JP5278658B2 - Rice photosensitive gene Ehd3 and its utilization - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、植物の感光性に関与する遺伝子および該遺伝子を利用した植物の感光性の改変に関する。植物の感光性の改変は、植物の品種改良などの分野において有用である。 The present invention relates to a gene involved in plant photosensitivity and to modification of plant photosensitivity using the gene. The modification of plant photosensitivity is useful in fields such as plant breeding improvement.
イネの出穂期は主に日長に依存する感光性とそれ以外の要因（基本栄養成長性あるいは感温性）によって決定されている。この出穂期に関する遺伝解析は古くから行われ、これまでSe1座（第6染色体）、E1座（第7染色体）、E2座（不明）、E3座（第3染色体）、あるいはEf1 座（第10染色体）等の出穂期関連遺伝子が突然変異や品種に内在する変異によって見出されている。 The heading time of rice is mainly determined by photosensitivity that depends on day length and other factors (basic nutrient growth or temperature sensitivity). Genetic analysis of this heading stage has been conducted for a long time, and so far Se1 locus (chromosome 6), E1 locus (chromosome 7), E2 locus (unknown), E3 locus (chromosome 3), or Ef1 locus (10th) Genes related to heading time such as chromosomes) have been found by mutations and mutations inherent in varieties.
イネは一般に短日で出穂が促進され、逆に長日では出穂が遅延する。日本の栽培品種では、一般に九州や本州南部の品種は強い感光性をもち、東北や北海道の品種は感光性がないか極めて弱い。イネは感光性を失うと日長の変化によって出穂期が変化せず、一定の生育期間を経ると、出穂する特徴を示す。このようにイネは感光性の有無により、栽培地域や栽培時期などに関する適応性が大きく変化するため、イネの感光性の改変は、イネの品種改良において重要な課題となっている。 In rice, heading is generally promoted on a short day, while heading is delayed on a long day. Among Japanese cultivars, cultivars in Kyushu and southern Honshu generally have strong photosensitivity, while varieties in Tohoku and Hokkaido are not sensitive or very weak. When rice loses its photosensitivity, the heading time does not change due to changes in day length, and it shows the characteristic of heading after a certain growth period. As described above, the adaptability of rice in terms of the cultivation area and the cultivation time varies greatly depending on the presence or absence of photosensitivity. Therefore, modification of rice photosensitivity has become an important issue in improving rice varieties.
従来、イネの品種改良における出穂期の改変は、（1）交雑による早生・晩生系統の選抜や（2）放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。しかしながら、これらの作業には長期間を要し、また変異の程度や方向性を予測できないなど多くの問題が存在していた。 Conventionally, the modification of heading time in rice varieties improvement has been carried out by (1) selection of early and late lines by crossing and (2) mutagenesis by radiation and chemicals. However, these operations require a long time, and there are many problems such as the inability to predict the degree and direction of mutation.
ところで、イネの遺伝学の分野においては、イネの感光性を強くする遺伝子を総称して「感光性遺伝子」と呼んでいる。近年、DNAマーカーがイネの遺伝解析に利用されるようになって、出穂期のような複雑な遺伝に従う形質の遺伝解析（量的形質遺伝子座（QTL）のマッピング）が進展した。この背景のもと、イネの感光性に関与する遺伝子の遺伝学的な同定が進められてきた（非特許文献１、２）。これらのうち、4種類のQTLs、Hd1、 Hd3a、 Hd6およびEhd1については分子レベルで単離・同定されている（非特許文献３−６）。しかしながらイネ品種の早晩性の決定に重要な役割を果たしているその他の遺伝子については、その分子レベルでの実体が解明されていなかった。 By the way, in the field of rice genetics, genes that enhance rice photosensitivity are collectively called “photosensitive genes”. In recent years, DNA markers have been used for genetic analysis of rice, and genetic analysis of traits that follow complex inheritance such as heading time (quantitative trait locus (QTL) mapping) has progressed. Based on this background, genetic identification of genes involved in rice photosensitivity has been advanced (Non-Patent Documents 1 and 2). Among these, four types of QTLs, Hd1, Hd3a, Hd6 and Ehd1 have been isolated and identified at the molecular level (Non-patent Documents 3-6). However, the molecular level of other genes that play an important role in determining the early / late nature of rice varieties has not been elucidated.
