JP5166051B2

JP5166051B2 - キサンテン化合物のスルホンアミド誘導体

Info

Publication number: JP5166051B2
Application number: JP2008010915A
Authority: JP
Inventors: ヴィルヘルム・ゲー・フランク; マティアス・エス・ヴェンツェル; ペーター・テー・ツェルネイ; スルブヒ・デサイ; グレッグ・ハーマンソン
Original assignee: ピアス・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2008-01-21
Publication date: 2013-03-21
Anticipated expiration: 2028-01-21
Also published as: ATE534641T1; US20080177086A1; EP1947095A1; EP1947095B9; US7745645B2; EP1947095B1; JP2008231093A

Description

本発明は、蛍光性キサンテン化合物のスルホンアミド誘導体、これらを用いる組成物および方法に関する。

有機蛍光化合物（色素とも呼ばれる）は、生物学的アッセイにおいて高感度検出試薬として用いられる。キサンテン型色素は、研究用試薬として多くの製造会社から商業的に入手可能である。
これらの化合物のうちフルオレセイン誘導体は、3H-キサンテン-6-オール-3-オンのコア構造をベースにし、中心環のC9に2-カルボキシフェニル基を有する。ローダミン色素は、典型的には、6-アミノ-3H-キサンテン-3-オン構造を有し、C9に同じ2-カルボキシフェニル基を有する。

蛍光色素に負荷電のスルホネート基を加えると、これらの水溶性を高め、生物学的アプリケーションにおける使用を容易にし、かつ、電荷の反発などに起因する色素-色素相互作用を低減する。スルホン化は、シアニン色素の修飾（米国特許第5,268,486号、同第5,486,616号、同第5,569,587号、および同第5,569,766号）およびキサンテン型色素の修飾（米国特許第6,130,101号）にも用いられてきた。
米国特許第6,130,101号公報

さらなる化合物、組成物、および方法が求められている。

キサンテン環構造を有する化合物のスルホンアミド誘導体、特にアリールスルホンアミド誘導体を開示する。これらは、蛍光キサンテン化合物または色素と呼ばれ、フルオレセイン、ロードル色素、ローダミン類、およびこれらの反応性の誘導体および結合体がある。１種以上のアリールスルホンアミド誘導体および親水性構成部分をこのスルホンアミドの窒素に加えると、置換されていない化合物の誘導体より水溶性および他の特性が高められる。１つの実施態様では、本化合物は、場合により、生体分子に共有結合的にカップリングさせるために用いることができる反応性基を有していてもよい。
これらの化合物は、増強された蛍光、水溶性、および生体適合性を有し、生物学的アッセイおよび他のタイプのアッセイにおける蛍光プローブとして組成物および方法において使用されうる。

１つの実施態様として、スルホンアミド誘導体に加えて、少なくとも１個の反応性のL-Rt基（Ｌは、色素に共有結合した連結基であり、Ｒｔは、別の分子に共有結合的に連結可能な反応性基である）を有するキサンテン色素誘導体が挙げられる。

１つの実施態様は、一般式Iまたは一般式II：
［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、同じかまたは異なり、独立して、-H、-C₁〜C₁₈アルキル、および-ω-スルホアルキルからなる群から選択され；
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、独立して、-O^-、-OH、-SH、-NH-NH₂、-F、-CI、-Br、-I、-O-Su(スクシンイミジル／スルホスクシンイミジル), -O-STP (4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-TFP (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-ベンゾトリアゾール、-ベンゾトリアゾール、-NR-CO-CH₂-I、-NR₂、-NR-生体分子、-NR-L-COO^-、-NR-L-COOH、NR-L-COO-Su、-NR-L-COO-STP、-NR-L-COO-TFP、-NR-L-CONR₂, -NR-L-CO-生体分子、-NR-L-CO-NH-NH₂、-NR-L-OH、-NR-L-O-ホスホルアミダイト、-NR-L-CHO、-NR-L-マレイミド、および-NR-L-NH-CO-CH₂-I〔ここで、Ｒは、Ｒ^１またはＲ^２と同じであり、Ｌは、酸素、置換された窒素、および／または硫黄からなる群から選択される少なくとも１種の原子で置換されていてもよい、直鎖状（-(CH₂)_o-、o = 1〜15）の、交差の、または環状の二価のアルカン基からなる群から選択され、前記生体分子は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンである〕からなる群から選択され；
Ｚは、-O^-または-OHであり；
Ｕは、-O^-、-OH、または-NH-L-SO₂Zであり；
Ｋａｔは、Li、Na、K、（モノ-、ジ-、またはトリアルキル）アンモニウム、または他の陽イオンであり；
Ａｎは、-F、-CI、-Br、-I、-BF₄、-ClO₄、-CH₃CO₂、-CF₃CO₂、または他の陰イオンであり；
ｍは、式Iまたは式IIの色素部分の正または負の電荷を補うのに必要な1〜6の整数であり；かつ
ｎは、0〜12の整数である］
の少なくとも１種の化合物である。

