JP5167149B2 - 白血病の診断および治療ターゲット - Google Patents

Description

［関連出願情報］
本願は、２００６年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／７６０，７０９号の利益を主張し、その開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

［連邦政府の支援に関する記載］
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号ＧＭ６８８０４の下に、連邦政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

［発明の分野］
本発明は、ヒストンメチル化に基づく、白血病治療用の候補化合物を識別する方法および診断方法に関する。

高次クロマチン構造は、遺伝子調節および後成的遺伝に著しく重要である（Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：６１９−６２３）。コアヒストンの翻訳後修飾は、高次クロマチン構造の確立および維持に影響を及ぼす。一定のコアヒストンの、特定構造を持たないテールは、アセチル化、メチル化、リン酸化、リボシル化およびユビキチン化によって、大規模に修飾される。ヒストン修飾をクロマチン構造と結びつける「ヒストンコード」仮説は、近年の集中的な研究の焦点になってきた（Ｓｔｒａｈｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１２９８−１３０６；Ｔｕｒｎｅｒ（２０００）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２：８３６−８４５）。ヒストンメチル化はヒストン修飾の主形態であることが明らかになっている（Ｓｔｒａｈｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１２９８−１３０６；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｅｒｇ（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：２３４３−２３６０）。特に、ＳＥＴドメインを含有するヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅｓ）の大きなファミリーが同定されている（Ｌａｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｎｕｗｅｉｎ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：２８６−２９８）。ＳＥＴドメインタンパク質は、ヒストンＨ３およびＨ４のさまざまなＮ末端リジン残基をメチル化することが示されている。ヒストンリジンメチル化は、転写調節から細胞分裂時に起こる染色体の正確な伝達まで、多様な生物学的過程に関連づけられている（Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｅｌｇｉｎ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２：１７８−１８７）。

さらにまた、ＳＥＴドメイン含有タンパク質が触媒するリジンメチル化は、がんに結びつけられている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７：３９６−４０２）。例えば、Ｈ３−Ｋ４メチルトランスフェラーゼＭＬＬは白血病ではしばしば転座し（Ａｙｔｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｒｙ（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：５６９５−５７０７；Ｍｉｌｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：１１０７−１１１７；Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：１１１９−１１２８）、Ｈ３−Ｋ２７メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２はいくつかの腫瘍において過剰発現され、その発現レベルはそれらの腫瘍の侵襲性と相関する（Ｂｒａｃｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＥＭＢＯ Ｊ．２２：５３２３−５３３５；Ｋｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１１６０６−１１６１１；Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１９：６２４−９）。

Ｄｏｔ１は、元々、サッカロミセスセレビシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、テロメアサイレンシングの破壊因子（ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）として同定された（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０：６１３−６３２）進化的に保存されたタンパク質である。これは減数分裂周期中のパキテン期チェックポイントにおいても機能する（Ｓａｎ−Ｓｅｇｕｎｄｏ ａｎｄ Ｒｏｅｄｅｒ（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１：３６０１−３６１５）。酵母Ｄｏｔ１の配列解析により、これは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ中のものに似た一定の特徴的ＳＡＭ結合モチーフを有することが明らかになった（Ｄｌａｋｉｃ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：４０５−４０７）。

最近、ｈＤＯＴ１ＬはヒストンＨ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼであり（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１０５２−１０５８）、ＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病誘発に重要な役割を果たすこと（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）が証明された。ＭＭＬ−ＡＦ１０によるＨｏｘａ９遺伝子へのｈＤＯＴ１Ｌのミスターゲティングは、Ｈ３−Ｋ７９メチル化およびＨｏｘａ９のアップレギュレーションをもたらし、それが白血病性形質転換の一因になることが示された（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。さらに、ｈＤＯＴ１ＬとＭＬＬ−ＡＦ１０の相互作用には、ＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に必要なＡＦ１０のＯＭ−ＬＺ（オクタペプチドモチーフ−ロイシンジッパー）領域が関与することも証明された（ＤｉＭａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９：３７８０−５）。

本発明者らは、（１）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合は、インビトロおよびインビボで白血病誘発を媒介するのに、必要かつ十分であるらしいこと、（２）ｈＤＯＴ１ＬおよびそのＨ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼ活性がＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に関係すること、（３）Ｈｏｘａ５遺伝子がＣＡＬＭ−ＡＦ１０による形質転換に関与することを、ここに初めて証明する。いかなる本発明の理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、ｈＤＯＴ１Ｌがタンパク質−タンパク質相互作用によってＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化を保つ実験モデルも提供する。ｈＤＯＴ１Ｌと会合したＣＡＬＭ−ＡＦ１０は、次に、Ｈｏｘａ５プロモーターに動員されてＨ３−Ｋ７９メチル化を媒介し、それが結果として、Ｈｏｘａ５アップレギュレーションおよび白血病誘発につながる。

染色体転座は、（特に急性白血病において）ヒトがんの主原因の一つである。キメラ遺伝子ＣＡＬＭ−ＡＦ１０を生成するｔ（１０；１１）（ｐ１２−１３；ｑ１４−ｑ２３）の転座は、Ｔ−ＡＬＬ（Ｔ細胞急性リンパ性白血病）およびＡＭＬ（急性骨髄性白血病）を含むさまざまなタイプの白血病に観察される（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １４：１００−１０４；Ｄｒｅｙｌｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：４６６２−７）。この染色体転座は、キメラ遺伝子ＭＬＬ−ＡＦ１０を生成するｔ（１０；１１）（ｐ１３；ｑ２３）の転座と区別することが難しい場合もあるが、ＭＬＬ−ＡＦ１０を持つ患者は、もっぱらＡＭＬを発症する（Ｂｅｖｅｒｌｏｏ ｅｔ ａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４２２０−４）。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０によるＡＭＬとＭＬＬ−ＡＦ１０によるＡＭＬにも顕著な相違がある。例えばＣＡＬＭ−ＡＦ１０によるＡＭＬはＭ０／１サブタイプに属するのに対し、ＭＬＬ−ＡＦ１０によるＡＭＬはＭ４／５サブタイプに属する（Ｄｒｅｙｌｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：４６６２−７；Ｂｅｖｅｒｌｏｏ ｅｔ ａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４２２０−４）。造血および白血病誘発におけるＭＬＬ（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）の役割は確立されているが、基礎にある分子機序は解明され始めたばかりである（Ａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：５６９５−５７０７；Ｄａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８：９６５−７４；Ｈｅｓｓ（２００４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．１４：２３５−５４）。ＭＬＬとは異なり、造血および白血病におけるＣＡＬＭ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）の機能は全くわかっていない。なぜなら、ＣＡＬＭタンパク質は転座がなければ細胞質に位置し、そこではクラスリンによる輸送に関与しているからである（Ｄｒｅｙｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３：４８０４−９；Ｔｅｂａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：２６８７−７０２）。実際、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の白血病性形質転換能は、実験的には証明されていない。

したがって第１の態様として、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、
ＤＯＴ１ＬポリペプチドがＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＤＯＴ１ＬポリペプチドをＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の相互作用を検出するステップとを含み、該試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、該試験化合物存在下での、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

さらに本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、
試験化合物がＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に結合するのに十分な条件下で、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物とＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の結合を検出するステップとを含み、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質への試験化合物の結合は、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法も提供する。

さらなる一態様として、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質がＨｏｘＡ５プロモーターに結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＨｏｘＡ５プロモーター領域を含む核酸をＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、ＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質のＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用を検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、試験化合物存在下での、ＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質とＨｏｘＡ５プロモーターの間の相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

さらにもう一つの態様として、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質が結合して複合体を形成し、前記複合体がＨｏｘＡ５プロモーターに結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＨｏｘＡ５プロモーター領域を含む核酸をＤＯＴ１ＬポリペプチドおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体のＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用を検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、試験化合物存在下での、ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体のＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

さらにもう一つの態様として、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、試験化合物がＨｏｘＡ５プロモーター領域および／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の部分に結合するのに十分な条件下で、ＨｏｘＡ５プロモーター領域および／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の部分を含む核酸を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物とＨｏｘＡ５プロモーターおよび／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の部分の間の結合を検出するステップとを含み、試験化合物とＨｏｘＡ５プロモーターおよび／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の部分の間の結合は、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

もう一つの態様として、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＨｏｘＡ５プロモーター活性にとって十分な条件下で、ＨｏｘＡ５プロモーター領域を含む核酸を試験化合物と接触させるステップと、ＨｏｘＡ５プロモーター活性を検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下でのＨｏｘＡ５プロモーター活性のレベルと比較した、試験化合物存在下でのＨｏｘＡ５プロモーター活性の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

他の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病サブタイプＭ０／１（ＡＭＬ−Ｍ０／１）の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、試験化合物の存在下で、ＤＯＴ１Ｌポリペプチドを、ヒストンＨ３を含むヒストンまたはヌクレオソーム基質と接触させるステップと、ヒストンＨ３リジン７９（Ｈ３−Ｋ７９）メチル化をもたらすのに十分な条件下で、基質のＨ３−Ｋ７９メチル化を検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下でのＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルと比較した、試験化合物存在下での、Ｈ３−Ｋ７９メチル化の減少は、前記試験化合物がＴ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

もう一つの態様として、本発明は、Ｔ−ＡＬＬまたはＡＭＬ−Ｍ０／１の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＤＯＴ１ＬポリペプチドがＡＦ１０に結合するのに十分な条件下で、ＤＯＴ１ＬポリペプチドをＡＦ１０と接触させるステップと、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＡＦ１０の間の相互作用を検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での結合のレベルと比較した、試験化合物存在下での、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＡＦ１０の間の相互作用の減少は、前記試験化合物がＴ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

本発明は診断方法も包含する。一態様として、本発明は、対象が白血病を有するかどうかもしくは白血病を発症する危険があるかどうかを診断し、かつ／または前記疾患の経過に関する予後を決定する方法であって、対象からヒストン（例えばヌクレオソーム）を含む生物学的試料を取得するステップと、ＨｏｘＡ５遺伝子と関連するヒストンＨ３リジン７９（Ｈ３−Ｋ７９）メチル化を検出するステップとを含み、非白血病生物学的試料中のＨｏｘＡ５関連Ｈ３−Ｋ７９メチル化のレベルと比較した、生物学的試料中のＨｏｘＡ５関連Ｈ３−Ｋ７９メチル化の増加は、前記対象が白血病を有することもしくは白血病を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／または前記対象における疾患の経過の予後指標となる方法を提供する。

さらにもう一つの態様として、本発明は、対象が白血病を有するかどうかもしくは白血病を発症する危険があるかどうかを診断し、かつ／または前記疾患の経過に関する予後を決定する方法であって、対象におけるＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定するステップを含む方法を提供する。

以下の発明の説明では、本発明のこれらの態様および他の態様を、さらに詳しく述べる。

クロマチン構造は遺伝子調節および後成的遺伝に重要である。ヒストンの翻訳後修飾は高次クロマチン構造の確立および維持に関与することが知られており、されにまた、一定のコアヒストンのテールが、アセチル化、メチル化、リン酸化、リボシル化およびユビキチン化によって修飾されることも報告されている。本発明は、一つには、（１）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合は、インビトロおよびインビボで白血病誘発を媒介するのに、必要かつ十分であるらしいこと、（２）ｈＤＯＴ１Ｌおよび前記Ｈ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼ活性がＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に関係すること、（３）Ｈｏｘａ５遺伝子がＣＡＬＭ−ＡＦ１０による形質転換に関与することの、初めての証明に基づく。いかなる本発明の理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、ｈＤＯＴ１Ｌがタンパク質−タンパク質相互作用によってＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化を保つ実験モデルも提供する。ｈＤＯＴ１Ｌと会合したＣＡＬＭ−ＡＦ１０は、次に、Ｈｏｘａ５プロモーターに動員されてＨ３−Ｋ７９メチル化を媒介し、それが結果として、Ｈｏｘａ５のアップレギュレーションおよび白血病誘発につながる。