イネ感光性遺伝子が単離されれば、これを形質転換法により任意の品種に導入することによって、それらの系統の感光性を改変させ、これによりイネの出穂期を調節することが可能であると考えられる。このため、該遺伝子を利用した品種改良は、簡便性や確実性の面で、従来の方法と比して極めて有利であると言える。 Once rice photosensitivity genes have been isolated, they can be introduced into any cultivar by transformation to modify the photosensitivity of those lines and thereby control the heading time of rice. it is conceivable that. For this reason, it can be said that the breed improvement using the gene is extremely advantageous in comparison with the conventional method in terms of simplicity and certainty.
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な植物の感光性遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変し、これにより植物の開花時期を改変することを目的とする。 This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to provide the photosensitive gene of a novel plant. Another object of the present invention is to modify the photosensitivity of a plant using the gene, thereby altering the flowering time of the plant.
本発明者等は、植物の中でも、特に出穂時期を改変する簡便な方法の開発が望まれているイネに着目し、その感光性に関与する遺伝子を単離すべく鋭意研究を行った。 The inventors of the present invention have paid particular attention to rice for which development of a simple method for modifying the heading time is desired among plants, and conducted earnest research to isolate genes involved in the photosensitivity.
Ehd3遺伝子はイネ日本型品種ササニシキにいもち病抵抗性を導入した「東北IL9号」に放射線照射を行なって得た極晩生突然変異の原因遺伝子であり、第8染色体短腕末端近くに座乗することが明らかとなっている（松原ら、育種学研究8（別1）、2006）。また、「東北IL9号」とehd3突然変異系統「R0521」を異なる日長条件下で栽培し、それらの到穂日数を調査した結果から、Ehd3遺伝子は出穂を促進する機能を有し、突然変異系統ではその機能が欠損していることが推定されていた。 The Ehd3 gene is a causative gene for a very late mutation obtained by irradiation of Tohoku IL9, which introduced rice blast resistance in the rice cultivar Sasanishiki, and sits near the short arm end of chromosome 8 (Matsubara et al., Breeding Studies 8 (Another 1), 2006). In addition, cultivating "Tohoku IL9" and ehd3 mutant line "R0521" under different day length conditions, and examining the number of days to reach, Ehd3 gene has a function to promote heading, mutation It was estimated that the function was deficient in the strain.
本発明者らは、このようにその存在自体は確認されたが、いまだ同定されていない感光性遺伝子Ehd3を単離するために、「R0521」とインド型品種「G4」の戻し交雑後代第１世代を用いた連鎖解析により、Ehd3遺伝子候補領域を37kbに限定した。 In order to isolate the photosensitive gene Ehd3 whose existence itself has been confirmed but has not yet been identified, the present inventors have first established a backcross progeny of “R0521” and the Indian variety “G4”. The candidate Ehd3 gene region was limited to 37 kb by linkage analysis using generations.
さらにこの候補遺伝子領域の解析を行なった結果、他の機能同定されたPHDフィンガーファミリータンパク質のPHDフィンガードメインとは別のグループに属するPHDフィンガードメインを有する、2154kb、563アミノ酸からなるEhd3候補遺伝子の単離に成功した。この遺伝子について相補試験を行なった結果、この遺伝子が長日条件下で出穂を著しく促進させる機能を有するEhd3遺伝子であることが確認された。 Furthermore, as a result of analysis of this candidate gene region, a single Ehd3 candidate gene consisting of 2154 kb and 563 amino acids having a PHD finger domain belonging to a group different from the PHD finger domain of another PHD finger family protein whose function has been identified. Successfully released. As a result of a complementation test for this gene, it was confirmed that this gene is an Ehd3 gene having a function of significantly promoting heading under long day conditions.
即ち、本発明者らは、遺伝学的レベルでしか同定されていなかった出穂期関連遺伝子座Ehd3について、マップベースクローニング法によりその塩基配列を単離・同定した。さらに、イネの出穂期を容易に改変する手法を開発し、これにより本発明を完成するに至った。 That is, the present inventors isolated and identified the base sequence of the heading stage-related locus Ehd3, which had been identified only at the genetic level, by a map-based cloning method. Furthermore, the technique which changes easily the heading time of a rice was developed, and it came to complete this invention by this.
