JP5139804B2

JP5139804B2 - 多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための方法

Info

Publication number: JP5139804B2
Application number: JP2007536009A
Authority: JP
Inventors: ステファンラスヴルム，; コンラドラインハルト，
Original assignee: エスアイアールエス‐ラブゲーエムベーハー
Priority date: 2004-10-13
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2025-08-18
Also published as: EP2011887B1; WO2006042581A1; DE102004049897B4; EP1799848A1; JP2008516588A; US8476200B2; DE102004049897A1; ATE514795T1; EP2011887A3; EP2011887A2; ES2365978T3; US20090075831A1; EP2218795B1; EP2218795A1

Description

発明の詳細な説明

本発明は、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用、およびそのような生体外遺伝子発現プロファイルを測定するための方法、ならびに標的遺伝子の遺伝子発現のスイッチオフおよび／または変更のための、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質のスクリーニングのための遺伝子発現の決定のための、ならびに／あるいは、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するための、遺伝子発現プロファイルの使用および／またはこのプロファイルで使用されるプローブの使用に関する。

本発明はさらに、多臓器不全の患者での遺伝子活性（転写）の変化の発生と併せて、実験的に検証された病識から得ることができる、患者の多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための新たな可能性に関する。

病態生理学的理解および支持治療の進歩にも関わらず、多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）および多臓器不全（ＭＯＦ）はそれぞれ、集中治療中の患者が死亡する最多の原因であり、世界的に増加しつつある。この進行の結果は、個々の患者に極めて重大であるばかりでなく、国民医療保障制度のコストおよび多くの医療分野での医学的進歩にも膨大な影響をもたらす。

多臓器不全は、同時にまたは短期間で生ずる２種以上の生命維持臓器系の不全と定義される。多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）は、初期臓器機能不全としてＭＯＦよりも先に生ずる［１］。多臓器不全の今日の定義は、同時にまたは短期間内に生ずる２種以上の器官の機能障害であるが、慢性的に持続する臓器不全は除外することができる［２］。ＭＯＦの予後は、関与する臓器系の数に密接に関係する。１つの臓器が不全の場合、２４時間以内の死亡率は２２％であり、７日後では４１％である。３つの臓器系が不全の場合、死亡率は、第１日目で８０％まで上昇し、４日後には１００％になる［３］。

ＭＯＤＳおよびＭＯＦの重症度のクリニカルスコアでは、ＧＯＲＩＳなどの多臓器不全スコア（ＭＯＦ−スコア）［４］、あるいは敗血症関連の臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアが日常的に使用される［５］。ＭＯＦスコアは、臓器機能の３つのグレードへの迅速で臨床上単純な分類を可能にする。臨床文献では、ＭＯＦスコア＞４が、ＭＯＦであると通常は記述される［６］。ＳＯＦＡスコアは、下記の臓器系の機能、すなわち呼吸（肺）、凝固、肝臓、心血管系、中枢神経系、および腎臓の機能の臨床評価を迅速に記録するポイントシステムである。このスコアシステムでは、４つのグレードが使用される。

臨床上、ＭＯＦは３段階で進む［７］。

１．ショックを受ける臓器：引き金になる病態生理学的メカニズムは、起源の非常に異なる血流不全である。これは、数時間のうちに生じ、それでも永久的な損傷には至らない。

２．臓器機能障害：持続的な血流不足が、次の２〜３日の間続く場合、これは、局所浮腫および細胞損傷と共にＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群、［８］により分類される）の発症をもたらすことになる。この段階を、多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）と呼ぶ。

３．臓器不全：持続的な血流不足は、内臓領域のうっ血をもたらし、それが、重複感染および腸からのエンドトキシンの移行に繋がる。これは、臨床症状の増強をもたらし、敗血症の全体像に至る。臓器機能障害は、臓器不全になる。

ＭＯＤＳおよびＭＯＦは、複雑な病態生理学を有する臨床像である。その発症の正確な分子的原因と、ＳＩＲＳを引き起こす可能性のある重症感染および外傷に対する免疫学的炎症性宿主応答の複雑さと、これに対応する心循環的作用は、今日まで完全に理解されていない［９］。

