JP5128055B2 - 抗血液凝固性被膜および抗血栓性活性酸素測定用センサー - Google Patents
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Description
金属ポルフィリン錯体の調製:
(1)5,10,15,20−テトラキス(3−チオフェニル)ポルフィリン(H2T3
ThP)の合成:
容量100mlの丸底フラスコ中にプロピオン酸50ml、3−チオフェンカルバルデヒド2.0ml及びピロール1.4mlを入れ、攪拌しながら160℃で1時間還流した。還流後、この反応物を室温まで放冷し、更に氷冷して、200mlの冷メタノール中に加えた。次に吸引濾過を行い、残留物をメタノールで洗浄後、さらにシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム)により精製、乾固、再結晶、減圧乾燥し、H2T3ThPを黒色粉末結晶として得た(収量:0.63g 収率:19%)。生成物はUV−visibleスペクトル(UV−2100:(株)島津製作所製)及び1H−NMR測定により同定した。
金属(Fe)の導入):
容量50mlの3つ口フラスコに48%臭化水素酸10mlを入れ、30分間窒素ガスを吹き込み、さらに還元鉄100mgを加え、100℃で還元鉄が溶解するまで攪拌した。攪拌後、溶液を減圧下で乾固させ、白色粉末の臭化鉄無水和物を得た。
位したFeT3ThPの合成):
上記(2)で得たFeT3ThP(0.018g)と1−メチルイミダゾール(2〜100μl、FeT3ThP:1−メチルイミダゾール=1〜50(モル比))をジクロロメタン0.5mlに加え、超音波(15W)照射下で撹拌(5分)または超音波非照射下で撹拌(6時間以上)した。
これをエバポレーターで乾固して活性酸素種用電極の作製に供した。
活性酸素種用電極の作製:
グラッシーカーボン(0.28〜0.30mmφ)の線材をガラスキャピラリー(内径0.3mmφ)中に導入し、さらにこれらを注射用ステンレス針(SUS304製;寸法は18G)に導入した。これらの間をエポキシ系接着剤で接着、固定し、次に、グラッシーカーボンおよび外側のニードルを、各々、導電性接着剤(銀ペースト)を介して白金線と接合させ、さらに、先端をグラインダーで研磨して3層構造のニードル型の電極を作製した(グラッシーカーボンは作用極用電極部、中側のガラスキャピラリーが作用極と対極の絶縁部、外側のニードルは対極用電極部となる)。
抗血栓センサーの作製:
重合ピロール膜の電解重合時の電気化学セルとして、図1に示すような、ガラスセル、微小サンプルホルダー、テフロンキャップから構成される二室式のものを使用した。ヘパリン5.56mgを純水0.5mlに溶解させたものを、微小サンプルホルダーに入れ、更にピロール0.168ml(5.0mM)を加えた。また、ガラスセルにヘパリン50mgを含む純水5.0mlを入れた。参考例2で作成したニードル型電極のうち、ポルフィリン重合膜で表面を修飾したグラッシーカーボン部分を作用極に、ステンレス針部分を対極用い、参照極にはAg/AgClを用いた。
重合ピロール膜中のヘパリン存在の確認:
重合ピロール膜中にヘパリンが存在することの確認はトルイジンブルー法(P. K. Smith et al., Anal. Biochem., 109, 466(1980))を用いて行った。すなわち、実施例1で作製した抗血栓センサーを0.05%トルイジンブルー溶液0.1mlに1時間浸漬後、このトルイジンブルー溶液をエタノールで1/10に希釈し、UV−vis測定を行って重合ピロール膜に吸着されたトルイジンブルー量を比較した。
抗血栓センサーによる活性酸素の測定:
作用極部分をヘパリンを含んだピロール重合膜で被覆した抗血栓センサーであっても正確に活性酸素濃度が測定できるかどうかを以下のようにして確認した。すなわち、実施例1で調製した抗血栓センサーの、金属ポルフィリン皮膜の形成された部分を作用極、周囲のステンレス部分を対極とし、参照極としてステンレス線を用いた3極式測定系を構成した。
抗血栓性評価:
フィブリノーゲンの0.05g/ml溶液に、トロンビン10U/mlを添加し、血栓モデル溶液を作成した。この血栓モデル溶液に、実施例1で得た抗血栓性センサーを30分浸漬した後、実施例3と同じキサンチン/キサンチンオキシダーゼ(XOD)系による30mU/mlXOD添加時のスーパーオキシダーゼ量の測定を行った(1日目)。更に、上記血栓モデル液に継続的に抗血栓性センサーを浸漬し、経時的に測定可能性を調べた。この結果、7日目まで、1日目と同様にスーパーオキシドアニオンラジカル量の測定したところ、図4に示す測定値に何の影響もなかった。これに対し、比較センサー(WO
03/054536の実施例4で得たセンサー)では、浸漬1日で電気絶縁性のフィブリンが電極表面を覆うため、O2 −・が発生しても酸化電流を検出することは不可能であった(図5)。
2 … … テフロンキャップ
3 … … ニードル型電極
4 … … 参照極
5 … … ピロール/硫酸化多糖溶液
6 … … ヘパリン水溶液
7 … … 微小サンプルホルダー
Claims (4)
- 金属ポルフィリン錯体の重合膜の表面に形成される抗血液凝固性被膜であって、へパリンとピロールを含有する溶液を電解重合させることにより前記金属ポルフィリン錯体の重合膜の表面に重合して形成された電解重合ピロール膜であって、前記へパリンとピロールとが相溶するとともにイオンの流通可能な空隙を有するへパリンを含有する電解重合ピロール膜から構成される抗血液凝固性被膜。
- ピロールとへパリンを、それらの重量比で、1:1ないし10:1の範囲で含む溶液から得たものである請求項1記載の抗血液凝固性被膜。
- 導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成した作用極を有する活性酸素測定用センサーにおいて、前記金属ポルフィリン錯体の重合膜の表面をへパリンとピロールを含有する溶液を電解重合させることにより前記金属ポルフィリン錯体の重合膜の表面に重合して形成された電解重合ピロール膜であって、前記へパリンとピロールとが相溶するとともにイオンの流通可能な空隙を有するへパリンを含有する電解重合ピロール膜で被覆したことを特徴とする抗血栓性活性酸素測定用センサー。
- 前記へパリンを含有する電解重合ピロール膜が、ピロールとへパリンを、それらの重量比で、2:1ないし4:1の範囲で含む電解液中を用いて電解することにより得られたものである請求項3記載の抗血栓性活性酸素測定用センサー。
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2005
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