本発明は、より具体的には以下の〔１〕−〔１５〕を提供するものである。
〔１〕 植物の感光性を制御する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔２〕 イネ由来である〔１〕に記載のDNA。
〔３〕 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）〔１〕または〔２〕に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA
（ｂ）〔１〕または〔２〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
（ｃ）植物細胞における発現時に、RNAi効果により、〔１〕または〔２〕に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔１〕または〔２〕に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
〔４〕 植物の感光性を制御するために用いる、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のDNA。
〔５〕 〔１〕に記載のタンパク質の変異体であって、植物の感光性を制御する機能が欠損した植物由来のタンパク質をコードする、下記（ｅ）から（ｈ）に記載のDNA。
（ｅ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｆ）配列番号：４または５に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｇ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA
（ｈ）配列番号：４または５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔６〕 〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
〔７〕 〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAまたは〔６〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔８〕 〔７〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔９〕 〔８〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１０〕 〔８〕または〔９〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１１〕 〔８〕または〔９〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAまたは〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔１２〕 〔１〕または〔２〕に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の出穂を促進する方法。
〔１３〕 植物体の細胞内における、内因性の〔１〕または〔２〕に記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、感光性を制御する方法。
〔１４〕 〔３〕に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕 植物がイネである、〔１２〕から〔１４〕のいずれかに記載の方法。
More specifically, the present invention provides the following [1]-[15].
[1] The DNA according to any one of (a) to (d) below, which encodes a plant-derived protein having a function of controlling plant photosensitivity.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3
(B) DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2
(C) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2
[2] The DNA according to [1], which is derived from rice.
[3] The DNA according to any one of (a) to (d) below.
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of DNA according to [1] or [2]
(B) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of [1] or [2]
(C) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to [1] or [2] due to an RNAi effect during expression in a plant cell
(D) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to [1] or [2] due to a co-suppression effect during expression in plant cells
[4] The DNA according to any one of [1] to [3], which is used for controlling plant photosensitivity.
[5] The DNA according to any one of (e) to (h) below, which is a mutant of the protein according to [1] and encodes a plant-derived protein that lacks the function of controlling plant photosensitivity.
(E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
(G) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(H) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
[6] A vector comprising the DNA according to any one of [1] to [5].
[7] A transformed plant cell carrying the DNA according to any one of [1] to [5] or the vector according to [6].
[8] A transformed plant comprising the transformed plant cell according to [7].
[9] A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to [8].
[10] A propagation material for the transformed plant according to [8] or [9].
[11] A method for producing a transformed plant according to [8] or [9], wherein the DNA according to any one of [1] to [5] or the vector according to [6] is applied to a plant cell. A method comprising introducing and regenerating a plant from the plant cell.
[12] A method for promoting heading of a plant, comprising expressing the DNA according to [1] or [2] in a cell of the plant body.
[13] A method for controlling photosensitivity, which comprises suppressing endogenous expression of the DNA according to [1] or [2] in a plant cell.
[14] The method according to [13], wherein the DNA according to [3] is introduced into a plant.
[15] The method according to any one of [12] to [14], wherein the plant is rice.
本発明により、単離したEhd3遺伝子の利用による出穂期の新しい改変法を確立することができた。すなわち、単離・同定した出穂促進遺伝子Ehd3は、短日条件、日本の夏期のイネの栽培期間の自然日長条件、そして特に長日条件での出穂促進に必要不可欠な因子である。 According to the present invention, it was possible to establish a new modification method of heading stage by utilizing the isolated Ehd3 gene. That is, the isolated and identified heading-promoting gene Ehd3 is an essential factor for promoting heading under short-day conditions, natural day length conditions during the Japanese rice cultivation period in summer, and particularly under long-day conditions.
本発明で単離した出穂促進遺伝子Ehd3を利用することにより、イネの出穂期を容易に変化させ、異なる地域に適応したイネ品種育成に貢献できると考えられる。
具体的には、Ehd3遺伝子の発現をRNAiコンストラクトの形質転換等により制御することで、イネの出穂遅延を図ることができる。形質転換に要する期間は交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、他の形質の変化を伴わないで出穂期の改変が可能となる。
By using the heading-promoting gene Ehd3 isolated in the present invention, it is considered that the heading time of rice can be easily changed and it can contribute to the breeding of rice varieties adapted to different regions.
Specifically, the heading delay of rice can be achieved by controlling the expression of the Ehd3 gene by transformation of an RNAi construct or the like. The period required for transformation is extremely short compared to gene transfer by mating, and the heading time can be modified without changing other traits.