以下に、本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面を参照して、本発明を説明する。本発明は異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載する実施形態に限定されると解釈してはならない。むしろこれらの実施形態は、この開示が十分かつ完全になり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達することになるように記載するものである。例えば、ある実施形態に関して例示する特徴は、他の実施形態に組み入れることができ、特定の実施形態に関して例示した特徴を、その実施形態から削除することもできる。さらにまた、本明細書に提案する実施形態に加えられる変形および付加であって、本発明から逸脱しないものは、本明細書に照らせば、当業者には明白になるだろう。

別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が一般に理解している意味と同じ意味を持つ。本明細書において使用する専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的としており、本発明を限定しようとするものではない。

本発明の説明および本願特許請求の範囲において使用する単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」（「ある」「一つの」「その」）は、文脈上そうでないことが明白でない限り、複数形も包含するものとする。

本明細書で使用する場合、「および／または」は、関連して列挙された事項の一つ以上の、ありとあらゆる、考えうる組み合わせを指し、それらを包含すると共に、もう一つの選択肢（「または」）で解釈する場合には、組み合わせの欠如も指し、包含する。

本明細書で使用する用語「ポリペプチド」はタンパク質とペプチドとの両方を包含する。

特定の実施形態では、本発明の実施に使用するポリペプチドが「単離された」ポリペプチドである。本明細書にいう「単離された」ポリペプチドとは、自然に存在する生物またはウイルスの他の構成成分、例えば細胞構造構成成分もしくはウイルス構造構成成分またはそのポリペプチドに付随して一般的に見出される他のポリペプチドもしくは核酸などの少なくとも一部から分離されているか、それら他の構成成分の少なくとも一部を実質的に含まないポリペプチドである。特定の実施形態では、「単離された」ポリペプチドが、少なくとも約１％、５％、１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の純度（ｗ／ｗ）を持つ。他の実施形態では、「単離された」ポリペプチドが、出発物質と比較して少なくとも約５倍、１０倍、２５倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上のタンパク質の濃縮（ｗ／ｗ）が達成されることを示す。

特定の実施形態では、本発明で使用される核酸が「単離された」核酸である。本明細書にいう「単離された」核酸とは、自然に存在する生物の他の構成成分、例えば細胞構造構成成分またはその核酸に付随してよく見出される他のポリペプチドもしくは核酸などの少なくとも一部から分離されているか、それら他の構成成分の少なくとも一部を実質的に含まない核酸を意味する。特定の実施形態では、「単離された」核酸が、少なくとも約１％、５％、１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の純度（ｗ／ｗ）である。他の実施形態では、「単離された」核酸が、出発物質と比較して少なくとも約５倍、１０倍、２５倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍またはそれ以上の核酸の濃縮（ｗ／ｗ）が達成されることを示す。

核酸に関して本明細書で使用する用語「発現」（およびその文法上の等価表現）は、核酸の転写および場合によっては翻訳を指す。

用語「調整する」（およびその文法上の等価表現）は増加または減少を指す。特定の実施形態では、用語「増加」または「強化」（およびその文法上の等価表現）が、少なくとも約２５％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれ以上の上昇を意味する。特定の実施形態では、用語「減少」または「低下」（およびその文法上の等価表現）が、少なくとも約２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の縮小を意味する。いくつかの実施形態では、表示した活性、物質または他のパラメータが検出可能でない。

「治療する」「治療すること」もしくは「の治療」（またはその文法上の等価表現）とは、対象の状態の重症度が低下するか、少なくとも部分的に改善もしくは寛解すること、および／または少なくとも一つの臨床症状にいくらかの軽減、緩和もしくは減少が達成されること、および／またはその状態の進行の遅延および／または疾患もしくは障害の発生の予防もしくは遅延が起こることを意味する。「治療する」（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｓ）「治療すること」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または「の治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）などの用語は、（例えば感染またはがんの発生を予防するための）対象の予防的治療も包含する。本明細書で使用する用語「予防する」（ｐｒｅｖｅｎｔ、ｐｒｅｖｅｎｔｓ）または「予防」（およびその文法上の等価表現）は、疾患の完全な撤廃を意味するのではなく、その状態の発生率を低下させ、その状態の発生および／または進行を遅延させ、かつ／またはその状態に関連する症状を減少させるあらゆるタイプの予防的治療を包含する。したがって、文脈上別段の解釈を必要とする場合を除き、用語「治療する」「治療すること」もしくは「の治療」（またはその文法上の等価表現）は、予防レジメンおよび治療レジメンの両方を指す。

本明細書にいう「治療有効量」とは、対象を（上に定義したように）治療するのに十分な量である。

本明細書にいう「診断方法」とは、特定の障害を患っている対象および／または特定の障害の危険がある対象を識別するために行われるスクリーニング手法を指す。

「予後判定方法」とは、疾患の経過（例えば活動性の多寡）を少なくとも部分的に予測するのを助けるために使用される方法を指す。言い方を変えると、予後判定方法は疾患の重症度を評価するために使用することができる。例えば、本明細書に開示するスクリーニング手法は、罹患個体を識別するためにも、疾患の重症度を評価するためにも、かつ／または疾患の今後の経過を予測するためにも行うことができる。そのような方法は、治療的処置の考えうる利益、実施すべき治療のタイプなどを評価するのに役立ちうる。また、以前に特定障害の診断を下された対象に対し、その特定対象について、その疾患がどのように進行するか、より深い洞察を得たい場合（例えば、特定の患者が特定の薬物治療に有利に応答する見込み、または特定の薬物治療に関して臨床試験を行う目的で患者を独特な異なる部分集団に分類または分別したい場合）に、予後判定方法を実行することもできる。

本明細書で言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

別段の表示がある場合を除き、本発明による組換えおよび合成ポリペプチド、融合タンパク質、抗体またはその抗原結合性断片の製造、核酸配列の操作、形質転換細胞の作出などには、標準的方法を使用することができる。そのような技法は、当業者には知られている。例えばＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ，「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ，「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

本発明者らは、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の相互作用が、ＨｏｘＡ５のアップレギュレーションおよび白血病誘発に関係することを確認した。したがって本発明は、ＤＯＴ１Ｌおよび／またはＣＡＬＭ−ＡＦ１０および／またはＨｏｘＡ５間の相互作用を創薬のターゲットとして使用する方法を提供する。

本発明は、現在知られているまたは今後発見される任意のＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＤＯＴ１Ｌ核酸を使って実施することができる。ＤＯＴ１Ｌ核酸およびＤＯＴ１Ｌポリペプチドについては以前に記述されている（例えば米国特許出願公開番号２００５−００４８６３４Ａ１；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１０５２−１０５８；およびＯｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８を参照されたい）。ＤＯＴ１の酵母ホモログは、元々、テロメアサイレンシングの破壊因子として同定された（酵母ＤＯＴ１のタンパク質配列および核酸配列はアクセッション番号ＮＰ＿０１０７２８に見出すことができる）。ｈＤＯＴ１Ｌ（ヒトＤＯＴ１様タンパク質）と呼ばれるヒトホモログがクローニングされ、単離され、ＨＭＴａｓｅであることが決定されている。ｈＤＯＴ１Ｌ核酸およびｈＤＯＴ１Ｌタンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０９５０４として登録されている。ｈＤＯＴ１Ｌの約３６０個のＮ末端アミノ酸だけが、酵母ＤＯＴ１と有意な配列類似度を持っている。さらに本発明者らは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５１００５６およびＣＡＡ９０６１０）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＧ１０２７２およびＡＡＦ５４１２２）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿１２５７３０）、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＡＡ０３５５８）、およびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＡＡ３３６３４）由来のＤＯＴ１ホモログも、公共データベース中の配列から同定している。これらのホモログではＳＡＭ結合ドメインが保存されている（約３０〜１００％のアミノ酸配列一致度および５０〜１００％のアミノ酸配列類似度［すなわち同一アミノ酸または保存されたアミノ酸］）。

触媒ドメイン（アミノ酸１〜４１６）を含有するｈＤＯＴ１Ｌタンパク質フラグメントの２．５Å解像度の構造が解明されている。ｈＤＯＴ１Ｌのアミノ酸１〜４１６について原子座標が決定され、ＲＣＳＢデータベースにＩＤコード１ＮＷ３として登録されている（Ｍｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１２：７１１−７２３も参照されたい）。

本発明の特定の実施形態では、ＤＯＴ１ＬポリペプチドがＨ３−Ｋ７９特異的ＨＭＴａｓｅ活性を持つ。Ｈ３−Ｋ７９「特異的」ＨＭＴａｓｅ活性とは（例えばヒストンまたはヌクレオソーム基質を使った場合に）全てのまたは基本的に全てのＨＭＴａｓｅ活性がＨ３−Ｋ７９に向けられることを意味する。

ＡＦ１０ポリペプチドも当分野では知られている。例えばヒトＡＦ１０配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５９８７４５；マウスＡＦ１０配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号０５４８２６を参照されたい。本発明は、現在知られているまたは今後決定される任意のＡＦ１０ポリペプチドを使って実施することができる。

さらに本発明は、当分野で現在知られているまたは今後発見される任意のＣＡＬＭポリペプチドを使って実施することができる。例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ０７７６２（ヒトアミノ酸）；Ｕ４５９７６（ヒトｍＲＮＡ）；Ｓ３６３２７；ＣＡＡ４８７４８およびＳ３６３２６（ラットアミノ酸）；Ｘ６８７７およびＮＭ＿０３１７２８（ラット核酸）；Ｍ８３９８５、ＡＡＡ３７５８７およびＡＡＡ３７５８６（マウスアミノ酸）；Ｓ２７８６６（マウス核酸）；ならびにＸＭ＿５９５０７５およびＸＰ＿５９５０７５（ウシアミノ酸）；Ｓ３９１５０およびＸＰ＿５９５０７５（ウシ核酸）を参照されたい。

「ＤＯＴ１Ｌポリペプチド」「ＡＦ１０ポリペプチド」および「ＣＡＬＭポリペプチド」という用語は、完全長ポリペプチドの機能的フラグメント、または実質的に類似するもしくは実質的に同一なアミノ酸配列（少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上のアミノ酸配列類似度または一致度）を持つ上記のいずれかの機能的等価物であって、ネイティブポリペプチドの機能的性質の一つ以上を保持しているものを包含する。

「機能的」とは、そのポリペプチド（または核酸）が、ネイティブポリペプチド（または核酸）の生物学的性質の一つ以上に関して、同じまたは実質的に類似する活性（例えばネイティブポリペプチド（または核酸）の活性の少なくとも約５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれ以上）を持つことを意味する。

例えば代表的な実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌポリペプチド（上で論じた機能的フラグメントおよび機能的等価物を含む）が、ネイティブＤＯＴ１Ｌポリペプチドと比較して同じまたは実質的に類似するＨ３−Ｋ７９ ＨＭＴａｓｅ活性、ＳＡＭ結合活性、ヒストンおよび／またはヌクレオソーム結合活性、ＡＦ１０結合活性、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質結合活性、白血病誘発活性および／または他の任意の興味ある生物学的活性を持つ。

ヒストン、ヌクレオソーム、核酸またはポリペプチドへのＤＯＴ１Ｌ結合を評価する方法は、当業者には明白であろう標準的技法を使って行うことができる（典型的方法については実施例を参照されたい）。そのような方法として、酵母および哺乳類細胞ツーハイブリッドアッセイおよび共免疫沈降技法が挙げられる。

ＤＯＴ１Ｌに関連する他の生物学的活性、例えばＨ３−Ｋ７９ ＨＭＴａｓｅおよび白血病誘発活性も、例えば下記実施例で述べるような当分野で知られる標準的方法を使って評価することができる。

