JP5067688B2 - Method for inhibiting protein disulfide bond formation in plants - Google Patents
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Description
本発明は、植物の細胞内において内因性のEro1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、該細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害する方法に関する。 The present invention relates to a method for comprehensively inhibiting disulfide bond formation of an intracellular protein, characterized by suppressing the expression of an endogenous Ero1 gene in a plant cell.
新生ポリペプチド鎖は小胞体(以下ERと略すこともある)内腔において正しい折りたたみ構造をとった機能分子に変換されるが、その一連のフォールディング過程においてジスルフィド結合は可溶性タンパク質プロテインジスルフィドイソメラーゼ(protein disulfide isomerase:PDI)により形成される。PDIは最初に同定されたチオール−ジスルフィド酸化還元酵素であり、CxxC(C:システイン残基)(配列番号:10)活性部位を含む二つのチオレドキシン様ドメインを有しそれぞれ基質タンパク質のジスルフィド結合形成および異性化を触媒する(非特許文献1〜4)。ジスルフィド結合形成の分子機構について、近年、酵母(Saccharomyces cerevisiae)の遺伝学的・生化学的解析により、PDIへの酸化力供給を担う酵素タンパク質としてEro1(ER oxidoreductase)が同定された(非特許文献5〜7)。Ero1はER内腔に局在する膜タンパク質であり(非特許文献5、6)、補酵素としてflavin adenine dinucleotide(FAD)を保持する(非特許文献8、9)。Ero1は二つのシステインペア(CxxxxC(配列番号:11)およびCxxCxxC(配列番号:12)モチーフ)を活性部位として有し、Ero1(S-S)-PDI(-SH)タンパク質間チオール−ジスルフィド交換反応によりPDIにジスルフィド結合を導入する。 The nascent polypeptide chain is converted into a functional molecule with the correct folding structure in the lumen of the endoplasmic reticulum (hereinafter sometimes abbreviated as ER), but disulfide bonds are soluble protein protein disulfide isomerase (protein disulfide isomerase) formed by isomerase (PDI). PDI is the first thiol-disulfide oxidoreductase identified and has two thioredoxin-like domains containing a CxxC (C: cysteine residue) (SEQ ID NO: 10) active site, each of which forms disulfide bonds in the substrate protein and Catalyze isomerization (Non-Patent Documents 1 to 4). Regarding the molecular mechanism of disulfide bond formation, Ero1 (ER oxidoreductase) was recently identified as an enzyme protein responsible for supplying oxidative power to PDI by genetic and biochemical analysis of yeast (Saccharomyces cerevisiae) (non-patent literature) 5-7). Ero1 is a membrane protein localized in the ER lumen (Non-patent Documents 5 and 6) and retains flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme (Non-patent Documents 8 and 9). Ero1 has two cysteine pairs (CxxxxC (SEQ ID NO: 11) and CxxCxxC (SEQ ID NO: 12) motifs) as active sites, and PDI by an thiol-disulfide exchange reaction between Ero1 (SS) and PDI (-SH) proteins. Introduce a disulfide bond.
Ero1遺伝子は、酵母に1遺伝子のみ(非特許文献5)、ヒトには2遺伝子が存在する(非特許文献10、11)。酵母およびヒトでは、Ero1がPDIへの酸化力を供給することで新生ポリペプチド鎖におけるジスルフィド結合形成を司っていること、さらに、PDIは多種多様なホモログが同定されており,それぞれ基質となる新生ポリペプチド鎖に対し特異性を示すことが示唆されている(非特許文献12〜16)。 The Ero1 gene has only one gene in yeast (Non-patent Document 5) and two genes in human (Non-patent Documents 10 and 11). In yeast and humans, Ero1 supplies oxidative power to PDI to control disulfide bond formation in the nascent polypeptide chain, and PDI has been identified as a wide variety of homologues, each serving as a substrate It has been suggested that it exhibits specificity for nascent polypeptide chains (Non-Patent Documents 12 to 16).
一方、高等植物ではシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)において2つのEro1遺伝子(非特許文献17)が同定されているものの、種子胚乳においてタンパク質ジスルフィド結合形成過程がEro1タンパク質依存的であるかについては不明である。
しかしながら、イネ(Oryza sativa)PDI1-1遺伝子欠損変異体esp2において種子貯蔵タンパク質の一つグルテリンが前駆体として蓄積することが報告されている(非特許文献18)。グルテリンはまずERにおいて前駆体分子(プログルテリン:分子量約 57 kD)として合成され、ジスルフィド結合が形成された後、最終的に貯蔵液胞へと輸送され酸性サブユニット(分子量 37-39 kD)および塩基性サブユニット(分子量 22-23 kD)にプロセシングされることから、イネ種子胚乳細胞においてもPDIがタンパク質ジスルフィド結合形成に必須であることが示唆される。PDI遺伝子は多重遺伝子族を形成し、これまでにイネでは19、トウモロコシ(Zea mays)では22、シロイヌナズナでは22のオルソログが同定されている(非特許文献19)。
On the other hand, in higher plants, two Ero1 genes (Non-patent Document 17) have been identified in Arabidopsis thaliana, but it is unclear whether the protein disulfide bond formation process is dependent on Ero1 protein in seed endosperm.
However, it has been reported that one seed storage protein, glutelin, accumulates as a precursor in rice (Oryza sativa) PDI1-1 gene deletion mutant esp2 (Non-patent Document 18). Glutelin is first synthesized as a precursor molecule (proglutelin: molecular weight of about 57 kD) in the ER, and after disulfide bonds are formed, it is finally transported to the storage vacuole and has an acidic subunit (molecular weight 37-39 kD) and Processing to the basic subunit (molecular weight 22-23 kD) suggests that PDI is essential for protein disulfide bond formation in rice seed endosperm cells. The PDI gene forms a multigene family, and so far, 19 orthologs have been identified in rice, 22 in maize (Zea mays), and 22 in Arabidopsis thaliana (Non-patent Document 19).
食物アレルゲンはアナフィラキシーショックやアトピー性皮膚炎等の原因物質である。主要な食物アレルゲンは複数のシステイン残基を有するタンパク質であり、ジスルフィド結合を形成して安定したαへリックス構造をとりIgE抗体に対する高次構造エピトープとなる。植物性食物アレルゲンの主要なものとして貯蔵タンパク質が挙げられる。可食部においてアレルゲン性の低い植物の開発が求められている。
小麦粉に水を加え、捏ねると生地ができる。小麦粉の生地の特性は、システイン残基の還元型チオール基が捏ねる際にジスルフィド結合を形成して、タンパク質複合体のグルテンを形成することに依存する(非特許文献20、21)。小麦粉はタンパク質含量が高いものから強力粉、中力粉、薄力粉に分類される。強力粉はタンパク質に含まれる還元型チオール基の量が多いため、生地にした際にジスルフィド結合を多く形成しグルテン形成能も高くなると考えられる。一方、米粉に水を加え捏ねて生地にしてもグルテンが形成されないのは、米粉に含まれるタンパク質には還元型チオール基が少ないことが原因の一つと考えられる。従って、小麦粉の代替品として米粉を使用する際には、還元型チオール基を多く含んだ米粉の使用が望ましいと考えられるが、そのような性質を有した米粉はこれまで報告されていない。一般に、小麦粉の代替品として米粉を使用する際は、米粉に小麦粉由来の粉末グルテンを添加することが必要である(特許文献1)。
Food allergens are causative substances such as anaphylactic shock and atopic dermatitis. The main food allergen is a protein having a plurality of cysteine residues, forms a disulfide bond, takes a stable α-helix structure, and becomes a conformational epitope for an IgE antibody. Storage protein is one of the major plant food allergens. Development of plants with low allergenicity is required in the edible part.
Add water to the flour and knead to make dough. The characteristics of flour dough depend on the formation of gluten in protein complexes by forming disulfide bonds when the reduced thiol groups of cysteine residues are kneaded (Non-patent Documents 20 and 21). Wheat flour is classified into high-powered flour, medium-powered flour, and weak-powered flour from those with high protein content. Since strong flour contains a large amount of reduced thiol groups contained in protein, it is thought that when it is made into dough, it forms many disulfide bonds and increases gluten-forming ability. On the other hand, the reason why gluten is not formed even when dough is made by adding water to rice flour is thought to be due to the fact that the protein contained in rice flour has few reduced thiol groups. Therefore, when using rice flour as a substitute for wheat flour, it is considered desirable to use rice flour containing a large amount of reduced thiol groups, but no rice flour having such properties has been reported so far. Generally, when using rice flour as a substitute for wheat flour, it is necessary to add flour-derived powdered gluten to the rice flour (Patent Document 1).
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の細胞内において内因性のEro1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、該細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害する方法を提供することにある。また、植物の細胞内において、内因性のEro1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、プロテインジスルフィドイソメラーゼの酸化活性を阻害する方法の提供を課題とする。さらに本発明は、Ero1遺伝子の発現を抑制する機能を有するDNAの提供を課題とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and its object is to suppress the expression of an endogenous Ero1 gene in a plant cell, and to form a disulfide bond in the intracellular protein. It is providing the method of inhibiting this comprehensively. Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting the oxidation activity of protein disulfide isomerase, which comprises suppressing endogenous Ero1 gene expression in plant cells. Another object of the present invention is to provide a DNA having a function of suppressing the expression of the Ero1 gene.
本発明者らは、上記の課題を解決するために、植物の種子胚乳においてタンパク質ジスルフィド結合形成を網羅的に阻害する方法として、基質タンパク質-PDI-Ero1電子伝達カスケードにおけるEro1タンパク質の酵素活性を抑制することが有効であるか否かを検討した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors suppressed the enzyme activity of Ero1 protein in the substrate protein-PDI-Ero1 electron transport cascade as a method of comprehensively inhibiting protein disulfide bond formation in plant seed endosperm. We examined whether it was effective to do.
