KR20100001620A - 다중벽 탄소나노튜브 기반 바이오센서 및 이의 제조 방법 - Google Patents

다중벽 탄소나노튜브 기반 바이오센서 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 입자가 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 이온성 액체-키토산 혼합물이 3차원적 네트워크를 이루면서 코팅된 효소 고정화층을 포함하는 바이오센서, 상기 바이오센서를 제조하는 방법 및 상기 제조된 바이오센서를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 관한 것이다.
콜레스테롤, 금 나노입자, 이온성 액체, 키토산, 다중벽 탄소나노튜브, 전류측정

Description

다중벽 탄소나노튜브 기반 바이오센서 및 이의 제조 방법{Biosensor Based on Multi-Walled Carbon Nanotubes and Method for Manufacturing the Same}
본 발명은 본 발명은 금 입자가 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 이온성 액체-키토산 혼합물이 3차원적 네트워크를 이루면서 코팅된 효소 고정화층을 포함하는 바이오센서와 상기 효소 고정화층을 포함하는 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 관한 것이다.
콜레스테롤은 생물학적 막의 구조적 구성 성분이다. 신경조직, 뇌, 피부, 부신 및 간에 존재하였고 이는 신경을 절연하는 지방 시트 (fatty sheet)의 주요 성분이다. 인간 혈액에서 콜레스테롤 수준 측정은 심장병, 뇌혈전 등의 임상적 진단이라는 측면에서 중요한 주목을 받았다 (Arya, S.K. et al., 2007. Anal. Biochem. 363, 210-218; Li, J. et al., 2003. Electroanalysis 15, 1031-1037). 분광광도법(spectrometer)를 이용한 콜레스테롤을 측정하는 전통적 방법은 낮은 특이성, 발색 시약의 불안정성 및 표준화의 어려움을 가진다. 화학적 공정은 간단, 신속 및 비용적인 면에서 콜레스테롤을 측정하는 효소적 공정으로 실질적으로 대체하였다. 기질내로의 효소 고정은 효소 기반 바이오센서의 제작의 중요한 단계이다. 직접 흡착법 (Su, X. et al., 2005. J. Colloid Interface Sci. 287, 35-42) 및 폴리머 매트릭스로의 포괄법(Singh, S. et al., 2006. Anal.Chem.Acta. 568, 126-132)과 같은 효소를 고정하기 위한 전통적인 접근법으로 콜레스테롤 바이오센서를 제작하기 위하여 시도가 있었다. 물리적 증착 기술은 간단하고 빠르다. 그러나, pH, 온도 및 이온강도(ionic strength)에서의 변화로 인하여 단백질의 탈착(desorption of protein)을 겪게 된다. 따라서, 침출(leaching)없이 효소를 고정화시킬 수 있는 매트릭스의 개발이 매우 요구된다.
지지 매트릭스는 효소 고정화에 중요한 역할을 한다. 콜레스테롤 센서 제작을 위한 효소 고정에 상이한 종류의 지지 매트릭스들이 이용되었다. 폴리아닐린 (polyaniline: PANI) 필름은 콜레스테롤 에스터라제 (cholesterol esterase) 및 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase: ChOx)를 고정하기 위하여 사용되었다(Singh, S. et al., 2006. Anal.Chem.Acta. 568, 126-132). 콜레스테롤 바이오센서는 프러시안 블루의 필름 표면 전반에 형성된 실리카 솔-젤 막으로 ChOx를 고정화시켜 제작되었다(Jianping, L. et al., Electroanalysis 15, 1031-1037). 콜레스테롤 바이오센서는 ChOx(Tana, X. et al., 2005. Anal. Biochem. 337, 111120), 콜레스테롤 에스트라제 (Singh,S. et al., 2004. Anal. Chem. Acta 502, 229-234; Vidal, J.C. et al., 2004. Talanta 64, 655-664; Brahim, S. et al., 2001. Anal. Chim. Acta 448, 27-36; Vidal, J.C. et al., 2004. Anal.Biochem. 333, 88-98; Ram, M.K. et al., 2001. Biosens. Bioelectron. 16, 849-856; Shumyantseva,V. et al., 2004. Biosens. Bioelectron. 19, 971-976) 등을 기반하여 제작되었다.
상이한 구성에 기반한 전류측정용 바이오센서는 여러 연구논문들의 주제가 되었으며(Martin, S.P. et al., 2003. Anal. Chim. Acta 487, 91-100; Manesh, K.M. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 771-779). 콜레스테롤 바이오센서는 ChOx 및 폴리스티렌 술포네이트(polystyrene sulfonate)의 층간 증착(layer-by-layer deposition)을 통하여 제작되었다(Vengatajalabathy, G. et al., 2001. Sens. Actu.B. 80, 272-277). 바이오센서 전극은 다중벽 탄소나노튜브 (multi-walled carbon nanotube: MWNT), 키토산(chitosan: Chi), 폴리스티렌 술포네이트 및 Au 분자의 다중층으로 ChOx를 공유 고정화시켜 제작되었다(Yang, M. et al., 2006. Biomaterials 27, 246-255). 바이오센서에서 프러시안 블우(prussian blue) 필름, ChOx/silicic sol/gel/Prussian blue, 의 존재는 -0.50 V 의 낮은 전위에서도 콜레스테롤 측정을 가능하게 한다(Lin, C.C. et al., 2003. Biomaterials 24, 549-557). 콜레스테롤 센서의 민감성, 선택성을 개선하고자, 효소 고정을 위한 매트릭스내로 유익한 물질을 포함시키는 것이 논문을 통하여 알려졌다.
