JP5120934B2 - マイクロ流体チップの微小流路を流過する細胞の切断装置、マイクロ流体チップおよび細胞の切断方法 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロ流体チップの微小流路を流過する細胞の切断装置と切断方法、並びにこの切断に用いられるマイクロ流体チップに関する。

特許文献１に示すように新たなクローニング手法として自動核移植装置が提案されている。これは、クローニングの高速度化を目指したもので、２分割した卵細胞から核を持った方を除去し、ドナー細胞と無核細胞の２個に電圧を印加して融合させるものである。このような手法の適用に際して細胞を切断することが必要になる。特許文献１には、ブレードによる細胞切断あるいは流体力による細胞切断が記載されている。

特許文献２には、マイクロチップの一部に細胞破砕部と設けることが記載されている。
特許文献３には、粒子性状を３次元に表示する画像表示装置が記載されている。
特許文献４には、流体中の粒子像を静止画像として捕え、画像中から目的とする対象物を解析する方法が記載されている。

特開２００６−３２５４２９号公報 特開２００６−２２０５５１号公報 特開２００７−７８５９０号公報 特開平８−８６７３６号公報

特許文献１には、細胞を押しつぶしたり、鋭利な刃でもって切断したり、あるいは流体の流圧によって引っ張って細胞を分割することが記載されている。細胞を鋭利な刃でもって切断することは切断後における細胞の復元を考慮した場合に望ましいものとは言えない。また流体力によって細胞を切断することは細胞の復元を考慮した場合に望ましいものであるが、流圧による引張りによる方法では確実に細胞を切断することを行ない得ないおそれがある。

マイクロ流体チップに設けた微小流路は外気から遮断された空間であり、内部を流れる流体の蒸発がないため、蒸発などによる流れの乱れは発生しない。

本発明は、かかる点に鑑みてマイクロ流体チップの利点を活用し、細胞の復元を容易にし、確実に細胞を切断することの出来る細胞切断装置、細胞切断方法並びにこれらに使用するマイクロ流体チップを提供することを目的とする。

本発明は、細胞導入部と細胞導出部を有する透明性の微小流路を備え、該微小流路に前記細胞導入部から細胞を導入して流過液と共に前記微小流路を流過させるようにしたマイクロ流体チップであって、該マイクロ流体チップの前記微小流路を流過する細胞の細胞切断装置において、
前記マイクロ流体チップには、前記微小流路から直角状方向に、前記微小流路に向って開口部が形成された分岐部を介して細胞吸引する透明性の細胞吸引微小流路が設けられ、
前記微小流路を流過する細胞を前記細胞吸引微小流路に吸引する細胞吸引手段が設けられ、
前記微小流路を流過する細胞の流過状況および前記細胞吸引微小流路への細胞の吸引状態を画像として取得する細胞画像取得手段が設けられ、
前記細胞画像取得手段によって画像取得された細胞を前記細胞吸引手段によって、前記細胞吸引微小流路に吸引させ、細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態を形成し、前記細胞画像取得手段によって監視された前記吸引された細胞が前記細胞保持状態形成の時に、前記分岐部の開口部で、前記微小流路を切断液が流過されることによって切断されるようにした細胞切断手段が設けられること
を特徴とする細胞切断装置を提供する。

本発明は、細胞導入部と細胞導出部を有する微小流路を備え、該微小流路に前記細胞導入部から細胞を導入して流過液と共に前記微小流路を流過させるようにしてマイクロ流体チップにおいて、
前記微小流路から直角状方向に前記微小流路に向って開口部が形成された分岐部を介して細胞吸引する細胞吸引微小流路が設けられ、
前記微小流路を流過する細胞を前記細胞吸引微小流路に吸引する細胞吸引手段が接続され、
前記微小流路を流過する細胞が、前記細胞吸引手段によって前記細胞吸引微小流路に吸引されて前記分岐部で細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態が形成され、この状態形成時に前記微小流路に切断液が流過されて前記分岐部の開口部で、前記分岐部に保持する細胞を切断するようにした細胞切断手段が設けられること
を特徴とするマイクロ流体チップを提供する。

