JP5118487B2 - iNOSを産生する病気に対する改善された治療薬剤 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年5月19日に提出された米国特許出願第10/849,768号の一部継続出願である。
本発明は、血液中の微粒子iNOSの除去または中和のための新規かつ有用な治療薬剤に関し、全身性炎症反応症候群(前敗血症)、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックに対する処置を提供する。
本発明に従って、患者の血液においてiNOSを産生する病気に関する新規かつ有用な治療薬剤を本明細書において提供する。
本発明の様々な局面は、先に記述した図面と共に考慮すべきであるその好ましい態様および実施例に関する以下の詳細な記述から発展するであろう。
1.凍結した低温保存細胞から開始してDLD-1-5B2細胞を培養において増殖させた;
2.iNOSの発現を細胞において誘導した;
3.誘導された細胞を回収した;および
4.誘導された細胞におけるiNOSを可溶性および微粒子分画に単離および分画した。
図7に説明したヒトiNOSの二つの分画を、敗血症の動物モデルとしてLPSプライミングマウスに及ぼすその効果に関して試験した。実験を開始する前に、可溶性のiNOSを、米国特許第6,531,578号において見いだされる抗iNOS MAbの一つまたは複数によってコーティングしたMAG-BEADSに対する選択的吸収によって可溶性分画から除去した。簡単に説明すると、ヤギ抗マウスIgG IgGに共有結合したMAG-BEADSを、イリノイ州ロックフォードのPierce Chemical Co.から購入した。iNOSに対して特異的なモノクローナル抗体を有するMAG-BEADSをローディングするために、クローン21C10-1D10、2A1-F8、1E8-B8、および2D2-B2からの分泌された抗iNOS MAbを含む培養上清を、浮遊させたMAG-BEADSの少量に個々に加えた。iNOSを含む可溶性の分画を1:2に希釈して、プールして洗浄し、浮遊させた抗iNOSコーティングMAG-BEADSに適用した。浮遊液を軽く攪拌しながら終夜インキュベートして、可溶性のiNOSをMAG-BEADS上にコーティングした抗iNOS MAbに結合させてから、浮遊液を含む試験管を磁気ラックに置いた。ビーズは全て、磁石に隣り合う試験管の側に集合した。得られたiNOS枯渇可溶性分画を移して、最終容積に希釈して保存可溶性分画と比較して1:5倍希釈を行った。保存iNOS可溶性分画の1:5倍希釈も同様に、滅菌生理食塩液において調製した。1:5倍希釈保存溶液分画の1:5 iNOS枯渇可溶性分画の、およびiNOS枯渇可溶性分画を作製するために用いたiNOSコーティングMAG-BEADSの試料を全て分析して、可溶性iNOSが除去されたか否かを決定して、可溶性iNOSが、MAG-BEADSに付着した抗iNOS MAbに結合したことを証明した。これらの分析から、90%より多い可溶性iNOSが、可溶性分画(iNOS枯渇可溶性分画)から除去されていること、およびiNOSが抗iNOS MAbをローディングしたMAG-BEADSに結合していることが示された。
LPSプライミングマウスにおける微粒子ヒトiNOSについて認められる殺マウス効果の阻害を調べるために、米国特許第6,531,578号において見いだされる抗ヒトiNOS MAbを用いた。実施例Iに記述される抗iNOS MAbによってコーティングしたMAG-BEADSに対する選択的吸収によって、微粒子iNOSを微粒子分画から除去した。図9は、微粒子分画から微粒子iNOSの選択的除去を確認するウェスタンイムノブロットを表す。実施例Iにおける可溶性分画の枯渇に関して記述した技法と類似の技法を用いた。簡単に説明すると、ヤギ抗マウスIgG IgGに共有的に連結したMAG-BEADSを、イリノイ州ロックフォードのPierce Chemical Companyから購入した。クローン21C10-1D10、2A1-F8、IE8-B8、および2D2-B2からの分泌された抗iNOS MAbを含む培養上清を、iNOSに対する抗体をビーズにローディングするために、浮遊させたMAG-BEADSの少量に個々に適用した。