実施態様において、一般式Iおよび／または式IIの化合物として、下記式III（V03-04093）、式IV、式V（V03-04115）、式VI、式VII（V03-04153）、式VIII、式IX（V02-06158）、式X、式XI（V03-04118）、式XII、式XIII（V03-04120）、式XIV、式XV（V03-04133）、および／または式XVI：
の実施態様が挙げられる。

別の実施態様は、少なくとも１種の賦形剤と、
一般式Iまたは一般式II：
［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、同じかまたは異なり、独立して、-H、-C₁〜C₁₈アルキル、および-ω-スルホアルキルからなる群から選択され；
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、独立して、-O^-、-OH、-SH、-NH-NH₂、-F、-CI、-Br、-I、-O-Su(スクシンイミジル／スルホスクシンイミジル), -O-STP (4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-TFP (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-ベンゾトリアゾール、-ベンゾトリアゾール、-NR-CO-CH₂-I、-NR₂、-NR-生体分子、-NR-L-COO^-、-NR-L-COOH、NR-L-COO-Su、-NR-L-COO-STP、-NR-L-COO-TFP、-NR-L-CONR₂, -NR-L-CO-生体分子、-NR-L-CO-NH-NH₂、-NR-L-OH、-NR-L-O-ホスホルアミダイト、-NR-L-CHO、-NR-L-マレイミド、および-NR-L-NH-CO-CH₂-I〔ここで、Ｒは、Ｒ^１またはＲ^２と同じであり、Ｌは、酸素、置換された窒素、および／または硫黄からなる群から選択される少なくとも１種の原子で置換されていてもよい、直鎖状（-(CH₂)_o-、o = 1〜15）の、交差の、または環状の二価のアルカン基からなる群から選択され、前記生体分子は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンである〕からなる群から選択され；
Ｚは、-O^-または-OHであり；
Ｕは、-O^-、-OH、または-NH-L-SO₂Zであり；
Ｋａｔは、Li、Na、K、（モノ-、ジ-、またはトリアルキル）アンモニウム、または他の陽イオンであり；
Ａｎは、-F、-CI、-Br、-I、-BF₄、-ClO₄、-CH₃CO₂、-CF₃CO₂、または他の陰イオンであり；
ｍは、式Iまたは式IIの色素部分の正または負の電荷を補うのに必要な1〜6の整数であり；かつ
ｎは、0〜12の整数である］
の少なくとも１種の化合物と
を含む、生体適合性色素組成物である。

別の実施態様は、少なくとも１種の賦形剤と、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、および式XVI、およびこれらの組合せから選択される化合物とを含む生体適合性色素組成物である（ここで、式III〜XVIは上述したとおりである）。

別の実施態様は、少なくとも１種の生体分子をラベリングする方法であって、
少なくとも１種の賦形剤と、
一般式Iまたは一般式II：
［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、同じかまたは異なり、独立して、-H、-C₁〜C₁₈アルキル、および-ω-スルホアルキルからなる群から選択され；
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、独立して、-O^-、-OH、-SH、-NH-NH₂、-F、-CI、-Br、-I、-O-Su(スクシンイミジル／スルホスクシンイミジル), -O-STP (4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-TFP (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-ベンゾトリアゾール、-ベンゾトリアゾール、-NR-CO-CH₂-I、-NR₂、-NR-生体分子、-NR-L-COO^-、-NR-L-COOH、NR-L-COO-Su、-NR-L-COO-STP、-NR-L-COO-TFP、-NR-L-CONR₂, -NR-L-CO-生体分子、-NR-L-CO-NH-NH₂、-NR-L-OH、-NR-L-O-ホスホルアミダイト、-NR-L-CHO、-NR-L-マレイミド、および-NR-L-NH-CO-CH₂-I〔ここで、Ｒは、Ｒ^１またはＲ^２と同じであり、Ｌは、酸素、置換された窒素、および／または硫黄からなる群から選択される少なくとも１種の原子で置換されていてもよい、直鎖状（-(CH₂)_o-、o = 1〜15）の、交差の、または環状の二価のアルカン基からなる群から選択され、前記生体分子は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンである〕からなる群から選択され；
Ｚは、-O^-または-OHであり；
Ｕは、-O^-、-OH、または-NH-L-SO₂Zであり；
Ｋａｔは、Li、Na、K、（モノ-、ジ-、またはトリアルキル）アンモニウム、または他の陽イオンであり；
Ａｎは、-F、-CI、-Br、-I、-BF₄、-ClO₄、-CH₃CO₂、-CF₃CO₂、または他の陰イオンであり；
ｍは、式Iまたは式IIの色素部分の正または負の電荷を補うのに必要な1〜6の整数であり；かつ
ｎは、0〜12の整数である］
の少なくとも１種の化合物と
を含む組成物を、前記化合物が生体分子に結合するのに足りる条件の下、有効な濃度で前記生体分子に供給する工程；および
前記生体分子に結合した結合体を検出する工程
を含む方法である。

別の実施態様は、少なくとも１種の生体分子をラベリングする方法であって、
少なくとも１種の賦形剤と、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、および式XVI、およびこれらの組合せの少なくとも１種の化合物とを含む組成物を、前記化合物が生体分子に結合するのに足りる条件下、有効な濃度で前記生体分子に供給する工程；および
前記生体分子に結合した結合体を検出する工程
を含む方法である（ここで、式III〜XVIは上述したとおりである）。

