue 214 of luciferase from Photinas pyralis or amino acid residue 216 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase,
(B) an amino acid residue corresponding to amino acid residue 232 of luciferase derived from Photinas pyralis or amino acid residue 234 of luciferase derived from Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis;
(C) an amino acid residue corresponding to amino acid residue 295 of Photinus pyralis-derived luciferase or amino acid residue 297 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase,
(D) amino acid residue 14 of Photinus pyralis-derived luciferase, amino acid residue 16 of Luciola mingrelica-derived luciferase, or amino acid residue 17 of Luciola cruciata or Luciola lateralis-derived luciferase,
(E) the amino acid residue 35 of Photinus pyralis-derived luciferase, the amino acid residue 37 of Luciola mingrelica-derived luciferase, or the amino acid residue 38 of Luciola cruciata or Luciola lateralis-derived luciferase,
(F) Amino acid residue 105 of luciferase derived from Photinas pyralis, amino acid residue 106 of luciferase derived from Luciola mingrelica, amino acid residue 107 of luciferase derived from Luciola cruciata or Luciola lateralis, or amino acid residue of Lucifera derived from Luciola lateralis gene An amino acid residue corresponding to group 108,
(G) an amino acid residue corresponding to amino acid residue 234 of Lucinase derived from Photinas pyralis or amino acid residue 236 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase,
(H) an amino acid residue corresponding to amino acid residue 420 of Photinus pyralis-derived luciferase or amino acid residue 422 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase;
(I) the amino acid residue 310 of Photinus pyralis-derived luciferase or the amino acid residue corresponding to amino acid residue 312 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis;
At least one of which is different from the amino acid appearing in the corresponding wild-type sequence, and the luciferase enzyme has an increased heat compared to an enzyme having the amino acid of the corresponding wild-type luciferase of a specific species at the site. Provided is an enzyme characterized by having stability.
[0003]
Preferably, the protein has luciferase activity, and Photonus pyralis, Luciola minglerica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, Hotaria parola, Pyrophorus pragiofaramus, Rampyris noctilka, Pyrocoelia nayako Alternatively, it has at least 60% similarity to luciferase from Photina pensilla vanica.
In particular, the protein has a luciferase activity and has a wild-type luciferase sequence, such as Photinas Piralis, Luciola Mingrelica, Luciola cruciata or Luciola Lateralis, Hotaria parola, Pyrophorus pragiofaramus (Green -Luc GR), Pyrophorus pragiofaramus (yellow green Luc YG), Pyrophorus pragiofaramus (yellow-Luc YE), Pyrophorus pragiofaramus (orange-Luc OR), Rampyris noctilka , Piroko Area Nayako, Fotinas Pensilan Vanica LY, Fotinas Pensilan Vanica KW, Fotinas Pensilan Vanica J19 or Filixosix Green (Pv_GR) Or red (Ph_RE) Substantially. However, the protein may contain one or more, for example, up to 100 amino acid residues, preferably no more than 50, more preferably no more than 30 amino acids that are engineered to differ from the amino acids of the wild-type enzyme.
In particular, a bioluminescent enzyme derived from a species that can produce light emission using the substrate D-luciferin (4,5-dihydro-2- [6-hydroxy-2-benzothiazolyl] -4-thiazole carboxylic acid) Will form the basis of the mutant enzymes of the present invention.
According to the examples, the luciferase of the present invention has substantially the Photinus pyralis luciferase sequence and has at least one of the following changes.
(A) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 214 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed to an amino acid residue other than threonine;
(B) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 232 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed in addition to isoleucine,
(C) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 295 of Photinus pyralis derived luciferase is changed in addition to phenylalanine,
(D) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 14 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed to other than phenylalanine,
(E) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 35 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed in addition to leucine,
(F) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 105 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed to other than alanine,
(G) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 234 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed to other than aspartic acid,
(H) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 420 of Photinus pyralis derived luciferase is changed to other than serine,
(I) The amino acid residue corresponding to amino acid residue 310 of Photinus pyralis-derived luciferase is changed to other than histidine.
[0004]
When the protein of the present invention substantially has the sequence of an enzyme derived from Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, it has at least one of the following changes.
(A) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 216 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase (in a sequence based on Luciola mingrelica) is other than glycine, or (Luciola Other than asparagine (in sequences based on Cruciata or Luciola lateralis).
(B) The amino acid residue corresponding to the amino acid residue 234 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase is other than serine.
(C) The amino acid residue corresponding to amino acid residue 297 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase is other than leucine.
(D) The amino acid residue corresponding to the amino acid residue 16 of Luciola mingrelica-derived luciferase or the amino acid residue 17 of Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase is other than phenylalanine.
(E) The amino acid residue corresponding to the amino acid residue 37 of Luciola mingrelica-derived luciferase or the amino acid residue 38 of Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase is other than lysine.
(F) an amino acid residue corresponding to amino acid residue 106 of Luciola mingrelica-derived luciferase, an amino acid residue corresponding to amino acid residue 107 of Luciola cruciata or Luciola lateralis, or an amino acid of Luciola lateralis-derived luciferase The amino acid residue corresponding to residue 108 is other than glycine.
(G) The amino acid residue corresponding to amino acid residue 236 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola terrateris-derived luciferase is other than glycine.
(H) The amino acid residue corresponding to the amino acid residue 422 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase is other than threonine.
(I) the amino acid residue corresponding to the amino acid residue 312 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis is not threonine (in a sequence based on Luciola mingrelica) or ( Other than valine (in sequences based on Cruciata or Luciola Lateralis).
[0005]
The particular substituted amino acid in all cases that enhance thermal stability can be determined by routine methods as described below. In each case, different substitutions will cause increased thermal stability. As will be appreciated by those skilled in the art, substitution could be made by site-directed mutagenesis of the DNA encoding the natural or appropriate mutant protein. In this case, the present invention relates to the identification of proteins associated with thermal stability.