〔発明の実施の形態〕
本発明は、植物の新規な感光性遺伝子Ehd3、および該遺伝子を利用して植物の感光性を制御する手法を提供する。本発明者らにより感光性との関係が明らかにされた、イネ「東北IL9号」のEhd3遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：１に、cDNAの塩基配列を配列番号：２に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。また、イネehd3突然変異系統である「R0521」のEhd3遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：４に、cDNAの塩基配列を配列番号：５に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。
[Embodiment of the Invention]
The present invention provides a novel plant photosensitivity gene Ehd3 and a method for controlling plant photosensitivity using the gene. The base sequence of the genomic DNA of the Ehd3 gene of rice “Tohoku IL9”, whose relationship with photosensitivity has been clarified by the present inventors, is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of cDNA in SEQ ID NO: 2, The amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 3. In addition, the base sequence of the genomic DNA of the Ehd3 gene of the rice ehd3 mutant “R0521” is SEQ ID NO: 4, the base sequence of the cDNA is SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded by these genes is sequenced. Number: 6
配列番号：１に記載のゲノムDNAの塩基配列において、1374位〜1611位は5’非翻訳領域、1612位〜1713位、1858位〜2061位、2151位〜2471位、3382位〜3471位、3657位〜3701位および3791位〜4720位はコード領域、4721位〜4942位が3’非翻訳領域である。また、イネehd3突然変異系統である「R0521」のEhd3遺伝子は配列番号：１における3967位〜3977位、11bpの欠失によるフレームシフトでストップコドンが出現し、以降のアミノ酸全てが翻訳されない構造となっている。 In the base sequence of genomic DNA described in SEQ ID NO: 1, positions 1374 to 1611 are 5 ′ untranslated regions, positions 1612 to 1713, positions 1858 to 2061, positions 2151 to 2471, positions 3382 to 3471, Positions 3657 to 3701 and 3791 to 4720 are the coding region, and positions 4721 to 4942 are the 3 ′ untranslated region. In addition, the Ehd3 gene of the rice ehd3 mutant line “R0521” has a structure in which a stop codon appears due to a frame shift due to deletion of 11 bp from position 3967 to position 3977 in SEQ ID NO: 1, and all subsequent amino acids are not translated. It has become.
イネの量的形質遺伝子座（QTL)のEhd3は、これまでイネの感光性に関与する遺伝子座として、イネ第8染色体短腕末端付近という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていた。本発明者らは、マップベースクローニングの手法を利用することにより、イネ第8染色体短腕末端付近におけるEhd3遺伝子の存在領域の絞り込みを行い、遂に単一の遺伝子として同定することに成功した。 The rice quantitative trait locus (QTL) Ehd3 has been known as a locus involved in rice photosensitivity so far that it exists in one of the large regions near the short arm end of rice chromosome 8. It was done. The present inventors have narrowed down the region where the Ehd3 gene is present near the end of the short arm of chromosome 8 by using a map-based cloning technique, and finally succeeded in identifying it as a single gene.
本発明は、植物の感光性を制御する機能を有する植物由来のEhd遺伝子に関する。
本発明のEhd遺伝子としては、具体的には、植物の感光性を促進する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNAが含まれる。
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
The present invention relates to a plant-derived Ehd gene having a function of controlling plant photosensitivity.
Specifically, the Ehd gene of the present invention includes a DNA described in any one of (a) to (d) below, which encodes a plant-derived protein having a function of promoting plant photosensitivity.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2.
(C) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(D) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
本発明のEhd3遺伝子がコードするタンパク質は、C末端側に３つのPHDフィンガードメインを持つ独特の構造を有する。本発明のEhd3遺伝子に存在するPHDフィンガードメインの解析の結果、これらのPHDフィンガードメインはこれまでに機能同定された他のPHDフィンガーファミリータンパク質のPHDフィンガードメインとは別のグループに属することが明らかとなった（図５）。現在までにその機能が確認されているPHDフィンガータンパク質は花粉形成に関わることが明らかとなっており、このことからも本発明のEhd3タンパク質はこれらのPHDフィンガータンパク質とは異なる機能を有するといえる。
本発明のEhd3遺伝子を利用することにより、例えば、組み換えタンパク質の調製や感光性が改変された形質転換植物体を作出することなどが可能となる。
The protein encoded by the Ehd3 gene of the present invention has a unique structure having three PHD finger domains on the C-terminal side. Analysis of the PHD finger domains present in the Ehd3 gene of the present invention revealed that these PHD finger domains belong to a group different from the PHD finger domains of other PHD finger family proteins whose functions have been identified so far. (Fig. 5). It has been clarified that PHD finger proteins whose functions have been confirmed so far are involved in pollen formation. From this, it can be said that the Ehd3 protein of the present invention has a function different from these PHD finger proteins.
By using the Ehd3 gene of the present invention, for example, it is possible to prepare a recombinant protein or to produce a transformed plant with altered photosensitivity.