ＭＯＤＳおよびＭＯＦは、感染学的および非感染学的起源の両方である可能性がある。ＭＯＤＳおよびＭＯＦは通常、敗血症患者の臨床上重大な合併症として、また外傷によって引き起こされたショックの後に、また人工心肺を使用した手術後の患者に、また臓器移植の後などに発症する（図１）。ＭＯＤＳおよびＭＯＦの発症に関する重要な病原的メカニズムは、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ、［８］）の発症である。ＳＩＲＳに関連して開始される病態生理学的プロセスは、免疫系の全ての構成要素をまき込むだけでなく、心循環系の全てのレベルを妨害し、心筋抑制および血管拡張に制限されない。特に微小循環レベルの心循環変化は、共通の最終距離を形成し、多臓器不全の病因の重要な補助因子と見なされる組織低酸素症をもたらす。

図１は、今日の基準によるＭＯＤＳおよびＭＯＦの発症の、最も重要なメカニズムの例示的な説明を示し［１０］：過敏な免疫系は、多臓器不全の発症に決定的な役割を演ずる。この文脈において、内皮は、サイトカインを分泌することによって、また白血球付着をもたらすことによって、中心的な重要な役割を演ずる。シグナル伝達カスケードは、内皮細胞内で活性化され、その結果、転写因子の発現および活性化に繋がる。

感染性原因と非感染性原因とを区別することができる、感度の高い／特異的な診断が依然として存在しない理由は、ＭＯＤＳおよびＭＯＦの初期プロセスに関する知識が依然として不完全だからである。現在なお遺伝子発現レベルにある新しいタイプの生物マーカーおよび診断は、多臓器不全の早期診断、ならびにＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に、本質的な診断情報を提供することができる。さらに、これらのマーカーおよび診断は、全身性炎症の病態生理学的メカニズムの分類に寄与するのに重要である。

熱や白血球増多症、頻脈、および頻呼吸のように、臨床実習でしばしば使用される前駆症状は、ＭＯＤＳまたはＭＯＦの診断ならびにＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に関しては、完全に非特異的である。初期段階で微小循環の不規則性を検出するパラメータ、例えば腸粘膜のｐＨ［１１］および毛細血管床のラクテートレベル［１２、１３］の変化、原因が肺にはない呼吸不全の出現［２］、白血球エラスターゼの上昇［１４、１５］、ネオプテリンレベルの高さ［１６］、多形核白血球の活性化、およびＩＬ−６−レベルの高さ［１７］などは、限られた程度にのみＭＯＤＳおよびＭＯＦが後期発症する際の初期パラメータとして適しているが、これらはＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別に寄与することができない。したがって、非感染性および感染性のＭＯＤＳまたはＭＯＦを初期段階で区別するための、また患者が特定の治療にどのように応答するか予測するための、当業者の能力を改善する新規な診断方法が緊急に求められている。

しかし、この上なく医学的に重要なものは、まさしくＭＯＤＳおよびＭＯＦの感染性原因と非感染性原因との区別であり、例えば抗生物質は、この区別と共により効率的に使用することができ、これが著しいコスト削減ならびに抗生物質の非特異的施用により引き起こされる副作用の回避に寄与する。非感染性ＭＯＤＳまたはＭＯＦの場合はさらに、感染のそれぞれの部位を特定するための患者に非常にストレスが多い（例えばＣＴ／ＭＲＩに送られるなど）、時間と人手のかかる診断手段や、包括的な微生物学的方法の実現（例えば、患者が大量の血液も与えなければならない血液培養物の検査）だけでなく、静脈カテーテルなどの、患者に接続する全てのプラスチック材料の危険な交換もまた、回避することが可能である。逆もまた同様であり、ＭＯＤＳまたはＭＯＦの感染性原因の迅速な特定は、これらの手段を迅速に行うことを確実にすることができ、したがって死亡率を低下させることができる。

技術的な進歩、特にマイクロアレイ技術の開発により、現在当業者は、１００００個以上の遺伝子およびその遺伝子産物を同時に比較することが可能である。そのようなマイクロアレイ技術の使用は、現在、健康状態、調節メカニズム、生化学的相互作用、およびシグナル伝達物質ネットワークに関する情報を提供することができる。生物体が感染症にどのように反応するかについての理解が、この方法を改善するので、これは、敗血症障害の検出、診断、および療法の、機能強化されたモダリティの開発を促進すべきである。