However, in general, it is preferable to consider substitution with an amino acid having a property different from that of the wild-type amino acid. Thus, in some cases, hydrophilic amino acid residues will preferably be substituted with hydrophobic amino acid residues (and vice versa). Similarly, acidic amino acid residues will be replaced with basic amino acid residues.
For example, the protein of the invention has luciferase activity and has at least 60% similarity to a luciferase enzyme from Photinus pyralis, Luciola minglerica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, within its sequence It has at least one of the following changes and has increased thermostability compared to the wild type luciferase enzyme.
(A) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 214 of luciferase derived from Photinas pyralis and the amino acid residue corresponding to amino acid residue 216 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase are mutated, In addition, in the case of luciferase derived from Photinas pyralis, it is other than threonine.
(B) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 232 of Photinus pyralis-derived luciferase and the amino acid residue corresponding to amino acid residue 234 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase are mutated, And in the case of the luciferase derived from Photinus pyralis, it is other than isoleucine.
(C) the amino acid residue corresponding to amino acid residue 295 of Photinus pyralis-derived luciferase and the amino acid residue corresponding to amino acid residue 297 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase are mutated, And, for example, in the case of Photinus pyralis-derived luciferase, it is other than phenylalanine.
[0006]
All sequences of the various luciferases are highly conserved, indicating that there is a significant degree of similarity between these enzymes. This indicates that the corresponding region between enzyme sequences can be easily determined by examining the sequence and detecting the most similar region. If necessary, commercially available software (eg, “Bestfit” of the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Devereux et al. (1984) Nucleic Acid Research 12: 387-395 can be used to determine various intersequence corresponding regions or specific amino acids. See). Alternatively or additionally, the corresponding acid can be determined according to the literature: L. Ye et al., Biochim. Biophys Acta 1339 (1997) 39-52. The numbering system used in the document forms the basis of the numbering system used in this application.
For possible changes in the amino acid residue corresponding to amino acid residue 214 of Photinus pyralis luciferase, the polar amino acid threonine is a non-polar amino acid such as alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan or It is appropriately substituted with cysteine or the like. A particularly preferred substitution of the threonine residue corresponding to amino acid residue 214 of Photinus pyralis luciferase is by alanine. A more preferred substitution is by cysteine. However, different polar residues at this site, such as asparagine, will also enhance the thermal stability of the corresponding enzyme with threonine at that site.
Other amino acids appearing at this site in the wild-type luciferase enzyme include glycine (Luciola mingleica, Hotaria parola), asparagine (Pyrophorus pragiofaramus, GR, YC, YE and OR, Luciola cruciata, Luciola. Lateralis, Rampyris noctilka, Pyroceria nayako, Photina pensilla vanica LY, KW, J19) and serine (site 211 of fixosix luciferase). Substitution with non-polar or different non-polar side chains such as alanine and cysteine would be advantageous.
[0007]
For possible changes in the amino acid residue corresponding to amino acid residue 232 of Photinus pyralis derived luciferase, the nonpolar amino acid isoleucine is a different nonpolar amino acid such as alanine, glycine, valine, leucine, proline, phenylalanine, It is appropriately substituted with methionine, tryptophan or cysteine. Other amino acids appearing at this site in the wild type sequence include serine and asparagine (same as valine or alanine at the corresponding 229th site in Phritothix green and Red, respectively). included. Suitably, these polar residues are replaced by non-polar residues, such as those outlined above. A particularly preferred substitution of the residue corresponding to amino acid residue 232 of Photinus pyralis-derived luciferase and the residue corresponding to residue 234 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis is by alanine. This indicates an amino acid change relative to the wild type sequence.
Changes in the amino acid residue corresponding to amino acid residue 295 of Photinus pyralis-derived luciferase and the amino acid residue corresponding to amino acid residue 297 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase are also affected by the thermal stability of the protein. (This corresponds to residue 292 of fixosix luciferase). In general, the amino acid at this site is the non-polar amino acid phenylalanine or leucine. These are modified with different nonpolar amino acids. For example, in Photinus pyralis, the nonpolar amino acid phenylalanine is suitably substituted by a different nonpolar amino acid, such as alanine, leucine, glycine, valine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan or cysteine. A particularly preferred substitution for the phenylalanine residue corresponding to amino acid residue 214 of Photinus pyralis luciferase is by leucine.
Mutations in the amino acid residue corresponding to amino acid residue 14 of Photinus pyralis-derived luciferase or amino acid residue 16 corresponding to amino acid residue 16 of Luciola-derived luciferase (amino acid residue 13 in the fixosix-derived luciferase) are also possible. This amino acid residue (usually phenylalanine, but may be leucine, serine, arginine or in some cases tyrosine) is a different amino acid, particularly different non-polar amino acids such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, It will be modified appropriately to methionine or tryptophan, preferably alanine.
[0008]
Mutations in amino acid residue 35 corresponding to amino acid residue 35 of the luciferase from Photinus pyralis or amino acid residue 37 of the luciferase derived from Luciola mingrelica (corresponding to amino acid 38 in other Luciola species and Filixix) would also be effective . This amino acid varies between wild-type enzymes and will include not only leucine (Fotinas pyralis) at this site, but also lysine, histidine, glycine, alanine, glutamine and aspartic acid. Suitably the amino acid residue at this site is suitably substituted with a non-polar amino acid residue or a different non-polar amino acid such as alanine, valine, phenylalanine, isoleucine, proline, methionine or tryptophan. The preferred amino acid at this site is alanine, which is different from the wild type enzyme.
The mutation at the amino acid corresponding to site 14 of the sequence from Photinus pyralis and / or the mutation at amino acid residue 35 corresponding to amino acid residue 35 of Photinus pyralis luciferase is preferably not the only mutation in this enzyme. These mutations are suitably accompanied by other mutations as defined above, in particular mutations at sites corresponding to