iNOSを含む微粒子分画を1:5倍希釈して、プールして洗浄し、浮遊させた抗iNOSコーティングMAG-BEADSに適用した。浮遊液を軽く攪拌しながら終夜インキュベートして、微粒子iNOSを、MAG-BEADSにコーティングした抗体に結合させた後、浮遊液を含む試験管を磁気ラックに置いた。ビーズは全て、磁石に隣り合う試験管の側に集合して、iNOS枯渇溶液(iNOS枯渇可溶性分画)を移して、最終容積に希釈して保存可溶性分画と比較して1:10倍希釈を行った。保存iNOS可溶性分画の1:10倍希釈も同様に、滅菌生理食塩液において調製した。iNOS枯渇微粒子分画の、保存微粒子分画の、およびiNOS枯渇微粒子分画を作製するために用いたiNOSローディングMAG-BEADSの試料を全て分析して、微粒子iNOSが除去されたか否かを決定した、図9。MAG-BEADSに付着した抗iNOS MAbに結合したiNOSを図10において決定した。これらの分析から、90%より高い微粒子iNOSが、微粒子分画(iNOS枯渇微粒子分画)から除去されていること、およびiNOSが抗iNOS MAbをローディングしたMAG-BEADSに結合していることが示された。
第二の方法を用いて、米国特許第6,531,578号の抗ヒトiNOS MAbが、敗血症モデルとしてのLPSプライミングマウスにおける微粒子ヒトiNOSについて認められた殺マウス効果を阻害するか否かを試験した。実施例IIにおいて行ったように、微粒子分画から微粒子iNOSを物理的に除去する代わりに、腹水に含まれる個々の抗iNOS MAbを、微粒子iNOSを含む微粒子分画の少量に直接加えた。微粒子iNOS分画を抗iNOS MAbに45分間結合させてから、材料をマウスにIV注射した。異なる抗iNOS MAb 5個を、微粒子ヒトiNOSの殺マウス効果の個々の阻害(中和)能に関して試験した。マウスの群を亜致死量のLPS(2 mg/kg重量のSigma Chemical Companyから得た大腸菌LPS血清型0111:B4)によって滅菌生理食塩液においてプライミングした。4時間後、全てのマウスが嗜眠性となり下痢を発症した。様々な群のマウスに、生理食塩液、1:10倍希釈の保存微粒子iNOS、または異なる抗iNOS MAb 5個中1個と共に45分間プレインキュベートした1:10倍希釈での保存微粒子iNOSを静脈内注射した。異なる抗iNOS MAb 5個のそれぞれを腹水の1:50倍希釈で用いた。結果は多様であり、これを図12に示す。滅菌生理食塩液において1:10倍希釈した保存微粒子iNOSの尾静脈注射を行ったLPSプライミングマウスは、7日間の実験の最初の24時間以内に死亡した。対照的に、生理食塩液を尾静脈注射したLPSプライミングマウス5匹中4匹が7日間生存した(P<0.02)。微粒子iNOSの致死効果を中和する抗iNOS MAbの能力は、試験されるMAbに依存して変化した。試験した異なる抗iNOS MAb 5個のうち、抗iNOS MAb 1E8-B8および24B10-2C10は、LPSプライミングマウスに対する微粒子iNOSの致死効果を中和するために最善であった。いずれの場合も、マウス5匹中3匹が7日間生存した(P<0.05)。他の抗iNOS MAb(2D2-B2および2A1-F8)も、マウスの死亡を停止させるために幾分有効であり、すなわち、これらの群のそれぞれにおいてマウス5匹中2匹が7日間生存した。一つの抗iNOS MAb(21C10-1D10)は、7日間生存したマウスが5匹中1匹のみに過ぎなかったことから、かなり有効性が低かった。以下のように結論された:(1)LPSプライミングは微粒子iNOSが致死的となるために必要である;(2)その致死性を中和するために、溶液から微粒子iNOSを物理的に除去することは必ずしも必要ではない;(3)抗iNOS MAbは、iNOSに結合することによって、または微粒子iNOSを含むタンパク質-タンパク質複合体に結合することによって、LPSプライミングマウスに及ぼす微粒子iNOSの致死効果を中和することができる;および(4)異なる抗iNOS MAbは、微粒子iNOS自身として、または一つもしくは複数のタンパク質と会合して、微粒子iNOSの致死性を中和するその個々の能力が多様である。
