JP2008524114A

JP2008524114A - ｉＮＯＳを産生する病気に対する改善された治療薬剤

Info

Publication number: JP2008524114A
Application number: JP2007527523A
Authority: JP
Inventors: ロバートジェイ．ウェバー; ダグラスエス．ウェバー; セルマエイチ．ディクソン
Original assignee: ロバートジェイ．ウェバー; ダグラスエス．ウェバー; セルマエイチ．ディクソン
Priority date: 2004-05-19
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2025-05-19
Also published as: WO2005120569A3; JP5118487B2; AU2005251698A1; WO2005120569A2; US20050281826A1; CA2566651A1

Abstract

哺乳動物対象の血液においてiNOSを除去または中和する治療薬剤。薬剤は、抗iNOSモノクローナル抗体またはiNOS結合実体の形であってもよい。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2004年5月19日に提出された米国特許出願第10/849,768号の一部継続出願である。

発明の背景
本発明は、血液中の微粒子iNOSの除去または中和のための新規かつ有用な治療薬剤に関し、全身性炎症反応症候群（前敗血症）、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックに対する処置を提供する。

酸化窒素シンターゼ（NOS）は、ヒトにおいて見いだされている酵素である。NOSの三つのアイソフォームが同定されている。体内において、nNOSおよびeNOSは、それらが見いだされる細胞において構成的に発現されている。しかし、iNOSは、構成的に発現されず、多くのサイトカイン、リポ多糖類（LPS）、および炎症反応の他のメディエータによって誘導されることが知られている。具体的には、iNOSは、特定の病的疾患状態を示すことに関連している。特に、血液中のiNOSは、ヒトにおける敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショック状態の発症を予告する。敗血症は、米国だけでも年間200,000人を超える人が死亡すると推定される。敗血症を発症する人の中で、この病態生理学のために30％が死亡する。

ヒトeNOSまたはnNOSと交叉反応せずに、ヒトにおけるiNOSの認識に対して特異的であるモノクローナル抗体が記述されている米国特許第6,531,578号を参照する。米国特許第6,531,578号は、本出願にその全内容物が参照により組み入れられる。そのようなモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイは、試験を終了して結果を得るまでに数日を要する先行技術の試験と比較して、非常に短期間で敗血症の存在を検出することができる。敗血症が、その存在の認識後に積極的に処置されれば、敗血症に罹患した人が生存する見込みはかなり良くなる。敗血症の処置は、公知の抗菌、抗真菌、および抗ウイルス処置に限定されている。そのような処置は、ヒトにおいて敗血症が存在することが速やかに認識された場合であっても限られた成功しか収めていない。

「Cloning and Characterization of Inducible Nitric Oxide Synthase from Mouse Macrophages.」, Xie et al., Science, 256:225〜228(1992)と題する論文は、iNOSのクローニングおよび単離を報告した。iNOS酵素は、可溶性の細胞質タンパク質として記述された。

その後、「Nitric Oxide : Novel Biology with Clinical Relevance」, Billiar, Ann Surg, 221#4:339〜349(1995)；「Nitric Oxide : Pathophysiological Mechanisms」, Gross et al., Annu Rev Physiol, 57:737〜769(1995)；「The Cell Wall Components Peptidoglycan and Lipoteichoic Acid from Staphylococcus Aureus Act in Synergy to Cause Shock and Multiple Organ Failure」, De Kimpe et al, Proc Natl Acad Sci USA, 92:10359〜10363(1995)；「Mechanism of Gram-Positive Shock : Identification of Peptidoglycan and Lipoteichoic Acid Moieties Essential in the Induction of Nitric Oxide Synthase, Shock, and Multiple Organ Failure」, Kengatharan et al, J Exp Med, 188#2:305〜315(1998)；および「Induction of Nitric Oxide Synthase in RAW 264.7 Macrophages by Lipoteichoic Acid from Staphylococcus aureus : Involvement of Protein Kinase C- and Nuclear Factor-κB-Dependent Mechanisms」, Kuo et al, J Biomed Sci, 10:136〜145(2003)と題する論文が、グラム陰性菌のリポ多糖類（LPS）の細胞壁成分、グラム陽性菌のリポテイコ酸およびペプチドグリカン細胞壁成分、真菌、ならびにウイルスが、広範な細胞タイプにおいてインビボおよびインビトロでiNOS発現を誘導することができるという事実を指摘している。

「Mechanisms Of Suppression Of Macrophage Nitric Oxide Release By Transforming Growth Factor Beta」, Vodovotz et al, J Exp Med, 178#2:605〜613(1993)；「Vesicle Membrane Association Of Nitric Oxide Synthase In Primary Mouse Macrophages」, Vodovotz et al, J Immunol, 154#6:2914〜2925(1995)；および「Bladder Instillation And Intraperitoneal Injection Of Escherichia coli Lipopolysaccharide Up-Regulate Cytokines And iNOS In Rat Urinary Bladder」, Olsson et al, J Pharmacol Exp Ther, 284#3:1203〜1208(1998)と題する論文は、マウスマクロファージにおけるiNOSの発見以来、その細胞内での位置が、サイトゾルのみではないことを示した。実際に、小胞会合iNOSが認識されている。

「Caveolin-1 Down-Regulates Inducible Nitric Oxide Synthase Via The Proteasome Pathway In Human Colon Carcinoma Cells」, Felley-Bosco E et al, Proc Natl Acad Sci USA, 97#26:14334〜14339(2000)；「Macrophage NitricOxide Synthase Associates With Cortical Actin But Is Not Recruited To Phagosomes」, Infect Immun, Webb JL et al, 69#10:6391〜6400(2001)；「Epithelial Inducible Nitric-Oxide Synthase Is An Apical EBP50-Binding Protein That Directs Vectorial Nitric Oxide Output」, Glynne PA et al, J Biol Chem, 277#36:33132〜33138(2002)；「Caveolin-1-Mediated Post-Transcriptional Regulation Of Inducible Nitric Oxide Synthase In Human Colon Carcinoma Cells」, Felley-Bosco E, Biol Res, 35#2:169〜176(2002)；「Heat Shock Protein 90 As An Endogeneous Protein Enhancer Of Inducible Nitric-Oxide Synthase」, Yoshide M et al, J Biol Chem, 278#38:36953〜36958(2003)；「Protein Interactions With Nitric Oxide Synthase : Controlling The Right Time, The Right Place, and The Right Amount Of Nitric Oxide」, Kone BC et al, Am J Physiol Renal Physiol, 285#2:F178〜F190(2003)；および「Protein-Protein Interactions Involving Inducible Nitric Oxide Synthase」, Zhang W et al., Acta Physiol Scand, 179#2:137〜142(1997)と題する論文はまた、誘導された細胞を溶解して、遠心によって分画した場合に、iNOSが微粒子分画に見いだされることを報告した。

誘導型NOS（iNOS）はまた、タンパク質-タンパク質相互作用を通して他の多くのタンパク質と会合して見いだされている。そのようなタンパク質-タンパク質相互作用（iNOSと会合する他のタンパク質）には、皮質アクチン、EBP 50（エズリン-レジキシン-モエシン-結合燐タンパク質50）、カビオリン-1、Hsp90（熱ショックタンパク質90）、カリリン、NAP110（NOS-関連タンパク質1.10 kd）、およびRac-GTPアーゼが含まれる。これらのタンパク質-タンパク質相互作用により、細胞内の特異的領域または構造にiNOSが局在することが見いだされている。細胞を溶解して遠心によって分画すると、小胞の会合を通してまたはタンパク質-タンパク質相互作用によって、おそらく可溶性のiNOSタンパク質の一部が微粒子分画に分配されることが示されている。

米国特許出願第09/628,585号は、患者の血液の液体部分、すなわち血漿において遊離で見いだされるiNOSが、そのような患者が敗血症を有する、または24〜48時間以内に敗血症を発症するであろうことを示すという事実を明らかにした。非常に感度のよい化学発光サンドイッチ酵素イムノアッセイ（EIA）を用いて、そのような血漿iNOSを、敗血症の発症に関する非常に特異的な生化学マーカーとして用いることができる。先に参照した化学発光サンドイッチ（EIA）は、先に言及された米国特許第6,531,578号において開示された抗iNOS抗体のパネルの抗iNOSモノクローナル抗体（MAb）の二つに基づいている。

患者の血液中でのiNOSの検出は通常の治療による患者の処置において大きく役立つが、改善された治療があれば、医学の分野において顕著な進歩であろう。

発明の簡単な概要
本発明に従って、患者の血液においてiNOSを産生する病気に関する新規かつ有用な治療薬剤を本明細書において提供する。

本発明の治療薬剤は、eNOSまたはnNOSと交叉反応しない、ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体の形であってもよい。そのようなモノクローナル抗体は、マウス抗hiNOSモノクローナル抗体またはマウス-ヒトキメラ抗hiNOSモノクローナル抗体を構成してもよい。この点において、認識されるiNOSは、iNOSの微粒子分画を含むと考えられる。そのようなモノクローナル抗体は、膜会合微粒子iNOS、小胞会合微粒子iNOS、または少なくとも一つの他のタンパク質と会合した微粒子iNOSにおいて見いだされる可能性がある微粒子iNOSを中和する可能性がある。患者の血液中のiNOSの産生に最も通常関連した病気は、全身性炎症反応症候群（前敗血症）、敗血症、重度の敗血症、または敗血症性ショックである。その上、モノクローナル抗体は、マウス抗iNOSモノクローナル抗体、マウス-ヒトキメラ抗iNOSモノクローナル抗体、ヒト化抗iNOSモノクローナル抗体、またはヒト抗iNOSモノクローナル抗体であってもよい。同様に、本発明の治療的処置は、モノクローナル抗体との会合によって、哺乳動物対象の血液からiNOSを除去することができる。そのような場合、この結果を得るための手段も同様に本発明において提供される。そのような手段は、eNOSまたはnNOSと交叉反応することなくヒトiNOSに結合するモノクローナル抗体によってコーティングされた装置の形であってもよい。