本発明は、ＣＡＬＭ、ＡＦ１０、およびＤＯＴ１Ｌの機能的フラグメント、ならびにその機能的等価物を使って実施することもできる。特定の実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントおよびその機能的等価物が、ＳＡＭ結合ドメインを含む（場合によっては隣接する配列を含む）触媒ドメイン、およびそれをコードする核酸を含む。触媒ドメインを含む機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントおよび機能的等価物は、場合によってはＤＯＴ１Ｌ正荷電領域を、さらに含むことができる。

本発明の実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントまたは機能的等価物が、ＡＦ１０とのＤＯＴ１Ｌロイシンリッチ相互作用ドメインを含む。

代表的実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントまたは機能的等価物が、ロイシンジッパー領域および／またはコイルドコイル領域を含むことができる。

さらなる実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントまたは機能的等価物が、核外移行シグナルおよび／または核局在化シグナルを含む。

さらにもう一つの実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントまたは機能的等価物が、ＤＯＴ１ポリペプチドのＮ末端部分、例えばＮ末端の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸を含む。別の実施形態では、機能的フラグメントがＮ末端で切断され、例えば約１００、８５、７５、６０、５０、３５、２０、１５、１０または５個未満のアミノ酸がＮ末端から切断される。代表的実施形態では、機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントまたは機能的等価物が、Ｎ末端の１０〜１００アミノ酸、Ｎ末端の１０〜７０アミノ酸、Ｎ末端の２０〜５０アミノ酸またはＮ末端の２０〜４０アミノ酸を含む。別の代表的実施形態では、Ｎ末端の５〜１００、１０〜７５または１５〜５０アミノ酸が、Ｎ末端機能的ＤＯＴ１Ｌフラグメントまたは機能的等価物から切断される。

ＡＦ１０に関して、代表的実施形態では、機能的ＡＦ１０フラグメントまたは機能的等価物が、ネイティブＡＦ１０ポリペプチドと同じまたは実質的に類似するＤＯＴ１Ｌ結合活性、白血病誘発活性および／または他の任意の興味ある生物学的活性を持つ。さらにまた、機能的ＡＦ１０フラグメントまたは機能的等価物は、ＯＭ−ＬＺドメイン、例えばＡＦ１０のアミノ酸７１９〜８００［ヒトＡＦ１０配列、アクセッション番号ＡＹ５９８７４５；マウスＡＦ１０配列、アクセッション番号０５４８２６］、ＰＨＤ配列、ＡＴ配列、Ｃ末端グルタミンリッチ領域および／または核局在化シグナルを含むことができる。

機能的ＣＡＬＭフラグメントまたは機能的等価物は、ネイティブＣＡＬＭポリペプチドと比較して、同じまたは実質的に類似する白血病誘発活性、ＨｏｘＡ５遺伝子結合活性および／または他の任意の興味ある生物学的活性を持つ。特定の実施形態では、機能的ＣＡＬＭフラグメントまたは機能的等価物が、そのＣ末端にある推定ＣＲＭ１依存的ＮＥＳ（核外移行シグナル）配列、ＥＮＴＨドメイン、ＨｏｘＡ５遺伝子結合ドメインおよび／またはクラスリン結合ドメインを含む。

機能的フラグメントおよび機能的等価物が上述した機能領域を二つ以上含みうることは、当業者には理解されるだろう。

本明細書にいう「等価物」とは、一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を指す。等価物は「保存的」変化を持ってもよく、この場合、置換アミノ酸は類似する構造または化学的性質を持つ。特に、そのような変化は、アミノ酸が基本的に同じ機能的性質を持つ別のアミノ酸で置換されるように、電荷密度、疎水性／親水性、サイズおよび配置などの物理的特徴に関するアミノ酸間の既知の類似度を指針にすることができる。例えば、ＡｌａはＶａｌまたはＳｅｒで置き換えることができ；ＶａｌはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、好ましくはＡｌａまたはＬｅｕで置き換えることができ；ＬｅｕはＡｌａ、ＶａｌまたはＩｌｅ、好ましくはＶａｌまたはＩｌｅで置き換えることができ；ＧｌｙはＰｒｏまたはＣｙｓ、好ましくはＰｒｏで置き換えることができ；ＰｒｏはＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ、好ましくはＧｌｙ、Ｃｙｓ、またはＳｅｒで置き換えることができ；ＣｙｓはＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ、好ましくはＰｒｏまたはＭｅｔで置き換えることができ；ＭｅｔはＰｒｏまたはＣｙｓ、好ましくはＣｙｓで置き換えることができ；ＨｉｓはＰｈｅまたはＧｌｎ、好ましくはＰｈｅで置き換えることができ；ＰｈｅはＨｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ、好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒで置き換えることができ；ＴｙｒはＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅまたはＴｒｐで置き換えることができ；ＴｒｐはＰｈｅまたはＴｙｒ、好ましくはＴｙｒで置き換えることができ；ＡｓｎはＧｌｎまたはＳｅｒ、好ましくはＧｌｎで置き換えることができ；ＧｌｎはＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＳｅｒ、好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒで置き換えることができ；ＳｅｒはＧｌｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＡｌａで置き換えることができ；ＴｈｒはＧｌｎまたはＳｅｒ、好ましくはＳｅｒで置き換えることができ；ＬｙｓはＧｌｎまたはＡｒｇで置き換えることができ；ＡｒｇはＬｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕ、好ましくはＬｙｓまたはＡｓｐで置き換えることができ；ＡｓｐはＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ、好ましくはＡｒｇまたはＧｌｕで置き換えることができ；そしてＧｌｕはＡｒｇまたはＡｓｐ、好ましくはＡｓｐで置き換えることができる。ひとたび変化を加えたら、その変化を常法でスクリーニングして、機能に対するそれらの効果を決定することができる。

もう一つの選択肢として、等価物は「非保存的」な変化（例えばトリプトファンによるグリシンの置き換え）を持ちうる。同様の軽微な変化として、アミノ酸欠失もしくはアミノ酸挿入またはその両方を挙げることもできる。生物学的活性を消失させずにどのアミノ酸残基を置換し、挿入しまたは欠失させうるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ソフトウェアなどを使って見出すことができる。

当分野では知られているとおり、ある核酸またはポリペプチドが既知の配列に対して配列類似性または配列同一性を持つかどうかを識別するには、いくつかの異なるプログラムを使用することができる。配列類似度または配列一致度は、当分野で知られる標準的技法を使って、例えば、限定するわけではないが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２ （１９８１）の局所配列一致度アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３ （１９７０）の配列一致度アラインメントアルゴリズム（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４ （１９８８）の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータへの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン・サイエンスドライブ５７５）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５ （１９８４）に記載のＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを、好ましくはデフォルト設定で使用することによって、または目視検査によって決定することができる。

もう一つの適切なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０） ａｎｄ Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３−５７８７ （１９９３）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０−４８０ （１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ではいくつかの検索パラメータを使用し、それらは場合により、デフォルト値に設定される。これらのパラメータは動的値であり、特定配列の組成、および関心配列を検索する対象となる特定データベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立されるが、感度を増加させるためにそれらの値を調節してもよい。

さらにまた、もう一つの有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２によって報告されたｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。

ある実施形態では、同一残基だけに正のスコア（＋１）を付け、ギャップを含むあらゆる形態の配列変異に「０」という値を割り当てることにより、配列類似度計算に関して後述する重み付き尺度またはパラメータの必要を回避する。配列一致率は、例えば、一致した同一残基の数を、整列した領域中の「短い方」の配列の総残基数で割り、１００を掛けることによって算出することができる。「長い方」の配列は、整列した領域中に最も多くの実際の残基を持つものである。

ポリペプチドフラグメントの長さは重要ではない。機能的フラグメントの具体例は、完全長ポリペプチドの少なくとも約８０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、１２００、１４００またはそれ以上のアミノ酸（場合により、連続アミノ酸）、例えば完全長ポリペプチドの約８０〜１４００アミノ酸、約１００〜１０００アミノ酸、約１００〜７００アミノ酸、または約２００〜６００アミノ酸（場合により、連続アミノ酸）を含む。本発明は、機能的フラグメントをコードする核酸も提供する。機能的フラグメントをコードする典型的核酸は、完全長ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも約２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００またはそれ以上のヌクレオチド塩基（場合により、連続塩基）、例えば約２５０〜４０００、約３００〜３０００、約３００〜２０００、約４００〜２０００、または約６００〜１５００ヌクレオチド塩基（場合により、連続塩基）を含む。

ポリペプチドは、任意の関心ある種（例えば、哺乳類（ヒト、サルなどの非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌなどを含むが、これらに限るわけではない）、昆虫、酵母、鳥類、植物など）に由来することができ、対立遺伝子変異体、アイソフォーム、スプライス変異体などであることもできる。さらにアミノ酸配列は、全て合成物であるか、部分的に合成物であることもできる。

「ＤＯＴ１Ｌポリペプチド」「ＡＦ１０ポリペプチド」および「ＣＡＬＭポリペプチド」という用語は、そのポリペプチド（機能的フラグメントを含む）を含む融合タンパク質（およびそれをコードする核酸配列）を包含する。特定の実施形態では、融合タンパク質が非天然融合タンパク質であり、前記の用語は天然融合タンパク質を包含しない。この文脈において、「天然融合タンパク質」という用語は、ＭＬＬ−ＡＦ１０またはＣＡＬＭ−ＡＦ１０などの病理学的状態に関連するものを包含する。例えば、ポリペプチドは、市販の抗体によって認識されうる融合タンパク質（例えばＦＬＡＧモチーフ）として、または他の方法で（例えばポリＨｉｓテールの付加によって）より容易に精製することができる融合タンパク質として発現させることが有用でありうる。また、タンパク質の安定性を強化する融合タンパク質、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を製造することもできる。もう一つの選択肢として、融合タンパク質は、レポーター分子を含むこともできる。典型的な実施形態では、当分野で知られているとおり、酵母ツーハイブリッド系で使用するための融合タンパク質（例えばＧＡＬ４−ＤＯＴ１Ｌ融合物）を作製することができる。

「ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質」という用語は、ＡＦ１０とＣＡＬＭの間の天然および非天然融合タンパク質、ならびにＣＡＬＭ−ＡＦ１０の生物学的活性、例えばＤＯＴ１Ｌ結合、ＨｏｘＡ５遺伝子結合、白血病誘発および／または他の任意の関心ある生物学的活性を、少なくとも一つは保っている、その機能的フラグメントおよび機能的等価物を包含する。融合タンパク質のＡＦ１０部分およびＣＡＬＭ部分は、ＡＦ１０ポリペプチドおよびＣＡＬＭポリペプチドについて本明細書に説明するとおりである。さらにまた、本発明の方法で使用するために、ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の三元融合物（ｔｒｆｕｓｉｏｎ）を構築することもできる。