sites

214, 395 or 232 of Photinus pyralis luciferase.
An amino acid residue corresponding to residue 105 in Photinus pyralis-derived luciferase and an amino acid residue corresponding to amino acid residue 106 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase (residue 102 in Filixos) Changes will also affect the thermal stability of the protein. In general, the amino acid at this site will be a non-polar amino acid alanine or glycine, and in fixos it will be serine. These amino acids are appropriately modified with different nonpolar amino acids. For example, in Photinus pyralis, the nonpolar amino acid alanine is appropriately substituted with a different nonpolar amino acid, such as phenylalanine, leucine, glycine, valine, isoleucine, proline, methionine or tryptophan. A particularly preferred substitution for the alanine residue corresponding to residue 105 of Photinus pyralis luciferase is by valine.
[0009]
Amino acid residue corresponding to amino acid residue 234 of Photinus pyralis-derived luciferase and amino acid residue 236 (residue 231 in Filixos) of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase This change will also affect the thermal stability of the protein. In general, the amino acid at this site is aspartic acid or glycine, and in some cases glutamine or threonine. These are suitably substituted with nonpolar amino acids or different nonpolar amino acids. For example, in Photinus pyralis, the amino acid residue aspartic acid is suitably substituted by a nonpolar amino acid such as alanine, leucine, glycine, valine, isoleucine, proline, methionine or tryptophan. Particularly preferred for substitution of the phenylalanine residue corresponding to amino acid residue 234 of Photinus pyralis luciferase is glycine. If a nonpolar amino acid residue, such as glycine, is present at this site (eg, in Luciola derived luciferase), the glycine will be appropriately substituted with a different nonpolar amino acid.
An amino acid residue corresponding to amino acid residue 420 of Photinus pyralis-derived luciferase and amino acid residue 422 of Lucifera mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase (residue 417 and fixosix in Fixosix Green Changes in amino acid residues corresponding to residue 418) in red will also affect the thermal stability of the protein. Generally, the amino acid at this site is an uncharged polar amino acid, serine or threoline or glycine. These are appropriately substituted with different uncharged polar amino acids. For example, in Photinus pyralis, serine is suitably substituted by asparagine, glutamine, threonine or tyrosine, especially threonine.
Changes in amino acid residues corresponding to amino acid residue 310 of Photinus pyralis-derived luciferase and amino acid residues corresponding to amino acid residue 312 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase are also affected by the thermal stability of the protein. Will affect. The amino acids at this site vary between known luciferase proteins, and are histidine in the luciferase from Photinas pyralis, Pyceria nayako, Rampyris noctilca and some forms of Photina pensilvanica. And threonine from phyllixosix (amino acid residue 307), valine in Luciola cruciata and Luciola terrateris, and asparagine in some Pyrophoras luciferase-derived luciferases. Thus, in general, the amino acid at this site is a hydrophilic amino acid, which may be replaced with a different amino acid residue to increase the thermal stability of the enzyme. A particularly preferred substitution for the histidine residue corresponding to amino acid residue 310 of Photinus pyralis luciferase is by arginine.
[0010]
Other mutations may be present in the enzyme. For example, in a preferred embodiment, the protein is other than glycine, proline or aspartic acid from glutamine at the site corresponding to amino acid 354 of Photinus pyralis-derived luciferase (site 356 in Luciola-derived luciferase and site 351 of fixosix-derived luciferase). It has an amino acid changed to an amino acid. Suitably the amino acids at this site are tryptophan, valine, leucine, isoleucine and asparagine, particularly preferably lysine or arginine. This mutation is described in WO 95/25798.
In an alternative preferred embodiment, as described in EP-A-052448, the protein comprises an amino acid in which the site corresponding to amino acid residue 217 of Luciola luciferase is replaced with a hydrophobic amino acid, in particular isoleucine, leucine or valine. Have.
The protein may further contain mutations in the sequence provided that the luciferase activity of the protein is not overly compromised. The mutation appropriately enhances the properties of the enzyme or in some cases makes it more suitable for the intended purpose. This means that further mutations can affect thermostability and / or color shift properties and / or K of the enzyme relative to ATP._mIt means to cause the enhancement of. Examples of mutations that cause a color shift are described in WO95 / 18853. K_mVariations that affect values are described, for example, in WO96 / 22376 and International Patent Application No. PCT / GB98 / 01026. These documents are incorporated herein by reference.
The protein of the invention suitably has more than one mutation, preferably all three of the aforementioned mutations.
The proteins of the present invention include both wild type and recombinant luciferase enzymes. The protein of the present invention, as described above, means that at least 60% of the amino acids present in the wild-type enzyme are present in the protein of the present invention, and the luciferase derived from Photinus pyralis, Luciola minglerica, Luciola cruciata or Luciola lateralis. It has at least 60% similarity to the sequence or sequence of other luciferase enzymes. The proteins of the invention can have a higher degree of similarity to the wild-type enzyme, in particular at least 70%, more preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%. Similar proteins of this type include allelic variants, proteins from other insect species, and recombinantly produced enzymes.