抗iNOSモノクローナル抗体を治療薬剤として用いる代わりに、iNOS結合実体も同様に用いてもよい。例えば、この点において、iNOS結合アプタマー、オリゴヌクレオチド、人工抗体、ファージディスプレイ抗体、ファージディスプレイ抗体断片、および一本鎖モノクローナル抗体を用いてもよい。そのような治療薬剤は動物試験が行われて、哺乳動物患者の血液においてiNOSを誘導する疾病または病気に関する正の処置として役立つと考えられる。

iNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための新規および有用な治療薬剤が、本明細書において先に記述されていることは明らかであろう。

したがって、本発明の目的は、iNOSを産生する対象における病気を処置するための安全かつ有効である治療薬剤を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、iNOSを産生する哺乳動物対象における疾病を処置するための、患者の血液のiNOSを中和するまたは除去する治療薬剤を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、iNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための、公知の生化学および免疫学技術を用いて容易に製造される治療薬剤を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、iNOS産生哺乳動物対象における病気を処置するための、様々な型のiNOSの細胞効果を中和する治療薬剤を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、iNOS産生哺乳動物対象における病気を処置するための、様々な型のiNOSの細胞結合を阻害する治療薬剤を提供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は、hiNOS産生哺乳動物対象における病気を処置するための、hiNOSの型の細胞結合を阻害する治療薬剤を提供することである。

本発明のさらなる目的は、血液中のiNOS産生哺乳動物対象における病気を処置するための、生命を救うことができる治療薬剤を提供することである。

本発明は、以下の明細書に明らかとなるように、他の目的、ならびにその特定の特色および特徴に関する他の長所を有する。

本発明のよりよい理解のために、既に記述された図面と共に考慮すべきであるその好ましい態様に関する以下の詳細な説明を参照する。

発明の好ましい態様の詳細な説明
本発明の様々な局面は、先に記述した図面と共に考慮すべきであるその好ましい態様および実施例に関する以下の詳細な記述から発展するであろう。

臨床試験において、340人より多いヒト被験者を登録して、1,200個を超える血液試料を採取して分析し、米国特許第6,531,578号および米国特許出願第09/628,585号に記述のiNOSに関する化学発光EIAが、敗血症の発症を予知して病態の経過をモニターするか否かを決定した。遊離のiNOS（可溶性iNOS）が血液試料に存在することが見いだされた。同様に、微粒子iNOS、膜会合型微粒子iNOS、小胞会合微粒子iNOS、またはもう一つのタンパク質と会合した（タンパク質-タンパク質相互作用によって）微粒子iNOSが、いくつかの血液試料に存在した。そのような微粒子iNOSは如何なる細胞にも付着しなかった。

図1〜6は、末梢血単核球（PBMC）および細胞に会合していない小胞／球体にヒトiNOSが存在することを示した。例えば、図1は、ヒトiNOSを含むPBMC細胞を示す。iNOS含有PBMC細胞は、非染色細胞のバックグラウンドに存在する。このPBMC細胞における免疫染色は、正常な細胞における細胞質タンパク質の典型的な分布から予想されるように、均一に分布しないことが観察される可能性がある。免疫染色材料は、球状で、細胞質の辺縁（矢印の先）に存在する。核の領域はiNOSを含まず、細胞における核の上下の細胞質の薄い層の結果として蒼白に見える。同様に、細胞に会合していないが、同様にヒトiNOSを含む一つの小胞が認められる（矢印全体）。強く蛍光を発する一つの小胞は、アポトーシス体である可能性があると考えられる。

図2に戻ると、そのそれぞれがヒトiNOSに関して免疫染色される多くの細胞が示される。同様に、ヒトiNOSに関して免疫染色される多数の小さい余分な細胞小胞（アポトーシス体）も目に見える。おそらくアポトーシス体は細胞の端部に存在する小さい白い点として存在する（矢印全体）。各細胞の核は、細胞の非蛍光染色部分（暗い領域）に存在する。同様に、他の非反応細胞がバックグラウンドに存在する。

図3は、PBMCの比較的オープンな視野を示す。おそらくアポトーシス体である小さい余分の細胞小胞は白い点として見え、細胞から離れている（矢印）。抗iNOSモノクローナル抗体2A1-F8によるiNOSの免疫染色はこれらの細胞において顆粒状に見える。抗iNOSモノクローナル抗体2A1-F8は米国特許第6,531,578号に開示されている。

図4は、パネルA、B、およびCにおいて球体および細胞の一般的な集合体の写真3枚を示している。パネルAをUV光において写真を撮影して、集合体として存在する球体の免疫染色が明らかとなる。細胞のいくつかは小さく見え、収縮しており、IFAによるiNOS免疫染色に関して陰性である。矢印は集合体における免疫染色球体に隣接して見える。

図4のパネルBを位相差光において写真撮影して、この場合も試料における多数の余分の細胞球体の存在（矢印）が明らかとなる。無傷の細胞は、位相差光学に起因する白色の輪を有する暗い黒色体として示される。

最後に、図4のパネルCにおいて、パネルAおよびBにおいて示した同じ領域を、UV光と位相差光学との組み合わせによって写真撮影した。球体の白色の集合体（矢印）は、抗iNOSモノクローナル抗体2A1-F8による免疫染色を示し、余分の細胞球体がiNOSを含むことを証明している。

図5を参照して、ヒトiNOSに関して免疫染色した単一のPBMCは、「水疱形成」の進行中である。言い換えれば、PBMC細胞はiNOSを含む球体と会合した部分的に破壊された細胞質膜を有する。前アポトーシス体またはアポトーシス「水疱」は、ヒトiNOSに関して免疫染色される。

図6は、壊変中の単一のPBMC細胞を示し、ヒトiNOSに関して免疫染色される材料および小胞を放出する。細胞膜は破壊され、iNOS含有球体／小胞が散乱している。

図1〜6は、インビボでのアポトーシス体の存在に関する証拠を表す。微粒子または小胞会合iNOSは全て、敗血症、重度の敗血症、または敗血症性ショックに罹患した患者からの試料に限って見いだされた。図1〜6において明らかであるように、ヒトの血流中のアポトーシス体の存在は、敗血症の存在の指標、または敗血症の病態の重症度の指標である可能性がある。

可溶性iNOSおよび微粒子または小胞会合iNOSは、重篤な患者の血流に限って認められることから、これらの型のiNOSによる全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、または敗血症性ショックの病態に対する寄与を調べた。言い換えれば、可溶性または微粒子iNOSの存在が、敗血症または前敗血症を有する患者にとって有害であるという理論が立てられた。その結果、敗血症または前敗血症状態の患者の血流からiNOSを除去または中和すれば、そのような病気に関して可能性がある治療的処置となる可能性があると理論的に考えられる可能性がある。

そのような仮説を確認する可能性があるデータを収集するために、マウス敗血症モデルを一連の実験に用いた。そのような試験を用いて、可溶性または微粒子iNOSが全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、または敗血症性ショックの病理に寄与するか否かを決定した。さらに、可溶性または微粒子iNOSの除去または中和が敗血症の病理を減弱させるために役立つか否かを決定した。

先に述べたように、DLD-1-5B2細胞を、サイトカインの混合物に加えることによってヒトiNOSを産生するように誘導することができる。

「Transcriptional Regulation of Human Inducible Nitric Oxide Synthase Gene In An Intestinal Epithelial Cell Line」, Linn et al, Am J Physiol, 272:G1499〜G1508(1997)と題する記事において、ヒトiNOSを産生するようにDLD-1細胞を誘導することができることが示された。同様に、誘導された細胞を溶解した場合、二つのタイプのiNOS、すなわち可溶性iNOS分画および微粒子iNOS分画を遠心によって単離することができる。図7は、誘導されたDLD-1-5B2（DLD-1のクローン）細胞のプールした可溶性分画が、予想分子量131 kDでiNOS（レーン2および3）を含むことを示すウェスタンイムノブロットを示す。同様に、131 kDでのバンドによって示されるように、誘導されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画も同様にiNOSを含む（レーン4および5）。レーン6は、iNOS標準物質を含み、レーン1および7は、表記の分子量の分子量マーカーとして用いられる標準物質タンパク質を含む。誘導されたDLD-1-5B2細胞培養物からのiNOSの可溶性および微粒子分画を産生および単離するために、以下の段階に従った：
1．凍結した低温保存細胞から開始してDLD-1-5B2細胞を培養において増殖させた；
2．iNOSの発現を細胞において誘導した；
3．誘導された細胞を回収した；および
4．誘導された細胞におけるiNOSを可溶性および微粒子分画に単離および分画した。