まず、RNA干渉により、イネEro1遺伝子発現が胚乳特異的に抑制された形質転換体を作製した。その結果、このEro1 RNA干渉形質転換体種子では、グルテリンが前駆体分子種として過剰蓄積した。
さらに、液胞由来タンパク質顆粒PBIIへの局在化に分子内ジスルフィド結合形成を必須とするα-グロブリン(Glb)への、Ero1遺伝子発現抑制の影響を検討した。その結果、Ero1 RNA干渉形質転換体ではGlbが野生型とは異なる形状の顆粒として観察された。
First, a transformant in which rice Ero1 gene expression was specifically suppressed by endosperm by RNA interference was prepared. As a result, in this Ero1 RNA interference transformant seed, glutelin was excessively accumulated as a precursor molecular species.
Furthermore, we investigated the effect of Ero1 gene expression suppression on α-globulin (Glb), which requires intramolecular disulfide bond formation for localization to vacuolar protein granules PBII. As a result, in the Ero1 RNA interference transformant, Glb was observed as a granule having a shape different from that of the wild type.
即ち、本発明者らは、高等植物において種子胚乳特異的にEro1遺伝子発現を抑制することによりタンパク質ジスルフィド結合形成が阻害されることを見出し、本発明を完成するに至った。 That is, the present inventors have found that protein disulfide bond formation is inhibited by suppressing Ero1 gene expression specifically in seed endosperm in higher plants, and completed the present invention.
本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔16〕を提供するものである。
〔1〕 植物の細胞内において、内因性の以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、該細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害する方法。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
〔2〕 植物の細胞内において、内因性の以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、プロテインジスルフィドイソメラーゼの酸化活性を阻害する方法。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
〔3〕 胚乳細胞において特異的に当該DNAの発現を抑制することを特徴とする、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕 植物が単子葉植物である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕 下記(i)から(iv)のいずれかに記載のDNAを植物の細胞内に導入する工程を含む、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法。
(i)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(ii)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(iii)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNA。
(iv)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNA。
〔6〕 アグロバクテリウムによって、DNAを植物の細胞内に導入することを特徴とする〔5〕に記載の方法。
〔7〕 〔1〕〜〔6〕に記載の方法によって、〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの発現が抑制された植物体。
〔8〕 下記(i)から(iv)のいずれかに記載のDNA。
(i)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(ii)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(iii)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNA。
(iv)〔1〕(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNA。
〔9〕 植物の細胞内において、タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害するために用いる、〔8〕に記載のDNA。
〔10〕 植物の細胞内において、プロテインジスルフィドイソメラーゼの酸化活性を阻害するために用いる、〔8〕に記載のDNA。
〔11〕 〔9〕または〔10〕に記載のDNAを含むベクター。
〔12〕 〔8〕に記載のDNAまたは〔11〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔13〕 〔12〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔14〕 〔13〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔15〕 〔13〕または〔14〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔16〕 〔13〕または〔14〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔8〕に記載のDNAまたは〔11〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
More specifically, the present invention provides the following [1] to [16].
[1] Comprehensive disulfide bond formation of intracellular proteins characterized by suppressing endogenous expression of DNA according to any one of (a) to (d) below in plant cells How to inhibit.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(D) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
[2] A method for inhibiting the oxidative activity of protein disulfide isomerase, which suppresses endogenous expression of DNA according to any one of (a) to (d) below in a plant cell.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(D) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the expression of the DNA is specifically suppressed in endosperm cells.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the plant is a monocotyledonous plant.
[5] The method according to any one of [1] to [4], including a step of introducing the DNA according to any one of (i) to (iv) below into a plant cell.
(I) [1] DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d).
(Ii) [1] DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d).
(Iii) [1] DNA encoding a dsRNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d).
(Iv) [1] DNA encoding an aptamer that specifically recognizes the protein encoded by the DNA according to any one of (a) to (d).
[6] The method according to [5], wherein DNA is introduced into plant cells by Agrobacterium.
[7] A plant in which the expression of the DNA according to any one of (1) (a) to (d) is suppressed by the method according to [1] to [6].
[8] The DNA according to any one of (i) to (iv) below.
(I) [1] DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d).
(Ii) [1] DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d).
(Iii) [1] DNA encoding a dsRNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d).
(Iv) [1] DNA encoding an aptamer that specifically recognizes the protein encoded by the DNA according to any one of (a) to (d).
[9] The DNA according to [8], which is used for comprehensively inhibiting protein disulfide bond formation in plant cells.
[10] The DNA according to [8], which is used to inhibit the oxidation activity of protein disulfide isomerase in plant cells.
[11] A vector comprising the DNA of [9] or [10].
[12] A transformed plant cell carrying the DNA of [8] or the vector of [11].
[13] A transformed plant comprising the transformed plant cell according to [12].
[14] A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to [13].
[15] A propagation material for the transformed plant according to [13] or [14].
[16] A method for producing a transformed plant according to [13] or [14], wherein the DNA according to [8] or the vector according to [11] is introduced into a plant cell, A method comprising a step of regenerating a plant body.
本発明の方法により、植物の該細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害することが可能となった。
主要な食物アレルゲンとして貯蔵タンパク質が挙げられるが、これらは複数のシステイン残基を有するタンパク質であり、ジスルフィド結合を形成して安定したαへリックス構造をとりIgE抗体に対する高次構造エピトープとなる。本発明の方法により、可食部におけるタンパク質ジスルフィド結合形成を網羅的に阻害し、低アレルゲン性の植物を提供することが可能である。
また、本発明の方法により作製された形質転換イネの胚乳は、Ero1依存的なタンパク質ジスルフィド結合形成が阻害され、その結果の一つとして還元型チオール基を多く含んでいる。従って、粉砕した種子に水を加え捏ねて作製した生地では、チオール基間でジスルフィド結合が形成されるために、生地の粘性、可塑性および弾力性が増大する。粘性、可塑性および弾力性が増大した生地特性を有する米粉を、例えば小麦粉の代替品として、または小麦粉と混合して利用することができる。
The method of the present invention has made it possible to comprehensively inhibit the formation of disulfide bonds in the intracellular protein of plants.
The major food allergens include storage proteins, which are proteins having a plurality of cysteine residues and form a disulfide bond to form a stable α-helix structure and become a conformational epitope for an IgE antibody. By the method of the present invention, it is possible to comprehensively inhibit protein disulfide bond formation in the edible part and provide a plant with low allergenicity.
In addition, the endosperm of transformed rice produced by the method of the present invention inhibits Ero1-dependent protein disulfide bond formation, and as a result, it contains many reduced thiol groups. Therefore, in a dough produced by adding water to kneaded seeds and kneading, a disulfide bond is formed between thiol groups, and thus the viscosity, plasticity and elasticity of the dough increase. Rice flour having dough properties with increased viscosity, plasticity and elasticity can be utilized, for example, as a substitute for flour or mixed with flour.
〔発明の実施の形態〕
本発明は、植物の細胞内において、内因性Ero1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、該細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害する方法に関する。さらに、本発明は、植物の細胞内において、内因性Ero1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)群の酸化活性を阻害する方法に関する。
[Embodiment of the Invention]
The present invention relates to a method for comprehensively inhibiting disulfide bond formation of an intracellular protein, characterized by suppressing the expression of an endogenous Ero1 gene in a plant cell. Furthermore, the present invention relates to a method for inhibiting the oxidative activity of protein disulfide isomerase (PDI) group, characterized by suppressing the expression of endogenous Ero1 gene in plant cells.
本発明者らによって、タンパク質のジスルフィド結合形成との関係が明らかにされ、また植物においてPDIに酸化力を供給する機能を有することが明らかにされた、イネのEro1遺伝子の塩基配列を配列番号:1に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。 The present inventors have clarified the relationship with protein disulfide bond formation and the nucleotide sequence of the Ero1 gene of rice, which has been shown to have a function of supplying oxidizing power to PDI in plants, SEQ ID NO: The amino acid sequence of the protein encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 2.
本発明のEro1遺伝子としては、具体的にはタンパク質のジスルフィド結合形成を促進するタンパク質をコードする、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAが含まれる。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
The Ero1 gene of the present invention specifically includes the DNA described in any one of the following (a) to (d), which encodes a protein that promotes the formation of a disulfide bond of the protein.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(D) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
本発明で使用されるEro1遺伝子は、Ero1タンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、Ero1遺伝子にはそれぞれ、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。また、Ero1遺伝子はEro1タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。 The Ero1 gene used in the present invention is not particularly limited as long as it can encode the Ero1 protein, and each Ero1 gene includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, etc. in addition to cDNA. Moreover, as long as the Ero1 gene encodes the Ero1 protein, DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる)を作成し、これを展開して、Ero1遺伝子(例えば、配列番号:1に記載のDNA)を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。またEro1遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。 Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from a plant, a genomic library (vectors such as plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used), expanded, and Ero1 gene (for example, It is possible to prepare by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the DNA described in SEQ ID NO: 1. It is also possible to prepare by preparing a primer specific for the Ero1 gene and performing PCR using this primer. In addition, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a plant, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization in the same manner as described above. Alternatively, it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR.
さらに、Ero1遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため、Ero1遺伝子には、種々の植物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、イネにおけるEro1遺伝子産物と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を指す。このようなタンパク質には、例えば、Ero1タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、Ero1タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, since the Ero1 gene is considered to exist widely in the plant kingdom, the Ero1 gene includes homologous genes existing in various plants. Here, the “homologous gene” refers to a gene encoding a protein functionally equivalent to the Ero1 gene product in rice in various plants. Examples of such proteins include, but are not limited to, Ero1 protein mutants, alleles, variants, homologs, partial peptides of Ero1 protein, or fusion proteins with other proteins.
本発明におけるEro1タンパク質の変異体としては、配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、Ero1タンパク質の変異体として挙げることができる。 The variant of Ero1 protein in the present invention is a naturally occurring protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. And a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. A protein encoded by a naturally-occurring DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Functionally equivalent proteins can also be mentioned as mutants of Ero1 protein.
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内(例えば、3アミノ酸以内)であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)を挙げることができる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。 In the present invention, the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids). The amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids having amino acids (C, M), amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains The amino acids (H, F, Y, W) that can be used can be listed (the parentheses indicate the single letter of the amino acid). It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence maintains its biological activity. Yes.