[0011]
The protein of the present invention will be identified in that it is encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent hybridization conditions, preferably under high stringency conditions, to a sequence encoding a wild type enzyme. Such conditions are well known to those skilled in the art and are exemplified in, for example, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Generally, low stringency conditions are defined as 3 × SSC at about ambient temperature to about 65 ° C., and high stringency conditions are defined as 0.1 × SSC at about 65 ° C. SSC is the name of a buffer consisting of 0.15M NaCl, 0.015M trisodium citrate. 3 × SSC is 3 times the same strength SSC.
In particular, the similarity between the sequences of the present invention and specific sequences is described in Lipman and Pearson (Lipman, DJ & Pearson, WR (1985) Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol 227, ppl435-1441). It will be evaluated using a multiple alignment method. The “optimized” percentage score is calculated using the following parameters for the Lipman-Pearson algorithm: ktup = 1, gap penalty = 4 and gap penalty length = 12. Should be. Sequences that evaluate similarity should be used as “test sequences”. This is described in the base sequence for comparison, for example, the sequence of Photinus pyralis or Ye et al., The above other sequences recorded above, or in the case of fixos, Biochemistry, 1999, 38, 8271-8279. Sequences that are meant to be used as reference sequences.
A particular example of the present invention is a wild type luciferase sequence having the above mutation. This protein has at least one, preferably more than one of said displacements.
The present invention further provides a nucleic acid encoding the luciferase. Suitably, the nucleic acid is based on a wild type sequence well known to those skilled in the art. Appropriate mutations that produce the desired mutation in the amino acid sequence will be readily apparent based on knowledge of the genetic code.
[0012]
The nucleic acid of the present invention is appropriately incorporated into an expression vector, for example, a plasmid under the control of control elements such as a promoter, enhancer, terminator and the like. Transforming host cells, such as prokaryotic or eukaryotic cells, such as plant or animal cells, in particular prokaryotic cells, such as E. coli, with these vectors and expressing the desired luciferase enzyme in the cells. Can do. Conditions well known in the art can be used to produce luciferase enzyme in the culture of the resulting transformed cells, which can then be separated from the culture medium. When the cell is an animal or plant cell, the plant or animal may be propagated from the cell. Then, you may extract protein from the said plant. In the case of transgenic animals, the protein may be recovered from the milk. Vectors, transformed cells, transgenic plants and animals and all methods of producing enzymes by culturing said cells form a further aspect of the present invention.
Phototinus pyralis T214A mutant luciferase was generated by the following random mutagenesis. T214A single point mutant has higher thermostability than wild type luciferase.
When two new triple mutant luciferases: E354K / T214A / A215L and E354K / T214A / I232A were made, they also showed high thermostability.
Specific examples of Photonus pyralis mutant enzymes within the scope of the present invention include:
I232A / E354K
T214A / I232A / E354K
A215L / I232A / E354K
T214A / I232A / E354K / A215L
I232A / E354K / T214A / F295L
I232A / E354K / T214A / F295L / F14A / L35A
I232A / E354K / T214A / F295L / Fl4A / L35A / A215L
A105V
T214A
T214C
T214N
T295L
I232A
F14A
L35A
D234G
S420T
H31OR
Or all other equivalents when derived from other species of luciferase.
Mutations for creating triple mutants were introduced into the luciferase gene on plasmid pET23 by site-directed mutagenesis (PCR). The oligonucleotides added to the PCR reactions to cause the relevant mutations are those given in the examples below.
It has already been shown that the effects of point mutations at sites 354 and 215 are additive. The present invention offers the possibility of combining three or more mutations to give higher thermal stability.
The thermostable luciferase of the present invention will be advantageously used in all bioluminescent assays that utilize the luciferase / luciferin reaction as a signal transduction means. A large number of assays are known in the literature. Therefore, the protein of the present invention will be included in a kit prepared in view of the performance of the above assay, as appropriate, along with luciferin and other reagents necessary to perform a particular assay.
The invention will be described in detail by way of example with reference to the accompanying drawings.
[0013]
Example 1
Identification of thermostable mutant luciferase
Error-prone PCR was based on a protocol devised by Fromant et al., Analytical Biochemistry, 224, 347-353 (1995).
The dNTP mixture in this reaction was as follows.
35 mM dTTP
12.5 mM dGTP
22.5 mM dCTP
14 mM dATP
PCR conditions were as follows.
0.5 μl (50 ng) plasmid pPW601a J54^*
5.0 μl 10 × KCl reaction buffer
1 μl each of W56 and W57⁺(60 pmole of each primer)
1 μl Biotaq® polymerase (5 U)
2 μl dNTPs (see above)
1.76 μl MgCl₂(50 mM stock)
1 μl mNCl₂(25 mM stock) [final concentration in reaction = 3.26 mM]
36.7 μl dH₂O
^*Plasmid pPW601aJ54 is a mutant version of pPW601a (WO95 / 25798), and an NdeI site was created within 3 bases before the ATG start codon. This allowed easy cloning from pPW601a to the pET23 vector.
+ Primer sequence:

Under the parameters of the cycle.
5 minutes at 94 ° C,
Then at 94 ° C for 30 seconds
30 seconds at 55 ° C
5 minutes at 72 ° C
Cycle x 12,
10 minutes at 72 ° C.
[0014]
The PCR product was purified from the reaction mixture using the Clontech Advantage® PCR-pure kit. An aliquot of the purified product was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI. The digested PCR product was then “cleaned up” with the Advantage kit and ligated into the vector pET23a digested with the same enzymes.
Ligation conditions:
4 μl pET23a (56 ng)
5 μl PCR product (200 ng)
3 μl 5 × GibcoBRL ligase reaction buffer
1 μl GibcoBRL ligase (10 U)
2 μl dH₂O
Ligation was performed overnight at 16 ° C.
Ligated DNA was purified using the Advantage® kit and then electroporated into electrocompetent HB101 cells (1 mm cuvette, 1.8 Kv).
Eleven electroporations were performed and then the cells were added to 40 ml of TY broth containing 50 μg / ml ampicillin. The cells were then grown overnight at 37 ° C. Plasmid DNA was purified using a total of 50 ml of culture grown overnight. This was a library.
Library screening
E. coli BL21 DE3 cells were electroporated using an aliquot of the plasmid library. These cells were seeded on LB agar containing 50 μg / ml ampicillin and grown overnight at 37 ° C.
The next day, colonies were picked, patched to nylon filters on LB agar + amp plates and grown overnight at 37 ° C. The next day, the filter was covered with a luciferin solution (500 μM in 100 mM sodium citrate, pH 5.0). The patch was then observed in a dark room. 200 to 1 colonies / patch were selected for further analysis.
Characterization of thermostable mutants
An E. coli clone carrying the mutant plasmid was isolated. Plasmid DNA was prepared for ABI sequencing. The complete open reading frame encoding luciferase was sequenced using four different oligonucleotide primers. Sequencing revealed a single point mutation from A to G at nucleotide 640. A codon change from ACT (T) to GCT (A) resulted in an amino acid change at site 214.
[0015]
Example 2
Preparation of triple mutant enzyme
A mutagenic oligonucleotide was used to create the same mutation in pMOD1 (A215L / E354K), creating a triple mutant pMOD2 (A215L / E354K / T214A). This mutation also created a unique SacI / SstI site in pMOD1.
Example 3
Preparation of additional triple mutant enzymes
Using the pET23 plasmid having the T214A mutation as a template, a triple mutant T214A / I232A / E354K was prepared by a standard PCR reaction using the following primers.