DLD-1-5B2細胞を増殖させて拡大するために、価値のない（vile）凍結保存細胞を得て解凍した。細胞を培養する前に、トリパンブルー排除によって％生存率を計算し、これは75％より大きくなければならない。細胞を、DLD-1-5B2培地（PEN/Streptを添加した90％DMEMおよび10％FBS）を含むT-75フラスコに移した。細胞を空気中に5％CO₂を含む湿潤大気中で37℃でインキュベートした。細胞がほぼコンフルエントになるまで培地を2日毎に交換した。そのような技法後、細胞培養物を分割するか、または誘導するまで培地を毎日交換した。DLD-1-5B2細胞が対数増殖期においてほぼコンフルエンスとなった場合、細胞をさらなるT-75フラスコに1：6〜1：10に分割した。

8.33 ng/ml rhIFNγ、3.3 ng/ml rhTNFα、および3.3 ng/ml rhIL-1βの混合物を用いてDLD-1-5B2細胞を、ヒトiNOSを発現するように18時間誘導した。iNOSの誘導の際、NO産生の最終産物である亜硝酸塩および硝酸塩の量の増加をモニターして、誘導された細胞によってiNOSが産生されているか否かを決定した。グリース反応を用いて、培養培地に含まれる亜硝酸塩の量、および酵素硝酸レダクターゼによって硝酸塩から亜硝酸塩への酵素的変換後の硝酸塩の量をアッセイした。

誘導後18時間目に、DLD-1-5B2細胞を回収した。誘導された細胞の回収を最大限にするために、誘導されたフラスコからの培養液全てを50 ml滅菌遠心管に移して合わせ、「フローター」細胞を回収した。それぞれの試験管を遠心して、消費された培地を捨てた。「フローター」細胞沈降物を、PBSによる洗浄の準備ができるまで残しておいた。T-75フラスコを全てPBSによって洗浄して、消費された培地およびその血清成分を除去した。トリプシン／EDTAの混合物を細胞と共に5〜10分間37℃でインキュベートして、それぞれのフラスコの表面から細胞を浮遊させた。細胞をプラスチック表面から遊離させた後、熱不活化FBSをそれぞれのフラスコに加えて、トリプシン反応を停止させた。次に細胞をスクリューキャップを備えた遠心管に移して、遠心によって回収した。次に、「フローター」細胞をトリプシン処置した細胞沈降物と合わせた。プールした誘導された細胞を滅菌PBSによって3回洗浄して、毎回の洗浄後に遠心によって回収した。洗浄した細胞を少量の滅菌PBSを含む滅菌管に移して、iNOSの単離および分画のために処理する準備ができるまで-20℃で保存した。

誘導DLD-1-5B2細胞によって産生されたiNOSを、可溶性および微粒子分画に分画した。予め回収して凍結した誘導DLD-1-5B2細胞を氷水浴において試験管の全内容物が融解するまで解凍した。解凍の際に時折ボルテックスによって攪拌することによってプロセスを補助した。細胞はドライアイスを用いて2回の急速凍結／解凍プロセスによって溶解した。溶解した細胞を16,000×gで4℃で30分間遠心して、微粒子分画を沈降させた。可溶性iNOSを含む上清を移して氷中で保存した。沈降物を少量の氷冷滅菌PBSにおいて浮遊させて、ボルテックスミキサーによって激しく攪拌して、16,000×gで4℃で30分間遠心して、微粒子分画を沈降させた。得られた上清を第一の上清と共にプールした。そのような上清溶液は単離されたiNOS可溶性分画を含んだ。次に、iNOSの微粒子分画を-20℃で保存するか、または使用した。iNOS可溶性分画は、最終濃度2％の正常ウマ血清を加えることによる安定化を必要とし、その後-20℃で凍結状態で保存した。

一般的に、凍結保存細胞を培養することによって再開させると、それらは湿潤5％CO₂／95％空気を含む大気において37℃で数日後に対数増殖期に達する。DLD-1-5B2細胞が対数増殖期に入った後、最大のiNOS発現のために毎日のモニタリングおよび栄養補給サイクルが必要であり、DLD-1-5B2細胞を、コンフルエンスの2日後、三つのサイトカイン（IFNγ、TNFα、およびIL-1β）の混合物によって誘導して、誘導開始後18時間目に回収しなければならない。細胞培養の開始から第一の回収を終了するまでに約11日間を要し、その後誘導および回収を毎週行った。DLD-1細胞はATCC（CAT.#CCL221）から入手可能である。DLD-1-5B2細胞株は、標準的なクローニング技術を用いてDLD-1細胞をサブクローニングすることによって誘導した。

可溶性iNOS分画および微粒子iNOS分画の効果を、敗血症モデルとしてLPSの亜致死量をプライミングしたマウスにおいて調べた。これは、マウスの生存率に及ぼすiNOSタンパク質の異なる二つの分画の効果を決定するために行った。これらの実験の結果からiNOSタンパク質がマウスにおいて死をシグナル伝達するために機能を有するという発見が得られた。いくつかの実験を行って、iNOSの可溶性分画よりむしろ膜会合iNOSが、この敗血症モデルにおいて死を引き起こすために役割を有することが発見された。同様に、米国特許第6,531,578号において認められる抗体は、リポ多糖類（LPS）の亜致死量および微粒子iNOSによって引き起こされた死からマウスを保護することも発見された。

同様に、マウスのLPSプライミングは、微粒子iNOSの効果を発揮するために必要であることが実験から見いだされた。同様に、可溶性iNOSを含まない微粒子iNOS分画をLPSプライミングマウスに投与すると、ほぼ即死を引き起こした。微粒子iNOS自身、または一つもしくは複数のタンパク質と会合させることが、LPSプライミングマウスにおいて観察された致死効果の原因であると考えられる。微粒子型のiNOSまたは一つもしくは複数のタンパク質と会合させたiNOSを、溶液からの吸収によって除去すると、LPSプライミングマウスに微粒子iNOSを投与することによって発揮される致死効果は停止した。同様に、異なる抗iNOS MAbsは、微粒子iNOS、微粒子の膜会合型iNOS、微粒子の小胞会合型iNOS、または少なくとももう一つのタンパク質と会合した微粒子iNOSのマウスにおける致死性を中和するその個々の能力が多様であることも見いだされた。同様に、LPSおよび微粒子iNOSの用量を低下させると、マウスの生存率は増加した。しかし、抗iNOS MAbをLPSプライミングマウスに投与すると、7日間生存率が増加した。

さらに、遺伝子操作技法を利用して、米国特許第6,531,578号において見いだされるパネルのヒト化またはキメラ抗hiNOSモノクローナル抗体を開発した。具体的には、マウス抗hiNOS MAbs 1E8-B8、2D10-2H9、6A12-A12、21C10-1D10、21H11-2D2、24B10-2C7、および24H9-1F3の定常領域をヒトIgG₁およびIgκ定常領域に置換することによって、キメラマウス／ヒト抗hiNOSモノクローナル抗体（MAbs）7個を作製した。先に記述したハイブリドーマ細胞株7個のそれぞれから総RNAを単離した。免疫グロブリン重鎖（HC）および軽鎖（LC）をコードするRNAをRT-PCRによって増幅した。得られたPCR産物を適したクローニングベクターにサブクローニングして、シークエンシングした。各抗体鎖のプロトタイプヌクレオチド配列を多数のcDNAクローンから確立した。プロトタイプの配列をIMGTデータベース（http://imgt.cines.fr）と比較することによって、免疫グロブリン可変領域の正確な位置を決定した。MAb 7個のそれぞれに関して、キメラ抗体を構築するために、一つのプロトタイプHC-可変領域クローンおよび一つのプロトタイプLC-可変領域クローンを選択した。第二のPCRを用いて、（1）マウスHC-可変領域が、ヒトIgG₁定常領域を既に含む発現ベクターにインフレームで挿入されうるように、および（2）ヒトIgκ定常領域を既に含む発現ベクターにマウスLC-可変領域が挿入されうるように、加えた適当な制限部位と共に可変領域を増幅した。双方の可変領域のDNA配列を再度確認して、挿入が意図されるフレーム内で起こっていること、および第二のPCRの際に他の変異が導入されていないことを確かめた。各プラスミドDNA約500μgを調製した。

各抗体に関して、完全な抗体分子を産生させるために、キメラHCおよびdhfr選択マーカーをコードするベクターDNA、ならびにキメラLCおよびneo選択マーカーをコードするベクターを、dhfr^- DUXB11 CHO細胞株に同時トランスフェクトした。ネオマイシン類似体であるG418を含むヌクレオシドを含まない培地において培養することによって、重鎖および軽鎖抗体鎖の双方を発現する安定にトランスフェクトした細胞の選択を行った。DUXB11 CHO（dhfr^-）細胞は、DNAの合成にとって必要なデヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）酵素を欠損することから、これらの細胞はまた、ヌクレオシドを含まない培地における増殖能を有しなかった。その一つが機能的dhfr遺伝子を含む二つのベクターの同時トランスフェクションによってdhfr遺伝子を導入すると、これらの細胞がヌクレオシドを欠損する培養培地において増殖する能力を回復した。

哺乳動物系において組換え型蛋白質の十分な発現を得るために、遺伝子増幅を行った。これは、培養培地にメソトレキセート（MTX）の増加濃度を加えることによって選択的な圧の存在下で細胞を増殖に供することによって行った。MTXはDHFR酵素の活性を阻害することから、生存する細胞のみが、dhfr遺伝子増幅の十分なレベルを達成し、それによってMTXの阻害効果を克服した。遺伝子増幅はdhfr遺伝子に隣接する領域まで伸長することから、抗体の双方の鎖をコードするDNAも同様に、遺伝子複製の際に同時増幅された。