최근, 탄소나노튜브(carbon nonotube: CNT)는 높은 전기전도율(electrical conductivity), 공동 형태(hollow geometry), 강한 흡착력(adsorptive ability), 좋은 기계적 강도 및 우수한 생체접합성으로 인하여 상당한 흥미를 끌었다. CNT 기반 개질된 전극은 도파민(Britto, P.J. et al., 1996. Bioelectrochem. Bioener. 41, 121-125), 단백질(Chen, R.J. et al., 2001. J. Am. Chem. Soc. 123, 3838-3839), β-NAD (β-nicotinamide adenine dinucleotide) (Musameh, M. et al., 2002. Electochem. Commun. 4, 743-746), 포도당 (Wang, S. G. et al., 2003. Electrochem. Commun. 5, 800-803)등과 같은 생체분자의 산화를 위한 우수한 전자 전달반응을 나타내었다. 최근, CNT는 바이오센서의 제조에 효과적으로 사용되고 있다 (Manesh, K.M. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 771-779; Elie, A.G. et al., 2002. Nanotechnology 13, 559-564; Shobha et al., 2008; Deng, C. et al., 2008. Biosens. Bioelectronics, 23, 1272-1277; Zou, Y. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 1010-1016).
CNT-Au 나노하이드리드를 제조하기 위하여 CNT는 Au 나노입자와 결합하여야하며, CNT 표면으로 Au를 삽입하는 주요 문제점은 CNT의 측면으로 Au 나노입자를 균일하게 분포시키가 어렵고 Au 나노입자가 쉽게 응집체(aggregates)를 형성하는 것이다. 이런 문제들을 극복하기 위하여, Au 나노 입자의 상호-연결자로 유기분자 또는 폴리머 등이 사용되었다(Miguel, A.C. et al., 2006. J. Mater. Chem. 16, 22-25). 그럼에도 불구하고, CNT로 균일한 Au 나노입자를 분포시키는 것은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다. 최근, 본 발명자는 MWNT의 표면에 Au를 분산 배치시키기 위하여 γ-선 유도 환원법을 사용하였다 (Showkat, A.D. et al., 2007. Diamond Rel. Mater. 16, 1688-1692). MWNT(SH)를 얻기 위하여, MWNT는 티올(-SH) 기로 기능화되고, γ-선 조사를 이용한 Au(III) 이온의 환원에 의하여 MWNT(SH) 표 면 전면에 Au 나노입자들이 증착하였다. 또 다른 방법으로는, MWNT 표면위에 Au 입자를 데코레이션하기 위하여 폴리아닐린 (polyaniline: PANI)이 링커로 사용되었다 (Manesh, K.M. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 771-779; Santhosh, P. et al., 2006. J. Catal. 238, 177-185; Lee, K.P. et al., 2006. J. Nanosci. Nanotechnol., 6, 1575-1583). MWNT 및 Au 나노입자의 결합은 바이오센서의 제작에 유용한 것으로 증명되었다(Manso, J. et al., 2008. Electrochem.Acta 53, 4007-4012; Muguruma, H. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 827-832; Wu, B.Y. et al., 2007. Biosens. Bioelectron. 22, 2854-2860; Chen, S. et al., 2007. Biosens. Bioelectron. 22, 1268-1274; Xiang, C. et al., 2008. Electrochem.Commun. 10, 38-41).
키토산은 생체적합적이고, 생분해가능한 비독성의 천연 생체폴리머이다. 키토산은 우수한 필름 형성능, 높은 물 투과성, 우수한 접착 및 화학적 개질에 대한 민감성을 가지고 있으며 효소 고정을 위한 편리한 폴리메릭 스카폴드(polymeric scaffold)를 제공한다. 키토산은 바이오센서와 바이오촉매의 고정화 매트릭스로 성공적으로 사용될 수 있었다(Huang, H. et al., 2002. Anal.Biochem. 308, 141-151; Guerente, L.C. et al., 2005. Electrochem.Acta 50, 2865-2877). 그러나, 키토산은 낮은 전도성 때문에 전기화학적 바이오센서를 제조하기 위하여 CNT 또는 그 외 레독스 매개자 또는 금속 나노입자와 결합할 필요가 있다.
이온성 액체(ionic liquid: IL)는 이온으로 구성되어 있다. IL은 광범위한 전위 윈도우, 높은 열안정성, 점도, 우수한 전도성 및 용해성과 같은 독특한 특성 을 가진다. IL은 탄소물질과 같은 매트릭스로 쉽게 삽입될 수 있다(Zhao, F. etal., 2004. Anal. Chem. 76, 4960-4967).
콜레스테롤의 농도 측정 등의 의학적 분야 뿐만 아니라 다양한 분야에서 바이오센서들이 이용되고 있으며, 단점과 문제점을 개선시키기 위한 연구가 계속되고 있다.
바이오센서 내로 효소를 침출없이 효과적으로 고정화시킬 수 있는, 시료를 신속 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서의 개발이 요구되고 있다.
이를 위하여, 금 입자가 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 효소를 침출 없이 효과적으로 고정화 시킬 수 있는 고정화층을 제조하고자 하였다. 구체적으로, 금 입자가 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 키토산-이온성 액체 혼합물을 코팅시키는 방법으로, 효소를 효과적으로 고정화시킬 수 있는 층을 별도로 가지는 바이오센서를 제작할 수 있었다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 금 입자가 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 이온성 액체-키토산 혼합물이 3차원적 네트워크를 이루면서 코팅된 효소 고정화층을 가지는, 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, 바이오센서는 효소 및 효소가 특정의 기질분자를 식별하거나 특이적인 반응을 촉매할 때 일어나는 기질분자의 변화를 전기신호로 변환할 수 있는 계측장치를 구성요소로 포함하는, 특정 기질의 농도나 반응을 검출 및 정량이 가능한 장치를 의미한다. 구체적으로, 효소를 막에 고정화시키고 이를 전극에 밀착시켜 효소반응에 의하여 전극표면에 생기는 물질의 변화량을 전기신호의 변화량으로 변화시켜 측정한다.