本発明は、いくつかの研究用途、診断用途および／または治療用途に使用することができる。例えば、ＤＯＴ１Ｌポリペプチド、ＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチドおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質ならびにそれをコードする核酸は、以下の化合物を識別するために使用することができる。
・ＣＡＬＭに結合しかつ／またはＣＡＭＬの一つ以上の生物学的活性、例えば、限定するわけではないが、白血病誘発活性および／または他の任意の興味ある生物学的活性を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、
・ＡＦ１０に結合しかつ／またはＡＦ１０の一つ以上の生物学的活性、例えば、限定するわけではないが、白血病誘発活性および／または他の任意の興味ある生物学的活性を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、
・ＣＡＬＭ−ＡＦ１０に結合しかつ／またはＣＡＬＭ−ＡＦ１０の一つ以上の生物学的活性、例えば、限定するわけではないが、白血病誘発活性、ＨｏｘＡ５プロモーター活性のアップレギュレーション（例えば、ネイティブであるか異種であるかを問わず、ＨｏｘＡ５プロモーターと作動可能に関連する核酸の転写の増加）および／または他の任意の興味ある生物学的活性を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、
・ＤＯＴ１ＬのＡＦ１０またはＣＡＬＭ−ＡＦ１０との相互作用を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、
・ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化を調整する（例えば増加または減少させる）化合物；
・ＤＯＴ１ＬまたはＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０によるＨｏｘＡ５遺伝子のＨ３−Ｋ７９メチル化を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、
・ＨｏｘＡ５遺伝子におけるＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０またはＣＡＬＭ結合を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、および／または、
・ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０またはＣＡＬＭによるＨｏｘＡ５プロモーター活性（例えば、ネイティブであるか異種であるかを問わず、ＨｏｘＡ５プロモーターと作動可能に関連する核酸の転写）の調節を調整する（例えば増加または減少させる）化合物、
・ＨｏｘＡ５プロモーター活性に結合しかつ／またはＨｏｘＡ５プロモーター活性をダウンレギュレートする（例えばＨｏｘＡ５遺伝子発現またはレポーター遺伝子などの導入遺伝子と作動可能に関連するＨｏｘＡ５プロモーターを含むキメラコンストラクトを減少させる）化合物。

さらに本発明は、ＤＯＴ１Ｌポリペプチド、ＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合ポリペプチド、ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０三元融合（ｔｒｉｆｕｓｉｏｎ）タンパク質に結合し、かつ／またはその生物学的活性を調整し、ＨｏｘＡ５プロモーター活性を調整し、かつ／またはＤＯＴ１Ｌ、ＣＡＬＭ、ＡＦ１０、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０および／またはＨｏｘＡ５の相互作用を調整する化合物を識別することによって、白血病の治療および／または予防用の化合物を識別する方法を包含する。特定の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病サブタイプＭ０／１（ＡＭＬ−Ｍ０／１）の治療および／または予防用の化合物を識別する方法を提供する。

代表的実施形態では、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＤＯＴ１ＬポリペプチドがＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＤＯＴ１ＬポリペプチドをＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の相互作用のレベルを検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、試験化合物存在下での、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

ＤＯＴ１ＬポリペプチドのＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質との相互作用のレベルは、任意の適切な方法によって、例えばＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０の間の結合を決定することによって、かつ／またはＨｏｘＡ５遺伝子もしくはその一部（例えばプロモーター領域、エクソン１、エクソン２および／またはエクソン１とエクソン２の間のイントロンの全部または機能的部分）のヒストンＨ３−Ｋ７９メチル化を決定することによって、かつ／または（例えばプロモーターがネイティブ配列、ＨｏｘＡ５コード配列を表すｃＤＮＡまたはレポーター遺伝子などの異種配列と作動可能に関連している場合に）ＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定することなどによって、評価することができる。ＤＯＴ１ＬポリペプチドのＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質との相互作用のレベルは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化を決定することによって評価することもできる。

二つ以上の構成成分の間の結合は、直接的または間接的に（例えばそれら構成成分の結合がもたらす生物学的作用または帰結を検出することなどによって）決定することができる。

本明細書にいうレポーター遺伝子は、細胞または生物に検出可能な変化をもたらすポリペプチドならびにＲＮＡｉおよびアンチセンスＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡを含む、当分野で知られる任意の適切なレポーター分子をコードすることができる。代表的な実施形態では、レポーター分子は、酵素などのポリペプチド（例えば緑色蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）である。

本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、試験化合物がＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に結合するのに十分な条件下で、ＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物とＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の結合のレベルを検出するステップとを含み、ＣＡＬＭポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質への試験化合物の結合が、試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法も提供する。

もう一つの態様として、本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質がＨｏｘＡ５遺伝子の全部または一部に結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＨｏｘＡ５遺伝子の全部または一部を含む（例えばプロモーター領域、エクソン１、エクソン２および／またはエクソン１とエクソン２の間のイントロンの全部または機能的部分を含む）核酸をＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、ＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質とＨｏｘＡ５遺伝子の全部または一部の相互作用のレベルを検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、試験化合物存在下での、ＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質とＨｏｘＡ５遺伝子の全部または一部の間の相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０と相互作用することができるＨｏｘＡ５遺伝子の典型的領域を図５Ａに示す。

ＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質とＨｏｘＡ５遺伝子またはその一部の間の相互作用は、任意の適切な方法によって、例えば、限定するわけではないが、ＨｏｘＡ５遺伝子またはその一部へのＣＡＬＭポリペプチド、ＡＦ１０ポリペプチド、ＤＯＴ１ＬポリペプチドまたはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の結合を決定すること、および／またはＨｏｘＡ５遺伝子またはその一部（例えばＨｏｘＡ５プロモーターの全部または機能的部分）のＨ３−Ｋ７９メチル化を決定すること、および／または（例えばプロモーターがネイティブ配列、ＨｏｘＡ５コード配列を表すｃＤＮＡまたはレポーター遺伝子などの異種配列と作動可能に関連している場合に）ＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定することなどによって、評価することができる。

代表的実施形態では、本方法は細胞に基づく系で行われ、この場合、細胞は、レポーター分子（例えば酵素などのポリペプチド）をコードする核酸と作動可能に関連するＨｏｘＡ５プロモーターを含む組換え核酸を含む。細胞は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質を含む白血病細胞であることができ、あるいは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質を産生するように改変された細胞であることができる。その細胞に一つ以上の候補化合物を加え、ＨｏｘＡ５プロモーター活性のレベルによって示されるＨｏｘＡ５へのＣＡＬＭ−ＡＦ１０の結合を、レポーター分子の発現（例えば酵素活性）を決定することによって評価することができる。

本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質が結合して複合体を形成し、その複合体がＨｏｘＡ５プロモーターに結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、（上述した）ＨｏｘＡ５遺伝子の全部または一部を含む核酸をＤＯＴ１ＬポリペプチドおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質複合体のＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用のレベルを検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、試験化合物存在下での、ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質複合体とＨｏｘＡ５プロモーターの相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法も提供する。

前記の方法では、ＤＯＴ１ＬおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０を、ＤＯＴ１Ｌ−ＣＡＬＭ−ＡＦ１０三元融合タンパク質で置き換えることができる。

ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体とＨｏｘＡ５遺伝子またはその一部の間の相互作用は、任意の適切な方法によって、例えば、限定するわけではないが、ＨｏｘＡ５遺伝子またはその一部への複合体の結合を決定すること、またはＨｏｘＡ５遺伝子またはその一部（例えばＨｏｘＡ５プロモーター）のＨ３−Ｋ７９メチル化を決定すること、または（例えばプロモーターがネイティブ配列、ＨｏｘＡ５コード配列を表すｃＤＮＡまたはレポーター遺伝子などの異種配列と作動可能に関連している場合に）ＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定することなどによって、評価することができる。

ＨｏｘＡ５が一定の白血病において過剰発現されることは以前に観察されているが、がんでは多くの遺伝子が調節不全になるので、ＨｏｘＡ５アップレギュレーションの意義はわからなかった。本発明者らは、ＨｏｘＡ５アップレギュレーションが白血病誘発の原因因子であることを発見した。したがって本発明は、白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＨｏｘＡ５プロモーター活性に結合しかつ／またはＨｏｘＡ５プロモーター活性を（例えばＨｏｘＡ５遺伝子またはレポーター遺伝子などの導入遺伝子と作動可能に関連するＨｏｘＡ５プロモーターを含むキメラコンストラクトの発現をダウンレギュレートすることによって）調整する化合物を識別することを含む方法も提供する。特定の実施形態において、本方法は、ＨｏｘＡ５プロモーター領域および／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の領域（例えばエクソン１、エクソン２、またはエクソン１とエクソン２の間のイントロン）の全部または一部を含む核酸を、試験化合物と、試験化合物が核酸中に存在するＨｏｘＡ５プロモーター領域および／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の領域の全部または機能的部分に結合するのに十分な条件下で接触させるステップと、試験化合物と、核酸中に存在するＨｏｘＡ５プロモーターおよび／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の領域の全部または機能的部分の間の結合のレベルを検出するステップとを含み、結合は、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す。

白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する他の代表的方法は、ＨｏｘＡ５プロモーター領域の全部または機能的部分を含む核酸を、ＨｏｘＡ５プロモーター活性にとって十分な条件下で、試験化合物と接触させること、およびＨｏｘＡ５プロモーター活性のレベルを検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下でのＨｏｘＡ５プロモーター活性のレベルと比較した、試験化合物存在下でのＨｏｘＡ５プロモーター活性の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す。代表的化合物では、試験化合物が、核酸中に存在するＨｏｘＡ５プロモーターおよび／またはＨｏｘＡ５遺伝子の他の任意の領域（例えばエクソン１、エクソン２および／またはエクソン１とエクソン２の間のイントロン）の全部または機能的部分に結合する。ＨｏｘＡ５プロモーター活性は本明細書で述べるように決定することができる。

さらに本発明は、ＤＯＴ１ポリペプチドに結合し、かつ／またはＤＯＴ１ポリペプチドの生物学的活性および／またはＤＯＴ１ＬとＡＦ１０の相互作用を調整する化合物を識別することによって、Ｔ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の治療および／または予防用の化合物の識別する方法を提供する。

代表的実施形態では、本発明は、Ｔ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＤＯＴ１Ｌポリペプチドを、試験化合物の存在下で、ヒストンＨ３を含むヒストンまたはヌクレオソーム基質と接触させるステップと、Ｈ３−Ｋ７９メチル化をもたらすのに十分な条件下で、基質のＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルを検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下でのＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルと比較した、試験化合物存在下でのＨ３−Ｋ７９メチル化の阻害は、前記試験化合物がＴ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

さらに本発明は、Ｔ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、ＤＯＴ１ＬポリペプチドをＡＦ１０と接触させるステップと、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＡＦ１０の間の結合のレベルを、それらの間の結合にとって十分な条件下で検出するステップとを含み、試験化合物の非存在下での結合のレベルと比較した、試験化合物存在下でのＤＯＴ１ＬポリペプチドとＡＦ１０の間の結合の減少は、前記試験化合物がＴ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法を提供する。

ポリペプチドおよび核酸への結合を評価する方法は、当業者には明白であるだろう標準的技法を使って行うことができる（典型的方法については実施例を参照されたい）。そのような方法として、酵母および哺乳動物細胞ツーハイブリッドアッセイならびに共免疫沈降技法が挙げられる。

Ｈ３−Ｋ７９ ＨＭＴａｓｅおよび白血病誘発活性などの他の活性も、当分野で知られる標準的方法を使って、例えば下記実施例で述べるように評価することができる。

ＨｏｘＡ５プロモーター活性も、当分野で知られる任意の方法によって、例えばＨｏｘＡ５プロモーターと作動可能に関連するレポーター遺伝子の発現または活性を検出することによって、ＨｏｘＡ５転写物を（例えばＲＴ−ＰＣＲで）検出することによって、かつ／またはＨｏｘＡ５タンパク質産物を検出することによって、評価することができる。

本発明のスクリーニング方法は、細胞に基づく系または無細胞系で行うことができる。さらにもう一つの選択肢として、動物全体（トランスジェニック非ヒト動物を含む）でアッセイを行うこともできる。さらにまた、細胞に基づく系に関して、ポリペプチドは細胞に直接添加するか、細胞中の核酸から産生させることができる。核酸は、その細胞にとって内在性であるか、外来（例えば遺伝子改変細胞）であることができる。

任意の興味ある化合物を本発明に従ってスクリーニングすることができる。適切な試験化合物として、小有機化合物（すなわち非オリゴマー）、オリゴマーまたはその組み合わせ、および無機分子が挙げられる。適切な有機分子として、ポリペプチド（酵素、抗体およびＦａｂ’フラグメントを含む）、糖質、脂質、補酵素、および核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびキメラならびにその類似体を含む）ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。特定の実施形態では、化合物が、ターゲットポリペプチドの産生を阻害するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである。