産生された抗hiNOSキメラMAb DNA構築物（ヒト化1E8-B8、ヒト化2D10-2H9、およびヒト化24H9-1F3）の三つを発現する細胞を増幅した。ヒト化MAbの最高レベルを発現および分泌する増幅された細胞プールを、分泌されたヒト化抗hiNOS MAbを含む条件培地を収集するために選択した。これらの培地を、その結合特性を決定するための実験にとって必要な、ヒト化抗hiNOS MAbのミリグラム量を単離するための開始材料として用いた。

遺伝子操作されたキメラマウス／ヒト抗hiNOS MAbがそのそれぞれの同源の親マウス抗hiNOS MAbと同じ結合特性を有することを証明するために、実験を行った。試験から、抗hiNOS抗体結合活性がヒトIgG₁分子に組み入れられていること、およびもしあるとしてもヒト化MAbに残っているマウスIgGエピトープはわずかであることが示された。さらに、これらのキメラ抗hiNOS MAbを実験において用いて、（1）親マウスMAbに関して既に記述されているように、微粒子hiNOS、小胞会合hiNOS、および他のタンパク質と会合した微粒子hiNOSを溶液から除去するための、ならびに（2）敗血症のインビボマウスモデルにおいて微粒子hiNOSの殺マウス活性を中和するための、その有用性を証明した。

さらに、サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞の微粒子分画におけるhiNOSに関連したタンパク質が見いだされた。抗hiNOS MAbを、微粒子分画においてそのようなタンパク質に関連したhiNOSを結合させるためにMAGBEADSに固定した。単離後、タンパク質を、LC/MS/MSを通してそのアミノ酸配列を認識することによって同定した。Gene Bankデータベースにおける公知のタンパク質配列との比較から、信頼できる同定が得られた。

その上、低張ショックによって溶解した細胞の低速沈降物について免疫蛍光染色実験を行った。高速沈降物および高速上清と比較すると、低速沈降物のみが、LPSプライミングマウスに対して致死効果を示した。米国特許第6,531,578号の抗hiNOS MAbは、図1〜6のヒト敗血症患者の血液中において観察された小胞と類似の小胞またはアポトーシス体において強い蛍光染色を生じた。

サイトカイン誘導および溶解DLD-1-5B2細胞の微粒子分画に含まれる致死活性は、インビボマウス敗血症モデルを用いることによって特異的にモニターできることが決定された。致死活性は、ビーズ上に固定したヒト化抗hiNOS MAb 1E8-B8を用いて微粒子分画から選択的に除去することができ、そのようなインビボマウス敗血症モデルにおいて試験したところ、固相支持体上で固定したヒト化抗hiNOS MAb 1E8-B8によって微粒子分画を処置していなければ死亡したであろう動物の100％が生存した。致死活性実体は、ビーズ上にローディングした抗hiNOS MAbが既に結合することが示される合成ペプチドPS-5183と競合させることによって、固定した抗hiNOS MAbから回収することができる。インビボマウス敗血症モデルにおいて試験した場合、回収された材料はLPSプライミングマウスに対して致死的である。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供され、本発明を如何なるようにも制限するとは見なされない。

実施例I
図7に説明したヒトiNOSの二つの分画を、敗血症の動物モデルとしてLPSプライミングマウスに及ぼすその効果に関して試験した。実験を開始する前に、可溶性のiNOSを、米国特許第6,531,578号において見いだされる抗iNOS MAbの一つまたは複数によってコーティングしたMAG-BEADSに対する選択的吸収によって可溶性分画から除去した。簡単に説明すると、ヤギ抗マウスIgG IgGに共有結合したMAG-BEADSを、イリノイ州ロックフォードのPierce Chemical Co.から購入した。iNOSに対して特異的なモノクローナル抗体を有するMAG-BEADSをローディングするために、クローン21C10-1D10、2A1-F8、1E8-B8、および2D2-B2からの分泌された抗iNOS MAbを含む培養上清を、浮遊させたMAG-BEADSの少量に個々に加えた。iNOSを含む可溶性の分画を1：2に希釈して、プールして洗浄し、浮遊させた抗iNOSコーティングMAG-BEADSに適用した。浮遊液を軽く攪拌しながら終夜インキュベートして、可溶性のiNOSをMAG-BEADS上にコーティングした抗iNOS MAbに結合させてから、浮遊液を含む試験管を磁気ラックに置いた。ビーズは全て、磁石に隣り合う試験管の側に集合した。得られたiNOS枯渇可溶性分画を移して、最終容積に希釈して保存可溶性分画と比較して1：5倍希釈を行った。保存iNOS可溶性分画の1：5倍希釈も同様に、滅菌生理食塩液において調製した。1：5倍希釈保存溶液分画の1：5 iNOS枯渇可溶性分画の、およびiNOS枯渇可溶性分画を作製するために用いたiNOSコーティングMAG-BEADSの試料を全て分析して、可溶性iNOSが除去されたか否かを決定して、可溶性iNOSが、MAG-BEADSに付着した抗iNOS MAbに結合したことを証明した。これらの分析から、90％より多い可溶性iNOSが、可溶性分画（iNOS枯渇可溶性分画）から除去されていること、およびiNOSが抗iNOS MAbをローディングしたMAG-BEADSに結合していることが示された。

双方の性別を含むマウスの群に滅菌生理食塩液のみ、または亜致死量のLPS（Sigma Chemical Co., Saint Louis, MOから得た2 mg/kg体重の大腸菌LPS血清型0111:B4）を滅菌生理食塩液においてIP注射した。4時間後、LPSを注射したマウスのみが嗜眠性となり下痢を発症した。生理食塩液またはLPSによってプライミングしたマウスに、生理食塩液または以下の一つをさらに尾静脈から注射した：iNOSを含む可溶性分画（可溶性iNOS）、iNOSを枯渇した可溶性分画（iNOS枯渇可溶性分画）、または誘導DLD-1-5B2細胞によって産生および単離された微粒子iNOSの浮遊液。図8は、この実験の結果を示す。生理食塩液プライミングマウスはいずれも、如何なる試験試料に対しても如何なる効果も示さなかった。生理食塩液の用量、可溶性iNOSの用量、またはiNOS枯渇可溶性分画の用量のいずれかを尾静脈から注射することによって投与しても、LPSプライミングマウスに効果を認めなかった。しかし、iNOSの微粒子分画をLPSプライミングマウスに投与すると、マウスは全てほぼ即死した。同じ用量の微粒子iNOSを投与した生理食塩液プライミングマウスには効果を認めなかった。マウスのLPSプライミングは、（1）微粒子iNOSが効果を発揮するために必要である、および（2）LPSプライミングマウスに投与した場合に微粒子iNOSはほぼ即死を引き起こすが可溶性iNOSは引き起こさない、という結論に達した。

実施例II
LPSプライミングマウスにおける微粒子ヒトiNOSについて認められる殺マウス効果の阻害を調べるために、米国特許第6,531,578号において見いだされる抗ヒトiNOS MAbを用いた。実施例Iに記述される抗iNOS MAbによってコーティングしたMAG-BEADSに対する選択的吸収によって、微粒子iNOSを微粒子分画から除去した。図9は、微粒子分画から微粒子iNOSの選択的除去を確認するウェスタンイムノブロットを表す。実施例Iにおける可溶性分画の枯渇に関して記述した技法と類似の技法を用いた。簡単に説明すると、ヤギ抗マウスIgG IgGに共有的に連結したMAG-BEADSを、イリノイ州ロックフォードのPierce Chemical Companyから購入した。クローン21C10-1D10、2A1-F8、IE8-B8、および2D2-B2からの分泌された抗iNOS MAbを含む培養上清を、iNOSに対する抗体をビーズにローディングするために、浮遊させたMAG-BEADSの少量に個々に適用した。iNOSを含む微粒子分画を1：5倍希釈して、プールして洗浄し、浮遊させた抗iNOSコーティングMAG-BEADSに適用した。浮遊液を軽く攪拌しながら終夜インキュベートして、微粒子iNOSを、MAG-BEADSにコーティングした抗体に結合させた後、浮遊液を含む試験管を磁気ラックに置いた。ビーズは全て、磁石に隣り合う試験管の側に集合して、iNOS枯渇溶液（iNOS枯渇可溶性分画）を移して、最終容積に希釈して保存可溶性分画と比較して1：10倍希釈を行った。保存iNOS可溶性分画の1：10倍希釈も同様に、滅菌生理食塩液において調製した。iNOS枯渇微粒子分画の、保存微粒子分画の、およびiNOS枯渇微粒子分画を作製するために用いたiNOSローディングMAG-BEADSの試料を全て分析して、微粒子iNOSが除去されたか否かを決定した、図9。MAG-BEADSに付着した抗iNOS MAbに結合したiNOSを図10において決定した。これらの分析から、90％より高い微粒子iNOSが、微粒子分画（iNOS枯渇微粒子分画）から除去されていること、およびiNOSが抗iNOS MAbをローディングしたMAG-BEADSに結合していることが示された。