実施態様において、一般式Iおよび／または式IIの化合物として、下記式III（V03-04093）、式IV、式V（V03-04115）、式VI、式VII（V03-04153）、式VIII、式IX（V02-06158）、式X、式XI（V03-04118）、式XII、式XIII（V03-04120）、式XIV、式XV（V03-04133）、および式XVIの実施態様が挙げられる。

１つの実施態様において、下記式：
のとおり、出発物質としてm-アミノフェノールおよびトリメリット酸無水物を用いて、5-カルボキシ-ローダミン110が、6-カルボキシ-ローダミン110との異性体混合物として形成される。この5/6カルボキシ-ローダミン異性体混合物の収率は約16％であった。

5-カルボキシ-ローダミンから出発して、この反応は下記のとおりのスルホクロル化反応によって進行する：

１つの実施態様は、スルホンアミドキサンテン色素誘導体を蛍光染料として用いる。この実施態様では、色素誘導体を、さまざまなアプリケーション（例えば、ゲルまたはブロット上、細胞内、組織切片内などの電気泳動法によって分離されるアプリケーション）において生体分子（例えば、タンパク質など）を染色するために用いる。この実施態様では、反応性スルホンアミドキサンテン色素誘導体は、生体分子に共有結合的に連結していてもよく、かつ／あるいは色素誘導体の生体分子への非共有結合性相互作用（例えば、吸収）を増大させるために構成要素を色素誘導体に加えてもよい。このような非共有結合性相互作用は、極性基または荷電した基に欠ける疎水性構成要素（例えば、アルキル鎖、芳香環など）を加えることによって容易にすることができる。１つの実施態様では、疎水性構成要素と荷電したまたは極性の親水性構成要素とを色素化合物の別の部分で組み合わせると、生体分子（例えば、タンパク質など）の吸収性の染色が増強された。

本化合物は、光に安定な緑色の蛍光物質であり、レーザー光を増強し、これによってアルゴンイオンレーザーを用いる試料中の化合物の検出を容易にするのに良好な中間波長に吸収極大を有する。本化合物は、試料中の唯一の色素として用いることができる。あるいは、本化合物は、マルチプレックスアッセイに使用することができる。１つの実施態様は、マルチプレックスアッセイにおいて、本化合物を赤色色素と共に用いる。１つの実施態様は、本化合物を免疫蛍光顕微鏡法において用いる。１つの実施態様は、本化合物をハイコンテント分析（HGA）アッセイおよび化合物スクリーニング（例えば、核内移行、タンパク質誘導などに対するタンパク質性細胞質を定量するためのさまざまな刺激物質を用いるもの）において用いる。１つの実施態様は、本化合物を、（直接または間接の）免疫蛍光法において用いる（例えば、細胞内標的の局在を検出および定量するためのもの）。１つの実施態様は、本結合体化合物をスタンドアロンの一次抗体として用いる。１つの実施態様は、本化合物をHCAアッセイのためのターンキー試薬キットに組み込む。
本発明は、以下の実施例によってさらに理解されるであろう。

［実施例１］：化合物III（V03-04093）のＡ法による合成
821 mg（2 mmol）の5-(6)-カルボキシローダミン110塩酸塩（純粋な異性体または混合物）の10 mlクロロスルホン酸溶液を、80℃にて1時間加熱した。室温に冷却した後、10 mlの20％発煙硫酸を添加し、この溶液を室温にて90分間保った。次いで、この溶液を400 gの破砕した氷に注意深く注加し、得られた沈殿物を濾取した。氷水で洗浄した後、この沈殿物を、238 mg（2 mmol）の3-アミノプロパンスルホン酸のアセトニトリルと水との混合液（10 ml；V/V = 1:1）中の溶液（1 mlのトリエチルアミンを含有する）に溶解させた。溶媒を除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー（RP-18シリカゲル；1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水2/8）によって精製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 491 nm
MS (ESI⁺) [m/z]：656.4 [M]⁺

［実施例２］：化合物V（V03-04115）の合成
V03-04093（154 mg；0.2 mmol）を、DMFと水との混合液（10 ml；V/V = 3:1）に溶解し、0℃に冷却した。この溶液に、O-スクシンイミジル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（120 mg；0.4 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（52 mg；0.4 mmol）を添加した。0℃にて20分の後、溶媒を高い真空度で蒸留により除いた。残渣をカラムクロマトグラフィー（RP-18シリカゲル；アセトニトリル／水2/8）によって精製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 494 nm
MS (ESI^-) [m/z]：751.1 [M+H]^-

［実施例３］：化合物VII（V03-04153）の合成
V03-04093（154 mg；0.2 mmol）を、DMFと水との混合液（10 ml；V/V = 3:1）に溶解した。この溶液に、テトラフルオロフェノール（33 mg；0.2 mmol）、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（82 mg；0.4 mmol）、およびジイソプロピルエチルアミン（52 mg；0.4 mmol）を添加した。室温にて24時間の後、溶媒を高い真空度で蒸留により除いた。残渣を塩化ナトリウム（584 mg；10 mmol）を含有する10 mlの水に溶解させ、カラムクロマトグラフィー（RP-18シリカゲル；アセトニトリル／水2/8）によって精製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 495 nm
MS (ESI^-) [m/z]：802.1 [M]^-