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、Ero1タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、Ero1タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、例えば、PDIにジスルフィド結合を導入する機能や、タンパク質のジスルフィド結合形成を促進する機能を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術(Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975)やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術(Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988)が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Ero1遺伝子の塩基配列(例えば、配列番号:1に記載のDNA)もしくはその一部をプローブとして、またEro1遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からEro1遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。
In the present invention, “functionally equivalent” means that the target protein has the same biological function or biochemical function as the Ero1 protein. In the present invention, examples of the biological function and biochemical function of the Ero1 protein include a function of introducing a disulfide bond into PDI and a function of promoting the formation of a disulfide bond of a protein. Biological properties include the specificity of the site to be expressed and the expression level.
Methods well known to those skilled in the art for isolating homologous genes include hybridization techniques (Southern, EM, Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki). , RK, et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, vol. 239, 487-491, 1988). That is, for those skilled in the art, various nucleotide sequences of Ero1 gene (for example, DNA described in SEQ ID NO: 1) or a part thereof are used as probes, and oligonucleotides that specifically hybridize to Ero1 gene are used as primers. It is usually possible to isolate a homologous gene of Ero1 gene from a plant.
このような相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25%ホルムアミド、より厳しい条件では50%ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 In order to isolate DNA encoding such a homologous gene, a hybridization reaction is usually carried out under stringent conditions. Those skilled in the art can appropriately select stringent hybridization conditions. For example, in hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 × SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 × Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA at 42 ° C. After overnight prehybridization, a labeled probe is added and hybridization is performed by incubating overnight at 42 ° C. The cleaning solution and temperature conditions for the subsequent cleaning are about 1xSSC, 0.1% SDS, 37 ° C, more severe conditions are about 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and more severe conditions are about 0.2xSSC. , 0.1% SDS, about 65 ° C. ”. Thus, isolation of DNA having high homology with the probe sequence can be expected as the conditions for washing hybridization are more severe. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
単離されたDNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN(核酸レベル)やBLASTX(アミノ酸レベル)のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)を利用して、決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら(Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。 The homology of the isolated DNA is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) in the entire amino acid sequence. And the like). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Yes. When analyzing a base sequence by BLASTN, parameters are set to score = 100 and wordlength = 12, for example. Further, when the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
本発明は、植物の細胞内において、内因性Ero1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、該細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害する方法を提供する。
さらに、本発明は、植物の細胞内において、内因性Ero1遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、PDIの酸化活性を阻害する方法を提供する。
The present invention provides a method for comprehensively inhibiting disulfide bond formation of an intracellular protein, characterized by suppressing the expression of an endogenous Ero1 gene in a plant cell.
Furthermore, the present invention provides a method for inhibiting the oxidation activity of PDI, characterized by suppressing the expression of the endogenous Ero1 gene in plant cells.
新生ポリペプチド鎖は小胞体(ER)内腔において正しい折りたたみ構造をとった機能分子に変換される(フォールディング)。具体的には、アミノ酸残基の相互作用(水素結合)により、直鎖であるペプチドが折りたたまれて、αヘリックス構造やβシート構造などの二次構造をとり、それがタンパク質の立体構造を形成する。タンパク質はフォーディングされることにより個々の特有の機能を発揮する。高次構造は、いずれも一次構造による影響を受け、例えば疎水性アミノ酸残基同士は疎水結合、Cys同士はジスルフィド結合を形成して高次構造を安定化させるなどの特徴が挙げられる。
一連のフォールディング過程の中でジスルフィド結合は可溶性タンパク質であるPDIにより形成される。PDIはチオール−ジスルフィド酸化還元酵素であり,CxxC(配列番号:10)活性部位を含む二つのチオレドキシン様ドメインを有しそれぞれジスルフィド結合形成および異性化を触媒する。
The nascent polypeptide chain is converted into a functional molecule with the correct folding structure in the endoplasmic reticulum (ER) lumen (folding). Specifically, a linear peptide is folded by the interaction of amino acid residues (hydrogen bonding) to form a secondary structure such as an α helix structure or β sheet structure, which forms the three-dimensional structure of the protein. To do. Proteins exhibit their unique functions by being forged. The higher order structures are all affected by the primary structure. For example, hydrophobic amino acid residues form a hydrophobic bond and Cys form a disulfide bond to stabilize the higher order structure.
In a series of folding processes, disulfide bonds are formed by PDI, a soluble protein. PDI is a thiol-disulfide oxidoreductase that has two thioredoxin-like domains containing a CxxC (SEQ ID NO: 10) active site and catalyzes disulfide bond formation and isomerization, respectively.
本発明において「細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害」とは、PDIへの酸化力供給を担う酵素タンパク質であるEro1の発現を抑制することにより、基質タンパク質-PDI-Ero1電子伝達カスケードを阻害し、基質タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害することをいう。従って、本発明は内因性のEro1の発現を阻害することによる、PDIの酸化活性を阻害する方法もまた提供する。
本発明のジスルフィド結合形成の阻害は小胞体内で行なわれることが好ましい。
なお、本発明において、阻害されるタンパク質のジスルフィド結合は、タンパク質分子内のジスルフィド結合であってもよいし、タンパク質分子間のジスルフィド結合であってもよい。
In the present invention, “exclusive inhibition of disulfide bond formation in intracellular proteins” means that the substrate protein-PDI-Ero1 electron transfer cascade is suppressed by suppressing the expression of Ero1, an enzyme protein responsible for supplying oxidative power to PDI. And comprehensive inhibition of substrate protein disulfide bond formation. Accordingly, the present invention also provides a method of inhibiting the oxidative activity of PDI by inhibiting endogenous Ero1 expression.
Inhibition of disulfide bond formation according to the present invention is preferably carried out in the endoplasmic reticulum.
In the present invention, the disulfide bond of the protein to be inhibited may be a disulfide bond in a protein molecule or a disulfide bond between protein molecules.
本発明において、Ero1遺伝子の発現を抑制する植物には特に制限はなく、植物のタンパク質ジスルフィド結合形成を抑制したい所望の植物を用いることができるが、産業的な観点からは農作物が好適である。有用農作物としては、特に制限はないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。
本発明の植物として、より好ましくは単子葉植物、最も好ましくはイネが挙げられる。
In the present invention, the plant that suppresses the expression of the Ero1 gene is not particularly limited, and a desired plant that suppresses the formation of protein disulfide bonds in the plant can be used. However, crops are preferred from an industrial viewpoint. There are no particular restrictions on useful crops. And dicotyledonous plants such as soybean, cotton, tomato and potato.
The plant of the present invention is more preferably a monocotyledonous plant, most preferably rice.
本明細書における「Ero1遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、Ero1遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。 In the present specification, “suppression of Ero1 gene expression” includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. Moreover, not only complete cessation of expression of Ero1 gene but also decrease of expression is included.
また、本発明において、Ero1遺伝子の発現を抑制する箇所は、植物全体であってもよいし、植物体の一部であってもよい。Ero1遺伝子の発現を完全に停止させる場合には、植物体の一部であることが好ましい。植物体の一部としては、例えば、種子胚乳、葉、根などが挙げられるが、これに限定されない。 In the present invention, the part that suppresses the expression of the Ero1 gene may be the whole plant or a part of the plant body. When the expression of the Ero1 gene is completely stopped, it is preferably a part of the plant body. Examples of the plant body include, but are not limited to, seed endosperm, leaves, roots, and the like.
本発明の方法により基質タンパク質のジスルフィド結合形成が阻害された植物は、該ジスルフィド結合により高次構造をとる基質タンパク質の摂取を原因とする疾患等の予防に有用である。このような疾患としては、例えば、アレルギー疾患が挙げられ、より好ましくはアナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息などが挙げられる。
また、本発明の方法により作製されたイネの胚乳では還元型チオール基を多く含んでいる。従って、粉砕した種子に水を加え捏ねて作製した生地では、チオール基間でジスルフィド結合が形成されるために、生地の粘性、可塑性および弾力性が増大する。粘性、可塑性および弾力性が増大した生地特性を有する米粉の利用法として、例えば小麦粉の代替品としての利用、または小麦粉と混合しての利用が挙げられるが、これらに限定されない。
A plant in which formation of a disulfide bond of a substrate protein is inhibited by the method of the present invention is useful for prevention of diseases caused by ingestion of a substrate protein having a higher-order structure by the disulfide bond. Examples of such diseases include allergic diseases, more preferably anaphylactic shock, atopic dermatitis, allergic rhinitis, bronchial asthma and the like.
In addition, rice endosperm produced by the method of the present invention contains many reduced thiol groups. Therefore, in a dough produced by adding water to kneaded seeds and kneading, a disulfide bond is formed between thiol groups, and thus the viscosity, plasticity and elasticity of the dough increase. Examples of methods for using rice flour having dough characteristics with increased viscosity, plasticity and elasticity include, but are not limited to, use as a substitute for wheat flour, or use in combination with wheat flour.
本発明において、Ero1遺伝子の発現を抑制するための方法としては、Ero1遺伝子の転写産物と相補的なRNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムをコードするDNAの植物細胞への導入を挙げることができる。 In the present invention, as a method for suppressing the expression of the Ero1 gene, introduction of RNA complementary to the transcription product of the Ero1 gene or DNA encoding a ribozyme that specifically cleaves the transcription product into a plant cell is possible. Can be mentioned.
本発明の「Ero1遺伝子の転写産物と相補的なRNA」の一つの態様は、Ero1遺伝子のmRNAと相補的なアンチセンスRNAである。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
One embodiment of the “RNA complementary to the transcript of the Ero1 gene” of the present invention is an antisense RNA complementary to the mRNA of the Ero1 gene.
There are several factors as described below for the action of an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene. That is, transcription initiation inhibition by triplex formation, transcription inhibition by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, transcription inhibition by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, intron and exon Of splicing by hybrid formation at the junction with the protein, suppression of splicing by hybridization with the spliceosome formation site, suppression of transition from the nucleus to the cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with capping sites and poly (A) addition sites Splicing suppression by formation, translation initiation suppression by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, peptization by hybridization with the mRNA translation region and polysome binding site For example, inhibition of gene chain elongation is prevented, and hybridization between nucleic acid and protein interaction sites is performed. They inhibit the expression of target genes by inhibiting transcription, splicing, or translation processes.