iNOS枯渇微粒子分画がLPSプライミングマウスに対して及ぼす効果を、微粒子iNOSを含む保存（非枯渇）微粒子分画について認められた効果と比較した。両性を含むマウスの群に、滅菌生理食塩液においてLPSの亜致死用量（2 mg/kg重量のSigma Chemical Companyから得た大腸菌LPS血清型0111:B4）をIP注射した。4時間後、LPSをプライミングしたマウスは全て嗜眠性となり、下痢を発症した。様々な群のマウスに生理食塩液、1：10倍希釈の保存微粒子iNOS、開始保存浮遊液と比較して1：10倍希釈のiNOS枯渇微粒子分画のいずれかを尾静脈から投与した。図11は、これらの最終的な結果を表す。LPSのプライミングIP注射の4時間後に生理食塩液を投与したマウスは、本実施例の実験終了までの7日間生存したことから、如何なる効果も示さなかった。しかし、LPSのプライミングIP注射後4時間に1：10倍希釈の微粒子iNOSの尾静脈注射を行ったマウスでは、7日間生存したのは17％（6匹中1匹）に過ぎなかった。重要なことに、iNOS枯渇微粒子分画の尾静脈注射を行ったLPSプライミングマウスの84％（6匹中5匹）が、7日間生存した。これらのデータを比較すると、微粒子iNOS分画を投与したマウスと、生理食塩液（スチューデントのT-検定によってp＜0.005）またはiNOS枯渇微粒子分画（p＜0.02）を投与したマウスの生存のあいだに高い程度の統計学的有意差が見いだされた。生理食塩液のIV注射を行ったLPSプライミングマウスと、iNOS枯渇微粒子分画を投与したLPSプライミングマウスとのあいだに統計学的有意差を認めなかった。このように、微粒子分画から微粒子iNOSを特異的に除去すると、微粒子iNOS分画を投与したLPSプライミングマウスにおいて認められる致死効果が消失した。（1）LPSプライミングは、微粒子iNOSの致死効果が発揮されるために必要である；（2）LPSプライミングマウスにおいて観察された致死効果は、微粒子iNOS自身、または一つもしくは複数のタンパク質と会合した微粒子iNOSが原因である；および（3）微粒子iNOSまたは一つもしくは複数のタンパク質と会合した微粒子iNOSを、固定された抗iNOS MAbを用いて溶液からの吸収によって除去すると、微粒子iNOSの投与によって発揮された致死効果が停止する、という結論に達した。

実施例III
第二の方法を用いて、米国特許第6,531,578号の抗ヒトiNOS MAbが、敗血症モデルとしてのLPSプライミングマウスにおける微粒子ヒトiNOSについて認められた殺マウス効果を阻害するか否かを試験した。実施例IIにおいて行ったように、微粒子分画から微粒子iNOSを物理的に除去する代わりに、腹水に含まれる個々の抗iNOS MAbを、微粒子iNOSを含む微粒子分画の少量に直接加えた。微粒子iNOS分画を抗iNOS MAbに45分間結合させてから、材料をマウスにIV注射した。異なる抗iNOS MAb 5個を、微粒子ヒトiNOSの殺マウス効果の個々の阻害（中和）能に関して試験した。マウスの群を亜致死量のLPS（2 mg/kg重量のSigma Chemical Companyから得た大腸菌LPS血清型0111:B4）によって滅菌生理食塩液においてプライミングした。4時間後、全てのマウスが嗜眠性となり下痢を発症した。様々な群のマウスに、生理食塩液、1：10倍希釈の保存微粒子iNOS、または異なる抗iNOS MAb 5個中1個と共に45分間プレインキュベートした1：10倍希釈での保存微粒子iNOSを静脈内注射した。異なる抗iNOS MAb 5個のそれぞれを腹水の1：50倍希釈で用いた。結果は多様であり、これを図12に示す。滅菌生理食塩液において1：10倍希釈した保存微粒子iNOSの尾静脈注射を行ったLPSプライミングマウスは、7日間の実験の最初の24時間以内に死亡した。対照的に、生理食塩液を尾静脈注射したLPSプライミングマウス5匹中4匹が7日間生存した（P＜0.02）。微粒子iNOSの致死効果を中和する抗iNOS MAbの能力は、試験されるMAbに依存して変化した。試験した異なる抗iNOS MAb 5個のうち、抗iNOS MAb 1E8-B8および24B10-2C10は、LPSプライミングマウスに対する微粒子iNOSの致死効果を中和するために最善であった。いずれの場合も、マウス5匹中3匹が7日間生存した（P＜0.05）。他の抗iNOS MAb（2D2-B2および2A1-F8）も、マウスの死亡を停止させるために幾分有効であり、すなわち、これらの群のそれぞれにおいてマウス5匹中2匹が7日間生存した。一つの抗iNOS MAb（21C10-1D10）は、7日間生存したマウスが5匹中1匹のみに過ぎなかったことから、かなり有効性が低かった。以下のように結論された：（1）LPSプライミングは微粒子iNOSが致死的となるために必要である；（2）その致死性を中和するために、溶液から微粒子iNOSを物理的に除去することは必ずしも必要ではない；（3）抗iNOS MAbは、iNOSに結合することによって、または微粒子iNOSを含むタンパク質-タンパク質複合体に結合することによって、LPSプライミングマウスに及ぼす微粒子iNOSの致死効果を中和することができる；および（4）異なる抗iNOS MAbは、微粒子iNOS自身として、または一つもしくは複数のタンパク質と会合して、微粒子iNOSの致死性を中和するその個々の能力が多様である。

実施例IV
マウスの群に対して実施例I〜IIIにおいて用いた場合より低いLPSのプライミング用量およびより低い用量の微粒子iNOSを用いた。無関係なMAbを含む二つの腹水を対照として用いた。無関係な対照MAbには、インスリン様増殖因子-1に対して特異的なモノクローナル抗体（IGF-1：MAbクローン1F6-3H10）、およびヒトレプチンに対して特異的な一つのMAb（MAbクローン8F7-A10）が含まれた。マウスの群を、滅菌生理食塩液においてより低い亜致死量のLPS（1 mg/kg重量のSigma Chemical Companyから得た大腸菌LPS血清型0111:B4）によってプライミングした。4時間後、LPSプライミングマウスは全て嗜眠性となり、下痢を発症した。様々な群のマウスに、生理食塩液、1：20倍希釈の保存微粒子iNOS、または異なる5個の抗iNOS MAbの一つもしくは先に同定された無関係なMAb 2個の一つと共に45分間プレインキュベートした1：20倍希釈の保存微粒子iNOSのいずれかの尾静脈注射を行った。無関係なMAbおよび抗iNOS MAbをそれぞれ腹水の1：50倍希釈で用いた。結果は多様であり、図13に示す。より少ない量のプライミングLPSおよび微粒子iNOSをマウスにおいて用いることによって、マウス5匹中3匹が7日間生存した。図13に示すように、抗iNOS MAbクローン2A1-F8は、この群においてマウス5匹中5匹が7日間の実験終了まで生存したことから、微粒子iNOSの致死効果を中和するために最も良好であった。しかし、微粒子iNOSを、無関係な二つのMAbのいずれかを含む腹水と共にプレインキュベートしたところ、7日目での生存率は、iNOS微粒子分画と比較して低かった。このことは、（1）腹水中の一つまたは複数の成分が微粒子iNOSの致死効果を増加させること、または（2）LPSによってプライミングした後微粒子iNOSを投与した群における個々のマウスは、微粒子iNOSの致死効果に対する感受性がより低いことを示唆している。その結果、類似の条件で予想されるより多くのメンバーが生存した。後者の場合、1群あたりより多くのマウスを用いれば、この統計学的問題を解決するであろう。前者の場合、腹水は微粒子iNOSの致死性を幾分増幅したが、抗iNOS MAbが致死効果を中和する能力は過小評価されている。抗iNOS MAb 2A1-FAと共にプレインキュベートした微粒子iNOSを投与したマウスの群の生存を、無関係な二つのMAbの群のマウスの生存と比較したところ、統計学的に有意な差が見いだされ、言い換えれば抗IFG-1 MAbと共にプレインキュベートした群と比較した場合、P＜0.05であり、抗レプチンMAbと共にプレインキュベートした群と比較した場合、P＜0.02であった。本実施例において、（1）より低用量のLPSおよび微粒子iNOSは、マウスの7日間生存率を増加させる；（2）微粒子iNOSの致死効果を観察するためにはマウスをLPSによってプライミングしなければならない；（3）微粒子iNOSを抗iNOS MAbと共にプレインキュベートすると、マウスの7日間生存率を増加させる；および（4）腹水自身は、抗iNOS MAbに関して観察された有用な効果の原因ではない、という結論に達した。

実施例V
ヒト化抗hiNOS MAbの特定の結合活性を決定するために、関連する同源のペプチドおよびhiNOSタンパク質に関して以下の試験を行った。

本明細書において先に記述した遺伝子操作技法によって作製した三つのヒト化抗hiNOSキメラMAb（ヒト化1E8-B8、ヒト化2D10-2H9、およびヒト化24H9-1F3）が、同源のマウスMAbが結合することが見いだされている同じエピトープを認識してこれに結合するか否かに関して試験した。マウス抗hiNOS MAbクローン1E8-B8および24H9-1F3は、既に米国特許第6,531,578号の教示においてヒトiNOSの特異的領域の合成ペプチド類似体に結合することが既に示されている。マウス抗hiNOS MAb 1E8-B8は、ペプチドPS-5183（ペプチドG11、hiNOS[985-1002]である）に結合することが見いだされており、マウス抗hiNOS MAb 24H9-1F3は、ペプチドPS-5166（ペプチドF6、hiNOS[781-798]である）に結合することが見いだされている。ペプチドG11およびF6のアミノ酸配列は米国特許第6,531,578号に開示されている。遺伝子操作されたキメラマウス／ヒト1E8-B8および24H9-1F3 MAbを、ELISA滴定実験において当初のマウスMAbと同時にそれぞれのエピトープペプチド類似体との結合に関して最初に試験した。