小有機化合物（または「非オリゴマー」）には、多種多様な有機分子、例えばステロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガンド、ホルモン、薬物、アルカロイド、オピオイド、テルペン、ポルフィリン、毒素、触媒ならびにそれらの組み合わせを含む複素環式化合物、芳香族化合物、脂環式化合物、脂肪族化合物およびそれらの組み合わせなどが含まれる。

オリゴマーとしては、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、ポリ脂質、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリウレア、ポリエーテル、およびポリ（リン誘導体）、例えばホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、ホスファイト、ホスフィンアミドなど、ポリ（硫黄誘導体）、例えばスルホン、スルホネート、サルファイト、スルホンアミド、スルフェンアミドなどが挙げられ、リン誘導体および硫黄誘導体の場合、表示したヘテロ原子は、大部分が、Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯまたはＳおよびそれらの組み合わせに結合されるだろう。そのようなオリゴマーは、既知の技法に従って、コンビナトリアルライブラリーから取得してもよい。

さらにまた、例えばコンビナトリアルケミカル化合物ライブラリー（例えば米国特許第５，２８８，５１４号に記載のベンゾジアゼピンライブラリー；米国特許第５，４２０，３２８号に記載のホスホネートエステルライブラリー、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５２５，７３４号に記載のピロリジンライブラリー、ならびに米国特許第５，８１７，７５１号に記載のジケトピペラジンおよびジケトモルホリンライブラリー）、ポリペプチドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、アンチセンス核酸ライブラリーなどの化合物ライブラリー、またはポリペプチドおよび核酸アレイなどのアレイ化された化合物の収集物をスクリーニングするために、本発明の方法を実施することができる。

本発明は上述のスクリーニング方法によって識別される化合物も包含する。

さらにまた本発明は、ＨｏｘＡ５、ＣＡＬＭ、ＡＦ１０、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０および／またはＤＯＴ１Ｌに対する治療有効量の阻害核酸（例えばｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ）または抗体（例えばモノクローナル抗体）を投与することによって、白血病（例えばＴ−ＡＬＬまたはＡＭＬサブタイプＭ０／１）を患っている対象または白血病の危険がある対象を治療する方法を提供する。

本発明の実施形態によれば、抗体は、抗体フラグメントを含むモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができる。抗体および抗体フラグメントは特定の形態に限定されず、二重特異性、ヒト化、またはキメラ化抗体または抗体フラグメントであることができ、さらにＦａｂフラグメント、単鎖抗体などであることもできる。

本発明の実施に適した対象として、鳥類および哺乳類対象が挙げられ、哺乳類対象にはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコなどが含まれるが、これらに限るわけではない。

さらにもう一つの態様として、本発明は、ＨｏｘＡ５のＨ３−Ｋ７９ヒストンメチル化を評価することによる、対象が白血病を有するかどうかもしくは白血病の危険があるかどうかを評価するための診断方法、および／または対象における白血病の今後の経過を予測するための予後判定方法であって、正常（例えば非白血病）対象と比較した、ＨｏｘＡ５のＨ３−Ｋ７９メチル化の増加は、白血病の診断指標となり、かつ／または疾患の経過の予後指標となる。場合により、ＨｏｘＡ５遺伝子のＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルと、場合によりＨ３−Ｋ４メチル化のレベルが決定され（例えばＨｏｘＡ５プロモーター、エクソン１、エクソン２および／またはエクソン１とエクソン２の間のイントロン）、正常（例えば非白血病）対象と比較したＨ３−Ｋ７９メチル化の増加、および場合により、Ｈ３−Ｋ４メチル化の減少は、白血病の診断指標となり、かつ／または疾患の経過の予後指標となる。

さらに本発明は、対象が白血病を有するかどうかもしくは白血病を発症する危険があるかどうかを診断し、かつ／またはその疾患の経過に関する予後を決定する方法であって、対象におけるＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定するステップを含み、対照（例えば健常）対象におけるＨｏｘＡ５プロモーター活性と比較した、ＨｏｘＡ５プロモーター活性のアップレギュレーション（すなわち増加した活性）は、その対象が白血病を有することまたは白血病を発症する危険があることを示す方法を提供する。ＨｏｘＡ５プロモーター活性は、当分野で知られる任意の方法によって決定することができる。例えば、本方法は、対象から生物学的試料を取得するステップと、および生物学的試料中のＨｏｘＡ５プロモーター活性（例えば、ネイティブであるか異種であるかを問わず、ＨｏｘＡ５プロモーターと作動可能に関連する核酸の増加した発現）を決定するステップを、さらに含むことができる。

対象が白血病を有するかどうかもしくは白血病を発症する危険があるかどうかを診断し、かつ／またはその疾患の経過に関する予後を決定する方法の一例は、対象からＨｏｘＡ５遺伝子を含む生物学的試料を取得するステップと、生物学的試料中のＨｏｘＡ５遺伝子のＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルを検出するステップとを含み、非白血病生物学的試料におけるＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルと比較した、生物学的試料におけるＨｏｘＡ５遺伝子のＨ３−Ｋ７９メチル化の上昇は、その対象が白血病を有することもしくは白血病を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／またはその対象における疾患の経過の予後指標となる。本方法は、場合により、ＨｏｘＡ５遺伝子のＨ３−Ｋ４メチル化のレベルを決定するステップをさらに含むことができ、非白血病試料と比較した、生物学的試料におけるＨｏｘＡ５遺伝子のＨ３−Ｋ４メチル化の減少は、その対象が白血病を有することもしくは白血病を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／またはその対象における疾患の経過の予後指標となる。

代表的実施形態では、本発明の前記診断方法が、Ｔ−ＡＬＬもしくはＡＭＬサブタイプＭ０／１に関する診断および／または予後判定方法として実施される。

対象がＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を持つかどうかまたはＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を発症する危険があるかどうかを診断し、かつ／またはその疾患の経過に関する予後を決定する方法の一例は、対象からヒストン（例えばヌクレオソーム）を含む生物学的試料を取得するステップと、生物学的試料におけるＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルを検出するステップとを含み、非白血病生物学的試料におけるＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルと比較した、生物学的試料におけるＨ３−Ｋ７９メチル化の増加は、その対象がＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を持つことまたはＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／またはその対象における疾患の経過の予後指標となる。本方法は、場合により、生物学的試料におけるＨ３−Ｋ４メチル化のレベルを決定するステップをさらに含むことができ、非白血病試料と比較した、生物学的試料におけるＨ３−Ｋ４メチル化の減少は、その対象がＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を持つことまたはＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／またはその対象における疾患の経過の予後指標となる。

もう一つの代表的実施形態によれば、本発明は、対象がＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を持つかどうかまたはＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を発症する危険があるかどうかを診断し、かつ／またはその疾患の経過に関する予後を決定する方法であって、対象からヒストン（例えばヌクレオソーム）を含む生物学的試料を取得するステップと、生物学的試料におけるＨ３−Ｋ７９メチル化のレベルを検出するステップとを含み、非白血病生物学的試料におけるレベルと比較した、生物学的試料におけるＨｏｘＡ遺伝子関連Ｈ３−Ｋ７９メチル化（例えばＨｏｘＡ９遺伝子と関連するもの）の増加は、その対象がＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を持つことまたはＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／またはその対象における疾患の経過の予後指標となる。本方法は、場合により、一つ以上のＨｏｘＡ遺伝子（例えばＨｏｘＡ９遺伝子）に関連するＨ３−Ｋ４メチル化のレベルを決定するステップをさらに含むことができ、非白血病試料と比較した、生物学的試料におけるＨｏｘＡ遺伝子関連Ｈ３−Ｋ４メチル化の減少は、その対象がＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を持つことまたはＴ−ＡＬＬもしくはＡＭＬ−Ｍ０／１を発症する危険があることの診断指標となり、かつ／またはその対象における疾患の経過の予後指標となる。

本発明の診断および予後判定方法は、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ラット、マウス、ウサギまたはモルモット対象を含む（ただしこれらに限るわけではない）任意の哺乳動物対象で実施することができる。特定の実施形態では、対象が白血病を有するか、白血病を発症する危険があると考えられる。別の実施形態では、対象が白血病の動物モデルである。

本発明の診断および予後判定方法は、確証的ではなく、最終的な診断または予後判定を下すには、他の診断および／または予後判定方法で補足する必要がありうることは、当業者には理解されるだろう。

細胞または組織試料、臍帯試料、血液、血漿または血清試料、尿または糞便試料、粘液または喀痰試料など、任意の適切な生物学的試料を使用することができる。特定の実施形態では、生物学的試料がＢ細胞または骨髄試料である。他の代表的実施形態では、生物学的試料が、ヒストンＨ３を含むヒストンまたはヌクレオソーム調製物（例えばＢ細胞または骨髄細胞から得られるもの）である。代表的実施形態では、細胞または組織が対象から取り出され、培養され、その培養細胞または培養組織からヒストンまたはヌクレオソームが調製される。

「非白血病生物学的試料」とは、正常な対象（すなわち白血病を持たず白血病を発症する危険もない対象）を示す適切な対照試料を意味する。例えばこの試料は、正常な対象から単離することができ、いくつかの例（例えばヌクレオソーム調製物）では、培養細胞から単離することができる。

本発明を記述したので、以下の実施例では、これをさらに詳しく説明する。以下の実施例は、例示のみを目的として本明細書に記載するものであり、本発明を限定しようとするものではない。

実験手法
Ｕ９３７細胞におけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンおよび移植．ＣＡＬＭとＡＦ１０の接合部をターゲットとする２１ｂｐ−ｓｈＲＮＡ（５’−ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＣＴＧ ＴＧＡ−３’；配列番号３）をコードするＤＮＡを、Ｈ１ ＲＮＡプロモーターと共に、ｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏにサブクローニングした。形質導入細胞をピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）によって選択し、限界希釈法によってクローニングした。ノックダウン効率をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。５〜１０週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに照射（３００ｒａｄ）した。６時間後に、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウン（ＫＤ）Ｕ９３７細胞およびベクター形質導入（Ｖ）Ｕ９３７細胞を、眼窩内注射した（１×１０^７細胞／マウス、各群ｎ＝６）。マウスを監視し、組織学的検査およびＦＡＣＳ解析のために、末期に屠殺した。ＫＤ群のマウス数匹については、対照実験用に、末期に至る前に屠殺した。

マウス骨髄細胞の単離および形質導入．４〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使って骨髄細胞を収集した。Ｈｏｘａ５欠損骨髄細胞を８〜１０週齢のＭＦ１マウスから得た（Ｊｅａｎｎｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７，２０８５−９６）。マウスを１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル（５ＦＵ）で５日間処理してから、骨髄細胞を収集した。ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）マウス造血前駆細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使ってＬｉｎ⁻細胞を濃縮し、レトロウイルス形質導入に使用した。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによってＵ９３７細胞からクローニングした。野生型およびＯＭ−ＬＺ欠失突然変異型のＣＡＬＭ−ＡＦ１０を、ｐＭＳＣＶ−ｎｅｏのＦｌａｇタグの下流にサブクローニングした。レトロウイルス調製、形質導入、およびコロニーアッセイは、以前記述したように行った（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。図３ｂに記載する実験では、非形質導入細胞の成長を防ぐために、第３ラウンドまで、メチルセルロースにＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。メチルセルロース上のコロニーを拾い上げ、５ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むｍＦＴＯＣ（ＲＰＭＩ １６４０中の１０％ＦＢＳ、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ．７．３、５×１０^５Ｍ ２−メルカプトエタノール）中でさらに培養した。ブラストサイジン耐性レトロウイルスによるＤＯＴ１Ｌの形質導入については以前記述した（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。