本発明は、細胞導入部と細胞導出部を有する透明性の微小流路を備え、該微小流路に前記細胞導入部から細胞を導入して流過液と共に前記微小流路を流過させるようにしたマイクロ流体チップであって、
前記マイクロ流体チップには、前記微小流路から直角状方向に、前記微小流路に向って開口部が形成された分岐部を介して細胞吸引する透明性の細胞吸引微小流路が設けられ、
前記微小流路を流過する細胞を前記細胞吸引微小流路に吸引する細胞吸引手段が設けられ、
前記微小流路を流過する細胞の流過状況および前記細胞吸引微小流路への細胞の吸引状態を画像として取得する細胞画像取得手段が設けられ、
前記マイクロ流体チップの前記微小流路を流過する細胞の細胞切断方法において、
前記細胞画像取得手段によって画像取得された細胞を前記細胞吸引手段によって、前記細胞吸引微小流路に吸引させ、細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態を形成し、前記細胞画像取得手段によって監視された前記吸引された細胞を、前記細胞保持状態形成の時に、前記分岐部の開口部で、前記微小流路に切断液を流過させることによって切断するようにしたこと
を特徴とする細胞切断方法を提供する。

本発明によれば、微小流路を流過する細胞が、細胞吸引手段によって細胞吸引微小流路に吸引されて分岐部で細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路に残留する分岐部細胞保持状態が形成され、この状態形成時に微小流路に流過液が流過されて分岐部の開口部で、分岐部に保持する細胞を切断するようにした細胞切断手段が設けられており、これによって、マイクロ流体チップの利点を活用し、細胞の復元を容易にし、確実に細胞を切断することの出来る細胞切断装置、細胞切断方法並びにこれらに使用するマイクロ流体チップを提供することができる。

また、本発明によれば、細胞画像取得手段によって画像取得された細胞を細胞吸引手段によって、細胞吸引微小流路に吸引させ、細胞の一部が細胞吸引微小流路の分岐部に位置し、細胞の他部が微小流路に残留する分岐部細胞保持状態を形成し、細胞画像取得手段によって監視された吸引された細胞を、細胞保持状態形成の時に、分岐部の開口部で、微小流路に流過液を流過させることによって切断するようにしており、画像を見ながら流体力を利用して細胞を確実に切断することができる。また、この方法によれば、高速に多量の細胞を切断することができ、クローン技術の発展に伴って、同一遺伝子を持った実験動物の生産、家畜の品種改良、臓器などの再生医療応用など多方面での応用が期待できる。

以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。

図１は、本発明の実施例の細胞切断装置の概略を示す構成図である。図１において、細胞切断装置１００は、高分子であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で形成されたマイクロ流体チップ１、マイクロ流体チップ１に接続されたポンプ２、３、４、マイクロ流体チップ１と各ポンプを接続する流体接続管５、６、７、マイクロ流体チップ１に形成した微小流路および細胞吸引微小流路およびこれらの流路を流体と共に流過する細胞を撮映するカメラ９を含む撮像装置（ＣＣＤ）８、撮像した細胞の画像を記録するビデオ１０およびビデオ１０からの画像データを入力し、撮像した細胞画像を表示する画面１３を備えた画像表示装置１２、ポンプ２、３、４の制御を行う制御装置１４とから構成される。

図２は、マイクロ流体チップ１の詳細を示す平面断面図、図３は、図２の正面断面図である。これらの図においてマイクロ流体チップ１は、チップ本体２１とチップ本体２２が載置されるガラス基板２２と、チップ本体２１の内部に形成した微小流路２３とこの微小流路２３に接続され、流体および細胞導入部２４と流体および細胞導出部２６と微小流路２３に接続された細胞吸引微小流路２７と微小流路２３に接続された切断流流路２９とから構成され、流体および細胞導入部２４にはシリコンチューブで形成され流体接続管５に接続された第一のチューブ２５が接続され、流体および細胞導出部２６には同様に流体接続管６に接続された第二のチューブ（図示せず）が接続され、細胞吸引微小流路２７には流体および細胞吸引手段（図示せず）に接続された第二のチューブ２８が接続され、切断流流路２９には流体接続管７に接続された第四のチューブ３０が接続される。各部の寸法は図２および図３に図示した通りである。