マウスの群に対して実施例I〜IIIにおいて用いた場合より低いLPSのプライミング用量およびより低い用量の微粒子iNOSを用いた。無関係なMAbを含む二つの腹水を対照として用いた。無関係な対照MAbには、インスリン様増殖因子-1に対して特異的なモノクローナル抗体(IGF-1:MAbクローン1F6-3H10)、およびヒトレプチンに対して特異的な一つのMAb(MAbクローン8F7-A10)が含まれた。マウスの群を、滅菌生理食塩液においてより低い亜致死量のLPS(1 mg/kg重量のSigma Chemical Companyから得た大腸菌LPS血清型0111:B4)によってプライミングした。4時間後、LPSプライミングマウスは全て嗜眠性となり、下痢を発症した。様々な群のマウスに、生理食塩液、1:20倍希釈の保存微粒子iNOS、または異なる5個の抗iNOS MAbの一つもしくは先に同定された無関係なMAb 2個の一つと共に45分間プレインキュベートした1:20倍希釈の保存微粒子iNOSのいずれかの尾静脈注射を行った。無関係なMAbおよび抗iNOS MAbをそれぞれ腹水の1:50倍希釈で用いた。結果は多様であり、図13に示す。より少ない量のプライミングLPSおよび微粒子iNOSをマウスにおいて用いることによって、マウス5匹中3匹が7日間生存した。図13に示すように、抗iNOS MAbクローン2A1-F8は、この群においてマウス5匹中5匹が7日間の実験終了まで生存したことから、微粒子iNOSの致死効果を中和するために最も良好であった。しかし、微粒子iNOSを、無関係な二つのMAbのいずれかを含む腹水と共にプレインキュベートしたところ、7日目での生存率は、iNOS微粒子分画と比較して低かった。このことは、(1)腹水中の一つまたは複数の成分が微粒子iNOSの致死効果を増加させること、または(2)LPSによってプライミングした後微粒子iNOSを投与した群における個々のマウスは、微粒子iNOSの致死効果に対する感受性がより低いことを示唆している。その結果、類似の条件で予想されるより多くのメンバーが生存した。後者の場合、1群あたりより多くのマウスを用いれば、この統計学的問題を解決するであろう。前者の場合、腹水は微粒子iNOSの致死性を幾分増幅したが、抗iNOS MAbが致死効果を中和する能力は過小評価されている。抗iNOS MAb 2A1-FAと共にプレインキュベートした微粒子iNOSを投与したマウスの群の生存を、無関係な二つのMAbの群のマウスの生存と比較したところ、統計学的に有意な差が見いだされ、言い換えれば抗IFG-1 MAbと共にプレインキュベートした群と比較した場合、P<0.05であり、抗レプチンMAbと共にプレインキュベートした群と比較した場合、P<0.02であった。本実施例において、(1)より低用量のLPSおよび微粒子iNOSは、マウスの7日間生存率を増加させる;(2)微粒子iNOSの致死効果を観察するためにはマウスをLPSによってプライミングしなければならない;(3)微粒子iNOSを抗iNOS MAbと共にプレインキュベートすると、マウスの7日間生存率を増加させる;および(4)腹水自身は、抗iNOS MAbに関して観察された有用な効果の原因ではない、という結論に達した。
ヒト化抗hiNOS MAbの特定の結合活性を決定するために、関連する同源のペプチドおよびhiNOSタンパク質に関して以下の試験を行った。
合成ペプチドに対する結合に関するヒト化抗hiNOS MAbの試験の他に、ヒト化1E8-B8、ヒト化2D10-2H9、およびヒト化24H9-1F3を、ミリグラム量を得るために増幅して拡大した。これらのヒト化MAbを、サンドイッチEIAフォーマットにおいてそのhiNOSタンパク質との結合能に関して試験した。このフォーマットにおいて、「捕獲」または「捕捉」Abを、マイクロタイタープレートのウェルの表面に固定して、これを用いてウェルに加えたhiNOSを結合させて、それによって固定した。「捕獲」または「捕捉」Abに結合した後、第二のAbをウェルの表面上に固定されたhiNOSタンパク質の異なる部位に結合させた。この特異的な場合において、結合した第二抗体は、三つのヒト化抗hiNOS MAb、すなわちヒト化1E8-B8、ヒト化2D10-2H9、またはヒト化24H9-1F3の一つであった。図15に示すように、キメラ抗hiNOS MAbの三つ全てがこのサンドイッチEIAフォーマットにおいて固定されたhiNOSタンパク質に結合した。さらに、これらのキメラ抗hiNOS MAbは、ヤギ抗ヒトIgG-HRP共役「検出」第三抗体を用いた場合に、固定されたhiNOSに結合している場合に限って検出された。この化学発光サンドイッチEIAにおいて、ヤギ抗マウスIgG-HRP共役体を「検出」第三抗体として用いる場合、バックグラウンドを超える化学発光は測定されなかった。このように、以下のように結論された:(1)ヒト化抗hiNOS MAbは、hiNOSタンパク質上のそれぞれのエピトープに結合することができる;(2)当初のマウス結合部位は、ヒトIgG分子に融合されている;および(3)抗マウスIgG-HRP共役抗体は、これらのヒト化抗hiNOS MAbに結合しない。