본 발명의 바이오센서는 다중벽 탄소나노튜브 전극에 효소를 침출 없이 효과적으로 고정화시키기 위한 구조로서, 이온성 액체-키토산 혼합물을 이용하여 제작한 3차원적 네트워크를 이루는 효소 고정화 층을 부가적으로 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 키토산-이온성 액체 혼합물로부터 제조된 효소 고정화층은 바이오센서에 별도/부가적으로 존재한다 하여도 전자 전달 경로를 차단하거나 고도로 억제시키지 않는다. 또한, 고정화층에 효소가 고정되어도 효소 활성과 민감성을 억제하거나 제한하지 않는다는 점에서도 유용하다. 또한, 본 발명의 바이오센서는 강화된 전기촉매적 활성을 보이며, 시료의 농도 측정시 우수한 안정성과 재현성을 보이며 넓은 농도 범위의 시료에 대해서도 우수한 선형적 반응을 보아는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 사용 가능한 이온성 액체는 암모니윰(ammonium), 이미다졸 륨(Imidazolium), 피리디늄(Pyridinium), 피리다지늄(Pyridazinium), 피리미디늄(Pyrimidinium), 피라지늄(Pyrazinium), 피라졸륨(Pyrazolium), 티아졸륨(Thiazolium), 옥사졸륨(Oxazolium), 피페리디늄(Piperidinium), 피롤리디늄(Pyrrolidinium), 피롤리늄(Pyrrolinium), 피롤륨(Pyrrolium), 티리아졸륨(Thriazolium) 및 트리아졸륨(Triazolium)으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이들의 치환된 화합물인 양이온과 F-, Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CN)2 -, BF4 -, ClO4 -, RSO3 -, RCOO-(여기서, R은 C1 내지 C9의 알킬기 또는 페닐기임), PF6-, (CF3)2PF4-, (CF3)3PF3 -, (CF3)4PF2 -, (CF3)5PF-, (CF3)6P-, (CF3SO3 -)2, (CF2CF2SO3 -)2, (CF3SO3)2N-, CF3CF2(CF3)2CO-, (CF3SO2)2CH-, (SF5)3C-, (CF3SO2)3C-, CF3(CF2)7SO3 -, CF3CO2 - 및 CH3CO2 -로 구성된 군 중에서 선택된 음이온의 조합으로 이루어질 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오센서에 고정화되는 물질은 바람직하게는 효소이다. 그러나, 효소로만 한정되지 않으며, 바이오센서에 고정화되어 있는 동안, 기질과 반응하여 전기신호를 발생할 수 있는 물질이라면 제한없는 적용이 가능하다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 아미노산, 항체, 미생물 등의 고정화에도 응용될 수 있고 이에 따라 임상적 진단을 위한 의료, 환경, 식품, 공업 분야 등이 광범위한 분야에서의 적용을 기대할 수 있다.
구체적인 예시로서, 콜레스테롤 산화효소가 고정화된 본 발명의 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx는 혈액시료 내 콜레스테롤 수준을 정확하고 신속하게 측정할 수 있는 콜레스테롤 측정용 바이오센서로서의 성공적인 한 적용을 보여주고 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 티올기로 표면 기능화된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 Au을 전착시키는 공정; (ii) Au 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 키토산-이온성 액체 혼합물을 코팅하여 3차원적 네트워크를 이룬 효소 고정화층을 제조하는 공정; 및 (iii) Au 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극의 효소 고정화층에 효소를 고정화시키는 단계를 포함하는, 효소 고정화된 바이오센서를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 효소 고정화된 바이오센서를 제조하는 방법은 도 1에 대략적으로 도식화하여 나타내었다. 각 공정을 살펴보면 다음과 같다.
공정 (1)은 Au 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극을 제작하는 단계로서, 화학적으로 불활성이고 소수성인 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 Au 입자를 효과적으로 분포시키기 위하여, 4-아미노티오페놀 등을 링커로 이용하여 다중벽 탄소나노튜브 을 티올(-SH)기로 기능화시킨 다음, 표면에 Au 나노입자를 증착시키도록 한다. 티올기를 기능화시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다.
공정 (ii)은 공정 (i)에서 얻은 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 효소 고정 화층을 제조하는 단계로, 키토산을 단독으로 사용하는 것이 아니라, 이온성 액체와 키토산을 혼합물 성분을 코팅층 제조를 위한 원료로 사용하는데 특징이 있다.
키토산을 광범위한 전위 윈도우, 높은 열안정성, 점도, 우수한 전도성 및 용해성과 같은 독특한 특성을 가지는 이온성 액체에 녹여서 제조하고 이를 전극에 코팅하여 효소 고정화층을 제조할 경우, 키토산 단독 처리로는 얻을 수 없는 개질된 물리화학적 성질을 가지게 된다. 이온성 액체를 구성하는 양이온과 음이온의 조성과 구조를 변화시켜 물리화화적 성질의 조절이 가능하기 때문에 사용 목적에 부합하는 특징을 가지는 바이오센서 제작에 용이하게 사용될 수 있다. 또한, 이온성 액체와 키토산의 혼합 비율은 바이오센서에 목적에 알맞도록 조절이 가능하다. 본 공정에 사용가능한 이온성 액체는 바람직하게는, 실온 이온성 액체이다. 본 공정에 사용가능한 이온성 액체는 상기한 바와 같으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 BMIM-BF4를 사용하였다.
공정 (iii)은 상기 (ii)에서 얻은 다중벽 탄소나노튜브 전극의 효소 고정화층에 효소를 고정화시키는 단계이다. 본 발명의 전극에 고정화시켜 바이오센서로 사용될 수 있는 효소는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는, 산화효소이다. 이런 산화효소로, 포도당 산화효소, 젖산 산화효소, 알코올 산화효소, 또는 콜레스테롤 산화효소 등을 예로 들 수 있다. 구제척인 예시로서, 콜레스테롤 산화효소(ChOx)가 고정화된 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx를 제작하였다.
상기한 본 발명의 효소 고정화된 바이오센서 제작은 (i), (ii), 및 (iii)의 공정이 순차적으로 진행되며, 각 단계에 추가 및 부과 공정을 둘 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 제조된 바이오센서를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바이오센서용 전극을 이용하여, 본 발명의 바이오센서에 고정화된 효소의 기질이 검출되는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 분석하여 질병 등을 효과적으로 검사할 수 있다. 구제척인 예시로서, 본 발명의MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx를 이용하여 혈액시료 내 콜레스테롤 수준을 정확, 신속하게 측정할 수 있으며, 심장병, 뇌혈전 등의 질병을 임상적으로 검사할 수 있다.