マイクロ流体チップ１は、透明性のＰＤＭＳで形成してあり、従って微小流路２３、細胞吸引微小流路２７およびそのほかの流路は透明性の流路として形成される。

このように、透明性の微小流路２３は、細胞導入部（流体および細胞導入部２４）および細胞導出部（流体および細胞導出部２６）を備え、マイクロ流体チップ１は微小流路２３に細胞導入部から細胞を導入し、流体（流過液）と共に細胞が微小流路２３を細胞導出部に向けて流通する。

細胞吸引微小流路２７は、微小流路２３から直角方向に、微小流路２３に向って開口部３１が形成された分岐部３２を介して細胞を流過液の一部と共に吸引する。すなわち、微小流路２３を流過する細胞は、細胞吸引手段によって細胞吸引微小流路２７に吸引される。

この吸引によって、微小流路２３を流過する細胞が、分岐部３２で細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部おける細胞保持状態（分岐部細胞保持状態）が形成される。

この状態形成時に、切断流流路２９から微小流路２３に切断液が流過される。細胞導入部から流入するようにしてもよい。

このようにして、微小流路２３を流過する細胞が、細胞吸引手段によって細胞吸引微小流路２７に吸引されて分岐部３２で細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態が形成され、この状態形成時に微小流路２３に切断液が流過されて前記分岐部３２の開口部３１で分岐部３２に保持する細胞を切断するようにした細胞切断手段が形成されることになる。

切断流が流過すると、分岐部３２の開口部３１が切断刃の作用をなして分岐部３２に保持する細胞を切断する。微小流路２３からの細胞の吸引作用保持作用および切断作用にとって細胞吸引微小流路２７は、微小流路から直角方向に形成されることは重要である。直角方向と言っても数学的な直角ばかりでなく、数度の傾きは許容され、以って直角状方向と表現することにする。

以下、図４および図５を使用して切断流による細胞の切断について説明する。卵細胞を切断するためには、まず細胞膜表面にある透明帯を除去する。これをプロナーゼ酵素にて除去する。次に，細胞内部の細胞骨格を壊し、細胞をやわらかくするためにサイトカラシンに５分程度反応させる．これにより、細胞骨格が壊れ、以下に示すように細胞の切断が可能となる。

図４（Ａ）は卵子の細胞切断方法を実験例で示し、図４（Ｂ）は図４（Ａ）がやや不鮮明であるので、ポンチ画によって図４（Ａ）の内容を図示するものである。従って、図４（Ａ）（１）を見るに当って図４（Ｂ）（１）を参照するものとする。

図４（Ａ）（１）（以下、図４（１）と記載する。）は、図２に示したマイクロ流体チップ１を示し、細胞吸引微小流路２７の分岐部３２の開口部３１にて卵子の細胞を切断する状態を示す。図において、点線枠は分岐部状態を示し、矢印は流過液、切断流の流れ方向を示す。前述したように、マイクロ流体チップ１の各流路は外気から遮断された空間であり、各流路を流れる流体の蒸発がないため、蒸発による流れの乱れは発生しない。また、各流路の設計により細胞の位置決めを容易に行うことができる。また、上述したように、マイクロ流体チップ１は、ＰＤＭＳとガラス２２との組み合わせになるものであり、透明性が高く、撮像装置８による画像取得が容易である。

図４（２）に示すように、細胞（黒枠表示）を搬送流である流過液に乗せ、細胞吸引微小流路２７の開口部３１付近に位置させる。この状態から細胞吸引手段によって細胞を、すなわち細胞を含む流過液を細胞吸引微小流路２７に吸引する。図４（３）に吸引した状態を示す。この状態は、分岐部３２で細胞の一部（図７で上側）が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部（図で下側）が微小流路側に残留している分岐部細胞保持状態である。