親マウス抗hiNOS MAbに関して実施例Iにおいて既に記述したように、キメラマウス/ヒト抗hiNOS MAb 1E8-B8が、サイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞から得た微粒子分画からhiNOSを除去または枯渇できるか否かを評価した。実施例IおよびIIのマウス敗血症モデルは、マウスをプライミングするためにLPSの亜致死量を利用して、4時間後に、溶解して遠心によって分画されているサイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞の微粒子分画の浮遊液をIV注射した。細胞溶解に関して異なる二つの方法、すなわち2回の急速凍結/解凍サイクル(細胞溶解法A)または低張ショック(細胞溶解法B)を用いた。これら二つの方法のいずれかによる細胞溶解後、細胞溶解物を遠心によって分画した。遠心法1において、細胞溶解物を高速(16,000×g)で遠心して、高速微粒子分画または沈降物、および高速上清分画を得た。遠心法2において、細胞溶解物を低速(300×g)で遠心して、低速微粒子分画または沈降物を得た。次に、低速上清を高速で遠心して(16,000×g)高速微粒子分画および高速上清を産生した。いずれの技法によっても、実施例Iのマウス敗血症モデルにおいて殺マウス活性を含む微粒子分画が得られた。遠心法2を用いることによって、致死活性は、低速微粒子分画または沈降物に限って見いだされた。
ヒト化キメラ抗hiNOS MAbがサイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画に含まれる致死活性を中和できるか否かを、一連のインビボマウス実験において評価した。これらの実験は、親マウス抗hiNOS MAbに関して既に記述された実験、すなわち以下の例外を除き、実施例IIIおよびIVと類似であった:(1)マウス抗hiNOS MAbは、ヒト抗hiNOS MAb 1E8-B8および24H9-1F3に置換されていること;ならびに(2)MAbおよび微粒子分画はIV注射の直前に混合して、注射前に45分間プレインキュベートしなかったこと。これらの二つのヒト化抗hiNOS MAbの中和能、およびそれによってサイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞から得たhiNOS含有微粒子分画(実施例VIIの遠心法1)の致死的なチャレンジからLPSプライミングマウスを保護する能力を試験した(図16)。これらの実験において、これらの二つのヒト化抗hiNOS MAbの中和能(保護作用)を、異なる三つの用量、1.25 ng/g体重、12.5 ng/g体重、および125 ng/g体重で試験した。保護効果は、用量依存的に見いだされた。これらの実験において用いた低用量において、MAb処置群と無処置群のあいだに統計学的有意差を観察しなかったが、保護する傾向が見いだされた(図16)。しかし、試験したヒト化1E8-B8の最高濃度では、MAb処置群と無処置群のあいだに統計学的有意差が見いだされた(スチューデントのT-検定によりP<0.05)。同様に、ヒト化抗hiNOS MAb 24H9-1F3の保護効果も、無処置群の動物と比較して異なる二つの最高用量で統計学的に異なることが見いだされた。このMAbを12.5 ng/g体重で用いた場合、動物5匹全てが生存し(P<0.01)、125 ng/g体重で用いた場合、動物5匹中4匹が生存した(P<0.05)。これらの知見は、キメラマウス/ヒトIgG1分子に遺伝子操作される前の親マウス抗hiNOS MAbを用いて行った知見と類似である。これらの結果は、これらのMAbが、微粒子hiNOSに結合して、それによってその致死効果を発揮するために感受性を有する細胞にそれが結合することを立体的に妨害することによって、サイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画に含まれる致死活性を用量依存的に中和することができることをさらに確認した。