본 명세서에서, MWNT(SH)-Au와 ITO/MWNT(SH)-Au은, MWNT(SH)-Au/Chi-IL와 ITO/MWNT(SH)-Au/Chi-IL은, 및 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx와 ITO/MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx는 동일한 의미는 가지며 각각 상호교환적으로 사용되었다.
본 발명의 방법으로 제작된 바이오센서의 고정화층 내로 많은 양의 효소를 침출없이 효과적으로 고정화시킬 수 있었으며, MWNT, Au 나노입자, Chi 및 IL의 고유 특성들이 상승적 효과에 의하여 강화된 전기촉매적 활성이 나타나며, 시료의 농 도 측정시 우수한 안정성과 재현성을 보이며 넓은 농도 범위의 시료에 대해서도 우수한 선형적 반응을 보였다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1: 재료
콜레스테롤 산화효소(Cholesterol oxidase: ChOx) (100 U mg-1; U: enzyme units), 키토산 (85%), 트리톤-X 100 (polyoxyethylene isooctylphenyl ether)은 시그마 (Sigma: Korea)에서 획득하였다. 콜레스테롤 (95%) 및 글루타르알데히드는 알드리치(Aldrich)에서 구입하였다. 요산 (uric acid), 아스코르브산 (ascorbic acid), 아세트아미노펜(acetaminophen) 및 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 테르라플로우 테트라플로로보레이트 (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate: BMIM-BF4, ionic liquid, IL)는 분석용 등급이다. MWNT (직경은 10-50 nm)는 CNT Co. Ltd. (Incheon, Korea)에서 구입하였다. MWNT는 기능화되어 사용되었다. 인듐-도핑된 산화주석 (ITO)-코팅된 글라스 플레이트 (약 10Ω 의 고유표면저항)를 바이오센서 전극의 제조에 사용하였다.
1-2: 용액의 제조
(1) 키토산
0.5 g의 키토산을 1.0% (v/v)의 아세틱산 100 mL에 용해하였다. 투명한 균질의 용액을 얻기 위하여 용액을 초음파처리(ultrasonication)(30분) 하였다. 용액을 실온에서 보관하였다.
(2) 콜레스테롤
콜레스테롤 스탁 용액은 1 mL 이소프로판올 및 5 mL 트리톤 X-100 혼합물을 포함하는 50 mL 의 블루메트릭 플라스크에 0.0967 g 의 콜레스테롤을 용해함으로써 인삼염 버퍼 (0.05 M; pH=6.8)에서 준비하였다. 용액은 60℃에서 1시간 동안 온도조절되었다. 용액을 암 조건에서 4℃에서 보관하였다. 스탁 용액은 1% (w/w) 트리톤 X-100을 포함하는 0.01 M 인삼염 버퍼로 희석하였다.
1-3: 기계사용 (instrumentation)
IVIUMSTAT 일렉트로케미컬 인터페이스 (Netherlands)을 이용하여 순환전류전압 (cyclic voltammetry), 전기화학적 인피던스 스펙트라 (electrochemical impedance spectra : EIS) 및 전류측정(amperometry) 실험들을 수행하였다. 전기화학적 실험은 작동전극으로 ITO, 보조전극으로 Pt 와이어, 기준전극으로 Ag/AgCl 을 가지는 전통적 3-전극 시스템을 이용하여 수행하였다. 활성 표면 영역은 인삼염 버퍼 (pH 6.8) 내 1 mM K4[Fe(CN)6] 의 용액에서 스캔속도 50 mV/s 로 정류상태 순환전류전압법으로 측정하였다. EIS 측정은 인삼염 (pH 7.0)내 1 mM K3Fe(CN)6 존재하에 수행하였다. 전류-시간 곡선은 콜레스테롤 표준용액을 교반조로 연속 추가하면서 -0.05 V 의 작동 전위에서 교반조에서 기록하였다. 표면 관찰은 25 kV로 작동한 TEOL JSM-5600LV 장치에서 주사전자현미경(scanning electron microscopy: SEM)을 이용하여 수행하였다.
1-4: MWNT ( SH )- Au / Chi - IL / ChOx 바이오센서의 제조
MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서 전극의 제작은 ITO/MWNT(SH)-Au 형성, ITO/MWNT(SH)-Au/Chi-IL 형성, 및 ITO/MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 형성의 3 단계의 순차적 단계를 포함한다.
MWNT(SH) 을 얻기 위하여, 공지된 방법을 이용하여(Santhosh, P. et al., 2006. J. Catal. 238, 177-185) 4-아미노티오페놀을 링커로 이용하여 MWNT을 티올(-SH) 기능화시켰다. MWNT-SH/Au 전극을 얻기 위하여, ITO/MWNT-SH 표면에 Au 나노입자를 증착시키고자 순환 전류전압법을 사용하였다. DMF (5 mL)에서 MWNT-SH (5 mg) 현탁액을 준비하고 5분간 초음파처리하였다. ITO/MWNT(SH) 전극을 얻기 위하여 현탁액(50 μL) 을 ITO 표면에 필름으로 적제 주조하고 12 시간 동안 60℃에서 유지하였다. HAuCl4 용액(5.0 x 10-4)으로부터 Au 입자는, 100 mV/s 스캔속도 로, 1.1에서 0.0 V로의 (표준 전극으로 Ag/AgCl에 대한) 스캔사이의 전위를 반복적으로 순환하면서 ITO/MWNT(SH) 전극에 전기화학적으로 증착되었다. MWNT(SH)/Au 전극을 얻었다.
0.2 mL의 Chi 용액을 50μL의 IL 및 50μL의 글루타르알데히드 (0.1 %) 와 혼합하고 10분간 교반하였다. ITO/MWNT(SH)-Au/Chi-IL 전극을 얻기 위하여 CS-IL 혼합물을 ITO/MWNT(SH)-Au 에 적제하여 코팅하였다. 물로 세척하고 건조한 후에, 8μL의 ChOx 용액을 MWNT(SH)-Au/Chi-IL 전극 표면에 적제하고 실온에서 건조하였다. 비교의 목적으로 그 외 개질된 전극인, MWNT(SH)-Au/Chi/ChOx, MWNT(SH)/Chi-IL/ChOx 및 MWNT(SH)-Au/ChOx를 제작하였다.