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、Ero1遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。 The antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. In one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the Ero1 gene is designed, it is considered effective for inhibiting translation of the gene. However, sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, a DNA containing an antisense sequence of a non-translated region as well as a translated region of a gene is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by a known method. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof possessed by the plant to be transformed, but may be not completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. Good. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcription product of the target gene. In order to effectively inhibit the expression of a target gene using an antisense sequence, the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
「Ero1遺伝子の転写産物と相補的なRNA」の他の一つの態様は、Ero1遺伝子の転写産物と相補的なdsRNAである。RNA干渉(RNAi)は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA(以下dsRNA)を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA(short interference RNA)を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体(RISC:RNA-induced silencing complex)が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。 Another embodiment of the “RNA complementary to the transcript of the Ero1 gene” is a dsRNA complementary to the transcript of the Ero1 gene. In RNA interference (RNAi), when a double-stranded RNA (hereinafter referred to as dsRNA) having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. It is a phenomenon. When dsRNA of about 40 to several hundred base pairs is introduced into a cell, a RNaseIII-like nuclease called Dicer with a helicase domain is present in the presence of ATP, and dsRNA is about 21 to 23 base pairs from the 3 ′ end. Cut out and produce siRNA (short interference RNA). A protein specific to this siRNA binds to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex). This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the mRNA of the target gene at the center of siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. In addition to this pathway, the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA. There is also a possibility that this dsRNA becomes Dicer's substrate again to generate new siRNA and amplify the action.
本発明のRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。 The RNA of the present invention can be expressed from an antisense coding DNA that encodes an antisense RNA to any region of the target gene mRNA and a sense code DNA that encodes a sense RNA of any region of the target gene mRNA. . Moreover, dsRNA can also be produced from these antisense RNA and sense RNA.
本発明のdsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA(siRNAコードDNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモーターを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖(アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖)の3'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A(アデニン)塩基を4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類を異ならせることが好ましい。 When the dsRNA expression system of the present invention is retained in a vector or the like, the antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, and the antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively. There is. For example, antisense RNA and sense RNA can be expressed from the same vector as an antisense RNA in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of the antisense code DNA and the sense code DNA. It can be constructed by constructing an expression cassette and a sense RNA expression cassette, respectively, and inserting these cassettes into the vector in the same direction or in the opposite direction. It is also possible to construct an expression system in which the antisense code DNA and the sense code DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands. In this configuration, one double-stranded DNA (siRNA-encoding DNA) in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof. A promoter is provided oppositely so that it can be expressed. In this case, in order to avoid adding extra sequences downstream of the sense RNA and antisense RNA, a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide. As this terminator, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used. Moreover, in this palindromic style expression system, it is preferable that the types of the two promoters are different.
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。 In addition, as a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from different vectors, for example, antisense coding DNA and an antisense in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of sense coding DNA. An RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be held in different vectors.
本発明のRNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。 In the RNAi of the present invention, siRNA may be used as dsRNA. “SiRNA” means a double-stranded RNA consisting of short strands that are not toxic in cells, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 Can be ~ 30 base pairs. Alternatively, the siRNA to be expressed is transcribed and the length of the final double-stranded RNA portion is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. be able to.
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の配列の相同性を有する。 The DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more sequence homology. .
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ(対応する塩基が相補的でない)、バルジ(一方の鎖に対応する塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。 The part of the double-stranded RNA in which the RNAs in dsRNA are paired is not limited to a perfect pair, but mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (no base corresponding to one strand) ) Or the like may include an unpaired portion. In the present invention, both bulges and mismatches may be included in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
本発明の「Ero1遺伝子の発現の抑制」は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。 The “suppression of Ero1 gene expression” of the present invention can also be carried out using a DNA encoding a ribozyme. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type and a size of 400 nucleotides or more like M1RNA contained in RNaseP, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type.
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA 配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。 For example, the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves on the 3 ′ side of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to form a base pair with A at position 9, and the base at position 15 is In addition to C, A or U is also shown to be cleaved. If the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA. It is. For example, there are a plurality of sites that can be targets in the coding region of the enzyme of the present invention that is an inhibition target.
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている。 Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot virus satellite RNA (J. M. Buzayan Nature 323: 349, 1986). This ribozyme has also been shown to be designed to cause target-specific RNA cleavage.
本発明において、Ero1遺伝子の発現を抑制させるための方法としては、Ero1タンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNAの対象への投与を挙げることができる。
本発明の「アプタマー」は、「アプタマー」単独で疾患の治療に使用することもできるが、他の分子種、例えば、蛍光標識色素などを結合させた形態で使用することもできる。
In the present invention, examples of a method for suppressing the expression of the Ero1 gene include administration of a DNA encoding an aptamer that specifically recognizes the Ero1 protein to a subject.
The “aptamer” of the present invention can be used alone for treating diseases, but can also be used in a form in which other molecular species such as a fluorescently labeled dye is bound.
本発明のアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて製造することができる。限定はしないが、例えば、「インビトロセレクション法(SELEX法)」(Tuerk, C. and Gold, L., Science, 249, 505-510 (1990), Green, L. et al, Meths. Enzymol., 2, 75-86 (1991), Gold, L. et al, Annu. Rev. Biochem., 64,763-797 (1995), Uphoff, K. W. et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 6, 281-288 (1996))により製造することができる。 The aptamer of the present invention can be produced using methods well known to those skilled in the art. Although not limited, for example, “in vitro selection method (SELEX method)” (Tuerk, C. and Gold, L., Science, 249, 505-510 (1990), Green, L. et al, Meths. Enzymol., 2, 75-86 (1991), Gold, L. et al, Annu. Rev. Biochem., 64,763-797 (1995), Uphoff, KW et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 6, 281- 288 (1996)).
「インビトロセレクション法」は、ランダムな配列を含む核酸分子のプールからEro1タンパク質に対して親和性を持つ分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。選択された分子のみをPCR法で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つ分子を濃縮することができる。 The “in vitro selection method” is a method of selecting a molecule having affinity for the Ero1 protein from a pool of nucleic acid molecules containing a random sequence and excluding those molecules having no affinity. By repeating the cycle of amplifying only selected molecules by the PCR method and selecting by affinity, molecules having strong binding ability can be concentrated.
具体的には、まず、20〜300塩基、好ましくは30〜150、より好ましくは30〜100塩基程度のランダムな塩基配列を含む1本鎖核酸分子、例えば、DNA、RNAなどを調製する。これらの核酸分子は、直接合成するか、RNA分子の場合には、まずDNA分子を合成したのち転写反応により調製してもよい。これらの核酸分子がDNAの場合は、PCR増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有する。プライマー結合配列部分は、特に限定はしないが、PCR増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するべく調製してもよい。プライマー結合配列部分の長さは、特に限定はしないが、約20〜50、好ましくは20〜30塩基程度である。また、PCR増幅後の一本鎖DNAを電気泳動などで分離可能とするために、5'側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。さらに、RNA分子を調製する場合には、5'末端側のプライマーに適当なプロモーター、例えば、T7プロモーター配列などを配し、DNA分子からRNA分子への転写が可能となるように調製してもよい。 Specifically, first, a single-stranded nucleic acid molecule containing a random base sequence of about 20 to 300 bases, preferably 30 to 150, more preferably about 30 to 100 bases, such as DNA or RNA, is prepared. These nucleic acid molecules may be synthesized directly, or in the case of RNA molecules, DNA molecules may be synthesized first and then prepared by a transcription reaction. When these nucleic acid molecules are DNA, in order to enable PCR amplification, they have base sequences to serve as primers at both ends. The primer binding sequence portion is not particularly limited, but may be prepared to have an appropriate restriction enzyme site so that the primer portion can be excised with a restriction enzyme after PCR amplification. The length of the primer binding sequence portion is not particularly limited, but is about 20-50, preferably about 20-30 bases. Further, in order to make it possible to separate the single-stranded DNA after PCR amplification by electrophoresis or the like, the 5 ′ end may be labeled with a radiolabel, a fluorescent label, or the like. Furthermore, when preparing an RNA molecule, an appropriate promoter such as a T7 promoter sequence may be placed on the 5 'end primer so that transcription from the DNA molecule to the RNA molecule is possible. Good.
次に、PCR増幅によって得られたランダムな核酸分子と、Ero1タンパク質またはEro1タンパク質の特定の領域を包含するペプチド断片とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、混合物を電気泳動にかけて、核酸分子−Ero1タンパク質複合体と遊離核酸分子とを分離する。Ero1タンパク質と複合体を形成している核酸分子を定法に従って抽出する。回収された核酸分子がDNAの場合には、さらにPCR増幅を行い、増幅されたDNAを熱変性するなどして、一本鎖DNAとして回収する。回収された核酸分子がRNAの場合には、該RNAを逆転写してcDNAとしたのち、PCR増幅し、増幅されたDNAを転写してRNAを調製する。 Next, random nucleic acid molecules obtained by PCR amplification and peptide fragments including Ero1 protein or a specific region of Ero1 protein are mixed at an appropriate concentration ratio, and incubated under appropriate conditions. After incubation, the mixture is subjected to electrophoresis to separate the nucleic acid molecule-Ero1 protein complex from the free nucleic acid molecule. Nucleic acid molecules forming a complex with Ero1 protein are extracted according to a standard method. When the recovered nucleic acid molecule is DNA, PCR amplification is further performed, and the amplified DNA is recovered as single-stranded DNA by heat denaturation or the like. When the recovered nucleic acid molecule is RNA, the RNA is reverse transcribed into cDNA, and then PCR amplified, and the amplified DNA is transcribed to prepare RNA.