細胞培養、トランスフェクション、免疫染色、および免疫沈降．Ｕ９３７細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ １６４０で維持した。２９３Ｔ細胞またはＵ２ＯＳ細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。トランスフェクションはＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使って行った。トランスフェクションの２４時間後に、Ｕ２ＯＳ細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で５分間透過処理した。Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）およびｈＤＯＴ１Ｌ抗体（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）を一次抗体として免疫染色に使用した。ＤＡＰＩを核染色に使用した。

免疫沈降のために、トランスフェクションの３６時間後に２９３Ｔ細胞を収集し、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してから、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ［ｐＨ７．９］、４２０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、０．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．７μｇ／ｍｌのペプスタチン）で溶解した。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を穏やかに超音波処理し、１４，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により、細胞片を除去した。抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を０．５ｍｇタンパク質抽出物に加え、４℃で３時間インキュベートした。５００ｍＭ ＫＣｌを含有する溶解緩衝液で５回洗浄した後、免疫沈降物をウェスタンブロット法で解析した。

ＦＡＣＳ解析．ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスから収集した細胞、およびＣＡＬＭ−ＡＦ１０で形質導入したマウス骨髄細胞を、ＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に氷上で２０分間インキュベートしてから、フィコエリトリン接合アイソタイプ対照、フルオレセインイソチオシアネート接合アイソタイプ対照、およびアロフィコシアニン接合アイソタイプ対照、ならびにヒトＣＤ４５、マウスＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｂ２２０、ＣＤ３、およびＴｅｒ１１９に対するモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により、氷上で３０分間染色した。次に細胞を２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使って解析した。収集したデータをＳｕｍｍｉｔ Ｖ３．１（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ． Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ）で解析した。

Ｈｏｘ遺伝子、Ｂｍｉ−１およびＣＡＬＭ−ＡＦ１０のＲＴ−ＰＣＲ解析．全ＲＮＡを、ベクター形質導入Ｕ９３７細胞もしくはＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンＵ９３７細胞、または野生型もしくは突然変異型ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質導入細胞の第２および第３ラウンドに由来するマウス骨髄細胞のコロニーから、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って単離した。最大１μｇの全ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉで処理し、製造者のプロトコールに従って、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる逆転写にかけた。２０μｌのＲＴ反応液のうち０．５μｌのｃＤＮＡを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる３３〜３５サイクルのＰＣＲ増幅に、テンプレートとして使用した。そのｃＤＮＡの１０分の１をβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨ増幅に使用した。ＨｏｘａおよびＢｍｉ−１用のプライマー配列は請求すれば入手できる。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下のとおりとした：ＣＡＬＭ−ＡＦ１０−Ｆ：５’−ＴＡＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧ−３’（配列番号４）、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０−Ｒ：５’−ＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号５）。

ＣｈＩＰアッセイ．細胞調製、免疫沈降、およびＰＣＲについては以前に記述した（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。抗体は以下のとおり入手した：抗３ｍＫ４（Ａｂｃａｍ）、抗２ｍＫ９（Ｕｐｓｔａｔｅ）、および抗２ｍＫ７９（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１０５２−１０５８）。プライマー配列および詳細なＰＣＲ条件は請求すれば入手できる。

結果
ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質は、白血病性形質転換を媒介するのに必要である。本発明者らは最近、ヒストンＨ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼであるｈＤＯＴ１Ｌ（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１０５２−１０５８）がＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病誘発に重要な役割を果たすことを証明した（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。本発明者らは、ＭＬＬ−ＡＦ１０によるＨｏｘａ９遺伝子へのｈＤＯＴ１ＬのミスターゲティングがＨ３−Ｋ７９メチル化およびＨｏｘａ９アップレギュレーションをもたらし、それが白血病性形質転換の一因になることを示した（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。さらに本発明者らは、ＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に必要なＡＦ１０のＯＭ−ＬＺモチーフが、ｈＤＯＴ１ＬとＭＬＬ−ＡＦ１０の相互作用に関与することも証明した（ＤｉＭａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９，３７８０−５）。ＯＭ−ＬＺ領域がＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に保たれているという事実から、ｈＤＯＴ１ＬはＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病にも重要な役割を果たしうる可能性が考えられる。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病におけるｈＤＯＴ１Ｌの潜在的役割を検討するために、本発明者らは、まず、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と白血病の間の因果関係を確証しようと試みた。

以前の研究により、ヒト単球性白血病細胞株Ｕ９３７はＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質を発現させることが確証されている（Ｄｒｅｙｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４８０４−９；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １３：２１７−８）。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０が細胞の増殖および形質転換に関連するかどうかを決定するために、本発明者らは、ベクターに基づくＲＮＡｉアプローチを使って、Ｕ９３７細胞におけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンを行った（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。図１ａに示す結果は、本発明者らが、有意なＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンを持つ安定なＵ９３７派生細胞株を作製できることを示している（レーン１とレーン２を比較）。ベクター形質導入対照（Ｖ）と比較して、ノックダウン（ＫＤ）細胞は、液体ＲＰＭＩ培地中でゆっくり増殖するだけでなく（図１ｂ）、メチルセルロースで培養した場合に生じるコロニーは少なくかつ小さかった（図１ｃ）。このデータは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０のノックダウンがインビトロで細胞の増殖と形質転換の両方に影響を及ぼすことを示唆している。

インビボにおけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０の役割を評価するために、本発明者らは、１×１０^７個のノックダウン細胞および対照細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。図１ｄに示す結果は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンが移植マウスの生存時間を延ばしたことを証明している。ベクター形質導入対照細胞を移植したマウスの組織学的解析では、末期に複数の臓器で白血病細胞の浸潤が明らかになった（図１ｅ、上図）。これに対し、移植後の同じ日に解析したところ、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウン細胞を移植したマウスの臓器では、白血病細胞をほとんど検出することができなかった（図１ｅ、下図）。骨髄および脾臓から単離した細胞のＦＡＣＳ解析では、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウン細胞の移植が、たとえ同じ数の細胞を移植したとしても、対照と比較して、ヒト細胞のパーセンテージを有意に低下させることが明らかになった（骨髄では０．０５％対１１．１４％、脾臓では０．１０％対６．４９％）（図１ｆ）。総合すると上記の結果は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質が、インビトロおよびインビボにおける白血病細胞の細胞増殖および形質転換の一因になることを裏付けている。

ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換は機能的ｈＤＯＴ１Ｌに依存する。本発明者らは、次に、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の発現が、骨髄細胞形質転換を引き起こすのに十分であるかどうかを解析した。この目的にはメチルセルロースコロニー連続プレーティングアッセイを使用した（図２ａ）。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による骨髄形質転換におけるｈＤＯＴ１Ｌの役割を検討するために、本発明者らは、まず、ｈＤＯＴ１ＬはＣＡＬＭ−ＡＦ１０と相互作用することができ、その相互作用がＡＦ１０のＯＭ−ＬＺ領域に依存することを確証した（図６）。次に本発明者らは、野生型またはｈＤＯＴ１Ｌ相互作用領域ＯＭ−ＬＺを欠く欠失ＣＡＬＭ−ＡＦ１０突然変異体を用いるマウス骨髄細胞の形質導入により、コロニー連続プレーティングアッセイを行った。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、第２ラウンドのコロニーに由来する細胞において、両融合タンパク質の発現が確認された（図２ａ、レーン１および２）。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０を発現させる骨髄細胞において、第３ラウンドのプレーティングで第２ラウンドと比較してコロニー数が増加することはなかったが（図２ｃ、中央のカラム）、それらの細胞は、ｍＩＬ−３を補足したｍＦＴＯＣ（マウス胎仔胸腺臓器培養）培地で６ヶ月以上にわたって持続的に増殖することができた（図２ｄおよび非開示データ）。対照的に、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０のＯＭ−ＬＺ欠失突然変異体を発現させる細胞は、メチルセルロースアッセイにおいて有意な数の第３ラウンドコロニーを生成させず、６週間の培養後にｍＦＴＯＣ培地で増殖し続けることもなかった（図２ｃおよび２ｄ）。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０で形質転換された細胞のＦＡＣＳ解析は、これらの細胞がｃ−Ｋｉｔを発現させるが、他の系列特異的マーカー、例えばＧｒ−１、ＣＤ１１ｂ、Ｂ−２２０、ＣＤ３、およびＴＥＲ−１１９をいずれも発現させないことを示しており（図２ｅ）、これは、これらの細胞がどの造血細胞系列にも分化拘束されていない初期前駆骨髄細胞であるらしいことを示す。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の発現が、前駆骨髄細胞を形質転換するのに十分であり、ｈＤＯＴ１Ｌ相互作用領域がＣＡＬＭ−ＡＦ１０の形質転換能には必要であると結論する。ＡＦ１０のｈＤＯＴ１Ｌ相互作用領域がＣＡＬＭ−ＡＦ１０の形質転換能にとって必要であるという事実は、ｈＤＯＴ１ＬがＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病誘発に重要な役割を果たすことを、強く示唆している。ｈＤＯＴ１ＬによるＨ３−Ｋ７９メチル化がＣＡＬＭ−ＡＦ１０による増殖および白血病性形質転換に果たす役割をさらに証明するために、本発明者らは、野生型ｈＤＯＴ１ＬおよびそのＨ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼ活性が欠損した突然変異型ｈＤＯＴ１Ｌを、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換骨髄細胞で発現させた。次に本発明者らは、それらがメチルセルロースでのコロニー形成に及ぼす影響を解析した。図２ｆに示す結果は、野生型ｈＤＯＴ１Ｌの発現がコロニー形成を強化したのに対して、突然変異型ｈＤＯＴ１Ｌの発現はＣＡＬＭ−ＡＦ１０発現細胞のコロニー形成能を強く抑制したことを示している（図２ｆ）。したがって、ｈＤＯＴ１Ｌおよびその関連Ｈ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼ活性は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に重要な役割を果たすと、本発明者らは結論づける。

ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換はＨｏｘａ５アップレギュレーションを伴う。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換におけるｈＤＯＴ１Ｌの役割を確証したので、本発明者らは、関連するターゲット遺伝子を識別しようと試みた。ｃＤＮＡマイクロアレイ研究により、後期Ｈｏｘａ遺伝子およびＢｍｉ−１の過剰発現は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０およびいくつかのＭＬＬ融合タンパク質が関与する白血病の特徴であることが明らかになっている（Ｄｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９：１９４８−５７；Ｄｒａｂｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６：１８６−９５；Ｓｏｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６：２７４−８６）。特に、Ｈｏｘａ９の過剰発現は、ＭＬＬ−ＥＮＬおよびＭＬＬ−ＡＦ１０融合タンパク質が関与する白血病にとって極めて重要であることが証明されている（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）（Ａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １７：２２９８−３０７．２４：６１７−２８；Ｚｅｉｓｉｇ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：６１７−２８）。ｈＤＯＴ１ＬおよびＨ３−Ｋ７９メチル化がＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病誘発の一因となる分子機序を理解するために、本発明者らは後期Ｈｏｘａ遺伝子およびＢｍｉ−１発現をＲＴ−ＰＣＲによって解析した。図３ａに示す結果（レーン１とレーン２を比較）は、Ｕ９３７細胞におけるノックダウンＣＡＬＭ−ＡＦ１０が、結果として、後期Ｈｏｘａ遺伝子およびＢｍｉ−１の発現を減少させたことを示している（図３ａ、左図）。この結果と合致して、マウス骨髄細胞におけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０の過剰発現は、これらの遺伝子の活性化をもたらした（図３ａ、右図）。ｈＤＯＴ１Ｌ相互作用領域は、Ｂｍｉ−１アップレギュレーションには関与しないようだったが、後期Ｈｏｘａ遺伝子の発現には影響を及ぼした（図３ａ、レーン５とレーン６を比較）。興味深いことに、Ｈｏｘａ５は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０で形質導入されたマウス骨髄細胞において、ＯＭ−ＬＺ欠失突然変異体で形質導入された細胞と比較して、著しくアップレギュレートされた（図３ａ、レーン５とレーン６を比較）ことから、ｈＤＯＴ１ＬはＨｏｘａ５アップレギュレーションに関与することが示唆される。Ｈｏｘａ９の発現レベルがＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞では検出不能だったことを考えると、この形質転換過程には、Ｈｏｘａ５アップレギュレーションが、重要な役割を果たすのかもしれない。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換にとってＨｏｘａ５が必要であるかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｈｏｘａ５ノックアウトマウスから単離された骨髄細胞を使って、コロニー再プレーティングアッセイを行った。並行して、本発明者らは、Ｈｏｘａ５ノックアウトがＭＬＬ−ＡＦ１０の形質転換能に及ぼす効果も解析した。図３ｂに示す結果は、第３ラウンドのプレーティングにおけるコロニー数の増加が証明するように、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０は野生型マウスに由来する骨髄細胞を形質転換することはできるが、Ｈｏｘａ５が欠損した骨髄細胞を形質転換することはできないことを示している。対照的に、Ｈｏｘａ５ノックアウトは、ＭＬＬ−ＡＦ１０の形質転換能に影響を及ぼさない。これらの結果に基づいて、Ｈｏｘａ５アップレギュレーションはＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換にとって極めて重要であると、本発明者らは結論づける。

ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化はそのｈＤＯＴ１Ｌとの相互作用能力に依存する。ＣＡＬＭは、クラスリン集合において機能することが知られている細胞質タンパク質である（Ｔｅｂａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１０：２６８７−７０２；Ｍｅｙｒｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｔｒａｆｆｉｃ ６：１２２５−３４）。これは、推定ＣＲＭ１依存性ＮＥＳ（核外移行シグナル）配列をそのＣ末端に含有し、それはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質にも保たれる（Ｖｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５３：１５１１−７）（図７）。一方、ＡＦ１０は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質でも保たれるＮＬＳ（核局在化シグナル）を持つ核タンパク質である（図７）。細胞内局在に応じて、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０は、直接的または間接的に、Ｈｏｘａ５アップレギュレーションの一因となりうる。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の細胞内局在を決定するために、本発明者らは、Ｆｌａｇタグ付きＣＡＬＭ−ＡＦ１０をコードするプラスミドＤＮＡを、Ｕ２ＯＳ細胞にトランスフェクトした。並行して、本発明者らは、ＯＭ−ＬＺ領域に欠失を持つＣＡＬＭ−ＡＦ１０およびＦｌａｇタグ付きＣＡＬＭをコードする二つのコンストラクトもトラスフェクトした。過剰発現させたＣＡＬＭ−ＡＦ１０タンパク質の大半は細胞質分布を示すことが、免疫蛍光染色によって明らかになった（図４ａ）。しかし野生型ＣＡＬＭ−ＡＦ１０トランスフェクト細胞では核分布も目についた（ただし突然変異型ＣＡＬＭ−ＡＦ１０トランスフェクト細胞では核分布が目につくことはなかった）（図４ａ、ｂ）。対照的に、ＣＡＬＭは、クラスリン関連タンパク質に特有な網目様の細胞質分布を示した（図４ａ）（Ｔｅｂａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：２６８７−７０２）。興味深いことに、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０をｈＤＯＴ１Ｌと同時発現させると、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０は核に局在化するようになる（図４ｃ、４ｄ、左カラム）。タンパク質の高解像度解析は、それらが核内に共局在することを示している（図４ｅ）。重要なことに、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０局在化のこの変化は、ｈＤＯＴ１Ｌと相互作用するその能力に依存する。というのも、ｈＤＯＴ１Ｌと、ＯＭ−ＬＺ領域を欠くＣＡＬＭ−ＡＦ１０突然変異体との同時発現は、融合タンパク質の局在化に何も影響しないからである（図４ｃ、４ｄ、中央のカラム）。さらにまた、ｈＤＯＴ１ＬはＣＡＬＭ局在化に影響を及ぼさなかった（図４ｃ、４ｄ、右図）。これらの結果は、ｈＤＯＴ１Ｌが核内でＣＡＬＭ−ＡＦ１０と相互作用し、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０を核内に保つことを、強く示唆している。これらの結果は、図４ａおよび４ｂで観察される核ＣＡＬＭ−ＡＦ１０が、内在性ｈＤＯＴ１Ｌとの相互作用によるものであると思われることも示唆している。

Ｈｏｘａ５のアップレギュレーションはＣＡＬＭ−ＡＦ１０結合およびＨ３−Ｋ７９メチル化に付随して起こる。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０が核に局在化することができ、ｈＤＯＴ１Ｌと相互作用することができるという事実から、Ｈｏｘａ５はＣＡＬＭ−ＡＦ１０の直接的ターゲットであるかもしれないという可能性が生じる。この可能性を検討するために、本発明者らは、図２に記載のＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞を使って、ＣｈＩＰにより、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の結合をＨｏｘａ５遺伝子の全体にわたって解析した。図５ｂに示す結果は、融合タンパク質がアンプリコンｅ〜ｇによってカバーされる領域に結合することを証明している（図５ｂ、レーン５〜７）。空のベクターで形質導入した細胞を用いる並行ＣｈＩＰ実験ではシグナルが観察されないので、観察された結合は特異的である。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０がＨ３−Ｋ７９メチルトランスフェラーゼｈＤＯＴ１Ｌと相互作用することから、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞では、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０結合部位にＨ３−Ｋ７９メチル化が濃縮されると、本発明者らは予想する。図５ｃに記載するＣｈＩＰ結果は、Ｈ３−Ｋ７９メチル化が形質転換細胞におけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０の存在と相関し、対照細胞ではそのような相関がないことを証明している（レーン５とレーン１０を比較）。Ｈ３−Ｋ４メチル化が遺伝子活性化と相関するのに対して、Ｈ３−Ｋ９メチル化は遺伝子抑制と相関するという認識と合致して、非形質転換骨髄細胞においてＨｏｘａ５遺伝子がサイレンシングを受ける場合には、Ｈ３−Ｋ９メチル化がＨｏｘａ５遺伝子プロモーターに観察され（図５ｃ、レーン４）、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞でこの遺伝子が活性化される場合には、Ｈ３−Ｋ４メチル化が観察された（図５ｃ、レーン８）。全てのＣｈＩＰシグナルは特異的である。というのも、それらはアンプリコンｋによってカバーされる対照領域には存在しないからである。これらの結果は、ｈＤＯＴ１Ｌと会合したＣＡＬＭ−ＡＦ１０がＨｏｘａ５遺伝子にターゲティングされるというモデルと合致する。このターゲティングはＨｏｘａ５遺伝子のアップレギュレーションをもたらし、次にそれが、白血病性形質転換の一因になる。

一定の白血病患者においてＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合を生じさせる染色体転座が識別されたことにより、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０が発がん能を持つかもしれないことを示す情況証拠が得られている。本発明者らは、この研究において、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合が白血病誘発にとって必要でありかつ十分であることを、骨髄形質転換および移植アッセイを使って証明する（図１および２）。さらにまた、本発明者らは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換におけるｈＤＯＴ１Ｌの役割を裏付ける証拠を二つ提示する。第１に、ｈＤＯＴ１Ｌ相互作用ドメインを欠くＣＡＬＭ−ＡＦ１０は、その形質転換能を失う（図２ｃ）。第２に、酵素的に不活性な形態のｈＤＯＴ１Ｌの過剰発現は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞の増殖を抑制した（図２ｆ）。さらにまた本発明者らは、ｈＤＯＴ１Ｌが、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核外移行を防止することによって、およびＨｏｘａ５遺伝子におけるＨ３−Ｋ７９のメチル化（これはその活性化の一因になる）によって、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換の一因となることを証明した。最後に本発明者らは、Ｈｏｘａ５が、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に特異的に要求されることを示した。なぜなら、Ｈｏｘａ５ヌルマウス由来の骨髄細胞は、ＭＬＬ−ＡＦ１０による形質転換には影響しないが、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０による形質転換は受けることができないからである（図３ｂ）。このように、本発明者らの研究は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０が白血病性形質転換の原因であることを確証するだけでなく、Ｈｏｘａ５およびｈＤＯＴ１ＬがＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合が関与する白血病誘発過程において重要な役割を果たすことも明らかにしている。

本発明者らは、ｈＤＯＴ１ＬがＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病誘発の一因であることも、以前に証明した（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。ＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病誘発とＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病誘発には、どちらもｈＤＯＴ１ＬおよびＨｏｘ遺伝子活性化が関与するが、基礎にある機序は同じではない。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０とは異なり、ＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病性形質転換には、Ｈｏｘａ５は重要な役割を果たさないようである（図３ｂ）。その代りに、ｈＤＯＴ１ＬによるＨ３−Ｋ７９メチル化を介したＨｏｘａ９アップレギュレーションが、ＭＬＬ−ＡＦ１０による白血病性形質転換における重要なイベントであると思われる（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。いくつかの白血病ではＨｏｘａ９過剰発現が観察されているが、その過剰発現は白血病性形質転換にとって必ずしも必要でないことは、注目に値する（Ｓｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３：３１９２−９）。これは、白血病性形質転換に必要な過剰発現Ｈｏｘａ遺伝子を、形質転換にとって不可欠でないものと区別することの重要性を強調している。もう一つの相違は、それらの明確に異なる免疫表現型にある。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換骨髄細胞が主に系列拘束されていない前駆細胞である（ｃ−Ｋｉｔについてのみ陽性）のに対し、ＭＬＬ−ＡＦ１０によって形質転換された細胞は、系列マーカーの発現を伴って骨髄系列に分化する傾向を持つ（図２ｅ、図８）（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−７８）。この観察結果は、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０を持つ白血病患者がしばしば多系列の血液悪性疾患を発症するという事実（これは、その白血病細胞が造血発生の極めて初期段階に由来していることを示している）と合致する（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０：２５３−９）。異なるＨｏｘａ遺伝子のアップレギュレーションはこれらの表現型の相違に結びつけられるかもしれない。例えば、ヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＨｏｘａ５の構成的発現は、赤血球への分化を妨げ、骨髄造血を増加させる（Ｃｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９４：５１９−２８）。造血幹細胞におけるＨｏｘａ５の過剰発現が、白血病性形質転換を直接引き起こすことができるという報告は今のところないが、ＭＬＬ融合物を含まない多くの細胞株が、Ｈｏｘａ５の過剰発現に関して、Ｈｏｘａ９の過剰発現よりも高い発生率を持ち（Ｑｕｅｎｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ４５：５６７−７４）、このことは、Ｈｏｘａ５のアップレギュレーションがＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病に限定されないかもしれないことを示している。

上記は、本発明を例証するものであり、本発明を限定するものであると解釈してはならない。本発明は本願の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物はそこに包含される。