マイクロアレイは、その起源が「サザンブロット法」［１９］にあり、これは固体マトリックス上で３次元で対処することができるように、ＤＮＡ分子を固定化する最初の手法であった。最初のマイクロアレイは、しばしば未知の配列を有するＤＮＡ断片からなるものであり、多孔質膜（通常はナイロン）上に１ドットずつ付着させた。通常、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはプラスミドライブラリーを用い、ハイブリダイズした材料を放射性基で標識した［２０〜２２］。

最近、非常に高い密度で核酸を合成し利用するための新たな技術の開発と共に、基板としてガラスを使用し検出のために蛍光を使用することによって、核酸アレイを小型化することが可能になった。同時に、実験のスループットおよび情報量が増大した［２３〜２５］。

さらに、国際公開第０３／００２７６３号パンフレットから、敗血症および敗血症のような状態の診断に、マイクロアレイを基本的に使用できることがわかる。

マイクロアレイ技術の利用可能性に関する最初の説明は、癌研究分野での臨床試験を通して得られた。この場合、発現プロファイルは、ある臨床表現型に相関する個々の遺伝子または遺伝子群の活性の同定に関して、価値あることが証明された［２６］。急性白血病またびまん性Ｂ細胞リンパ腫に罹っているまたは罹っていない個人の多くのサンプルを分析し、遺伝子発現標識（ＲＮＡ）を見出し、引き続きこれを、臨床上関連あるこれらのタイプの癌の分類に用いた［２６、２７］。Ｇｏｌｕｂらは、個々の遺伝子が、信頼性ある予測を行うのに十分ではないが、しかし５３個の遺伝子（アレイ上に存在する６０００個よりも多くの遺伝子から選択された）の転写の変化に基づく予測は、非常に正確であることを見出した［２６］。

Ａｌｉｓａｄｅｈら［２７］は、大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の試験をした。発現プロファイルは、著者らによって「リンパチップ」で後処理され、すなわちこれは、リンパ球の通常のおよび異常な発生に関わる遺伝子をモニタするために開発された、相補ＤＮＡの１８０００個のクローンを有するマイクロアレイである。クラスター分析を使用することによって、患者の生存のチャンスに関して大きな相違を示した２つのカテゴリに、ＤＬＢＣＬを何とか分類した。これらサブタイプの遺伝子発現プロフィルは、Ｂ細胞分化の２つの重要な段階に相関していた。

出願人の、まだ公開されていないドイツ特許出願ＤＥ１０３４０３９５．７、ＤＥ１０３３６５１１．７、ＤＥ１０３１５０３１．５、および１０２００４００９９５２．９は、遺伝子発現プロファイルが、例えばＳＩＲＳ、全身性炎症性炎症、敗血症、および重症敗血症の診断にマイクロアレイ技術を用いることによって、原則として使用可能であることを述べている。これらの出願を、参考文献により本明細書に組み込む。

Ｆｅｅｚｏｒら［２８］からは、その外科治療の結果として多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）と共にＳＩＲＳを発症した患者の遺伝子活性が、同じ外科治療の結果としてＭＯＤＳを伴わずにＳＩＲＳを発症した患者の遺伝子活性と異なることがわかる。しかし、これらの研究は、患者が感染を示さなかったので、感染性ＭＯＦと比較した非感染性ＭＯＦの区別について述べることができない。

非感染性ＭＯＦと感染性ＭＯＦとを区別するための遺伝子発現プロフィルの使用については、依然として記述されなかった。

本出願に開示される発明は、非感染性ＭＯＦを持つ患者の遺伝子活性が、感染性ＭＯＦを持つ患者の遺伝子活性とは異なるという認識に基づいている。したがって、遺伝子活性におけるこれらの相違は、遺伝子発現を用いることによって、感染性ＭＯＦと非感染性ＭＯＦとの区別を可能にする。従来使用されてきた臨床パラメータは、そのような区別を可能にしないが、これは集中治療での専門的療法の開始に非常に重要である。