1-5: 콜레스테롤의 측정
0.1 mM의 콜레스테롤의 연속적 첨가에 대한 전류측정 실험을 -0.05 V의 전위에서 수행하였다. 용액을 마그네틱 바를 이용하여 균일한 속도로 천천히 교반하였다. 안정적인 수치에 도달한 후에 전류를 기록하였다. 전류-시간 곡선을 기록하였다. 또한, 인산염 버퍼 (pH 6.8) 내 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx에서 상이한 농도의 콜레스테롤에 대한 순환 전류전압곡선 (cyclic voltammogram: CV)을 기록하였다.
실시예 2: MWNT ( SH )- Au / Chi - IL / ChOx 바이오센서 전극의 제작
제작은 (i) MWNT(SH)-Au 전극을 얻기 위한 MWNT(SH) 표면 위로의 Au 입자 증 착, (ii) MWNT(SH)-Au의 Chi-IL층 코팅 및 (iii) MWNT(SH)-Au/Chi-IL 매트릭스 내로 ChOx를 고정화시키는 3 단계로 이루어진다 (도 1).
첫 단계에서, MWNT(SH) 표면으로 Au 입자가 전착(electrodeposition)되면서 MWNT(SH)-Au 전극이 얻어진다. MWNT(SH) 표면으로 Au 입자를 전착하는 동안에 기록된 CV는(도 2), 0.90 V 및 0.58 V 부근에서 2개의 캐소딕 피크를 나타내었다. 0.90 V 주위의 초기 밴드는 흡착된 AuCl4 -의 Auo로의 환원을 나타낸다(Chen, W.C. et al., 2002. Electrochim. Acta. 47, 1305-1315). +0.58 V 에서의 날카로운 피크는 Au(III) 의 Auo로의 환원에 해당한다. 비슷한 특징들이 탄소 전극으로의 Auo 증착에서 발견되었다(Schmidt, U. et al., 1997. J.Elctrochem. Soc. 144, 2013-2021; Trejo, G. et al., 1995. J.Elctrochem. Soc. 142, 3404-3408). 0.80 V 주변의 전류가 감소하는 동안, +0.50 V 에서의 피크전류(peak current)는 전위 사이클 수와 함께 꾸준히 증가하였다. 이는 Auo 입자가 전위 사이클 수의 증가와 함께 MWNT(SH)로 점점 더 적재된다는 것을 의미한다. MWNT(SH)로 흡착되는 Auo 입자수는 하기 식으로 계산하였다.
Figure 112008046472713-PAT00001
상기에서, Qdep 는 Auo의 흡착에 사용된 전하이고, M은 Au의 분자량, F는 감 응계수(faradic constant) 및 Z는 Auo (Au(III)에서 Auo, Z=3) 형성을 위하여 전달된 전자 수이다. 1번째 전위 사이클의 마지막에, 9 μg/cm2의 Auo 입자가 MWNT(SH)로 증착되었다. 10번째 전위 사이클 후에, 19 μg/cm2의 Auo 입자가 전착되었다.
CNT는 화화적으로 불활성이고 화학적으로 불활성이고 소수성이라서, Au 입자는 효과적으로 분포할 수 없다. 그러나, 티올(-SH)기로 MWNT의 표면 기능화 (surface functionalization)는 SH기와 Auo 와의 상호작용으로 인하여 Auo 입자의 증가된 증착을 나타내게 한다(Sawaguchi, T. et al, 1992. Bioelectrochem. Bioener. 29, 127-133; Dagan, M.L. et al., 1994. J. Am. Chem. Soc. 116, 7913-7914; Showkat, A.D. et al, 2007. Diamond Rel. Mater. 16, 1688-1692). 따라서, 전착 및 화학적 상호작용에 의한 MWNT(SH)로의 Au의 성공적인 고정을 통하여 MWNT(SH)-Au 전극을 제작할 수 있었다. 바이오센서 제작을 위한 순차적 공정에서, IL, Chi 및 글루타르알데히드로 구성되는 혼합물은 MWNT(SH)-Au 표면에 층으로 코팅되었다. IL (BMIM-BF4)는 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)으로 인하여 Chi와 혼합가능하다. Chi에서 아민기는 IL의 BF4 - 이온에 대하여 친화도를 가지고 있으며, 따라서, IL는 유도된 용해성을 가지게 된다. Chi의 아민기는 글루타르알데히드의 알데히드기와 공유 교차결합을 형성하여 3D 네트워크를 형성한다. 따라서, Chi는 글루타르알데히드와 공유 교차결합되고 MWNT(SH)-Au 표면에 걸쳐 3D 네트워크로서 제공된다.
바이오센서 제작의 최종 단계에서, ChOx는 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 전극을 획득하기 위하여, MWNT(SH)-Au/Chi-IL 매트리스로 고정화된다. 생체전기촉매 (bioelectrocatalysis)로서 유익할 MWNT, Au, Chi 및 IL으로부터 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx에 대한 상승적 효과를 기대하였다.
실시예 3: 형태
MWNT(SH)-Au 의 SEM 이미지에 의하면(도 3a), 직경이 250 nm 내지 1 μm의 범위의 클러스터 직경을 가지는 균일하게 분포하는 Au 입자의 구형 클러스터가 존재한다. MWNT(SH)-Au/Chi-IL (도 3b)의 SEM 이미지에서, Chi-IL 혼합물의 상호연결된 와이어(wires)는 MWNT(SH)-Au 표면 전체에서 확인될 수 있다.