Example 4
Identification of thermostable 295 variants
F295 mutants were generated using the error-prone PCR method described in Fromant et al., Analytical Biochemistry, vol 224, 347-353 (1995). PCR conditions were as follows.
0.5 μl (50 ng) plasmid pET23
5.0 μl 10 × KCl reaction buffer
1 μl primer 1 60 pmol of each primer
1 μl primer 2
1 μl Biotaq® polymerase (5 U)
2 μl dNTPs, 35 mM dTTP in mixture, 12.5 mM dGTP, 22.5 mM dCTP, 14 mM dATP
1.76 μl MgCl₂(50 mM stock)
1 μl MnCl₂(25 mM stock) [final concentration during reaction = 3.26 mM]
36.7 μl dH₂O

[0016]
The cycle parameters were as follows:
At 94 ° C for 5 minutes,
Then at 94 ° C for 30 seconds
30 seconds at 55 ° C
5 minutes at 72 ° C
Cycle x15,
10 minutes at 72 ° C.
The PCR product was purified from the reaction mixture using the Clontech Advantage® PCR-Pure kit. An aliquot of the purified product was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI. The digested PCR product was then “cleaned up” with the Advantage kit and ligated into the vector pET23a digested with the same enzymes.
The ligation conditions were as follows:
56ng pET23a
200 ng PCR product
3 μl 5 × GibcoBRL ligase reaction buffer
1 μl GibcoBRL ligase (10 U)
The volume was made up to 10 μl with dH 2 O.
Ligation was performed overnight at 16 ° C.
Ligated DNA was purified using the Advantage® kit and then electroporated into electrocompetent E. coli DH5α cells (1 mm cuvette, 1.8 Kv). 1 ml of SOC broth was added to each electroporation to recover the cells and express the antibiotic resistance gene encoded by the plasmid. An aliquot of the library was plated on LB agar containing 50 μg / ml ampicillin and the bacteria were grown overnight at 37 ° C. The agar plate was covered with a nylon filter disc and the colonies were transferred to a fresh plate. The original plate was left at room temperature to re-grow colonies. Plates were incubated with nylon filters at 42 ° C. for 2 hours, then sprayed with 500 μM luciferin in 100 mM citrate buffer, pH 5.0 and observed in the dark.
Three thermostable colonies were selected based on growth after 2 hours at 42 ° C. Plasmid DNA was isolated from these clones and sequenced, revealing in each case the F295L mutation.
[0017]
Example 5
Other variants of the invention were produced by PCR using appropriate combinations of the oligonucleotides described above and below.