［実施例４］：化合物IX（V02-06158）の合成
化合物V（V03-04115）（実施例２に従って調製したもの）（101 mg；0.1 mmol）を、DMFと水との混合液（5 ml；V/V = 3:1）に溶解した。この溶液に、アミノカプロン酸（26 mg；0.2 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（52 mg；0.4 mmol）を添加した。室温にて2時間の後、溶媒を高い真空度で蒸留により除いた。残渣を塩化ナトリウム（584 mg；10 mmol）を含有する10 mlの水に溶解させ、カラムクロマトグラフィー（RP-18シリカゲル；アセトニトリル／水3/7）によって精製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 492 nm
MS (ESI^-) [m/z]：767.1 [M]^-

［実施例５］：化合物XI（V03-04118）の合成
化合物XI（V03-04118）を、化合物IX（V02-06158）（79 mg；0.1 mmol）を出発物質として用いて、実施例２の化合物V（V03-04115）と同じように調製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 492 nm
MS (ESI^-) [m/z]：864.1 [M+H]^-

［実施例６］：化合物XIII（V03-04120）の合成
化合物XIII（V03-04120）を、化合物IX（79 mg；0.1 mmol）を出発物質として用いて、実施例３の化合物VII（V03-04153）と同じように調製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 493 nm
MS (ESI^-) [m/z]：915.2 [M]^-

［実施例７］：化合物XV（V03-04133）の合成
化合物V（V03-04115）（実施例２に従って調製したもの）（101 mg；0.1 mmol）を、DMFと水との混合液（5 ml；V/V = 3:1）に溶解した。この溶液に、2-マレイミドエチルアミントリフルオロアセテート（38 mg；0.15 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（52 mg；0.4 mmol）を添加した。室温にて2時間の後、溶媒を高い真空度で蒸留により除いた。残渣を塩化ナトリウム（584 mg；10 mmol）を含有する水に溶解させ、カラムクロマトグラフィー（RP-18シリカゲル；アセトニトリル／水3/7）によって精製した。
UV-Vis（ｐＨ7緩衝）：λ_abs = 493 nm
MS (ESI^-) [m/z]：776.1 [M]^-

［実施例８］：タンパク質への結合
化合物に、それらが他の分子に共有結合的に連結することを可能にする基を加えることによって、反応性を付与した。反応性の基を、例えばタンパク質などの巨大分子（例えば、抗体、ストレプタビジン）に結合させ、免疫蛍光アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ELIZA、フローサイトメトリー、細胞内アッセイなど）において用いた。

10 mg/mlのヤギ抗ウサギIgG(H+L)(GAR) 3 x 10 mgおよび10 mg/mlのヤギ抗マウスIgG(H+L)(GAM) 3 x 10 mgを、ｐＨ8.4の50 mM ホウ酸塩緩衝液5リットルに対して一晩透析した。透析した各抗体を、0.1 mlのDMF中で再構成された式V、XI、およびXIIIの各化合物10モル過剰でラベルした。反応を室温（約20℃〜約22℃）にて2時間行った。試料を、0.15 M NaCl、ｐＨ7.2（リン酸緩衝生理食塩水（PBS））の0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液3 x 5リットルに対して一晩透析することによって、過剰の未反応の化合物を除去した。PBSを3回交換して用いた。ラベルしたタンパク質の1:100希釈液を作成し、試料の吸収スキャンを実施した直後に、式V、XI、およびXIIIの各化合物で作られた結合体について、色素のモル数とタンパク質のモル数との比が5〜6の間（5および6を含む）であることを定量した。

10 mg/mlのストレプタビジン（SA）3 x 10 mgを、ｐＨ8.4の50 mM ホウ酸塩緩衝液中で再構成した。このストレプタビジンを、0.1 mlのDMF中で再構成された式V、XI、およびXIIIの各化合物5モル過剰でラベルした。反応を室温にて2時間行った。試料を、0.15 M NaCl、ｐＨ7.2（PBS）の0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液3 x 5リットルに対して一晩透析することによって、過剰の未反応の化合物を除去した。PBSを3回交換して用いた。ラベルしたタンパク質の1:100希釈液を作成し、試料の吸収スキャンを実施した直後に、式V、XI、およびXIIIの各化合物で作られた結合体について、色素のモル数とタンパク質のモル数との比が2〜4の間（2および4を含む）であることを定量した。

10 mg/mlのニュートラビジン（登録商標）ビオチン結合タンパク（NA）（Pierce Biotechnology社）1 x 10 mgを、ｐＨ8.4の50 mM ホウ酸塩緩衝液中で再構成した。ニュートラビジン（登録商標）ビオチン結合タンパクを、DMF中で再構成された式Vの化合物5モル過剰でラベルした。反応を室温にて2時間行った。過剰の未反応の化合物を、試料を、0.15 M NaCl、ｐＨ7.2（PBS）の0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液3 x 5リットルに対して一晩透析することによって除去した。PBSを3回交換して用いた。ラベルしたタンパク質の1:100希釈液を作成し、試料の吸収スキャンを実施した直後に、式Vの化合物で作られた結合体について、色素のモル数とタンパク質のモル数との比が2〜3の間（2および3を含む）であることを定量した。