실시예 4: MWNT ( SH )- Au / Chi - IL / ChOx 전극의 전기화학적 특성
4-1: 순환전압전류법 ( Cyclic Voltammetry )
개질된 전극의 전기화학적 특성을 레독스 마커(redox marker)로서 Fe(CN)6 3-/4- 시스템을 이용하여 조사하였다. bare ITO, MWNT(SH), MWNT(SH)-Au, MWNT(SH)-Au/Chi-IL 및 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 전극들의 전기화학적 성능을 조사하였다. 1 mM의 Fe(CN)6 3-/4- 레독스 프로브를 포함하는 인삼염 버퍼용액(pH=6.8)에서 CV를 기록하였다(도 4). 피크분리(peak separation) 및 피크전류(peak current) 수치에 대한 피크에서의 차이는 있지만, 모든 개질된 전극에 대하여 Fe(CN)6 3-/4-의 잘 정의된 레독스 특징들이 관찰되었다. 개질된 전극 (>160 mV)에서의 큰 피크분리는 전극에서 준-비가역공정(quasi-irreversible process)의 발생을 의미한다.
MWNT(SH) 전극의 경우, bare ITO 전극과 비교하여 피크 분리(△Ep)에 대한 큰 피크와 함께 (～230 mV) 피크전류에서 주목할만한 증가가 관찰되었다 (도 4a). MWNT(SH) 는 큰 표면적을 가지고 개질 전극, ITO/MWNT(SH)의 증가된 활성 표면적의 원인이 된다. MWNT(SH)-Au 전극의 경우, Fe(CN)6 3-/4- 레독스 공정의 애노딕 피크 출력이 MWNT(SH) 전극에서보다 1,5배 증가하였다. MWNT(SH)-Au에 대한 △Ep 는 MWNT(SH) 전극 (230 mV)과 비교하여 190mV 까지 감소하였다(도 4b).　　이런 결과는 MWNT 표면에 Au 의 존재가 전극의 전기촉매적 활성을 증가키는다는 것을 의미한다. MWNT(SH)-Au 가 Chi-IL층으로 커버될 때, MWNT(SH)-Au에 대하여 전극은 피크분리 및 전류 수치에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이런 결과는 MWNT(SH)-Au 표면의 Chi-IL층이 전자 전달 경로를 차단하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, Chi-IL 층은 효소, ChOx이 고정된 바이오센서 전극 제작에 유익하다.
Chi 는 효소 고정을 위한 인터링커(interlinker)로 일찍부터 사용되었다. Chi는 전극 표면에서의 차단 효과 때문에 전기활성에서 주목할만한 감소를 보였다. Chi가 글루코즈 산화효소(glucose oxidase)의 고정화에 유익함에도 불구하고, Chi 존재는 전자이동경로를 방해하였다 (Kang, X. et al., 2007. Anal.Biochem. 369, 71-79). 그러나, 본 연구에서 바이오센서 제작에 Chi 사용 대신에 Chi-IL 혼합물을 사용하였다. 증거로서, 순환전류전압 결과로부터의 Chi 로 IL의 결합효과는 강화된 전자 전달 경로를 제공하였다 (도 4c). MWNT(SH)-Au 표면은 침출없이 효소를 붙잡을 기능적 능력을 가지지 않는 반면, MWNT(SH)-Au/Chi-IL는 정전기적 상호작용을 통하여 3D 네트워크로 ChOx를 효과적으로 고정화시킬수 있었다(도 1). MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx (도 4d)에서 피크전류는 MWNT(SH)-Au/Chi-IL (도 4c)에서보다 2배 정도 높았다. 적은 △Ep (170mV) 가 관찰되었다. MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 에서의 피크전류는 다른 개질된 전극보다 많은 높은 것으로 나타났다.
도 5는 1mM Fe(CN)6 3-/4- (pH = 6.8)에서의 상이한 스캔속도에서 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 및 MWNT(SH)-Au/ChOx 전극의 CV를 보여준다. 애노딕 및 캐쏘딕 피크전류는 두 전극 모두에서 스캔속도와 함께 일제히 증가하였다. 도 5내 삽입된 도면에서 제시되는 바와 같이, 피크전류는 10 mV/s 내지 100 mV/s 범위의 스캔속도에 선형적으로 비례하였다. 전극에서의 전자 이동은 표면 제한된 공정인 것으로 추론된다. 스캔속도를 증가시킴에 따라, 환원 피크는 음전위로 이동하는 반면 산화 피크는 양전위로 이동하였다. 캐쏘딕 피크 분리 (△Ep)에 대한 애노딕 피크는 모든 전극에서 스캔속도와 함께 증가하고, 이는 준-비가역공정임을 의미한다. △Ep의 비교는, MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 전극에 대한 △Ep는 MWNT(SH)-Au/ChOx와 비교 하여 임위의 스캔속도에서 낮았다. MWNT(SH)-Au 전면에 Chi-IL의 존재는 ChOx가 전자 이동 공정을 수행하기 위한 유리한 미세환경을 제공한다. 이런 관찰은 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 가 생체전기촉매에 유익할, 높은 전자활성 표면적과 높은 전자활성도를 가진다는 것을 명확히 증명한다.
4-2: 전기화학 인피던스 스펙트로스코피 ( electrochemical impedance spectroscopy: EIS )
MWNT(SH)-Au/ChOx 및 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 전극의 계면특성을 조사하기 위하여 EIS를 사용되었다. 도 6은 1 mM Fe(CN)6 3-/4- (0.1 M KCl)에서 기록된 전극의 나이키스트 플랏(z" vs. z')을 보여준다. 나이키스트 플랏은 반원 및 선형 부분을 가진다. 고주파에서는 반원을 저주파에서는 선형 부분은 각각 전자 전달 한계 및 확산 공정에 각각 해당한다. 반원 부분의 직경은 전자 전달 저항 (electron transfer resistance: Rct)를 나타내다. bare (ITO) 전극의 Rct (735 Ω) (도 6a)는 다른 개질 전극보다 크다. bare 전극을 ITO/MWNT(SH)-Au/ChOx로 개질후에, 450 Ω까지 감소한 Rct 는 (도 6b), 표면 전도성을 개선시키는 MWNT(SH)-Au의 효과를 나타낸다. 중요하게는, ITO/MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx의 경우, ITO/MWNT(SH)-Au (450 Ω)의 저항성과 비교하여 저항성은 390Ω까지 더 감소하였다 (도 6c). 이런 관찰들은 MWNT(SH)-Au가 bare ITO 전극의 전도성을 개선시키고 CS-IL 층이 좋은 전자 전달 경로를 제공한다는 것을 나타낸다. 따라서, MWNT(SH)-Au 전면에 CS-IL 존재 는 ChOx를 위한 증가된 전자 전달 경로를 제공한다. MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서 전극은 생체분자(biomolecules)를 측정하기 위한 생체전기촉매로 기대된다.