当初のマウス1E8-B8 MAbは、G11ペプチド、hiNOS[985-1002]に結合して、結合した量は、抗体滴定実験に関して予測されるようにMAbの希釈が増加すれば減少した。同様に、ヒト化1E8-B8は、固定されたG11ペプチドに結合した。しかし、ヤギ抗マウスIgG-HRP共役「検出」Abは、ヒト化1E8-B8 MAbに結合せず、このことは、抗体結合部位がマウスIgG分子にもはや含まれないことを証明した。しかし、ヤギ抗ヒトIgG-HRP共役「検出」Abは、キメラ1E8-B8 MAbに結合して、このことは結合部位がヒトIgG₁分子に融合されていることを示した。

同様に、当初のマウス24H9-1F3 MAbおよびキメラマウス／ヒト24H9-1F3 MAbをF6ペプチド、hiNOS[781-798]との結合に関して試験した際に、マウスMAbを、ヤギ抗ヒトIgG-HRPを「検出」Abとして用いた場合のヒト化MAbの場合と同様に、予想されるように希釈を増加させて滴定した。ヤギ抗マウスIgG-HRP共役体をヒト化24H9-1F3 MAbと共に「検出」Abとして用いた場合、この比色ELISAにおいて発色が起こらなかった。このことは、再度、マウス結合部位がヒトIgG分子に融合されていることを証明した、図14。

実施例VI
合成ペプチドに対する結合に関するヒト化抗hiNOS MAbの試験の他に、ヒト化1E8-B8、ヒト化2D10-2H9、およびヒト化24H9-1F3を、ミリグラム量を得るために増幅して拡大した。これらのヒト化MAbを、サンドイッチEIAフォーマットにおいてそのhiNOSタンパク質との結合能に関して試験した。このフォーマットにおいて、「捕獲」または「捕捉」Abを、マイクロタイタープレートのウェルの表面に固定して、これを用いてウェルに加えたhiNOSを結合させて、それによって固定した。「捕獲」または「捕捉」Abに結合した後、第二のAbをウェルの表面上に固定されたhiNOSタンパク質の異なる部位に結合させた。この特異的な場合において、結合した第二抗体は、三つのヒト化抗hiNOS MAb、すなわちヒト化1E8-B8、ヒト化2D10-2H9、またはヒト化24H9-1F3の一つであった。図15に示すように、キメラ抗hiNOS MAbの三つ全てがこのサンドイッチEIAフォーマットにおいて固定されたhiNOSタンパク質に結合した。さらに、これらのキメラ抗hiNOS MAbは、ヤギ抗ヒトIgG-HRP共役「検出」第三抗体を用いた場合に、固定されたhiNOSに結合している場合に限って検出された。この化学発光サンドイッチEIAにおいて、ヤギ抗マウスIgG-HRP共役体を「検出」第三抗体として用いる場合、バックグラウンドを超える化学発光は測定されなかった。このように、以下のように結論された：（1）ヒト化抗hiNOS MAbは、hiNOSタンパク質上のそれぞれのエピトープに結合することができる；（2）当初のマウス結合部位は、ヒトIgG分子に融合されている；および（3）抗マウスIgG-HRP共役抗体は、これらのヒト化抗hiNOS MAbに結合しない。

実施例VII
親マウス抗hiNOS MAbに関して実施例Iにおいて既に記述したように、キメラマウス／ヒト抗hiNOS MAb 1E8-B8が、サイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞から得た微粒子分画からhiNOSを除去または枯渇できるか否かを評価した。実施例IおよびIIのマウス敗血症モデルは、マウスをプライミングするためにLPSの亜致死量を利用して、4時間後に、溶解して遠心によって分画されているサイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞の微粒子分画の浮遊液をIV注射した。細胞溶解に関して異なる二つの方法、すなわち2回の急速凍結／解凍サイクル（細胞溶解法A）または低張ショック（細胞溶解法B）を用いた。これら二つの方法のいずれかによる細胞溶解後、細胞溶解物を遠心によって分画した。遠心法1において、細胞溶解物を高速（16,000×g）で遠心して、高速微粒子分画または沈降物、および高速上清分画を得た。遠心法2において、細胞溶解物を低速（300×g）で遠心して、低速微粒子分画または沈降物を得た。次に、低速上清を高速で遠心して（16,000×g）高速微粒子分画および高速上清を産生した。いずれの技法によっても、実施例Iのマウス敗血症モデルにおいて殺マウス活性を含む微粒子分画が得られた。遠心法2を用いることによって、致死活性は、低速微粒子分画または沈降物に限って見いだされた。

遠心法1を用いて、ヒト化抗hiNOS MAb 1E8-B8をローディングしたMag-ビーズによって処置後の残留hiNOS-枯渇高速微粒子分画を、実施例Iの動物敗血症モデルにおいてLPSプライミングマウスの殺マウス能に関して試験した。一連の実験は、LPSの亜致死量（2 mg/kg体重）によってプライミングしたBalb/cマウスおよび遠心法1によって調製した高速微粒子分画の双方を用いた。一連の実験において、無処置高速微粒子分画は、死につつあるマウスが80％となる希釈倍数（N=5、LD₈₀）で用いた。この同じ高速微粒子分画を、ヒト化抗hiNOS MAbローディングMag-ビーズ、および無処置の高速微粒子分画と同じ希釈倍数で試験した残留hiNOS枯渇高速微粒子分画によって処置したところ、マウスは死亡しなかった−マウスは5匹全員が7日間の実験において生存した（スチューデントのT-検定によってP＜0.01）。第二の一連の実験において、無処置微粒子高速分画を、全てのマウスが死につつある50％高い濃度（N=5、LD₁₀₀）で用いた。残留hiNOS-枯渇微粒子分画を同じ濃度で試験したところ、この場合も、マウスは死亡せず、マウス5匹全員が7日間の実験において生存した（P＜0.001）。このように、高速微粒子hiNOS、高速微粒子分画におけるhiNOSの断片、hiNOSおよびhiNOS断片と会合した小胞、ならびに固定されたヒト化抗hiNOS MAb 1E8-B8に結合した高速微粒子分画におけるhiNOSおよびhiNOSの断片と会合したタンパク質の物理的な除去によって致死効果の喪失が起こり、生存の劇的な増加が起こった。

実施例VIII
ヒト化キメラ抗hiNOS MAbがサイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画に含まれる致死活性を中和できるか否かを、一連のインビボマウス実験において評価した。これらの実験は、親マウス抗hiNOS MAbに関して既に記述された実験、すなわち以下の例外を除き、実施例IIIおよびIVと類似であった：（1）マウス抗hiNOS MAbは、ヒト抗hiNOS MAb 1E8-B8および24H9-1F3に置換されていること；ならびに（2）MAbおよび微粒子分画はIV注射の直前に混合して、注射前に45分間プレインキュベートしなかったこと。これらの二つのヒト化抗hiNOS MAbの中和能、およびそれによってサイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞から得たhiNOS含有微粒子分画（実施例VIIの遠心法1）の致死的なチャレンジからLPSプライミングマウスを保護する能力を試験した（図16）。これらの実験において、これらの二つのヒト化抗hiNOS MAbの中和能（保護作用）を、異なる三つの用量、1.25 ng/g体重、12.5 ng/g体重、および125 ng/g体重で試験した。保護効果は、用量依存的に見いだされた。これらの実験において用いた低用量において、MAb処置群と無処置群のあいだに統計学的有意差を観察しなかったが、保護する傾向が見いだされた（図16）。しかし、試験したヒト化1E8-B8の最高濃度では、MAb処置群と無処置群のあいだに統計学的有意差が見いだされた（スチューデントのT-検定によりP＜0.05）。同様に、ヒト化抗hiNOS MAb 24H9-1F3の保護効果も、無処置群の動物と比較して異なる二つの最高用量で統計学的に異なることが見いだされた。このMAbを12.5 ng/g体重で用いた場合、動物5匹全てが生存し（P＜0.01）、125 ng/g体重で用いた場合、動物5匹中4匹が生存した（P＜0.05）。これらの知見は、キメラマウス／ヒトIgG₁分子に遺伝子操作される前の親マウス抗hiNOS MAbを用いて行った知見と類似である。これらの結果は、これらのMAbが、微粒子hiNOSに結合して、それによってその致死効果を発揮するために感受性を有する細胞にそれが結合することを立体的に妨害することによって、サイトカインによって誘導されて溶解されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画に含まれる致死活性を用量依存的に中和することができることをさらに確認した。