Example 6
Study on purification and heat inactivation of luciferase
Cells expressing the recombinant mutant luciferase were grown, disrupted and extracted as described in WO95 / 25798 to obtain a cell-free extract of luciferase.
Eppendorf tubes containing cell-free extracts were usually incubated at 40 ° C unless otherwise stated. Heat-stable containing a purified preparation of wild-type luciferase (comparative purpose) containing 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) containing 10% saturated ammonium sulfate, 1 mM dithiothreitol and 0.2% bovine serum albumin (BSA). Incubated in neutral buffer. At set times, the tubes were removed and cooled in an ice / water bath before measuring the remaining assayed activity calculated as a percentage of initial activity or relative bioluminescence.
The results are shown in FIGS. From FIG. 2, it can be seen that the luciferase variants of the present invention have improved thermal stability compared to known variants.
The dramatically increased stability against wild type luciferase (RWT) is evident from FIG.
[0018]
Example 7
Study on activity of 214 mutants
A library of 214 mutants was prepared by site-directed mutagenesis using cassette oligos (FIG. 5), thermostable mutants were selected and tested as in Example 1. Three specific thermostable variants were sequenced as in Example 1 and characterized as T214A, T214C, and T214N.
E. coli XL1-blue O / N cultures carrying plasmids encoding T214, T214A, T214C and T214N were lysed using Promega lysis buffer. 50 μl of the liquid extract was heat inactivated at 37 ° C. and 40 ° C. for various times. An aliquot of 10 μl of the heated extract was tested in Promega live assay buffer (100 μl).
The results are shown in the table below.
[0019]

[0020]

[0021]
The experiment was repeated at 40 ° C. for the three variants.

[0022]

[0023]
These results indicate that T214C is significantly more thermally stable than r-wt (wild type) or either T214A or N. This change in properties was unexpected because it was expected that the more cysteine residues present, the worse the thermal stability.
Example 8
Research on other point mutants
A series of other Photinus pyralis mutants with a single point mutation were prepared using random error-prone PCR (Figure 5). After screening and sequencing of the mutants produced, the sequencing was checked using site-directed mutagenesis followed by further sequencing. D234G, A105V and F295L were present. The thermal stability of these mutants was similar to the luciferase derived from the recombinant wild type Photinus pyralis tested. Protein samples in Promega lysis buffer were incubated at 37 ° C. for 10 minutes and their activity was assayed after 2, 5 and 10 minutes. The results shown in FIG. 4 indicate that each mutant produces enhanced thermal stability over the wild type.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the plasmid used to produce the mutants of the invention.
FIG. 2 shows the results of a heat inactivation study for luciferases including the luciferases of the present invention.
FIG. 3 shows the results of thermostability experiments for various luciferase mutants.
FIG. 4 shows the results of thermostability experiments for other luciferase mutants.
FIG. 5 shows the oligonucleotide used for the production of the mutant enzyme of the present invention.

Claims

A protein derived from Photinus Pirari scan - derived wild-type luciferase,
214 of the amino acid of the wild-type luciferase of Photinus Pirari scan - derived has been mutated to alanine or cysteine, protein.

The protein of claim 1,
214 of the amino acid of the wild-type luciferase of Photinus Pirari scan - derived has been mutated to alanine, protein.

A nucleic acid encoding the protein according to claim 1 or 2.

A vector comprising the nucleic acid according to claim 3.

A cell transformed with the vector according to claim 4.

The cell according to claim 5, which is a prokaryotic cell.

Use of the protein according to claim 1 or 2 in a bioluminescence assay.

A kit comprising the protein according to claim 1 or 2.