［実施例９］：ヤギ抗ウサギ結合体のプレートアッセイ
式Vの化合物-ヤギ抗ウサギ(GAR)結合体を用いた機能アッセイのデータを図１に示す。このアッセイは、室温（約20℃〜約22℃）にて段階的に希釈した96ウェルの白色半透明のウサギIgG-コーティングプレート（10 μg/ml〜0 μg/ml）で行った。このプレートを、PBS-0.05％Tween 3 x 200 μl、およびPBS緩衝液1 x 200 μlで洗浄した。式V-ヤギ抗ウサギ(GAR)結合体を、PBS緩衝液中、0.004 mg/mlに希釈した。この希釈した結合体をプレートのウェルに注ぎ（100μl／ウェル）、このプレートを1時間インキュベートした後、上述の通りに洗浄した。PBS緩衝液をプレートに加え（100μl／ウェル）、TECAN Safire（登録商標）をグリーンレーザー設定にて励起波長495 nmおよび発光波長519 nmで使用して蛍光強度を得た。商業的に入手可能なAlexa Fluor（登録商標）488-GAR（Molecular Probes社、Eugene オレゴン州）を、同じ濃度に希釈し、式V-GAR結合体について前述した通りに評価した。

図１に示したように、ウサギIgGが、2 ng／ウェルの濃度で、式V-GAR結合体を用いて検出された。式III-GAR結合体をアッセイした場合、Alexa Fluor（登録商標）488-GAR結合体より10％高いシグナル強度が得られた（データは図示せず）。

［実施例１０］：ストレプタビジン結合体およびニュートラビジン（登録商標）結合体を用いるプレートアッセイ
ストレプタビジンおよびニュートラビジン（登録商標）がそれぞれ結合した式Vの化合物を用いた機能アッセイのデータを、それぞれ図２および図３に示す。このアッセイは、段階的に希釈した96ウェルの白色半透明のビオチン化-BSA-コーティングプレート（2 μg/ml〜0 μg/ml）で行った。プレートを、PBS-0.05％Tween 3 x 200 μl、およびPBS緩衝液1 x 200 μlで洗浄した。式V-ストレプタビジン(SA)結合体および式V-ニュートラビジン（登録商標）(NA)結合体を、PBS緩衝液中、0.004 mg/mlに希釈した。希釈した結合体をプレートのウェルに注ぎ（100μl／ウェル）、このプレートを覆い、光を遮断し、1時間インキュベートした後、上述の通りに洗浄した。PBS緩衝液をプレートに加え（100μl／ウェル）、TECAN Safire（登録商標）をグリーンレーザー設定にて使用して蛍光強度を得た。商業的に入手可能なAlexa Fluor（登録商標）488-SA（Molecular Probes社）を、同じ濃度に希釈し、式Vが結合したSAについて前述した通りに評価した。

SAに対して図２に、NAに対して図３に示したように、このアッセイで、ビオチン化されたBSAが、2 ng／ウェルの濃度で、式Vが結合したストレプタビジンを用いても式Vが結合したニュートラビジン（登録商標）を用いても検出された。

［実施例１１］：マルチプレックスウエスタンブロット
組換えマウスTNFαとHela細胞ライセートとの組合せを、4〜20％のトリス-グリシンゲル上の電気泳動法によって分離した。タンパク質は、Hybond-LFPメンブレン（Amersham社）に移動し、1 x BSA/PBS-0.05％Tween中で一晩ブロックされた。このブロットを、PBS-0.05％Tween-20で希釈したマウス抗-チューブリンMAb一次抗体（1 μl/ml）およびウシ抗- TNFα一次抗体（1 μg/ml）と共に1時間コインキュベートした。インキュベーションの後、ブロットをPBS-0.05％Tween-20で3 x 10分間洗浄した。PBS-0.05％Tween-20で希釈した二次抗体-式V-ヤギ抗ウサギ(GAR)結合体（0.067 μg/ml）および二次抗体-DyLight（登録商標）649-ヤギ抗マウス(GAM)結合体（0.067 μg/ml）を、タンパク質の検出のためにインキュベートした。このインキュベーションの後、ブロットをPBS-0.05％Tween-20で6 x 5分間洗浄した。画像は、グリーンレーザーおよびレッドレーザー設定にてTyphoon 9410 Variable Model Imagerで撮影した。

結果を図４に示す。各レーン1〜7は、以下の量の組換えマウスTNFα：0.20 ng、0.39 ng、0.78 ng、6.25 ng、12.5 ng、25 ng、および50 ngをそれぞれ含有し、Hela細胞ライセートの以下の希釈液：Hela細胞ライセートの1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、および1:64希釈液をそれぞれ含有する。赤色に染色されたバンドは、TNFαである（純粋）。緑色に染色されたバンドは、細胞ライセート中のチューブリンである。TNFαは、式V-GAR結合体を用いて0.2 ngに至るまで検出された。これらの結果は、開示したローダミン結合体がマルチプレックスアプリケーションにおいて用いられ得ることを実証する。