上述の核酸分子とEro1タンパク質との混合、Ero1タンパク質と結合した核酸分子の分離、PCR増幅(RNAの場合には、逆転写後増幅)、増幅された核酸分子を再びEro1タンパク質との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンド行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にEro1タンパク質と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸分子は、定法に従い配列決定を行うことができる。 Mixing of the above-mentioned nucleic acid molecules with Ero1 protein, separation of nucleic acid molecules bound to Ero1 protein, PCR amplification (in the case of RNA, reverse transcription after amplification), and use of amplified nucleic acid molecule for binding to Ero1 protein again The series of operations up to is done several rounds. By repeating rounds, nucleic acid molecules that bind to Ero1 protein more specifically can be selected. The obtained nucleic acid molecule can be sequenced according to a conventional method.
以上の工程により得られた核酸分子の配列に基づいて、リン酸骨格部分に修飾を加え、例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホラミドチオエート結合、ホスホラミデート結合、ホスホルジアミデート結合、メチルホスホネート結合を含むリン酸骨格から構成されるアプタマーを得ることもできる。 Based on the sequence of the nucleic acid molecule obtained by the above steps, the phosphate skeleton is modified, for example, phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, phosphoramidothioate bond, phosphoramidate bond, phosphoramidate An aptamer composed of a phosphate skeleton containing a bond and a methylphosphonate bond can also be obtained.
本発明のEro1遺伝子の転写産物と相補的なRNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムをコードするDNA、Ero1タンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNAとしては、下記(i)から(iv)のいずれかに記載のDNAを挙げることができる。
(i)下記(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(ii)下記(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(iii)下記(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNA。
(iv)下記(a)〜(d)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNA。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
RNA complementary to the transcript of the Ero1 gene of the present invention, DNA encoding a ribozyme that specifically cleaves the transcript, and DNA encoding an aptamer that specifically recognizes Ero1 protein include the following (i): To (iv).
(I) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d) below.
(Ii) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to any one of (a) to (d) below.
(Iii) DNA encoding a dsRNA complementary to the transcription product of DNA described in any of (a) to (d) below.
(Iv) DNA encoding an aptamer that specifically recognizes a protein encoded by the DNA described in any of (a) to (d) below.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(D) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
本発明のdsRNAをコードするDNAの例として、より好ましくは、配列番号:1に記載のDNAにおいて、配列番号:3および5に記載のプライマーにより増幅される領域を有するsiRNAを挙げることができる。
これらのDNAは、植物の細胞内において、タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害するため、またはプロテインジスルフィドイソメラーゼの酸化活性を阻害するために用いることが可能である。
As an example of the DNA encoding the dsRNA of the present invention, more preferably, siRNA having a region amplified by the primers described in SEQ ID NOs: 3 and 5 in the DNA described in SEQ ID NO: 1.
These DNAs can be used to comprehensively inhibit the formation of protein disulfide bonds or to inhibit the oxidation activity of protein disulfide isomerase in plant cells.
また本発明は、Ero1遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクターならびに形質転換植物細胞を提供する。
本発明のベクターには、上述のRNAiを誘導するために構築されたベクターが含まれる。本発明のベクターは、本発明のDNAが含まれるため、細胞に導入された場合には該細胞において転写によって形成される一本鎖RNAが分子内で対合してdsRNAを形成する。
The present invention also provides a vector containing a DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene and a transformed plant cell.
The vector of the present invention includes a vector constructed for inducing the above-mentioned RNAi. Since the vector of the present invention contains the DNA of the present invention, when introduced into a cell, single-stranded RNA formed by transcription in the cell paired within the molecule to form dsRNA.
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えばプラスミド、ファージ、またはコスミドなどを例示することができる。
また上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
The vector used for the transformation of plant cells is not particularly limited as long as the inserted gene can be expressed in the cells. For example, a plasmid, a phage, or a cosmid can be exemplified.
The “plant cell” includes various forms of plant cells such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like.
本発明のベクターは、本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを、恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有してもよい。また、本発明のベクターは本発明のDNAを、植物体において部位特異的に発現させるためのプロモーターを含有していてもよい。例えば、胚乳特異的に本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを発現させるためには、イネ種子貯蔵タンパク質、デンプン合成酵素等のプロモーターを、本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを発現するようにベクターに挿入することができる。具体的には、実施例に記載のプロモーターが挙げられる。 The vector of the present invention may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention. The vector of the present invention may contain a promoter for expressing the DNA of the present invention in a site-specific manner. For example, in order to express DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention specifically in the endosperm, a promoter such as rice seed storage protein, starch synthase, etc. is expressed, and the DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention is expressed. Can be inserted into a vector. Specific examples include the promoters described in the Examples.
当業者においては、所望のDNAを有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することができる。 Those skilled in the art can appropriately prepare a vector having a desired DNA by a general genetic engineering technique. Usually, various commercially available vectors can be used.
本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを保持したり、発現させるためにも有用である。
本発明におけるEro1遺伝子の発現を抑制するDNAは、通常、適当なベクターへ担持(挿入)され、宿主細胞へ導入される。即ち本発明は、Ero1遺伝子の発現を抑制するDNAまたはベクターを保持する宿主細胞を提供する。該ベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されない。本発明のDNAを内因性遺伝子を有する細胞内に導入および発現させる目的としてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、植物個体内等で本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター(プロメガ社製)、植物個体であればpBINPLUSベクター(van Engelen, F.A. et al., (1995). pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.)などを例示することができる。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法(Molecular Cloning, 5.61-5.63)により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。
The vector of the present invention is also useful for retaining or expressing a DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention in a host cell.
The DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene in the present invention is usually carried (inserted) into an appropriate vector and introduced into a host cell. That is, the present invention provides a host cell carrying a DNA or vector that suppresses the expression of the Ero1 gene. The vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA. An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of introducing and expressing the DNA of the present invention into a cell having an endogenous gene. The expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention in a test tube, a plant individual or the like. For example, a pBEST vector (manufactured by Promega) is used for in vitro expression. ), PBINPLUS vector (van Engelen, FA et al., (1995). PBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.) . The DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63), for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
生体内で本発明の「Ero1遺伝子の発現を抑制するDNA」を発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法(エレクトロポーレーション)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、リポフェクション法(GIBCO-BRL社製)、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの当業者に公知の方法により生体内に導入する方法などが挙げられる。
植物体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
As a method of expressing the “DNA that suppresses the expression of Ero1 gene” of the present invention in vivo, the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, polyethylene glycol method, electroporation method, Agrobacterium method, Liposome method, cationic liposome method, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation (electroporation) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipofection Examples thereof include a method known to those skilled in the art, such as a method (GIBCO-BRL), a microinjection method, and a particle gun method.
Administration into a plant may be an ex vivo method or an in vivo method.
また、植物体内へ本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを導入する場合、DNAは、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて、植物細胞に直接導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。このようなベクターを用いて、植物体内へ本発明のDNAを導入する場合の方法としては、好ましくは、Toki (1997) Plant Mol. Biol. Rep. 15, 16-21に記載の方法が挙げられる。
なおこれら上述の形質転換方法は、宿主となる植物などの種類(例えば単子葉植物、双子葉植物)に応じて適宜選択することが好ましい。
In addition, when the DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention is introduced into the plant body, the DNA can also be directly introduced into plant cells using a microinjection method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, or the like. However, it can also be introduced into a plant cell indirectly via a virus or bacterium capable of infecting plants as a vector by incorporating it into a plasmid for gene transfer into a plant. Examples of such viruses include cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus, gemini virus and the like as typical viruses, and Agrobacterium and the like as bacteria. When introducing a gene into a plant by the Agrobacterium method, a commercially available plasmid can be used. The method for introducing the DNA of the present invention into a plant using such a vector is preferably the method described in Toki (1997) Plant Mol. Biol. Rep. 15, 16-21. .
These transformation methods described above are preferably selected as appropriate depending on the type of plant or the like that serves as the host (for example, monocotyledonous plants or dicotyledonous plants).
また、本発明は、Ero1遺伝子の発現を抑制するDNAまたは本発明のベクターを保持する植物細胞を提供する。さらに本発明は、本発明の植物細胞を含む形質転換植物体を提供する。Ero1遺伝子の発現を抑制するDNAまたは本発明のベクターが導入される細胞には、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はない。
本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
The present invention also provides a plant cell carrying a DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene or the vector of the present invention. Furthermore, this invention provides the transformed plant body containing the plant cell of this invention. The cells into which the DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene or the vector of the present invention is introduced include plant cells for producing transformed plants. There is no restriction | limiting in particular as a plant cell.
The plant cells of the present invention include cultured cells as well as cells in the plant body. Also included are protoplasts, shoot primordia, multi-buds, and hairy roots.
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法などを挙げることができるが、特に制限されるものではない。いくつかの技術については既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。 Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells. For example, with regard to the technique for producing a transformed plant body, a method for regenerating a plant body by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol, a method for regenerating a plant body by introducing a gene into protoplasts using an electric pulse, or a gene for cells by a particle gun method. Can be mentioned, and a method for regenerating a plant body and a method for regenerating a plant body by introducing a gene via Agrobacterium are not particularly limited. Some techniques have already been established and are widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクターの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入してもよい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
In order to efficiently select plant cells transformed by introduction of a vector containing DNA that suppresses the expression of Ero1 gene of the present invention, the recombinant vector contains an appropriate selection marker gene or contains a selection marker gene You may introduce | transduce into a plant cell with a plasmid vector. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the neomycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotics kanamycin or gentamicin, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to hygromycin, and the acetyl that is resistant to the herbicide phosphinothricin. Examples include transferase genes.
Plant cells into which the recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing a suitable selection agent according to the type of the introduced selection marker gene and cultured. As a result, transformed plant cultured cells can be obtained.