실시예 5: 콜레스테롤 바이오센서로서의 MWNT ( SH )- Au / Chi - IL / ChOx 의 작동
5-1: 순환전류전압
도 7은 상이한 농도의 콜레스테롤을 포함하는 인삼염 버퍼 용액(pH = 6.8) 내에서의 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx의 CV를 보여준다. CV는 콜레스테롤 농도(0.1 mM)에서의 연속적 단계 변화를 기록하였다. 콜레스테롤 (0.1 mM)의 첨가 후에, 콜레스테롤 부재하의 산화 전류와 비교하여 애노딕 피크 전류는 2배 증가하였다 (도 7b). 도 7(b-e)는 콜레스테롤 (0.1 mM)의 연속적 첨가가 피크 전류에서의 선형적인 증가를 유발함을 보여준다. 따라서, MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서는 콜레스테롤의 연속적인 첨가에 대하여 거의 선형의 반응을 나타내었다.
5-2: 전류측정 반응 ( amperometric response )
도 8A는 -0.05 V의 작동 전위에서, 인산염 버퍼 (pH=6.8)에서의 콜레스테롤 농도의 연속적인 단계별 변화(0.5 mM)에 대한 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서에 대한 전류특정(전류-시간) 반응을 보여준다. 비교 목적으로, MWNT(SH)-Au/ChOx 전극에 대한 전류-시간 곡선을 기록하였다 (도 8B). MWNT(SH)-Au/ChOx 전극에서는 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx와 비교하여 적은 전류 반응이 감지되었다. 본 연구는 콜레스테롤에 대한 전류 반응의 증대에 미치는 MWNT(SH)-Au 표면에 존재하는 Chi-IL의 중요성을 증명하는 것이다. MWNT(SH)-Au/CS-IL/ChOx 바이오센서는 0.5 내지 5μmM 농도범위의 콜레스테롤에 대하여 0.998의 상관계수(correlation coefficient)를 가지는 선형적 반응을 보인다 (도 8A, 삽입). MWNT(SH)-Au/ChOx의 40 μA M-1과 비교하여 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서의 민감도는 200 μA M- 1 이다. 따라서, MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 민감도는 MWNT(SH)-Au/ChOx 바이오센서보다 5배 정도 높았다. MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 전극에 대한 높은 민감성은 MWNT(SH)-Au의 Chi-IL 층의 중요성을 증명한다. Chi-IL층은 생체적합성 및 ChOx를 위하여 증대된 전자전달경로를 제공한다.
콜레스테롤의 연속적 첨가를 위하여, MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 개질된 전극에서 전류는 즉시 증가하고 안정한 상태로 도달하였다. 안정한 반응에 도달하기 위하여 필요한 시간 (반응시간)은 ~ 8 s였다. MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx에서의 콜레스테롤의 반응시간은 솔-젤/키토산/ChOx 하이브리드 혼합물 필름 (13s) (Tana, X. et al., 2005. Anal. Biochem. 337, 111120), 폴리피롤-하이드로겐(30 s) (Brahim, S. et al., 2001. Anal. Chim. Acta 448, 2736) 및 솔-젤 필름의 ChOx (51 s) (Yao, T. et al., 1998. Biosens. Bioelectron., 13, 6773) 기반한 콜레스테롤 바이오센서에서 보고되어진 것보다 많이 낮았다. 빠른 반응은 MWNT(SH), Au-입자, Chi 및 IL의 상승적 효과에 기인한다. MWNT(SH)는 표면으로의 Au 입자의 로딩과 효과적인 결합을 위한 높은 표면적을 제공한다. Chi-IL는 ChOx로 전자 전달 을 위한 생체적합성 및 미세환경을 제공한다.
실시예 6: 간섭( Interference ), 안정도( stability ) 및 재현성( reproducibility )
도 8C는 인산염 버퍼 (pH 7.0) 내의 MWNT(SH)Au/Chi-IL /ChOx 개질된 전극에서 콜레스테롤 (0.5 mM), 요산 (UA) (0.5 mM), 아스코르브산 (AA) (0.5 mM), 및 아세트아미노펜 (AP) (0.5 mM)에 대한 전류특정 반응을 나타낸다.
아주 명확한 전류 반응이 -0.05 V의 전위에서 콜레스테롤(0.5 mM)에 대하여 관찰되었다. UA, AA, 및 AP의 적절한 생리학적 수준(0.5 mM)의 농도의 연속적 주입은 전류 반응에 대하여 어떤 추가 신호 또는 변화를 일으키지 않았다. MWNT, Au Chi-IL 및 ChOx의 상승적 효과는 매우 낮은 전위에서도(-0.05 V) 콜레스테롤의 검출을 가능케 한다. 아주 음전위에서의 콜레스테롤의 검출은 전위 간섭(potential intereferents) 효과를 제한한다. 따라서, MWNT(SH)Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서는 콜레스테롤의 측정에 대하여 높은 선택성을 나타낸다.
바이오센서의 재현성 및 안정성을 측정하였다. 단일 바이오센서를 이용한 인산염 버퍼 (pH = 6.8)에서의 1 mM 콜레스테롤에 대한 12번의 1세트 전류 측정 결과, MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서의 좋은 재현성을 의미하는 1.9 % 의 R.S.D 수치를 나타내었다.
MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서의 안정성은 전극을 4℃에서 20일간 보관하여 측정하였다. MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 센서는 0.5 mM 의 콜레스테롤에 대한 전류 반응에서 매우 적은 차이를 보였다. 전류 반응이 20일 후에도 5%까지 감 소하였다. 따라서, MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서 전극은 우수한 안정성과 재현성을 나타내었다. Chi-IL 3D 네트워크의 존재는 바이오센스로부터 ChOx의 침출을 제한한 안정성과 재현성을 준다.