［実施例１２］：免疫蛍光アッセイ
組織学的に調製されたヒト小腸正常細胞を含有するスライドを、インキュベーター内で45℃にて50分間加熱することによって脱パラフィン化した。このスライドを、EZ-脱ワックス溶液中の5分間のインキュベーション2回によって再水和した後、超純粋で1回およびPBS-0.05％Tween-20（PBST）で1回洗浄した。スライドを、標的取り出し溶液中、95℃〜99℃にて40分間インキュベートした後、20分間室温に冷却し、PBS-0.05％Tween-20で1回洗浄することによって、標的を取り出した。このスライドを、PBS-0.05％Tween-20で2 x 3分間洗浄した。

このスライドをもとのインキュベーション容器に戻し、PBS-0.05％Tween-20中の3％の正常ヤギ血清15 mlを添加し、このスライドを4℃にて一晩インキュベートした。このスライドを遠心分離で乾燥させた。DyLight（登録商標）680に結合したコムギ胚芽凝集素（WGA）を10 μg/mlに希釈し、ウサギ抗-S-100一次抗体を（もとの濃度から）1:400に希釈した。両試薬は、同じ1 ml のPBS-0.05％Tween-20中で希釈した。200 μlのこの処理液をスライドに注いだ。スライド上に収容された組織を、インキュベーションチャンバーで覆って、抗体溶液の蒸発を防いだ。このスライドを、一次抗体で1時間インキュベートした。このスライドを、PBS-0.05％Tween-20で3回洗浄した。

式V-ヤギ抗ウサギ(GAR)結合体を、10 μg/mlに希釈し、200 μlをスライドに注いだ。このスライド上に収容された組織を、インキュベーションチャンバーで覆って、抗体溶液の蒸発を防いだ。このスライドを、二次抗体で1時間インキュベートした後、PBS-0.05％Tween-20で3回洗浄した。このスライドをPBS中にディップした後、遠心分離により乾燥させた。一滴の蛍光封入媒体をスライドに添加した後、カバーガラスを施した。このスライドをZeissの共焦点顕微鏡を使用して視覚化するまで4℃で貯蔵した。

結果を図５に示す。赤色の染色領域は、DyLight（登録商標）680-WGA結合体を示す。緑色の染色領域は、式V-GAR結合体を示す。これらの結果は、開示したローダミン結合体が免疫蛍光アプリケーションにおいて用いられ得ることを実証する。

［実施例１３］：蛍光In-Situハイブリダイゼーション（FISH）
間期および中期を囲む視認可能な細胞質を有する細胞に対して、細胞を0.005％のペプシンを含む0.01 M HCl中37℃にて10分間インキュベートすることによって、スライドを調製した。次いで、このスライドをPBS中で2 x 1分間洗浄し、PBS中の1％のホルムアルデヒド中で10分間インキュベートした。このスライドをPBS中で2 x 1分間インキュベートし、70％エタノール中で1分間脱水させた後、98％エタノール中で1分間脱水させ、100％エタノール中で1分間脱水させた後、空気乾燥させた。

標的に対して式Vの化合物でラベルしたプローブ10 μlを、0.5 mlの微小遠心管に分配した後、水浴中で96℃にて5分間インキュベートした。この管を簡単に遠心分離した後、標的に10 μlのプローブ混合物を注ぎ、カバーガラスで覆った。このスライドおよびプローブを、温度制御されたホットプレート上で80℃にて2分間の間変性させる。その後、加湿された環境中、37℃にて12〜18時間インキュベートした。

カバーガラスを、37℃にて2 x SSC/0.1％Tween-20中に浸漬させることによって取り除いた。次いで、このスライドを、0.5 x SSC/0.1％SDS中60℃〜65℃にて4 x 5分間洗浄した後、蒸留水で簡単にリンスし、直射光を遮断して空気乾燥させた。DAPI抗退色溶液（20 μl）を標的に注ぎ、カバーガラス（24 mm x 50 mm）で覆った。その後、適切なフィルターセットまたはレーザーを備えた蛍光顕微鏡上で観察した。蛍光発光が、ハイブリダイゼーション後に検出された。

［実施例１４］：フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを使用し、ヤギ抗マウス(GAM)二次抗体でラベルされた式Vの化合物を用いて、Jurkat細胞上のCD3レセプターを評価する。Jurkat細胞を、5分間4000 rpmで遠心分離し、1 x 3 mlのdPBSで洗浄し、5 mlのdPBSに再懸濁させる。細胞の濃度は28 x 10⁶ 細胞/mlに調節する。細胞を、マウス抗-CD3抗体（0.625 μg/ml）中で45分間インキュベートし、5分間遠心分離にかけ、2 x 1 mlのPBSで洗浄する。細胞を、dPBSで希釈された式V-ヤギ抗マウス結合体（2.7 μg/ml）中で45分間インキュベートする。その後、細胞を上述の通りに遠心分離し、2 x 1 mlのdPBSで洗浄し、300 μlのdPBSに再懸濁させる。データをBecton Dickinson FACSCalibur（登録商標）または同等のフローサイトメトリーに収集する。個々の細胞上の抗体が、高精度、高速、かつ正確に、定量的に検出される。