したがって本発明の目的は、遺伝子活性マーカーを用いることによって、非感染性ＭＯＦと感染性ＭＯＦとを区別することである。

この目的は、請求項１、１１、および２５に記載の特徴によって解決される。

本発明は特に、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用に関する。

本発明はさらに、治療中に多臓器不全の非感染性および感染性原因に苦しむ患者の経過を評価するのに使用可能である。

本発明はさらに、２〜４期の臨床試験における、多臓器不全の非感染性または感染性原因を有する患者の試験対象基準または試験除外基準として使用可能である。

本発明の好ましい実施形態は、さらなる電子処理のための、ならびに敗血症患者の個々の予後を記述し、診断および／または患者のデータ管理システムのためのソフトウェアを作成するための、遺伝子活性データの作成である。

本発明は、「コンピュータ内」エキスパートシステム作成、および／または細胞がシグナル伝達する方法の「コンピュータ内」変調に使用してもよい。

本発明による遺伝子発現プロファイルの作成では、配列番号１〜配列番号１２９７、ならびに５〜２０００またはそれ以上、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、多数の特異的遺伝子および／または遺伝子断片を使用する。

配列番号１から配列番号１２９７を有するこれらの配列は、本発明の範囲に組み込まれ、よって発明の記述の一部でありしたがって本発明の開示の一部でもある１２９７個の配列を含んだ同封の配列表に開示される。配列表では、配列番号１から配列番号１２９７を有する個々の配列がさらに、そのＧｅｎＢａｎｋアクセション番号に割り当てられている（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。

本発明はさらに、標的遺伝子の遺伝子発現のスイッチオフおよび／または変更のために、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質のスクリーニングのための遺伝子発現の決定のために、ならびに／あるいは、多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するために、配列番号１〜配列番号１２９７で表される遺伝子ならびに少なくとも５〜２０００、好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された、患者サンプルから生体外で得られる遺伝子発現プロファイル、および／またはそのために使用されるプローブの使用に関する。

この文脈において、列挙されたプローブのハイブリダイズ可能な合成アナログを使用してもよい。

さらに、多臓器不全の非感染性または感染性の原因に苦しむ患者の遺伝子活性は、生体液における２〜４期の臨床研究で決定することができ、この「値」から、疾患の経過、生存のチャンス、治療の経過、または臨床試験で敗血症患者を含みまたは除外する可能性に関する結論を導き出すことができる。

本発明の別の実施形態は、特異的遺伝子および／または遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１２９７、ならびに５〜２０００またはそれ以上、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜８０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択されることを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、少なくとも２〜１００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、少なくとも２００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、少なくとも２００〜５００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、少なくとも５００〜１０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、少なくとも１０００〜２０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、上に列挙される遺伝子または遺伝子断片および／またはそれらのＲＮＡから得られる配列を、合成アナログ、アプタマー、ミラーマー（ｍｉｒｒｏｒｍｅｒ）、ペプチド核酸、およびモルホリン核酸に代えることを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、遺伝子の合成アナログが、５〜１００、特に約７０塩基対を含むことを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション法を用いて決定することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、マイクロアレイを用いて決定することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、遺伝子活性を、ハイブリダイゼーション非依存的方法によって、特に酵素的および／または化学的加水分解、および／または増幅方法、好ましくはＰＣＲを行い、その後、核酸および／またはその誘導体および／またはその断片の定量を行うことによって、決定することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、サンプルを、体液、特に血液、髄液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液、細胞内容物、またはこれらの混合物から選択することを特徴とする。

本発明の別の実施形態は、細胞サンプルを、その細胞内容物を遊離させるために必要に応じて溶解処理にかけることを特徴とする。

当業者には、請求項に示される本発明の個々の特徴を、任意の所望の方法によって互いに組み合わせることができることが明らかである。

本発明で使用されるマーカー遺伝子という用語は、全ての得られたＤＮＡ配列、部分配列、および合成アナログ（例えばペプチド−核酸、ＰＮＡ）を包含する。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の決定に言及する本発明の記述は、限定を求めるものではなく、本発明の例示的適用にすぎない。

血液に言及する本発明の記述は、本発明の単なる例示的実施形態である。本発明で使用される生体液という用語は、ヒトの体液全てを包含する。

本発明のさらなる利点および特徴は、実施形態の記述ならびに図面から明らかにされよう。

図１は、異なる病状から始まる多臓器不全の病理的経過を示す。

多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、差次的遺伝子発現試験。

外科集中治療室での治療を受けている５７名の患者の全血サンプルを、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための差次的遺伝子発現の測定に関して検査をした。