サイトカイン誘発DLD-1-5B2細胞の微粒子分画において、hiNOSと会合した如何なるタンパク質も同定するために実験を行った。抗hiNOS MAbをMag-ビーズ上に固定して、微粒子hiNOSおよび微粒子分画における他のタンパク質と会合したhiNOSを結合させた。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞から得た微粒子分画を、Mag-ビーズ上の固定された抗hiNOS MAb 1E8-B8によって処置した後、Mag-ビーズを洗浄して未結合材料を除去して、タンパク質から固定抗体を取り除いた。単離されたタンパク質を陰性ゲルPAGEによって分離して、タンパク質のバンドをクーマシーブリリアントブルーによって染色した;およびゲルを脱染色してタンパク質バンドを可視化した。非誘導DLD-1-5B2細胞からのゲルにおいて認められたバンドとは異なるタンパク質のバンドをゲルから切り出した。個々のバンドに含まれるタンパク質をトリプシンによって消化して、トリプシン断片を産生した。ペプチド断片を単離して、その個々のアミノ酸配列を決定するために分析するためにLC/MS/MSに供した。LC/MS/MS分析によって決定されたアミノ酸配列をGeneBankデータベースに含まれる公知の全てのタンパク質配列と比較した。多数のトリプシンペプチド断片とアミノ酸配列相同性を有して、およびトリプシンペプチド断片によって含まれるその全体的なアミノ酸配列の統計学的に有意な部分を有するタンパク質を同定して表にまとめた(表1)。例えば、表1に記述するように、PDIは、ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体(プロリル4-ヒドロキシラーゼβサブユニットとしても知られる)である。異なる10個のトリプシンペプチドのアミノ酸配列は、このタンパク質のアミノ酸配列の様々な領域と正確にマッチして、全体的な配列の23.0%を含んだ。個々のペプチド断片のラダースコアは、58.0〜95.9の範囲であり、この特異的タンパク質がこの試料に存在する予測の相対的信頼レベルは、80%より大きい。このように、質量分析結果は、このタンパク質がPAGEゲルから切り出したバンドに含まれることを示している。このタンパク質のGeneBankアクセッション番号は、gi/2507460である。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞の微粒子分画におけるhiNOSまたはhiNOS断片に会合して同定された他のヒトタンパク質13個に関する同じ情報を表1に示す。
微粒子分画に含まれるhiNOSが細胞膜、小胞、または膜断片のような他の構造に存在するか否かを決定するために、免疫蛍光染色実験を行った。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞を、多数回の凍結/解凍サイクルに関して起こりうるタンパク質の変性を回避するために、細胞膜を破壊して細胞成分、細胞成分、および水疱形成小胞を含む膜構造を溶液に放出するために、実施例VIIの低張ショック(細胞溶解法B)によって溶解した。溶解した細胞を含む溶液を低速遠心(300×g)にまず供して、低速微粒子沈降物を得た。次に、低速上清を高速遠心(16,000×g)に供して、高速微粒子沈降物および高速上清の双方を産生した。これらの三つの分画を、LPSプライミングマウスにおけるその殺マウス活性に関して調べたところ、致死活性は低速微粒子分画に限って見いだされた。高速沈降物も高速上清も、LPSプライミングマウスに静脈内注射した場合、致死的ではなかった。低速微粒子分画を顕微鏡下で調べたところ、二つのタイプの構造が観察された。一つは、「幽霊」細胞の細胞膜、すなわち破壊された細胞の残遺物であり、もう一つは、宙に浮いた連結したビーズのように何度も見える小胞であった(図18)。この調製物を、hiNOSの位置を免疫学的に特定するために米国特許第6,531,578号の抗hiNOS MAbを用いて免疫蛍光によって染色したところ、小胞に限って強い蛍光染色が観察された。