図４（４）に示すように、この状態形成時に微小流路２３に切断流が矢印のように流し、開口部３１の角部（直角状角部）を利用して切断流の有する流れ力によって細胞の切断を行う。切断された細胞の一部は吸引力によって細胞吸引微小流路２７を上方へと移動される。

図４（５）は、上方へと移動した細胞が静止し、また切断された他方の細胞も微小流路図において静止している状態を示す。
図４（６）は、切断された２つの細胞（Cut cells）が微小流路２３に位置された状態を示す。このようにして、微小流路２３に置かれた２つの細胞はピペット（Pipette）によって吸い出される。

切断された直後は細胞は伸びた状態になっているが、約１分程度で球形に復元する。復元した状態を図４（７）に示す。この例はウシ卵子の細胞の例であるが、他の細胞についても同様の挙動となることが実験によって確認された。

図４に示す切断方法は細胞を画像として直接的に捉えて、細胞画像監視によって確実かつ容易に行うことができる。図５に画像処理方法を示す。図５（Ａ）はその画像処理ステップを示し、図５（Ｂ）は図５（Ａ）がやや不鮮明であるので、ポンチ画によって図５（Ａ）の内容を図示するものである。従って、図５（Ａ）（１）を見るに当って図５（Ｂ）（１）を参照するものとする。

図５（Ａ）（１）（以下、図５（１）と記載する。）は、マイクロ流体チップ１の微小流路２３および細胞吸引微小流路２７の背景画像を示す。
図５（２）に示すように、撮像手段８によって細胞の画像を取得する。次に図５（３）に示すように細胞の画像と背景画像の差分画像を取得する。
このような差分画像の取得は、画像についての２値化処理によって容易に行うことができる。

このようにして差分画像を取得して細胞吸引微小流路２７に細胞を吸引することを行うが、細胞吸引微小流路２７に位置させた細胞の一部の体積は、ピクルス数で換算することができる。従って、細胞吸引手段に用いるポンプの駆動を変えることで、細胞の吸引および切断を様式的にかつ自動的に処理することができる。図５（４）はこのようにして様式的にかつ自動的に細胞を切断する状態を示す。

このように、本実施例は微小流路２３を流過する細胞の流過状況および細胞吸引微小流路２７への細胞の吸引状態を画像として取得する細胞画像取得手段を設けている。更に、細胞画像取得手段によって画像取得された細胞を細胞吸引手段によって、細胞吸引微小流路２７に吸引させ、画面上で、細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態を形成し、細胞画像取得手段によって監視された吸引された細胞が画面上で、細胞保持状態が形成された時に、分岐部の開口部３１で、画面を監視して微小流路２３に切断液を流過させることによって切断されるようにしている。

従来のマニピュレータを用いた手法では、マニピュレータによる細胞の画像取得が難しく、また、マニピュレータの位置制御、切断刃位置のキャリブレーションなどの多くの処理手順を要したが、本実施例によると、流過液と共に流過していく細胞について撮像手段８によって直接的に画像として捉えることが可能となって吸引、分岐部保持および切断を画像監視することによって確実に行うことができる。そして、吸引、分岐部保持および切断、更には切断された細胞に撮像され、ビデオ１０（図１）に集録され、以後の観察に供されることになる。

本実施例は、透明なマイクロ流体チップ１を用いて、またその中を流れる流体を用いて細胞を切断するようにしており、この場合に画像処理を併用することによって細胞切断の自動高速化を実現している。

本実施例によって取得された切断された細胞は、クローン技術の発展に伴う同一遺伝子を持った実験動物の生産、家畜の品種改良、臓器などの再生医療応用など多方面に応用することができる。

本発明の実施例の全体構成を示す概略図。 本発明の実施例の一部詳細を示す平面断面図。 図２の正面断面図。 細胞切断方法を示す実験図。 画像処理方法を用いた切断方法を示す図。