実施例IX
サイトカイン誘発DLD-1-5B2細胞の微粒子分画において、hiNOSと会合した如何なるタンパク質も同定するために実験を行った。抗hiNOS MAbをMag-ビーズ上に固定して、微粒子hiNOSおよび微粒子分画における他のタンパク質と会合したhiNOSを結合させた。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞から得た微粒子分画を、Mag-ビーズ上の固定された抗hiNOS MAb 1E8-B8によって処置した後、Mag-ビーズを洗浄して未結合材料を除去して、タンパク質から固定抗体を取り除いた。単離されたタンパク質を陰性ゲルPAGEによって分離して、タンパク質のバンドをクーマシーブリリアントブルーによって染色した；およびゲルを脱染色してタンパク質バンドを可視化した。非誘導DLD-1-5B2細胞からのゲルにおいて認められたバンドとは異なるタンパク質のバンドをゲルから切り出した。個々のバンドに含まれるタンパク質をトリプシンによって消化して、トリプシン断片を産生した。ペプチド断片を単離して、その個々のアミノ酸配列を決定するために分析するためにLC/MS/MSに供した。LC/MS/MS分析によって決定されたアミノ酸配列をGeneBankデータベースに含まれる公知の全てのタンパク質配列と比較した。多数のトリプシンペプチド断片とアミノ酸配列相同性を有して、およびトリプシンペプチド断片によって含まれるその全体的なアミノ酸配列の統計学的に有意な部分を有するタンパク質を同定して表にまとめた（表1）。例えば、表1に記述するように、PDIは、ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体（プロリル4-ヒドロキシラーゼβサブユニットとしても知られる）である。異なる10個のトリプシンペプチドのアミノ酸配列は、このタンパク質のアミノ酸配列の様々な領域と正確にマッチして、全体的な配列の23.0％を含んだ。個々のペプチド断片のラダースコアは、58.0〜95.9の範囲であり、この特異的タンパク質がこの試料に存在する予測の相対的信頼レベルは、80％より大きい。このように、質量分析結果は、このタンパク質がPAGEゲルから切り出したバンドに含まれることを示している。このタンパク質のGeneBankアクセッション番号は、gi/2507460である。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞の微粒子分画におけるhiNOSまたはhiNOS断片に会合して同定された他のヒトタンパク質13個に関する同じ情報を表1に示す。

微粒子分画の陰性PAGEゲルから切り出されたバンドにおけるトリプシン消化およびトリプシンペプチド断片のLC/MSによって同定された表1のそれぞれのヒトタンパク質は、本発明者らの抗hiNOS MAbに特異的に結合する誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞から得た。したがって、これらのタンパク質のそれぞれは、サイトカインによって誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞から得た微粒子分画においてhiNOSと会合した。

同定されたタンパク質（表1）の三つに対する抗体は市販されており、これを用いて、図17のMag-ビーズ上で固定された抗hiNOS MAbから取り除かれたタンパク質のウェスタンブロットのためのメンブレンのプロービングの後にSDS-PAGE分離を行った。これらのウェスタンブロットは、抗hiNOS固定Mag-ビーズから取り除かれた材料において、ヒトPDI前駆体、ヒトHSP 90-β、およびヒストンH2Bタンパク質が存在することを陽性に確認した。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞について得られた微粒子分画においてhiNOSに会合するタンパク質の除去はまた、実施例II、III、およびVIIIの固定された抗hiNOS MAbによる処置に起因するインビボマウス敗血症モデルにおける殺マウス活性の減少に寄与する可能性がある。

実施例X
微粒子分画に含まれるhiNOSが細胞膜、小胞、または膜断片のような他の構造に存在するか否かを決定するために、免疫蛍光染色実験を行った。サイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞を、多数回の凍結／解凍サイクルに関して起こりうるタンパク質の変性を回避するために、細胞膜を破壊して細胞成分、細胞成分、および水疱形成小胞を含む膜構造を溶液に放出するために、実施例VIIの低張ショック（細胞溶解法B）によって溶解した。溶解した細胞を含む溶液を低速遠心（300×g）にまず供して、低速微粒子沈降物を得た。次に、低速上清を高速遠心（16,000×g）に供して、高速微粒子沈降物および高速上清の双方を産生した。これらの三つの分画を、LPSプライミングマウスにおけるその殺マウス活性に関して調べたところ、致死活性は低速微粒子分画に限って見いだされた。高速沈降物も高速上清も、LPSプライミングマウスに静脈内注射した場合、致死的ではなかった。低速微粒子分画を顕微鏡下で調べたところ、二つのタイプの構造が観察された。一つは、「幽霊」細胞の細胞膜、すなわち破壊された細胞の残遺物であり、もう一つは、宙に浮いた連結したビーズのように何度も見える小胞であった（図18）。この調製物を、hiNOSの位置を免疫学的に特定するために米国特許第6,531,578号の抗hiNOS MAbを用いて免疫蛍光によって染色したところ、小胞に限って強い蛍光染色が観察された。hiNOSのIFA染色は、「幽霊」細胞にも、他の任意の構造にも観察されなかった。これらの小胞（アポトーシス体）の大きさおよび認められた抗hiNOS MAbによるその強いIFA染色は、ヒト敗血症患者の血液において観察されたものと同一ではないが、非常に類似である（図1〜6）。これらの調製物を、タンパク質のSDS-PAGE分離後にウェスタンブロットによって分析すると（図19）、高速上清は、無傷のhiNOSを含むことが見いだされた。低速微粒子分画は、無傷のhiNOSの少量を含んだが、これらの実験において用いられる抗hiNOS MAb 2D2-B2に結合する二つのhiNOS断片を含んだ（図19）。高速上清は、実施例Iの動物敗血症モデルにおいてLPSプライミングマウスを殺さないが、低速微粒子分画はLPSプライミングマウスに対して致死的であることが繰り返し見いだされた。

さらに、二つの一連の実験において、（1）Mag-ビーズ上に固定されたヒト化MAb 1E8-B8、（2）それに対してMAb 1E8-B8が結合するペプチドG-11、および（3）先に記述したように、凍結／解凍サイクル2回（実施例VIIの細胞溶解法A）、または低張ショック（実施例VIIの細胞溶解法B）のいずれかによって溶解したサイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞から得られた微粒子分画を用いて、抗hiNOSローディングMAG-BEADSに結合した小胞を含むhiNOSおよび関連材料を回収した。二つの微粒子分画（一つは実施例VIIの細胞溶解法Aによって調製し、もう一つは実施例VIIの細胞溶解法Bによって調製した）を、MAG-BEADSに固定したヒト化MAb 1E8-B8によって処置した後、MAG-BEADSを洗浄して、未結合材料を除去した。MAG-BEADSにローディングされた抗hiNOSに結合した材料を、ペプチドG-11の高濃度（100 μg）と共に、ローディングされたビーズをインキュベートすることによって、ヒト化抗hiNOS MAbと競合させた。MAG-BEADSに結合したヒト化抗hiNOS 1E8-B8 MAbと競合した材料を遠心して、洗浄し、米国特許第6,531,578号のパネルにおける他の抗hiNOS MAbを用いて蛍光標識した。双方の一連の実験において、強く蛍光を発生する小胞が観察され、他の材料は免疫蛍光を発生することが認められなかった。実施例Iのマウス敗血症モデルにおいて、これらの同じ二つの調製物を用いて、亜致死量のLPSによってプライミングしたマウスにチャレンジしたところ、双方の試料は、サイトカインによって誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞から得た微粒子分画において当初発見された致死活性を有することが見いだされた。すなわち、これらの回収された調製物の一つによって、マウス2匹中2匹が死亡したが、他の回収された調製物では、マウス2匹中1匹が死亡した。抗hiNOSローディングMAG-BEADSと競合した材料に含まれるタンパク質を、hiNOS[781-798]に結合する抗hiNOS MAbクローン2D2-B2を用いてウェスタンブロットによって分析したところ、実施例VIIの細胞溶解法Aによって調製した微粒子分画から回収された材料に関して、見かけの分子量131 kD、70 kD、および27 kDで三つの主なバンドが見いだされた。しかし、実施例VIIの細胞溶解法Bによって調製した低速微粒子分画から回収した試料に関しては、70 kDaでの単一のバンドが見いだされた。

実施例XI
図16に表示した実施例VIIIのタイプのさらなる実験において、サイトカイン誘導および溶解したDLD-1-5B2細胞から得た上清分画の致死効果を、実施例Iのインビボマウス敗血症モデルにおいて調べて、殺細胞活性は見いだされなかった。一連の実験において、上清分画が、LPSの亜致死量をプライミングしたマウスを保護できるか否かを探求した。この一連の実験において、マウスを既に記述されたようにLPSによってプライミングして、4時間後に異なる三つの処置の一つをチャレンジした：（1群、N=5）、サイトカイン誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞の微粒子分画（実施例VIIの方法A）をマウスを全て殺す用量（LD₁₀₀）で；（2群、N=5）群#1と同様の用量の微粒子分画プラスサイトカイン誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞（実施例VIIの方法A）からの上清の4倍多い量の同時投与；ならびに（群3、N=5）、サイトカイン誘導および溶解されたDLD-1-5B2細胞からの上清の4倍多い量を微粒子分画の投与の30分前に投与する。これらの実験において、群1および2の全ての動物が死亡した。しかし、群3における動物は全て生存した（スチューデントのT-検定によりP＜0.001）。このように、上清分画の前投与は、微粒子分画の致死的チャレンジに対して保護的であった。非致死上清分画は、微粒子分画の投与に起因する致死的細胞事象を遮断した。このように、上清分画は致死的材料の細胞への結合を遮断して、それによって微粒子分画の致死量から動物を保護した。

前述から、本発明の実践を代表する態様および実施例を、本発明の完全な開示を作製する目的でかなり詳細に記述してきたが、そのような詳細に明らかな改変を行ってもよく、それらも本発明の趣旨および原理に含まれることは当業者に明らかであると思われる。