［実施例１５］：ハイコンテントスクリーニング（HCS）および／またはハイコンテント分析（HCA）アッセイのための試薬キット
上述した化合物のいずれかを、抗体に結合させ、特定の生物学のためのHCSおよび／またはHCAのためのキットとして調製することができる。このキットは、有効なプロトコールにおける使用指示書を備える。

［実施例１６］：ハイコンテントスクリーニング（HCS）
上述した化合物のいずれかを、抗体に結合させ、p53誘導のHCS測定に用いる。A549細胞を、異なる濃度のカンプトテシンでこれらの細胞を処理する1日前に、96ウェルマイクロプレート上に5000細胞／ウェル播種する。薬剤の存在下、37℃、5％CO₂、加湿されたインキュベーター内で18〜20時間個この細胞をインキュベートした。その後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定化し、0.1％Triton X-100で透過処理した後、ウサギp53一次抗体および上述した化合物の１つのヤギ抗ウサギ結合体でラベル化した。細胞核を、Hoechst 33342でラベル化した。試料を撮影し、ArrayScan（登録商標）でHCS Reader（Cellomics社、Pittsburgh、ペンシルベニア州）上で定量的に分析する。蛍光画像は、5 μMのカンプトセシンで核内のp53誘導を示した。未処理の細胞には、p53のシグナルが存在しなかった。カンプトセシン処理した細胞は、核内での鮮やかなp53ラベリングを示した。

実施態様の他の変形も、上記の記述および実施例から当業者に明らかである。したがって、前述した実施態様は、特許請求の範囲を限定するものと解されるべきではない。

本出願は、色を用いて作製された少なくとも１種の図を含む。米国特許法施行規則1.84条に基づき、着色図の受理請求書を同封して同日に提出する。着色図を有する本出願または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより米国特許庁により提供される。
図１は、特定の化合物（式V）の１つの、タンパク質アッセイにおけるヤギ抗ウサギ結合体としての使用を示す（式V-GAR結合体）。図２は、ストレプタビジン結合体としての式Vの使用を示す。図３は、ニュートラビジン（登録商標）結合体としての式Vの使用を示す。図４は、マルチプレックスウエスタンブロットによるタンパク質の検出のための式Vの使用を示す。図５は、免疫蛍光染色における式Vの使用を示す。