外科集中治療室での治療中、感染性ＭＯＦ［以下、重症敗血症または敗血症性ショックと呼び、８により分類される］を発症した３１名の患者の全血サンプル。

さらに全血サンプルを、外科手術集中治療室での治療中に非感染性ＭＯＦ［８により分類される］発症した２６名の患者から得た。

参照サンプルとして、細胞系ＳＩＧ−Ｍ５からのｔｏｔａｌＲＮＡを使用した。

両方の患者群の特性範囲を、表１に示す。この表には、年齢、性別、ならびに器官系の機能に関する測定値としてのＳＯＦＡ−スコアに関する情報が、示されている。同様に、プロカルシトニン（ＰＣＴ）およびＣＲＰの血漿タンパク質レベル、白血球の数、ならびに患者の最も一般的なＣＤＣ（疾病管理センター）基準が示されている。

患者サンプルの全てを、１つのマイクロアレイごとに参照サンプルとコハイブリダイゼーションを行った。

実験の説明：
全血を採取した後、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の使用説明書に従ってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキットを使用して、ｔｏｔａｌＲＮＡを単離した。

細胞培養

細胞培養（対照サンプル）では、１９種の凍結細胞培養物（ＳＩＧＭ５）（液体窒素で凍結）を使用した。これらの細胞をそれぞれ、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が追加された２ｍｌのＩｓｃｏｖｅ培地（ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ）に接種した。続いて、細胞培養物を、１２ウェルのプレートで２４時間、５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートした。続いて、最終的に同じフォーマットの３枚のプレートが利用可能になるように（合計で３６ウェル）、１８ウェルの内容物を、同じ体積の２つのパートに分けた。その後、同じ条件下で２４時間培養を続けた。その後、各プレートの１１ウェルから得られた培養物を、一緒にし、遠心分離にかけた（１０００×ｇ、５分、室温）。上清を除去し、細胞ペレットを上述の培地４０ｍｌに溶解した。これらの溶解した細胞４０ｍｌを、等しい割合で２個の２５０ｍｌフラスコに分配し、上述の培地を５ｍｌ添加した後にインキュベートした。２枚の残りのプレートに残された２ｍｌのうち、８０μｌを、上述の培地１ｍｌで事前に調製してある同じプレートの空のウェルに入れた。４８時間のインキュベーション後、１２ウェルプレートの１つだけを、下記の通り処理し、すなわち５００μｌを各ウェルから抽出して一緒にした。得られた６ｍｌを、約１０ｍｌの新鮮な培地が入っている２５０ｍｌフラスコに導入した。この混合物を、１０００×ｇで５分間、室温で遠心分離にかけ、上述の培地１０ｍｌに溶解した。続いて細胞を計数することによって、下記の結果が得られた：１．５×１０７細胞／ｍｌ、合計１０ｍｌ、細胞の総数：１．５×１０８個。細胞の数は依然として十分でないので、上述の細胞懸濁液２．５ｍｌを、２５０ｍｌ（７５ｃｍ^２）フラスコ（合計４個のフラスコ）中の上述の培地３０ｍｌに導入した。７２時間のインキュベーション後、新鮮な培地２０ｍｌを各フラスコに添加した。引き続きインキュベーションを２４時間行った後、細胞を上述のように計数した。細胞の総数は３．８×１０^８細胞であった。所望の数の細胞である２×１０６細胞を得るために、細胞を、４個のフラスコ内で上述の培地４７．５ｍｌ中に再懸濁した。２４時間のインキュベーション時間の後、細胞を遠心分離にかけ、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋（ＢｉｏｃｈｒｏｍＡＧ）を含まないリン酸緩衝液で２回洗浄した。

ｔｏｔａｌＲＮＡの単離は、製造業者の使用説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡＬキット（Ｍａｃｈｅｒｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて行う。上述のプロセスを、必要な細胞数が得られるまで繰り返した。これは、１０８細胞当たりＲＮＡが６００μｇという効率に対応した、必要量である６ｍｇのｔｏｔａｌＲＮＡを得るのに必要であった。