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら(Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995))の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら(Bio/Technology 7:581 (1989))の方法やGorden-Kammら(Plant Cell 2:603(1990))が挙げられ、ジャガイモであればVisserら(Theor.Appl.Genet 78:594 (1989))の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe(Planta 99:12(1971))の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら(Plant Cell Reports 12:7-11 (1992))の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら(特開平8-89113号公報)の方法が挙げられる。 Transformed plant cells can regenerate plant bodies by redifferentiation. The method of redifferentiation varies depending on the type of plant cell. For example, Fujimura et al. (Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)) can be used for rice, and Shillito et al. (Bio / Technology 7) for maize. : 581 (1989)) and Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603 (1990)), and for potatoes, Visser et al. (Theor. Appl. Genet 78: 594 (1989)). In the case of tobacco, the method of Nagata and Takebe (Planta 99:12 (1971)) can be cited, and in the case of Arabidopsis, the method of Akama et al. (Plant Cell Reports 12: 7-11 (1992)) can be cited as eucalyptus. Then, the method of Toi et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 8-89113) can be mentioned.
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。
この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法(Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に準じて実施することができる。
In addition, the presence of introduced foreign DNA in a transformed plant that has been regenerated and cultivated in this way can be analyzed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of the DNA in the plant body. Can be confirmed.
In this case, extraction of DNA from the transformed plant body can be performed according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNA、あるいは本発明により改変されたDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。 When the foreign gene comprising the DNA of the present invention present in the regenerated plant body is analyzed using the PCR method, the amplification reaction is performed using the DNA extracted from the regenerated plant body as a template as described above. In addition, an amplification reaction is carried out in a reaction mixture in which the DNA of the present invention or a synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA modified according to the present invention is used as a primer. You can also. In the amplification reaction, DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times to obtain an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention. When the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, it is possible to confirm that the amplified DNA fragments are fractionated and the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention.
また、本発明のEro1遺伝子の発現を抑制するDNAの植物体への導入により、Ero1遺伝子の発現が抑制されたか否かは実施例の方法により確認することが可能である。
具体的には、ウェスタンブロッティング法によりEro1タンパク質発現レベルを解析する方法や種子貯蔵タンパク質の蓄積量を比較解析する方法が挙げられる。本発明においてはEro1タンパク質発現レベルの減少、プログルテリンの過剰蓄積が認められた場合に、Ero1遺伝子の発現が抑制されていると判断することができる。さらに、Ero1遺伝子の発現が抑制されたか否かを確認する方法として、基質タンパク質-PDI-Ero1電子伝達カスケードの結果生じると考えられる過酸化水素の発生量が減少するか否かの解析、または、α−グロブリンが液胞由来タンパク質顆粒PBIIとして蓄積するか否かを解析することもできる。
Further, whether or not the expression of the Ero1 gene is suppressed by introduction of the DNA that suppresses the expression of the Ero1 gene of the present invention into a plant can be confirmed by the method of the example.
Specifically, a method of analyzing the expression level of Ero1 protein by Western blotting and a method of comparative analysis of the accumulated amount of seed storage protein can be mentioned. In the present invention, when a decrease in Ero1 protein expression level and excessive accumulation of proglutelin are observed, it can be determined that the expression of Ero1 gene is suppressed. Furthermore, as a method for confirming whether or not the expression of the Ero1 gene is suppressed, an analysis of whether or not the generation amount of hydrogen peroxide, which is considered to result from the substrate protein-PDI-Ero1 electron transfer cascade, decreases, or It can also be analyzed whether α-globulin accumulates as vacuole-derived protein granules PBII.
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAまたはベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫およびクローンの繁殖材料は、植物の種子休眠を制御する方法に使用することが可能である。 Once a transformed plant into which the DNA of the present invention is introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. The present invention includes plant cells into which the DNA or vector of the present invention has been introduced, plant bodies containing the cells, progeny and clones of the plant bodies, and propagation materials for the plant bodies, their progeny, and clones. These plant cells, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials of the plants, progeny and clones thereof can be used in a method for controlling seed dormancy of plants. .
本発明においては、上記の如く、Ero1遺伝子の発現を抑制することで、植物の細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を網羅的に阻害することができる。本発明の方法で作製した植物は、例えば有用農作物においてタンパク質のジスルフィド結合形成を阻害することが可能である。 In the present invention, as described above, it is possible to comprehensively inhibit the formation of disulfide bonds in plant intracellular proteins by suppressing the expression of the Ero1 gene. Plants produced by the method of the present invention can inhibit protein disulfide bond formation in useful crops, for example.
さらに、Ero1遺伝子の配列情報を基に、植物の内因性のEro1遺伝子の発現を抑制するために用いる、アンチセンスRNAをコードするDNA、dsRNAをコードするDNA、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、さらにアプタマーをコードするDNA等を作製することも可能である。作製されたDNAは、植物のタンパク質のジスルフィド結合を阻害するために使用できる。 Furthermore, DNA encoding antisense RNA, DNA encoding dsRNA, and DNA encoding ribozyme activity are used to suppress the expression of endogenous Ero1 gene in plants based on the sequence information of Ero1 gene. Furthermore, it is also possible to prepare DNA or the like encoding an aptamer. The produced DNA can be used to inhibit disulfide bonds in plant proteins.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[材料および方法]
(1)Ero1 RNA干渉誘導ベクターの構築およびイネ形質転換
イネ(Oryza sativa cv Nipponbare)種子より全RNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを調製した。cDNAを鋳型としてPCRを行い、イネEro1(Os03g0733800)のVal-119からLys-410をコードするDNA断片を増幅した。センス鎖およびアンチセンス鎖を連結した逆方向反復配列断片を調製し、hygromycin phosphotransferaseを含むバイナリーベクター(Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153)のα-グロブリン(Glb)遺伝子プロモーター下流に制限酵素認識部位を用いて導入して、Ero1 RNA干渉誘導ベクターを作製した(図1A)。
Ero1 RNA干渉誘導下で、GFP-GlbもしくはGFP-GlbΔC融合タンパク質を発現させるバイナリーベクター(BV)は、下記DV(Destination Vector)およびEV(Entry Vector)間における付着部位(att)組換えにより計四種作製した(DV1xEV1; DV1xEV2; DV2xEV1; DV2xEV2)(図3)。
具体的には、DVはGlbプロモーター下流にsp-GFP-Glbもしくはsp-GFP-GlbΔCを含むバイナリーベクター(Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153)に、attR1-CmR-ccdB-attR2断片(Invitrogen)を導入し作製した(DV1およびDV2)。
また、EVは上記Ero1遺伝子の逆方向反復配列断片を、pENTRベクター(Invitrogen)のattL1-attL2間に制限酵素部位を用いて導入し作製した。Ero1遺伝子の逆方向反復配列の上流には胚乳で発現する2種のプロモーター、Gt1(Zheng, Z., et al., (1993) Plant J. 4, 357-366)(EV1)およびAPS2bプロモーター(EV2)(恩田・川越,2006年農芸化学会発表; Ohdan, T., et al., (2005) J. Exp. Bot. 56, 3229-3244)を連結した。Gt1プロモーターはGt1遺伝子(AK107314)の開始コドンより上流2530塩基、APS2bプロモーターはAPS2b遺伝子(AK103906)の5'-UTRを含む2048塩基を、ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅した.Ero1遺伝子の逆方向反復配列下流にはGt1ターミネーターを連結し、これはGt1遺伝子(AK107314)の終始コドンより下流944塩基を同様にして単離した。
イネの形質転換は上記ベクターを用いアグロバクテリウム法により行った(Goto, F., et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17, 282-286)。
[Materials and methods]
(1) Construction of Ero1 RNA interference induction vector and rice transformation Total RNA was extracted from rice (Oryza sativa cv Nipponbare) seeds, and cDNA was prepared by reverse transcription reaction. PCR was performed using cDNA as a template, and a DNA fragment encoding Lys-410 was amplified from Val-119 of rice Ero1 (Os03g0733800). An inverted repeat fragment ligated with the sense strand and antisense strand was prepared and α-globulin of a binary vector containing hygromycin phosphotransferase (Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153) Glb) gene was introduced downstream of the gene promoter using a restriction enzyme recognition site to prepare an Ero1 RNA interference induction vector (FIG. 1A).
A binary vector (BV) that expresses a GFP-Glb or GFP-GlbΔC fusion protein under induction of Ero1 RNA interference was calculated by recombination of the attachment site (att) between the following DV (Destination Vector) and EV (Entry Vector). Seed preparation (DV1xEV1; DV1xEV2; DV2xEV1; DV2xEV2) (Figure 3).
Specifically, DV is transferred to a binary vector (Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153) containing sp-GFP-Glb or sp-GFP-GlbΔC downstream of the Glb promoter. -Cm R -ccdB-attR2 fragment (Invitrogen) was introduced and prepared (DV1 and DV2).
EV was prepared by introducing the inverted repeat fragment of the above Ero1 gene using a restriction enzyme site between attL1-attL2 of the pENTR vector (Invitrogen). Upstream of the inverted repeat of Ero1 gene are two promoters expressed in endosperm, Gt1 (Zheng, Z., et al., (1993) Plant J. 4, 357-366) (EV1) and APS2b promoter ( EV2) (Onda and Kawagoe, 2006 Agricultural Chemistry Society presentation; Ohdan, T., et al., (2005) J. Exp. Bot. 56, 3229-3244). The Gt1 promoter was amplified by PCR using 2530 bases upstream from the start codon of the Gt1 gene (AK107314), the APS2b promoter was 2048 bases containing the 5'-UTR of the APS2b gene (AK103906), and genomic DNA as a template. A Gt1 terminator was ligated downstream of the inverted repeat of the Ero1 gene, and 944 bases downstream from the stop codon of the Gt1 gene (AK107314) were similarly isolated.
Rice transformation was performed by the Agrobacterium method using the above vector (Goto, F., et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17, 282-286).