Claims

一般式Iまたは一般式II：
［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、同じかまたは異なり、独立して、-H、-C₁〜C₁₈アルキル、および-ω-スルホアルキルからなる群から選択され；
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、独立して、-O^-、-OH、-SH、-NH-NH₂、-F、-CI、-Br、-I、-O-Su(スクシンイミジル／スルホスクシンイミジル), -O-STP (4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-TFP (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-ベンゾトリアゾール、-ベンゾトリアゾール、-NR-CO-CH₂-I、-NR₂、-NR-生体分子、-NR-L-COO^-、-NR-L-COOH、NR-L-COO-Su、-NR-L-COO-STP、-NR-L-COO-TFP、-NR-L-CONR₂, -NR-L-CO-生体分子、-NR-L-CO-NH-NH₂、-NR-L-OH、-NR-L-O-ホスホルアミダイト、-NR-L-CHO、-NR-L-マレイミド、および-NR-L-NH-CO-CH₂-I〔ここで、Ｒは、Ｒ^１またはＲ^２と同じであり、Ｌは、酸素、置換された窒素、および／または硫黄からなる群から選択される少なくとも１種の原子で置換されていてもよい、直鎖状（-(CH₂)_o-、o = 1〜15）の、交差の、または環状の二価のアルカン基からなる群から選択され、前記生体分子は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンである〕からなる群から選択され；
Ｚは、-O^-または-OHであり；
Ｕは、-O^-、-OH、または-NH-L-SO₂Zであり；
Ｋａｔは、Li、Na、K、（モノ-、ジ-、またはトリアルキル）アンモニウム、または他の陽イオンであり；
Ａｎは、-F、-CI、-Br、-I、-BF₄、-ClO₄、-CH₃CO₂、-CF₃CO₂、または他の陰イオンであり；
ｍは、式Iまたは式IIの色素部分の正または負の電荷を補うのに必要な1〜6の整数であり；かつ
ｎは、0〜12の整数である］
の少なくとも１種の化合物。
式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、または式XVI：
の少なくとも１種から選択される化合物。
少なくとも１種の賦形剤と、
式Iまたは式II：
［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、同じかまたは異なり、独立して、-H、-C₁〜C₁₈アルキル、および-ω-スルホアルキルからなる群から選択され；
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、独立して、-O^-、-OH、-SH、-NH-NH₂、-F、-CI、-Br、-I、-O-Su(スクシンイミジル／スルホスクシンイミジル), -O-STP (4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-TFP (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-ベンゾトリアゾール、-ベンゾトリアゾール、-NR-CO-CH₂-I、-NR₂、-NR-生体分子、-NR-L-COO^-、-NR-L-COOH、NR-L-COO-Su、-NR-L-COO-STP、-NR-L-COO-TFP、-NR-L-CONR₂, -NR-L-CO-生体分子、-NR-L-CO-NH-NH₂、-NR-L-OH、-NR-L-O-ホスホルアミダイト、-NR-L-CHO、-NR-L-マレイミド、および-NR-L-NH-CO-CH₂-I〔ここで、Ｒは、Ｒ^１またはＲ^２と同じであり、Ｌは、酸素、置換された窒素、および／または硫黄からなる群から選択される少なくとも１種の原子で置換されていてもよい、直鎖状（-(CH₂)_o-、o = 1〜15）の、交差の、または環状の二価のアルカン基からなる群から選択され、前記生体分子は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンである〕からなる群から選択され；
Ｚは、-O^-または-OHであり；
Ｕは、-O^-、-OH、または-NH-L-SO₂Zであり；
Ｋａｔは、Li、Na、K、（モノ-、ジ-、またはトリアルキル）アンモニウム、または他の陽イオンであり；
Ａｎは、-F、-CI、-Br、-I、-BF₄、-ClO₄、-CH₃CO₂、-CF₃CO₂、または他の陰イオンであり；
ｍは、式Iまたは式IIの色素部分の正または負の電荷を補うのに必要な1〜6の整数であり；かつ
ｎは、0〜12の整数である］
の少なくとも１種から選択される生体適合性色素組成物をもたらす化合物と
を含む、生体適合性色素組成物。
少なくとも１種の賦形剤と、
式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、および式XVI：
、ならびにこれらの組合せから選択される生体適合性色素組成物をもたらす化合物と
を含む、生体適合性色素組成物。
少なくとも１種の生体分子をラベリングする方法であって、
少なくとも１種の賦形剤と、
式Iまたは式II：
［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、同じかまたは異なり、独立して、-H、-C₁〜C₁₈アルキル、および-ω-スルホアルキルからなる群から選択され；
ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、独立して、-O^-、-OH、-SH、-NH-NH₂、-F、-CI、-Br、-I、-O-Su(スクシンイミジル／スルホスクシンイミジル), -O-STP (4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-TFP (2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)、-O-ベンゾトリアゾール、-ベンゾトリアゾール、-NR-CO-CH₂-I、-NR₂、-NR-生体分子、-NR-L-COO^-、-NR-L-COOH、NR-L-COO-Su、-NR-L-COO-STP、-NR-L-COO-TFP、-NR-L-CONR₂, -NR-L-CO-生体分子、-NR-L-CO-NH-NH₂、-NR-L-OH、-NR-L-O-ホスホルアミダイト、-NR-L-CHO、-NR-L-マレイミド、および-NR-L-NH-CO-CH₂-I〔ここで、Ｒは、Ｒ^１またはＲ^２と同じであり、Ｌは、酸素、置換された窒素、および／または硫黄からなる群から選択される少なくとも１種の原子で置換されていてもよい、直鎖状（-(CH₂)_o-、o = 1〜15）の、交差の、または環状の二価のアルカン基からなる群から選択され、前記生体分子は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンである〕からなる群から選択され；
Ｚは、-O^-または-OHであり；
Ｕは、-O^-、-OH、または-NH-L-SO₂Zであり；
Ｋａｔは、Li、Na、K、（モノ-、ジ-、またはトリアルキル）アンモニウム、または他の陽イオンであり；
Ａｎは、-F、-CI、-Br、-I、-BF₄、-ClO₄、-CH₃CO₂、-CF₃CO₂、または他の陰イオンであり；
ｍは、式Iまたは式IIの色素部分の正または負の電荷を補うのに必要な1〜6の整数であり；かつ
ｎは、0〜12の整数である］
の少なくとも１種の化合物と
を含む組成物を、前記化合物が生体分子に結合するのに足りる条件下、有効な濃度で前記生体分子に供給する工程；および
前記生体分子に結合した結合体を検出する工程を含む方法。
少なくとも１種の生体分子をラベリングする方法であって、
少なくとも１種の賦形剤と、
式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、および式XVI：
、ならびにこれらの組合せの少なくとも１種の化合物と
を含む組成物を、化合物が前記生体分子に結合するのに足りる条件下、有効な濃度で前記生体分子に供給する工程；および
前記生体分子に結合した結合体を検出する工程を含む方法。
タンパク質アッセイ、免疫蛍光アッセイ、シングルプレックスアプリケーション、またはマルチプレックスアプリケーションの少なくとも１種において使用される、請求項５または６のいずれかに記載の方法。
他の蛍光色素または結合体と組み合わせてマルチプレックスアプリケーションにおいて使用される、請求項５または６のいずれかに記載の方法。
結合前に前記化合物に反応性を付与する、請求項５または６のいずれかに記載の方法。
前記生体分子が、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビオチン、またはハプテンの少なくとも１種から選択される、請求項５または６のいずれかに記載の方法。
式V：
で示される化合物（V03-04115）。
生体分子結合体として検出された、請求項１１に記載の化合物。
タンパク質アッセイにおける使用指示書を備えるキットに含まれる請求項１１に記載の化合物。