본 발명의 바이오센서는 임상적 진단을 위한 의료 분야뿐만 아니라 효소를 이용하는 공업프로세스, 환경, 식품 분야 등에서도 다양하게 응용이 가능하다.
도 1은 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서 전극의 제작 계략도를 나타낸다.
도 2는 Au 입자의 MWNT(SH) 전기화학적 침착 동안에 순환전류곡선을 기록한 결과이다 (AuCl4 - = 5.0 x 10-4 M, H2SO4 = 0.5 M, 스캔 속도: 100 mV/S, 전위 사이클 수 = 10).
도 3은 MWNT(SH)-Au (a) 및 (b) MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 4는 개질된 전극의 순환전류곡선을 나타낸다 (a) MWNT(SH) (b) MWNT(SH)-Au, (c) MWNT(SH)-Au/Chi-IL, (d) MWNT(SH)/Au/Chi-IL/ChOx); 지지 전해질 = 1 mM Fe(CN)6 3-/4-을 포함하는 0.1 M KCl; 스캔속도 = 50 mV/s.
도 5는 전극에서의 순환전류곡선을 나타낸다 (a) MWNT(SH)-Au/ChOx 및 (b) 다양한 스캔속도(inner to outer)에 대한 1 mM Fe(CN)6 3-/4-(인삼염 버퍼, pH 6.8)에서의 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx: (a) 10 (b) 20 (c) 30 (d) 40 (e) 50 (f) 60 (g) 70 (h) 80 (i) 90 (j) 100 mV/s (삽입도: 피크 전류 vs. 스캔속도).
도 6은 0.1 M KCl의 1 mM Fe(CN)6 3-/4-에서 개질된 전극의 나이키스트 플랏 (nyquist plots: z" vs. z')을 나타내는 결과로, (a) bare ITO (b) MWNT(SH)- Au/ChOx 및 (c) MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx)을 나타낸다.
도 7은 상이한 콜레스테롤 농도에 대한 인산염 버퍼 (pH 6.8)에서 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 전극의 순환전류곡선을 나타낸다. a는 콜레스테롤 없는 경우, (b - d) 각각은 0.1 mM 씩 증가된 콜레스테롤 농도의 첨가를 나타낸다(inner to outer).
도 8은 (A)는 전극의 전류 반응을 나타낸다. 0.5 mM 콜레스테롤의 연속적 첨가에 대한 (a) MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx, (b) MWNT(SH)-Au/ChOx 바이오센서, (B)는 (a) MWNT(SH)-Au/CS-IL/ChOx 및 (b) MWNT(SH)-Au/ChOx에 대한 검량 플랏을 나타낸다. 콜레스테롤 농도 (0.5-5mM) Vs 전류, (C)는 인삼염 버퍼 내 (pH 6.8) 콜레스테롤 (0.5 mM) (a) 요산 (0.5 mM) (b) 아스코르빅산 (0.5 mM) (c) 및 아세트아미노펜 (0.5 mM) (d) 에 대한 MWNT(SH)-Au/Chi-IL/ChOx 바이오센서의 전류 반응을 나타낸다.

Claims (7)

  1. 금 입자가 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 이온성 액체-키토산 혼합물이 3차원적 네트워크를 이루면서 코팅된 효소 고정화층을 포함하는 바이오센서.
  2. 제 1항에 있어서, 이온성 액체는 암모니윰, 이미다졸륨, 피리디늄, 피리다지, 피리미디늄, 피라지늄, 피라졸륨, 티아졸륨, 옥사졸륨, 피페리디늄, 피롤리디늄, 피롤리늄, 피롤륨, 티리아졸륨 및 트리아졸륨으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이의 치환된 화합물인 양이온과 F-, Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CN)2 -, BF4 -, ClO4 -, RSO3 -, RCOO-(여기서, R은 C1 내지 C9의 알킬기 또는 페닐기임), PF6-, (CF3)2PF4-, (CF3)3PF3 -, (CF3)4PF2 -, (CF3)5PF-, (CF3)6P-, (CF3SO3 -)2, (CF2CF2SO3 -)2, (CF3SO3)2N-, CF3CF2(CF3)2CO-, (CF3SO2)2CH-, (SF5)3C-, (CF3SO2)3C-, CF3(CF2)7SO3 -, CF3CO2 - 및 CH3CO2 -로 구성된 군 중에서 선택된 음이온의 조합으로 이루어진 바이오센서.
  3. (i) 티올기로 표면 기능화된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 Au을 전착시 키는 공정; (ii) Au 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극 표면에 키토산-이온성 액체 혼합물을 코팅하여 3차원적 네트워크를 이룬 효소 고정화층을 제조하는 공정; 및 (iii) Au 전착된 다중벽 탄소나노튜브 전극의 효소 고정화층에 효소를 고정화시키는 단계를 포함하는, 효소 고정화된 바이오센서를 제조하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 이온성 액체는 암모니윰, 이미다졸륨, 피리디늄, 피리다지, 피리미디늄, 피라지늄, 피라졸륨, 티아졸륨, 옥사졸륨, 피페리디늄, 피롤리디늄, 피롤리늄, 피롤륨, 티리아졸륨 및 트리아졸륨으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이의 치환된 화합물인 양이온과 F-, Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CN)2 -, BF4 -, ClO4 -, RSO3 -, RCOO-(여기서, R은 C1 내지 C9의 알킬기 또는 페닐기임), PF6-, (CF3)2PF4-, (CF3)3PF3 -, (CF3)4PF2 -, (CF3)5PF-, (CF3)6P-, (CF3SO3 -)2, (CF2CF2SO3 -)2, (CF3SO3)2N-, CF3CF2(CF3)2CO-, (CF3SO2)2CH-, (SF5)3C-, (CF3SO2)3C-, CF3(CF2)7SO3 -, CF3CO2 - 및 CH3CO2 -로 구성된 군 중에서 선택된 음이온의 조합으로 이루어진 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 효소는 산화효소인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 효소는 포도당 산화효소, 젖산 산화효소, 알코올 산화효 소, 또는 콜레스테롤 산화효소인 방법.
  7. 제 3항의 방법으로 제조된 바이오센서를 이용하여 시료를 분석하는 방법.
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