(2)共焦点レーザー顕微鏡観察
Ero1 RNA干渉誘導下で、GFP-Glb融合タンパク質を共発現させた形質転換体について(図3)、T1登熟種子より切片(100 μm)を作製した。この切片の胚乳アリューロン層の隣接細胞におけるGFP蛍光像を、共焦点レーザー顕微鏡(TCS SP2 AOBS, Leica Microsystems)により連続的に取得した。コントロールとしてGFP-Glb融合タンパク質のみを発現させた形質転換体についても同様に解析を行った。
胚乳細胞における過酸化水素発生は過酸化水素特異的蛍光プローブを用いて可視化した。野生型登熟種子切片(100 μm)を、過酸化水素特異的蛍光プローブBES-H2O2(Wako)を5 μM含む1xPBS緩衝液に浸し、室温で30分間反応させた後、蛍光像を共焦点レーザー顕微鏡により観察した(励起波長:488 nm;蛍光波長:505-555 nm)。なお、BES-H2O2の過酸化水素特異性を確認するため、スーパーオキシド特異的蛍光プローブBES-So(Wako)を用いて反応を行った。その結果、BES-H2O2とは異なり蛍光は検出されず(データ未記載)、BES-H2O2が過酸化水素特異的に反応することを確認した。PBIはローダミン染色(Rhodamine B、Sigma)により可視化した。
(2) Confocal laser microscope observation
For the transformant co-expressed with the GFP-Glb fusion protein under the induction of Ero1 RNA interference (FIG. 3), a section (100 μm) was prepared from the T1 ripened seed. The GFP fluorescence image in the adjacent cell of the endosperm aleurone layer of this section was continuously acquired with a confocal laser microscope (TCS SP2 AOBS, Leica Microsystems). As a control, a transformant expressing only the GFP-Glb fusion protein was similarly analyzed.
Hydrogen peroxide generation in the endosperm cells was visualized using a hydrogen peroxide specific fluorescent probe. Wild-type matured seed slices (100 μm) were immersed in 1xPBS buffer containing 5 μM of hydrogen peroxide-specific fluorescent probe BES-H 2 O 2 (Wako), reacted at room temperature for 30 minutes, Observation was performed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 488 nm; fluorescence wavelength: 505-555 nm). In addition, in order to confirm the hydrogen peroxide specificity of BES-H 2 O 2 , a reaction was performed using a superoxide-specific fluorescent probe BES-So (Wako). As a result, unlike BES-H 2 O 2 , no fluorescence was detected (data not shown), and it was confirmed that BES-H 2 O 2 reacted specifically with hydrogen peroxide. PBI was visualized by rhodamine staining (Rhodamine B, Sigma).
(3)種子貯蔵タンパク質全抽出および電気泳動
野生型もしくはEro1 RNA干渉形質転換体のT1登熟種子を液体窒素中で破砕し、SDS-Urea緩衝液(50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 8 M Urea, 4 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) glycerol, 5 % (v/v) 2-mercaptoethanol)に懸濁した(種子20 mg/ 700 mL)。25℃で4時間振とうし、全抽出タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)(アクリルアミド14 %)により分離した。
(3) Seed storage protein total extraction and electrophoresis Wild-type or Ero1 RNA interference transformant T1 ripened seeds were disrupted in liquid nitrogen and SDS-Urea buffer (50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 8 M Urea, 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glycerol, 5% (v / v) 2-mercaptoethanol) (seed 20 mg / 700 mL). After shaking at 25 ° C. for 4 hours, the total extracted protein was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (acrylamide 14%).
(4)ウエスタン解析
(3)で抽出した種子全タンパク質をSDS-PAGEで分離し,polyvinyliden difluoride膜(ATTO)に電気的転写後、抗イネEro1ウサギ抗体と反応させた。抗原-抗体複合体は、Horseradish peroxidase標識抗ウサギ抗体(ロバ)(Amersham Biosciences)を用いて、ECL(Amersham Biosciences)により検出した。抗体作製に用いた抗原イネEro1タンパク質は、下記の方法で調製した。
イネESTクローン(OSJNEc05N03)を鋳型としてPCRを行い、Ero1のArg-57からC末端までをコードするDNA断片を増幅した。得られたPCR断片を、制限酵素部位を用いてpQE30(QIAGEN)に導入し、N末端6xHisタグ組換えタンパク質発現ベクターを構築した(Ero1/pQE30)。宿主大腸菌BL21をEro1/pQE30で形質転換し、Ampicillin(50 μg/mL)を含むLB液体培地中37℃で前培養した。Isopropyl-β-D(-)-thiogaractopyranoside (1 mM)を添加後、37℃で2時間培養し、遠心(5000 rpm, 5分間)により集菌した。
大腸菌細胞を緩衝液A(20 mM Tris-Cl, pH7.5, 2 mM EDTA, 0.2 M NaCl, 1 mg/mL lysozyme)中で超音波破砕後遠心(13000 rpm, 10分間)し、得られた沈殿画分を緩衝液B(100 mM Tris-Cl, pH7.5, 2 mM EDTA, 0.2 M NaCl, 1% (w/v) deoxycholic acid, 1 % (v/v) Nonidet P40, 10 mM 2-mercaptoethanol)に懸濁洗浄後、上記遠心により目的タンパク質を封入体として回収した。封入体を緩衝液C(50 mM リン酸緩衝液, pH 8.0, 250 mM KCl, 8 M Urea, 10 % (v/v) glycerol)に懸濁後遠心(10000 rpm, 20分間)し、上精よりEro1タンパク質をNi-NTA Agarose(QIAGEN)樹脂を用いて精製した。
(4) Western analysis The seed total protein extracted in (3) was separated by SDS-PAGE, electrically transferred to a polyvinyliden difluoride membrane (ATTO), and then reacted with an anti-rice Ero1 rabbit antibody. Antigen-antibody complexes were detected by ECL (Amersham Biosciences) using a Horseradish peroxidase labeled anti-rabbit antibody (donkey) (Amersham Biosciences). Antigen rice Ero1 protein used for antibody production was prepared by the following method.
PCR was performed using rice EST clone (OSJNEc05N03) as a template to amplify a DNA fragment encoding from Arg-57 to C-terminus of Ero1. The obtained PCR fragment was introduced into pQE30 (QIAGEN) using a restriction enzyme site to construct an N-terminal 6xHis-tagged recombinant protein expression vector (Ero1 / pQE30). Host E. coli BL21 was transformed with Ero1 / pQE30 and pre-cultured at 37 ° C. in an LB liquid medium containing Ampicillin (50 μg / mL). Isopropyl-β-D (-)-thiogaractopyranoside (1 mM) was added, followed by culturing at 37 ° C. for 2 hours, and collection by centrifugation (5000 rpm, 5 minutes).
E. coli cells were obtained by sonication in buffer A (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.2 M NaCl, 1 mg / mL lysozyme) followed by centrifugation (13000 rpm, 10 minutes). Precipitate fraction was added to buffer B (100 mM Tris-Cl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.2 M NaCl, 1% (w / v) deoxycholic acid, 1% (v / v) Nonidet P40, 10 mM 2- After suspension washing in mercaptoethanol), the target protein was collected as inclusion bodies by centrifugation. Suspend the inclusion body in buffer C (50 mM phosphate buffer, pH 8.0, 250 mM KCl, 8 M Urea, 10% (v / v) glycerol), and centrifuge (10000 rpm, 20 minutes). The Ero1 protein was further purified using Ni-NTA Agarose (QIAGEN) resin.
〔実施例1〕 イネEro1遺伝子発現の胚乳特異的抑制
イネEro1ホモログは第3染色体にコードされている。本発明では極めて高い配列特異性を有するRNA干渉法によりイネEro1遺伝子発現の抑制を行った。まず、イネEro1遺伝子について、酵母やシロイヌナズナのそれと一次構造上相同性の高い領域をコードするDNA断片を単離した。その逆方向反復配列断片を導入したRNA干渉誘導ベクターを構築し、形質転換イネを作製した(図1A)。
なお、高等植物においてEro1タンパク質を介した酸化的フォールディングが行なわれている場合には、Ero1遺伝子は植物体の生育に必須である可能性がある。そこで植物個体の稔性を維持するため、Ero1遺伝子発現を種子胚乳特異的に抑制した。具体的には、RNA干渉誘導の制御因子として異なる三種の胚乳特異的プロモーターを比較検討した。イネ種子貯蔵タンパク質α-グロブリンもしくはグルテリンをコードする遺伝子(それぞれGlbおよびGt1)と、細胞質型ADP-glucose pyrophosphorylaseのsmall subunitをコードするAPS2b遺伝子のプロモーターを単離し、Ero1遺伝子の逆方向反復配列の上流に連結して、それぞれ形質転換体を作製した。種子稔性はAPS2bプロモーターを使用した場合が最も高く、APS2b>Gt1>=Glbの順で向上した。
作製した形質転換イネの種子より全タンパク質を抽出しEro1タンパク質発現レベルをウエスタン法により比較解析したところ、野生型と比べRNA干渉形質転換体ではEro1タンパク質の発現レベルが顕著に低下し(図1B)、種子におけるEro1遺伝子の発現が本法により抑制されることを確認した。
[Example 1] Endosperm-specific suppression of rice Ero1 gene expression Rice Ero1 homologue is encoded by chromosome 3. In the present invention, rice Ero1 gene expression was suppressed by RNA interference method having extremely high sequence specificity. First, for the rice Ero1 gene, a DNA fragment encoding a region having a high primary homology with those of yeast and Arabidopsis thaliana was isolated. An RNA interference induction vector into which the inverted repeat fragment was introduced was constructed to produce transformed rice (FIG. 1A).
When oxidative folding via Ero1 protein is performed in higher plants, the Ero1 gene may be essential for plant growth. Therefore, in order to maintain the fertility of plant individuals, Ero1 gene expression was specifically suppressed in the seed endosperm. Specifically, we compared three different endosperm specific promoters as regulators of RNA interference induction. Isolate the promoters of rice seed storage protein α-globulin or glutelin (Glb and Gt1 respectively) and APS2b gene encoding the small subunit of cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase, upstream of the inverted repeat of Ero1 gene In this way, transformants were prepared. Seed fertility was highest when the APS2b promoter was used, and improved in the order of APS2b>Gt1> = Glb.
When total protein was extracted from the seeds of the produced transformed rice and the Ero1 protein expression level was compared and analyzed by Western method, the expression level of Ero1 protein was significantly reduced in the RNA interference transformant compared to the wild type (Fig. 1B). It was confirmed that the expression of Ero1 gene in seeds was suppressed by this method.