患者の末梢血単核球（PBMC）の視野の倍率200倍の写真であり、矢印の先に示す唯一の免疫染色陽性細胞（白色）、および多数の他の非反応細胞（非常に青白い）を有する視野において間接蛍光標識抗iNOSモノクローナル抗体2A1-F8と反応する、矢印で示す小さいiNOS含有小胞（白色）を示す。間接免疫蛍光アッセイ（IFA）技法によって抗iNOSモノクローナル抗体2A1-F8によって免疫染色したiNOSおよび細胞関連iNOS含有小胞（矢印）を含む細胞の大きい割合を示すPBMCの視野の倍率200倍の写真である。図2とは異なる敗血症患者からのPBMCの、図2と比較してあまり混み合っていない視野を示す倍率200倍の写真であり、iNOS含有小胞（おそらくアポトーシス体）は細胞から分離している。共通の領域をUV光（A）、位相差光（B）、およびUVと位相差光（C）において連続的に示した3枚のパネルA、B、およびCを有する倍率200倍の写真であり、iNOS含有小胞の大きい集合体（矢印）を示す。抗iNOSモノクローナル抗体2A1-F8とのIFA反応によって明らかになったiNOS含有球体（おそらく非アポトーシス体）に関連した部分的に破壊された細胞質膜を示す、UV光において写真を撮影した患者のPBMCの倍率400倍の写真である。壊変のプロセスにおいてiNOS免疫陽性染色細胞を示し、iNOS含有小胞（おそらくアポトーシス体）を放出する、図5において示した患者と同じ患者からのUV光において写真撮影したPBMCの倍率200倍の写真である。 iNOSの可溶性および微粒子分画を示すウェスタンイムノブロットの写真であり、レーン1は、分子量標準物質、レーン2は、5μlの誘導された可溶性分画、レーン3は、2.5μlの誘導された可溶性分画、レーン4は、5μlの誘導された微粒子分画、レーン5は2.5μlの誘導された微粒子分画、レーン6はiNOS標準物質、およびレーン7は分子量標準物質である。 LPSによってプライミングして、4時間後に実施例1に記述される化学実体を投与したマウスの48時間生存を示すグラフである。実施例2に記述した微粒子分画からのiNOSの除去を示すSDS-PAGE後のウェスタンイムノブロットであり、レーン1は分子量標準物質、レーン2は5μlのiNOS標準物質、レーン3は、5μlの誘導微粒子分画、レーン4は、2.5μlの誘導微粒子分画、レーン5は、5μlの抗iNOS MAbコーティングMAG-BEAD枯渇微粒子分画、レーン6は、2.5μlの抗iNOS MAbコーティングMAG-BEAD枯渇微粒子分画、レーン7は、5μlのiNOS標準物質、およびレーン8は分子量標準物質である。実施例2において用いたMAG-BEADsに付着させた抗iNOSモノクローナル抗体に結合したiNOSの免疫染色の写真である。 LPSによってプライミングして、4時間後に実施例2において記述した特定の化学実体を投与したマウスの7日間生存を示すグラフである。 LPSによってプライミングして、4時間後に実施例3において記述した特定の化学実体を投与したマウスの7日間生存を示すグラフである。 LPSによってプライミングして、4時間後に実施例4において記述した特定の化学実体を投与したマウスの7日間生存を示すグラフである。ヤギ抗マウスIgG-HRP共役物を検出抗体として用いるマウス抗hiNOS MAb 24H9-1F3（マウスMAb I）の、ヤギ抗ヒトIgG-HRP共役物を検出抗体として用いるヒト化抗hiNOS MAb 24H9-1F3（ヒト化MAb I-a）の、またはヤギ抗ヒトIgG-HRP共役体を検出抗体として用いるヒト化抗hiNOS MAb 24H9-1F3（ヒト化MAb I-b）の、ペプチドF6によって感作したマイクロタイタープレートでの比色滴定を示すグラフである。ヒト化抗hiNOS MAb 1E8-B8（MAbA）、2D10-2H9（MAbD）、または24H9-1F3（MAbI）の、それぞれ「捕捉」抗hiNOS抗体による、それぞれhiNOS 10 fmolによる、およびそれぞれ「検出」抗体として抗ヒトIgG-HRP共役体による、ELISA滴定化学発光サンドイッチイムノアッセイ滴定を示すグラフである。ヒト化MAb 1E8-B8および24H9-1F3を用いる対照実験におけるLPSプライミングマウスの生存率を示す棒グラフであり、P値はスチューデントのT-検定によって計算した。微粒子分画におけるhiNOSまたはhiNOSの断片に関連して見いだされたタンパク質の存在を確認するウェスタンブロットである。一組のデジタル画像パネルであり、パネル「A」は、iNOSに関して強い免疫蛍光染色を示すサイトカイン誘導DLD-1-5B2細胞の低張ショックに起因する余分の細胞小胞を示し、パネル「B」は、低張処理によって溶解した細胞に囲まれるhiNOSに関して蛍光免疫染色した小胞を示す。分子量標準物質（レーン1）；高速上清に含まれる無傷のhiNOS（レーン2および3）；低速微粒子分画に含まれる無傷のhiNOSおよびhiNOSの二つの断片（レーン4および5）；ならびに高速微粒子分画にhiNOSが含まれないことを示すウェスタンブロットである。

Claims

以下を含む、その血液中にhiNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための治療薬剤：
ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体。
ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体が、hiNOSの一つの型によって引き起こされた細胞効果を中和するモノクローナル抗体を含み、hiNOSの一つの型が本質的に以下からなる群より選択される、請求項1記載の薬剤：
微粒子hiNOS、微粒子hiNOSの断片、小胞会合hiNOS、微粒子hiNOSの小胞会合断片、もう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOS、およびもう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOSの断片。
病気が、本質的に、全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックからなる群より選択される、請求項2記載の薬剤。
モノクローナル抗体が、本質的に、マウス抗hiNOSモノクローナル抗体、マウス-ヒトキメラ抗hiNOSモノクローナル抗体、ヒト化抗hiNOSモノクローナル抗体、およびヒト抗hiNOSモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項2記載の薬剤。
以下を含む、その血液中にhiNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための治療装置：
ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体によってコーティングされた装置。
ヒトiNOSを認識するモノクローナル抗体が、hiNOSの一つの型によって引き起こされた細胞効果を中和するモノクローナル抗体を含み、hiNOSの一つの型が本質的に以下からなる群より選択される、請求項5記載の薬剤：
微粒子hiNOS、微粒子hiNOSの断片、小胞会合hiNOS、微粒子hiNOSの小胞会合断片、もう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOS、およびもう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOSの断片。
病気が、本質的に、全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックからなる群より選択される、請求項6記載の薬剤。
モノクローナル抗体が、本質的に、マウス抗hiNOSモノクローナル抗体、マウス-ヒトキメラ抗hiNOSモノクローナル抗体、ヒト化抗hiNOSモノクローナル抗体、およびヒト抗hiNOSモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項5記載の薬剤。
以下を含む、その血液中にiNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための治療薬剤：
hiNOS結合実体。
iNOS結合実体が、本質的に、iNOS結合アプタマー、オリゴヌクレオチド、人工抗体、ファージディスプレイ抗体、ファージディスプレイ抗体断片、および一本鎖モノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項9記載の治療薬剤。
hiNOS結合実体が、hiNOSの一つの型によって引き起こされた細胞効果を中和するhiNOS結合実体を含み、hiNOSの一つの型が本質的に以下からなる群より選択される、請求項9記載の物薬剤：
微粒子hiNOS、微粒子hiNOSの断片、小胞会合hiNOS、微粒子hiNOSの小胞会合断片、もう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOS、およびもう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOSの断片。
病気が、本質的に、全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックからなる群より選択される、請求項9記載の薬剤。
以下を含む、その血液中にhiNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための治療装置：
hiNOS結合実体によってコーティングされた装置。
hiNOS結合実体が、hiNOSの一つの型によって引き起こされた細胞効果を中和するhiNOS結合実体を含み、hiNOSの一つの型が本質的に以下からなる群より選択される、請求項13記載の薬剤：
微粒子hiNOS、微粒子hiNOSの断片、小胞会合hiNOS、微粒子hiNOSの小胞会合断片、もう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOS、およびもう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOSの断片。
病気が、本質的に、全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックからなる群より選択される、請求項13記載の薬剤。
以下を含む、その血液中にiNOSを産生する哺乳動物対象における病気を診断するためのシステム：
免疫染色されたiNOS型。
免疫染色されたiNOS型が細胞外小胞会合iNOSを含む、請求項16記載のシステム。
病気が、本質的に、全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症、および敗血症性ショックからなる群より選択される、請求項17記載の薬剤。
以下を含む、その血液中にhiNOSを産生する哺乳動物対象における病気を処置するための治療薬剤：
hiNOSの一つの型によって引き起こされた細胞効果の阻害剤。
細胞効果の阻害剤が、hiNOSの一つの型によって引き起こされ、hiNOSの一つの型が本質的に以下からなる群より選択される、請求項19記載の薬剤：
微粒子hiNOS、微粒子hiNOSの断片、小胞会合hiNOS、微粒子hiNOSの小胞会合断片、もう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOS、およびもう一つのタンパク質と会合した微粒子hiNOSの断片。
hiNOSの一つの型によって引き起こされた細胞効果の阻害剤が、細胞溶解の細胞溶解産物に由来するhiNOSの上清分画を含む、請求項19記載の薬剤。