図１Ａ〜Ｆ。Ｕ９３７細胞におけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０のノックダウンは、インビトロおよびインビボにおけるそれらの増殖および白血病誘発を損なう。ａ中、上図は、この融合タンパク質およびノックダウンのためのターゲット領域を表す。二つの矢印はＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマー位置を示す。下図はノックダウン効率を評価するＲＴ−ＰＣＲ結果である。β−アクチンを対照とする。Ｖはベクター対照、ＫＤはノックダウン。ｂ、ｃは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンがＲＰＭＩ培地（ｂ）およびメチルセルロース（ｃ）における細胞増殖に及ぼす効果である。５０個以上の細胞を持つコロニーだけを数えた。ｃにおける図の下の数字は、コロニー数および標準偏差を表す。ｄ〜ｆは、インビボにおけるＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンの効果を示す。ｄは、ノックダウンＣＡＬＭ−ＡＦ１０は、親Ｕ９３７細胞の移植を受けたマウスと比較して、移植マウスの生存時間を延ばすことを示す。ｅは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウン細胞を移植したマウス（下図）は、対照Ｕ９３７細胞を移植したマウス（上図）と比較して、脾臓、腎臓および膵臓における白血病細胞の浸潤が少ないことを示すＨＥ染色である。矢印は移植されたＵ９３７細胞の浸潤を示す。原倍率は、脾臓は×４０、その他は×２０。ｆは、移植されたＵ９３７ ｈＣＤ４５陽性細胞の骨髄および脾臓における増殖のＦＡＣＳ解析である。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンは、骨髄と脾臓の両方で、Ｕ９３７細胞増殖に影響を及ぼす。 図２Ａ〜Ｆ。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の発現はマウス骨髄細胞形質転換を引き起こすのに十分であり、ｈＤＯＴ１Ｌはこの過程に重要な役割を果たす。ａは、レトロウイルス形質導入手法の概略図を示す。ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによる、形質導入された遺伝子の発現の確認を示す。Ｕ９３７細胞を陽性対照とする。ＧＡＰＤＨを、ＲＴ−ＰＣＲへのＲＮＡ投入量の等しさに関する対照とする。ｃは、ベクター対照と、野生型および突然変異型ＣＡＬＭ−ＡＦ１０によって形質導入された骨髄細胞の連続コロニープレーティングを示す。３回の独立した実験の平均コロニー数および標準偏差を記載する。野生型とＯＭ−ＬＺ欠失突然変異体の間の第３ラウンドコロニー数のｐ値を記載する。ｄは、ｍＦＴＯＣ培養における形質導入細胞の成長曲線を示す。ｅは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞のＦＡＣＳによるイムノフェノタイピングを示す。解析に使用した細胞表面マーカーを示す。ｆは、第２の形質導入手法の図解（左図）ならびに野生型および触媒作用欠損ｈＤＯＴ１ＬがＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質転換細胞のコロニー形成に及ぼす効果（右図）である。 図３Ａ〜Ｂ。Ｈｏｘａ５はＣＡＬＭ−ＡＦ１０による白血病性形質転換に関与する。ａ中、左図は、野生型Ｕ９３７細胞およびＣＡＬＭ−ＡＦ１０ノックダウンＵ９３７細胞における後期Ｈｏｘａ遺伝子およびＢｍｉ−１の発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。右図は、野生型およびＯＭ−ＬＺ欠失ＣＡＬＭ−ＡＦ１０突然変異体によって形質導入された第２ラウンドコロニー由来のマウス骨髄細胞における後期Ｈｏｘａ遺伝子およびＢｍｉ−１の発現のＲＴ−ＰＣＲ解析である。ＭＬＬ−ＥＮＬ形質導入細胞におけるＨｏｘａ９発現が同じプライマーで検出されたので（レーン９）、Ｈｏｘａ９に関して検出可能なシグナルを欠くのは、プライマーの不全によるものではない。ｂは、Ｈｏｘａ５ノックアウトはＣＡＬＭ−ＡＦ１０の形質転換能を弱めるが、ＭＬＬ−ＡＦ１０の形質転換能には影響しないことを示す。連続コロニープレーティングアッセイを図２ａの場合と同じように行った。３回の独立した実験の平均コロニー数および標準偏差を記載する。Ｃ５７Ｂ６系統ではＨｏｘａ５ノックアウトが胚致死性を示すので、このアッセイで使用した骨髄細胞はＭＦ１系統のＨｏｘａ５ノックアウトおよび野生型同腹仔から得た（Ｊｅａｎｎｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７，２０８５−９６）。 図４Ａ〜Ｅ。ｈＤＯＴ１ＬはＣＡＬＭ−ＡＦ１０を核内に保つ。ａは、Ｕ２ＯＳ細胞における野生型およびＯＭ−ＬＺ欠失突然変異型Ｆｌａｇ−ＣＡＬＭ−ＡＦ１０ならびにＣＡＬＭの細胞内分布である。トランスフェクト細胞（赤色、上図）を矢印で示す。核をＤＡＰＩで染色する（下図）。ｂは、共焦点顕微鏡法を使ったＦｌａｇ抗体による核染色の解析。バー＝１０ｍｍ。ｃは、ｈＤＯＴ１Ｌ（緑色、上図）およびＦｌａｇ−ＣＡＬＭ−ＡＦ１０（赤色、中図）を同時トランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞の免疫蛍光染色である。トランスフェクト細胞を矢印で示す。核をＤＡＰＩで染色する（下図）。ｄは、（ｃ）に呈示された細胞の定量。Ｎ：核内に発現させた細胞である。Ｃ：細胞質内に発現させた細胞。ｅは、同時発現させた場合のｈＤＯＴ１ＬおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化の共焦点顕微鏡解析である。観察された二つの染色パターンを記載する。より多くのドットを伴う下図に示すパターンが優勢である（約８０％）。バーは、１０ｍｍを示す。 図５Ａ〜Ｃ。ｈＤＯＴ１Ｌと会合したＣＡＬＭ−ＡＦ１０は、プロモーターでも下流でもＨｏｘａ５に結合して、局所Ｈ３−Ｋ７９メチル化を媒介する。ａは、Ｈｏｘａ５遺伝子座およびＣｈＩＰアッセイに使用したアンプリコンの図解である。ｂは、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質導入骨髄細胞および対照骨髄細胞におけるＨｏｘａ５座の全体にわたるＣＡＬＭ−ＡＦ１０の位置のＣｈＩＰ解析である。インプット＝０．５％。ｃは、Ｈｏｘａ５遺伝子の選択した領域におけるヒストン修飾のＣｈＩＰ解析である。アッセイに使用した細胞および抗体を示す。インプット＝２％。 図６Ａ〜Ｂ。ＣＡＬＭ−ＡＦ１０とｈＤＯＴ１Ｌの相互作用は、ＡＦ１０のＯＭ−ＬＺ領域によって媒介される。ａは、トランスフェクションに使用したコンストラクトの図解である。２９３Ｔ細胞中のＣＡＬＭ−ＡＦ１０とｈＤＯＴ１Ｌの共免疫沈降。トランスフェクションの３６時間後にトランスフェクト細胞を収集した。４２０ｍＭ ＫＣｌを含有する溶解緩衝液を使って全細胞抽出物を調製した。免疫沈降にはＭ２アガロースビーズを使用し、５００ｍＭ ＫＣｌを含有する溶解緩衝液でビーズを洗浄した。ｈＤＯＴ１Ｌ抗体（上図）およびＦｌａｇ抗体（下図）を用いるウェスタンブロット法で結果を解析した。Ｉｎ：インプット、Ｓ：上清、ＩＰ：免疫沈降物。 図７Ａ〜Ｂ。ａは、ＣＡＬＭタンパク質およびＡＦ１０タンパク質の概略図である。ＮＥＳおよびＮＬＳを含む潜在的機能モチーフを示す。赤い矢印は、Ｕ９３７細胞中に存在するＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合物に関する主要切断点を示す。緑色の矢印は、ＭＬＬ−ＡＦ１０融合におけるＡＦ１０の切断点を示す。数字はアミノ酸位置を表す。ｂは、ＣＡＬＭ中の推定ＮＥＳ配列のアライメントである。この配列は、ＣＡＬＭに似たエンドサイトーシスアクセサリータンパク質ＡＰ１８０に保存されている。 ＣＡＬＭ−ＡＦ１０形質導入骨髄細胞とＭＬＬ−ＡＦ１０形質導入骨髄細胞の間の免疫表現型の相違を示すＦＡＣＳ解析。野生型Ｈｏｘａ５骨髄細胞の第２ラウンドコロニー由来の細胞を、ｃ−Ｋｉｔ、Ｇｒ１、およびＣＤ１１ｂ抗体で染色してから、ＦＡＣＳ解析を行った。

Claims (19)

1. 白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、
   ＤＯＴ１ＬポリペプチドがＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＤＯＴ１ＬポリペプチドをＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、
   ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の相互作用を検出するステップと
   を含み、
   前記試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、前記試験化合物存在下での、ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す、方法。
2. ＤＯＴ１ＬポリペプチドのＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質との相互作用が、
   （ｉ）ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０の間の結合を決定すること、
   （ｉｉ）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０の核局在化を決定すること、
   （ｉｉｉ）ＨｏｘＡ５のヒストンＨ３リジン７９（Ｈ３−Ｋ７９）メチル化を決定すること、もしくは前記ＨｏｘＡ５プロモーターの前記Ｈ３−Ｋ７９メチル化が決定されること、または
   （ｉｖ）ＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定すること
   によって評価される、請求項１に記載の方法。
3. 白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、
   試験化合物がＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質に結合するのに十分な条件下で、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質を前記試験化合物と接触させるステップと、
   前記試験化合物とＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の間の結合を検出するステップとを含み、
   ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質への前記試験化合物の結合が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法。
4. 白血病の予防および／または治療のための候補化合物を識別する方法であって、
   （ｉ）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質がＨｏｘＡ５プロモーターに結合するのに十分な条件下、または（ｉｉ）ＤＯＴ１ＬポリペプチドとＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質が複合体を形成し、前記複合体がＨｏｘＡ５プロモーターに結合するのに十分な条件下で、試験化合物の存在下で、ＨｏｘＡ５プロモーター領域を含む核酸を（ｉ）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質、または（ｉｉ）ＤＯＴ１ＬポリペプチドおよびＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質と接触させるステップと、
   （ｉ）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質の前記ＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用、または（ｉｉ）前記ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体の前記ＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用を検出するステップと
   を含み、
   前記試験化合物の非存在下での相互作用のレベルと比較した、前記試験化合物存在下での、（ｉ）ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質とＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用、または（ｉｉ）前記ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体の前記ＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用の減少が、前記試験化合物が白血病の予防および／または治療のための候補化合物であることを示す方法。
5. 前記核酸が前記ＨｏｘＡ５遺伝子のエクソン１をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記核酸が前記ＨｏｘＡ５遺伝子のエクソン１とエクソン２の間のイントロンをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記核酸が前記ＨｏｘＡ５遺伝子のエクソン２をさらに含む、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
8. 前記ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体の前記ＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用が、前記ＨｏｘＡ５プロモーターへの前記ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体の結合を決定することによって評価される、請求項４に記載の方法。
9. ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体の前記ＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用が、前記ＨｏｘＡ５プロモーターのヒストンＨ３リジン７９（Ｈ３−Ｋ７９）メチル化を決定することによって評価される、請求項４に記載の方法。
10. 前記ＤＯＴ１Ｌ／ＣＡＬＭ−ＡＦ１０複合体の前記ＨｏｘＡ５プロモーターとの相互作用が、前記ＨｏｘＡ５プロモーター活性を決定することによって評価される、請求項４に記載の方法。
11. 前記ＨｏｘＡ５プロモーターがレポーター分子をコードするヌクレオチド配列と作動可能に関連し、ＨｏｘＡ５プロモーター活性が前記レポーター分子を検出することによって決定される、請求項２または４に記載の方法。
12. 前記レポーター分子がポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ポリペプチドが酵素である、請求項１２に記載の方法。
14. 無細胞アッセイとして行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
15. 細胞に基づくアッセイとして行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
16. 前記ＤＯＴ１Ｌポリペプチドおよび／またはＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質が核酸から発現される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
17. 前記白血病がＴ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）または急性骨髄性白血病サブタイプＭ０／１（ＡＭＬ−Ｍ０／１）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
18. 前記ＤＯＴ１Ｌポリペプチドが哺乳類ＤＯＴ１Ｌポリペプチドであり、前記ＣＡＬＭ−ＡＦ融合タンパク質が哺乳類ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
19. 前記ＤＯＴ１ＬポリペプチドがヒトＤＯＴ１Ｌポリペプチドであり、前記ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質がヒトＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。

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