〔実施例2〕 イネ胚乳細胞におけるEro1タンパク質依存的電子伝達
種子貯蔵タンパク質の蓄積を比較解析したところ、野生型と比較してEro1 RNA干渉形質転換体ではグルテリンが前駆体分子種(プログルテリン)として過剰蓄積した(図1C)。
酵母では、ERにおけるタンパク質の酸化的フォールディングの一連の過程において電子がポリペプチド鎖からEro1タンパク質へと伝達されるが、基質タンパク質-PDI-Ero1電子伝達カスケードの最終電子受容体として酸素分子が報告されている(Tu, B. P., and Weissman, J. S. (2002) Mol. Cell 10, 983-994)。そして、酸素分子への電子供与の結果、過酸化水素等活性酸素種が発生することが示唆されている(Tu, B. P., and Weissman, J. S. (2002) Mol. Cell 10, 983-994; Gross, E., et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 299-304)。本発明においては、種子胚乳細胞においてEro1を介した電子伝達カスケードが機能していることを調べる一つの指標として、過酸化水素の発生に着目した。野生型登熟種子の胚乳生細胞を過酸化水素特異的蛍光プローブと反応後共焦点レーザー顕微鏡解析を行ったところ、強い蛍光(BES蛍光)が検出された(図2A)。ER由来タンパク質顆粒であるPBIはローダミン染色により可視化されるが、BES蛍光はPBIと共局在し、BES蛍光強度はPBI間で差異を示した(図2B)。
以上の結果より、イネ種子胚乳細胞においてEro1タンパク質を介した基質タンパク質-PDI-Ero1電子伝達カスケードが機能していること、およびEro1遺伝子の発現抑制によりその電子伝達が阻害されることが示唆された。
[Example 2] Ero1 protein-dependent electron transfer in rice endosperm cells When the accumulation of seed storage protein was compared and analyzed, glutelin was a precursor molecular species (proglutelin) in Ero1 RNA interference transformants compared to wild type. Overaccumulated (Figure 1C).
In yeast, electrons are transferred from the polypeptide chain to the Ero1 protein during the oxidative folding process of proteins in the ER, but oxygen molecules have been reported as the final electron acceptor of the substrate protein-PDI-Ero1 electron transfer cascade. (Tu, BP, and Weissman, JS (2002) Mol. Cell 10, 983-994). And it is suggested that reactive oxygen species such as hydrogen peroxide are generated as a result of electron donation to oxygen molecules (Tu, BP, and Weissman, JS (2002) Mol. Cell 10, 983-994; Gross, E., et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 299-304). In the present invention, attention has been focused on the generation of hydrogen peroxide as one index for examining the function of the electron transfer cascade via Ero1 in seed endosperm cells. When endosperm cells of wild-type matured seeds were reacted with a hydrogen peroxide-specific fluorescent probe and analyzed by confocal laser microscopy, strong fluorescence (BES fluorescence) was detected (Fig. 2A). PBI, an ER-derived protein granule, was visualized by rhodamine staining, but BES fluorescence co-localized with PBI, and BES fluorescence intensity showed a difference between PBI (Fig. 2B).
These results suggest that the substrate protein-PDI-Ero1 electron transport cascade via Ero1 protein functions in rice seed endosperm cells, and that the electron transfer is inhibited by the suppression of Ero1 gene expression. .
〔実施例3〕 Ero1 RNA干渉による種子貯蔵タンパク質の細胞内蓄積への影響
α-グロブリンはA, B, C 三つの領域から成り、それぞれシステイン残基を含むコンセンサス配列を有する(領域A, L45xxC48(配列番号:7); 領域B, C78C79xQ81L82(配列番号:8); 領域C, P168xxC171(配列番号:9))。先行研究でα-グロブリンは最終的に液胞由来タンパク質顆粒PBIIとして蓄積し、α-グロブリンのPBII局在化には領域B-C間分子内ジスルフィド結合形成が必須であることが報告されている(Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153)。
そこで、Ero1遺伝子発現抑制のα-グロブリン(Glb)細胞内蓄積への影響を調べるため、Ero1 RNA干渉をGt1もしくはAPS2bプロモーター(それぞれPGt1もしくはPAPS2b)制御下誘導し、GFP-Glb融合タンパク質を共発現させた(図3A, 3Bおよび3C上段)。
登熟種子切片について共焦点レーザー解析を行ったところ、Ero1 RNA干渉形質転換体においてGFP蛍光は野生型とは異なる形状を示した。具体的には、野生型ではGFP蛍光が直径約4μmの球状として観察されるのに対し、PGt1::Ero1 RNA干渉形質転換体ではPBIIとは区別される小さい顆粒が多く観察され、PAPS2b::Ero1 RNA干渉形質転換体においても小さい顆粒として観察された(図4)。
一方、領域Cを欠損したα-グロブリン(GlbΔC)はPBIに局在し、これは分子間ジスルフィド結合形成依存的である(Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153)。そこでEro1 RNA干渉誘導下で、GFP-GlbΔC融合タンパク質を共発現させ(図3A, 3Bおよび3C下段)、同様に解析を行った。その結果、PGt1::Ero1 RNA干渉形質転換体およびPAPS2b::Ero1 RNA干渉形質転換体ではGFP蛍光が大小の顆粒さらにネットワーク状として観察され(図5)、野生型における典型的なPBIとは異なる形状を示した(図2B, 右パネル ローダミン)。
これらの結果より、Ero1が胚乳細胞におけるタンパク質顆粒形成に重要であり、Ero1遺伝子の発現抑制により種子タンパク質のジスルフィド結合形成が阻害されることが示唆された。
[Example 3] Effect of Ero1 RNA interference on intracellular accumulation of seed storage protein α-globulin is composed of three regions, A, B and C, each having a consensus sequence containing cysteine residues (regions A and L 45). xxC 48 (SEQ ID NO: 7); region B, C 78 C 79 xQ 81 L 82 (SEQ ID NO: 8); region C, P 168 xxC 171 (SEQ ID NO: 9)). Previous studies have reported that α-globulin eventually accumulates as vacuolar-derived protein granules PBII, and that intradomain BC interstitial disulfide bond formation is essential for α-globulin PBII localization (Kawagoe , Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141-1153).
Therefore, in order to investigate the effect of Ero1 gene expression suppression on α-globulin (Glb) intracellular accumulation, Ero1 RNA interference was induced under the control of Gt1 or APS2b promoter (PGt1 or PAPS2b, respectively) and GFP-Glb fusion protein was co-expressed (FIG. 3A, 3B and 3C upper stage).
When confocal laser analysis was performed on ripened seed slices, GFP fluorescence showed a different shape from the wild type in Ero1 RNA interference transformants. Specifically, in the wild type, GFP fluorescence is observed as a sphere with a diameter of about 4 μm, whereas in the PGt1 :: Ero1 RNA interference transformant, many small granules that are distinct from PBII are observed, and PAPS2b :: It was also observed as small granules in the Ero1 RNA interference transformant (FIG. 4).
On the other hand, α-globulin lacking region C (GlbΔC) is localized in PBI, which is dependent on intermolecular disulfide bond formation (Kawagoe, Y., et al., (2005) Plant Cell 17, 1141- 1153). Therefore, under the induction of Ero1 RNA interference, the GFP-GlbΔC fusion protein was coexpressed (FIG. 3A, 3B and 3C bottom) and analyzed in the same manner. As a result, GFP fluorescence was observed as large and small granules and as a network in PGt1 :: Ero1 RNA interference transformant and PAPS2b :: Ero1 RNA interference transformant (FIG. 5), which is different from typical PBI in wild type The shape was shown (Figure 2B, right panel rhodamine).
These results suggest that Ero1 is important for protein granule formation in endosperm cells, and that suppression of Ero1 gene expression inhibits the formation of disulfide bonds in seed proteins.
Claims (13)
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において30アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含み、細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を促進する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上の配列同一性を有し、細胞内タンパク質のジスルフィド結合形成を促進する機能を有するタンパク質をコードするDNA。 Comprehensively inhibits the formation of disulfide bonds of the intracellular protein characterized by suppressing the expression of the endogenous DNA described in any of (a) to (d) below in the plant cell Method.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) SEQ ID NO: 2 amino acids within 30 amino acids in the amino acid sequence set forth in substitution, see containing deletion, insertion, and / or an amino acid sequence added, it has the function of promoting disulfide bond formation of intracellular proteins DNA encoding a protein.
(D) DNA encoding a protein having a sequence identity of 90% or more with the DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a function of promoting the formation of disulfide bonds in intracellular proteins .
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において30アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含み、プロテインジスルフィドイソメラーゼの酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上の配列同一性を有し、プロテインジスルフィドイソメラーゼの酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA。 A method for inhibiting the oxidative activity of protein disulfide isomerase, comprising suppressing endogenous expression of the DNA according to any one of (a) to (d) below in a plant cell.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) SEQ ID NO: 2 amino acid substitutions within 30 amino acids in the amino acid sequence set forth in, deletions, seen including insertion, and / or an amino acid sequence obtained by adding, encoding a protein having an oxidation activity of protein disulfide isomerase DNA .
(D) DNA encoding a protein having a sequence identity of 90% or more with the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having protein disulfide isomerase oxidizing activity .
(i)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(ii)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(iii)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNA。
(iv)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNA。 The method according to any one of claims 1 to 4, further comprising the step of introducing the DNA according to any one of (i) to (iv) below into a plant cell.
(I) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(Ii) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(Iii) DNA encoding a dsRNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(Iv) DNA encoding an aptamer that specifically recognizes the protein encoded by the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(i)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(ii)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(iii)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNA。
(iv)請求項1(a)から(d)のいずれかに記載のDNAがコードするタンパク質を特異的に認識するアプタマーをコードするDNA。 In order to comprehensively inhibit protein disulfide bond formation in plant cells, including the DNA according to any one of (i) to (iv) below or a vector containing the DNA, or a protein disulfide isomerase An agent for inhibiting oxidative activity .
(I) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(Ii) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(Iii) DNA encoding a dsRNA complementary to the transcription product of the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
(Iv) DNA encoding an aptamer that specifically recognizes the protein encoded by the DNA according to any one of claims 1 (a) to (d).
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