hiNOSのIFA染色は、「幽霊」細胞にも、他の任意の構造にも観察されなかった。これらの小胞(アポトーシス体)の大きさおよび認められた抗hiNOS MAbによるその強いIFA染色は、ヒト敗血症患者の血液において観察されたものと同一ではないが、非常に類似である(図1〜6)。これらの調製物を、タンパク質のSDS-PAGE分離後にウェスタンブロットによって分析すると(図19)、高速上清は、無傷のhiNOSを含むことが見いだされた。低速微粒子分画は、無傷のhiNOSの少量を含んだが、これらの実験において用いられる抗hiNOS MAb 2D2-B2に結合する二つのhiNOS断片を含んだ(図19)。高速上清は、実施例Iの動物敗血症モデルにおいてLPSプライミングマウスを殺さないが、低速微粒子分画はLPSプライミングマウスに対して致死的であることが繰り返し見いだされた。
図16に表示した実施例VIIIのタイプのさらなる実験において、サイトカイン誘導および溶解したDLD-1-5B2細胞から得た上清分画の致死効果を、実施例Iのインビボマウス敗血症モデルにおいて調べて、殺細胞活性は見いだされなかった。一連の実験において、上清分画が、LPSの亜致死量をプライミングしたマウスを保護できるか否かを探求した。この一連の実験において、マウスを既に記述されたようにLPSによってプライミングして、4時間後に異なる三つの処置の一つをチャレンジした:(1群、N=5)、サイトカイン誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画(実施例VIIの方法A)をマウスを全て殺す用量(LD100)で;(2群、N=5)群#1と同様の用量の微粒子分画プラスサイトカイン誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞(実施例VIIの方法A)からの上清の4倍多い量の同時投与;ならびに(群3、N=5)、サイトカイン誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞からの上清の4倍多い量を微粒子分画の投与の30分前に投与する。これらの実験において、群1および2の全ての動物が死亡した。しかし、群3における動物は全て生存した(スチューデントのT-検定によりP<0.001)。このように、上清分画の前投与は、微粒子分画の致死的チャレンジに対して保護的であった。非致死上清分画は、微粒子分画の投与に起因する致死的細胞事象を遮断した。このように、上清分画は致死的材料の細胞への結合を遮断して、それによって微粒子分画の致死量から動物を保護した。
Claims (4)
- 哺乳類対象の血液中にiNOSを産生する前記哺乳類対象の病気を治療するための治療用生体材料であって、前記病気が全身性炎症反応症候群及び敗血症からなる群から選択され:
ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体;
を含むことを特徴とする治療用生体材料。 - 請求項1に記載の治療用生体材料において、前記ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体が、hiNOS型によって引き起こされた細胞効果を中和するモノクローナル抗体を含み、前記hiNOS型が粒状のhiNOSと、粒状のhiNOSの断片と、小胞結合hiNOSと、粒状のhiNOSの小胞結合断片と、別のタンパク質と結合した粒状のhiNOSと、別のタンパク質と結合した粒状のhiNOSの断片とを含む群から選択されることを特徴とする治療用生体材料。
- 請求項2に記載の治療用生体材料において、前記モノクローナル抗体が、マウス抗hiNOSモノクローナル抗体と、マウス−ヒトキメラ抗hiNOSモノクローナル抗体と、ヒト化抗hiNOSモノクローナル抗体と、ヒト抗hiNOSモノクローナル抗体とを含む群から選択されることを特徴とする治療用生体材料。
- 請求項1に記載の治療用生体材料が、ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体でコーティングされた磁性ビーズを含むことを特徴とする治療用生体材料。
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