符号の説明

１…マイクロ流体チップ、２，３，４…ポンプ、５，６，７…流体接続管、８…撮像装置（ＣＣＤ）、９…カメラ、１０…ビデオ、１２…画像表示装置、１３…画面、１４…制御装置、２１…チップ本体、２２…ガラス基板、２３…微小流路、２４…流体および細胞導入部（細胞導入部）、２６…流体および細胞導出部（細胞導出部）、２７…細胞吸引微小流路、２９…切断流流路、３１…開口部、３２…分岐部、１００…細胞切断装置。

Claims (3)

1. 細胞導入部と細胞導出部を有する透明性の微小流路を備え、該微小流路に前記細胞導入部から細胞を導入して流過液と共に前記微小流路を流過させるようにしたマイクロ流体チップであって、該マイクロ流体チップの前記微小流路を流過する細胞の細胞切断装置において、
   前記マイクロ流体チップには、前記微小流路から直角状方向に、前記微小流路に向って開口部が形成された分岐部を介して細胞吸引する透明性の細胞吸引微小流路が設けられ、
   前記微小流路を流過する細胞を前記細胞吸引微小流路に吸引する細胞吸引手段が設けられ、
   前記微小流路を流過する細胞の流過状況および前記細胞吸引微小流路への細胞の吸引状態を画像として取得する細胞画像取得手段が設けられ、
   前記細胞画像取得手段によって画像取得された細胞を前記細胞吸引手段によって、前記細胞吸引微小流路に吸引させ、細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態を形成し、前記細胞画像取得手段によって監視された前記吸引された細胞が前記細胞保持状態形成の時に、前記分岐部の開口部で、前記微小流路を切断液が流過されることによって切断されるようにした細胞切断手段が設けられること
   を特徴とする細胞切断装置。
2. 細胞導入部と細胞導出部を有する透明性の微小流路を備え、該微小流路に前記細胞導入部から細胞を導入して流過液と共に前記微小流路を流過させるようにしたマイクロ流体チップにおいて、
   前記微小流路から直角状方向に前記微小流路に向って開口部が形成された分岐部を介して細胞吸引する透明性の細胞吸引微小流路が設けられ、
   前記微小流路を流過する細胞を前記細胞吸引微小流路に吸引する細胞吸引手段が接続され、
   前記微小流路を流過する細胞が、前記細胞吸引手段によって前記細胞吸引微小流路に吸引されて前記分岐部で細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態が形成され、この状態形成時に前記微小流路に切断液が流過されて前記分岐部の開口部で、前記分岐部に保持する細胞を切断するようにした細胞切断手段が設けられること
   を特徴とするマイクロ流体チップ。
3. 細胞導入部と細胞導出部を有する透明性の微小流路を備え、該微小流路に前記細胞導入部から細胞を導入して流過液と共に前記微小流路を流過させるようにしたマイクロ流体チップであって、
   前記マイクロ流体チップには、前記微小流路から直角状方向に、前記微小流路に向って開口部が形成された分岐部を介して細胞吸引する透明性の細胞吸引微小流路が設けられ、
   前記微小流路を流過する細胞を前記細胞吸引微小流路に吸引する細胞吸引手段が設けられ、
   前記微小流路を流過する細胞の流過状況および前記細胞吸引微小流路への細胞の吸引状態を画像として取得する細胞画像取得手段が設けられ、
   前記マイクロ流体チップの前記微小流路を流過する細胞の細胞切断方法において、
   前記細胞画像取得手段によって画像取得された細胞を前記細胞吸引手段によって、前記細胞吸引微小流路に吸引させ、細胞の一部が細胞吸引微小流路側に位置し、細胞の他部が微小流路側に残留する分岐部細胞保持状態を形成し、前記細胞画像取得手段によって監視された前記吸引された細胞を、前記細胞保持状態形成の時に、前記分岐部の開口部で、前記微小流路に切断液を流過させることによって切断するようにしたこと
   を特徴とする細胞切断方法。

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