逆転写／標識／ハイブリダイゼーション

全血を採取した後、サンプルのｔｏｔａｌＲＮＡを単離し、製造業者の使用説明書に従ってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を使用して、品質の試験をした。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対する参照ＲＮＡとしての、ＳＩＧＭ５細胞からの１０μｇのｔｏｔａｌＲＮＡと共に、ｔｏｔａｌＲＮＡ１０μｇを各サンプルから分取し、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、転写した。その後、アルカリ加水分解によって、ＲＮＡを混合物から除去する。反応混合物中、後の時点で蛍光色素とｃＤＮＡとの結合を可能にするために、ｄＴＴＰの一部をアミノアリル−ｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）に代えた。

反応混合物の精製後、サンプルおよび対照のｃＤＮＡを、蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ５５５で共有結合標識し、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ社のマイクロアレイ上でハイブリダイズした。使用したマイクロアレイ上には、長さが５５〜７０塩基対である５３０８の異なるポリヌクレオチドが固定化された。ポリヌクレオチドのそれぞれは、ヒト遺伝子である。さらに、品質保証のための対象スポットが存在した。１つのマイクロアレイを２８のサブアレイに分割し、このサブアレイのそれぞれを、１５×１５スポットのグリッドに並べた。

ハイブリダイゼーションと、その後に行われる洗浄および乾燥はそれぞれ、４２℃で１０．５時間にわたり、製造業者の使用説明書に従ってハイブリダイゼーションステーションＨＳ４００（Ｔｅｃｏｎ）を使用して実施した。使用したハイブリダイゼーション溶液は、それぞれ標識されたｃＤＮＡサンプル、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、０．３％ラウリル硫酸ナトリウム（ｖ／ｖ）、２５％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、およびそれぞれ０．８μｇ μｌ−１のｃｏｔ−１ＤＮＡ、酵母ｔ−ＲＮＡ、およびポリ−ＡＲＮＡからなるものであった。その後行われるマイクロアレイの洗浄は、下記のスキームに従い室温で実施した：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％ラウリル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、および最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）での濯ぎをそれぞれ９０秒。その後、マイクロアレイを、２．５バールの圧力の窒素流中で１５０秒よりも長く、３０℃で乾燥した。

処理したマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルを、その後ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ）スキャナを用いて読み取り、種々の発現遺伝子の発現比を、ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ４．０（Ａｘｏｎ）ソフトウェアを用いて決定した。

評価：

分析のため、１つのスポットの平均強度を、対応するスポット画素の中央値として決定した。

システムエラーの補正：

Ｈｕｂｅｒら（２００２）の手法に従って、システムエラーを補正した。この手法に従って、マイクロアレイの加法的および乗法的なバイアスを、存在する遺伝子サンプルの７０％を基にして推定した。さらなる全ての計算のために、逆双曲線正弦関数を用いてシグナルを変換した。

分析では、患者サンプルのシグナルの、正規化され変換された相対比を、対照に対して計算した。これは、患者番号ｎの遺伝子番号ｊの計算によって、データＧｊ，ｎ＝ａｒｃｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｎ））−ａｒｃｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｎ））が明らかにされたことを意味する（式中、［ＳＣｙ３（ｊ，ｎ）、ＳＣｙ５（ｊ、ｎ）］は、関連したシグナル対である）。スポットを、患者に関して分析できなかった場合（例えば、スキャンされた画像が汚れている）、関連する値を「欠測値」と記した。

統計的比較：

比較のため、対応ランダムステューデント検定を遺伝子ごとに用いた。ランダムサンプルは共に、非感染性ＭＯＦおよび感染性ＭＯＦの患者群の値をそれぞれ含んでいた。種々に発現した遺伝子を選択するために、関連したｐ値および欠測値の数を評価した。これを、関連するｐ値が０．０５よりも小さい選択された遺伝子の群に適用した。

試験をした遺伝子の格付けに関する基準は、各遺伝子の発現比のレベルであった。感染性ＭＯＦに罹っている患者と比較した、非感染性ＭＯＦに罹っている患者の最も過剰発現しまたは発現が弱い遺伝子はそれぞれ、興味深いものであった。

表２は、患者サンプルの７２１個の遺伝子が見出されたことを示すが、これらは、非感染性ＭＯＦを有する患者と比べた場合、感染性ＭＯＦを有する患者で著しく過剰発現したものであった。さらに表３は、非感染性ＭＯＦを有する患者と比べた場合、感染性ＭＯＦを有する患者の５７６個の遺伝子が著しく発現が弱かったことを示す。これらの結果から、表２および表３に列挙された遺伝子活性は、多臓器不全の非感染性原因と多臓器不全の感染性原因とを区別することが明らかである。したがって、列挙された遺伝子活性は、多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するためのマーカーを提供する。

表２および３で特徴付けられた変化を、請求項１に記載の本発明のプロセスに使用することができる。

個々の配列の、表２および３に示されるＧｅｎＢａｎｋアクセション番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介するインターネットアクセス）は、添付の配列表に関連付けられており、箇条書きにされ、またはそれぞれ１つの配列に関して詳細に記述されている（配列番号１から配列番号１２９７まで）。

参考文献

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Claims

多臓器不全の非感染性原因と感染性原因とを区別するための、患者血液から生体外で得られた遺伝子発現プロファイルの使用であって、
前記遺伝子発現プロファイルは、遺伝子発現プロファイルの生体外測定のための方法から得ることが可能なものであり、
前記遺伝子発現プロファイルでは、患者血液中の、多臓器不全の非感染性原因および感染性原因に関係した複数の特異的遺伝子の患者の遺伝子発現が決定され、
前記特異的遺伝子およびその遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１２９７の配列で表される遺伝子ならびに少なくとも２０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択される、使用。
治療中、非感染性および感染性の多臓器不全における疾患の経過を評価するための、請求項１に記載の使用。
多臓器不全の非感染性原因または感染性原因を有する患者を分類するための、請求項１に記載の使用。
多臓器不全の非感染性原因または感染性原因を有する患者の試験対象基準または試験除外基準としての、請求項３に記載の使用。
さらなる電子処理に向けた遺伝子発現データを作成するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
診断目的でおよび／または患者データ管理システムのために患者の個々の予後を記述するソフトウェア作成のために、遺伝子発現データが使用される、請求項５に記載の使用。
臨床エキスパートシステムの作成のために、および／または細胞シグナル伝達経路をモデル化するために遺伝子発現データが使用される、請求項５に記載の使用。
遺伝子発現プロファイルを作成するために、配列番号１〜配列番号１２９７で表される遺伝子ならびに少なくとも２０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択された特異的遺伝子および／または遺伝子断片が使用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
遺伝子断片が、２０〜２００ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の使用。
遺伝子発現プロファイルがハイブリダイズ法を用いて確認される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のために、生体外で遺伝子発現プロファイルを測定するための方法であって、
患者血液における多臓器不全の非感染性原因および感染性原因に関連した複数の特異的遺伝子の遺伝子発現を決定し、
前記特異的遺伝子及び／又はその遺伝子断片が、配列番号１〜配列番号１２９７で表される遺伝子、ならびに少なくとも２０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択される、方法。
前記遺伝子断片が２０〜２００ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
少なくとも２個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
少なくとも２００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
２００〜５００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
５００〜１０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
１０００〜２０００個の異なる遺伝子および／または遺伝子断片を使用することを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
請求項１１で挙げられた遺伝子または遺伝子断片および／またはそれらのＲＮＡから得られた配列を、合成アナログ、アプタマー、ならびにペプチド核酸およびモルホリン核酸に代えることを特徴とする、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
遺伝子の合成アナログが、２０〜１００塩基対を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
遺伝子発現を、ハイブリダイゼーション法を用いて決定することを特徴とする、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて決定することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
遺伝子発現を、酵素的分解および／または化学的加水分解、並びに／或いは増幅法を行い、その後、核酸および／またはその誘導体、並びに／或いはその断片を定量することによって決定することを特徴とする、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する活性物質のスクリーニングのための遺伝子発現の決定のために、ならびに／あるいは、
多臓器不全の非感染性原因および／または感染性原因に対する効果を評価するために、
患者サンプルから生体外で得られた遺伝子発現プロファイル、および／またはそのために使用されるプローブの使用であって、
前記プローブは、配列番号１〜配列番号１２９７で表される遺伝子ならびに少なくとも２０ヌクレオチドを有するその遺伝子断片からなる群から選択される、使用。
請求項２３に挙げたプローブのハイブリダイズ可能な合成アナログを使用することを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
遺伝子および／または遺伝子断片が、２０〜２００ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の使用。