本発明において、本発明の遺伝子が由来する植物としては、特に制限はないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。また例えば花卉植物としては、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の遺伝子が由来する植物として、好ましくは単子葉植物が挙げられ、より好ましくは、イネを挙げることができる。 In the present invention, the plant from which the gene of the present invention is derived is not particularly limited, for example, rice, corn, wheat, barley, oat, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, sugar cane, Examples thereof include monocotyledonous plants such as pearl millet and dicotyledonous plants such as rapeseed, soybean, cotton, tomato and potato. Examples of flowering plants include chrysanthemum, roses, carnations, and cyclamen, but are not limited thereto. The plant from which the gene of the present invention is derived is preferably a monocotyledonous plant, more preferably rice.
本発明の「Ehd3遺伝子」は、「Ehd3タンパク質」をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、「Ehd3遺伝子」には、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。また、Ehd3遺伝子はEhd3タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。 The "Ehd3 gene" of the present invention is not particularly limited as long as it can encode "Ehd3 protein". "Ehd3 gene" includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, etc. in addition to cDNA. It is. Moreover, as long as the Ehd3 gene encodes the Ehd3 protein, DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
本発明の遺伝子のコード領域は、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における1612位〜1713位、1858位〜2061位、2151位〜2471位、3382位〜3471位、3657位〜3701位および3791位〜4720位、配列番号：２に記載の塩基配列における239位〜1930位、配列番号：４に記載の塩基配列におけるおける1612位〜1713位、1858位〜2061位、2151位〜2471位、3382位〜3471位、3657位〜3701位および3791位〜3970位、配列番号：５の塩基配列における239位〜1180位の領域を挙げることができる。 The coding region of the gene of the present invention is, for example, positions 1612 to 1713, positions 1858 to 2061, positions 2151 to 2471, positions 3382 to 3471, positions 3657 to 3701 in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. And positions 3791 to 4720, positions 239 to 1930 in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, positions 1612 to 1713, positions 1858 to 2061, positions 2151 to 2471 in the base sequence described in SEQ ID NO: 4. , Positions 3382 to 3471, 3657 to 3701 and 3791 to 3970, and the region of positions 239 to 1180 in the base sequence of SEQ ID NO: 5.
ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、Ehd3遺伝子（例えば、配列番号：１または２のいずれかに記載のDNA）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより当該クローンを得、調製することが可能である。また、Ehd3遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。 Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from a plant, a genomic library (vectors such as plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used), expanded, and Ehd3 gene (for example, The clone can be obtained and prepared by colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the DNA described in SEQ ID NO: 1 or 2. It is also possible to prepare a primer specific to the Ehd3 gene and perform PCR using this primer. In addition, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a plant, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization in the same manner as described above. Alternatively, it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR.
さらに、Ehd3遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため、Ehd3遺伝子には、種々の植物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、イネにおけるEhd3遺伝子産物と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を指す。このようなタンパク質には、例えば、Ehd3タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、Ehd3タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, since the Ehd3 gene is considered to exist widely in the plant kingdom, the Ehd3 gene includes homologous genes existing in various plants. Here, the “homologous gene” refers to a gene encoding a protein functionally equivalent to the Ehd3 gene product in rice in various plants. Examples of such proteins include, but are not limited to, Ehd3 protein mutants, alleles, variants, homologs, partial peptides of Ehd3 protein, or fusion proteins with other proteins.
本発明におけるEhd3タンパク質の変異体としては、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、Ehd3タンパク質の変異体として挙げることができる。 The Ehd3 protein variant in the present invention is a naturally occurring protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. And a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. A protein encoded by naturally-occurring DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, wherein the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 A protein that is functionally equivalent to a protein consisting of can also be cited as a variant of the Ehd3 protein.
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T、Y）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。 In the present invention, the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids). The amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T, Y), an amino acid having an aliphatic side chain (A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T), an amino acid having a sulfur atom-containing side chain ( C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, H), amino acids with aromatic-containing side chains (F , Y, W) can be mentioned (the parentheses represent single letter symbols of amino acids). It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence maintains its biological activity. Yes.
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、Ehd3タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、Ehd3タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、例えば感光性を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。 In the present invention, “functionally equivalent” means that the target protein has a biological function or biochemical function equivalent to that of the Ehd3 protein. In the present invention, examples of the biological function and biochemical function of the Ehd3 protein include photosensitivity. Biological properties include the specificity of the site to be expressed and the expression level.
相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Ehd3遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：１または２のいずれかに記載のDNA）もしくはその一部をプローブとして、またEhd3遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からEhd3遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。 Methods well known to those skilled in the art for isolating homologous genes include hybridization techniques (Southern, EM, Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki). , RK, et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, vol. 239, 487-491, 1988). That is, for those skilled in the art, an oligonucleotide that specifically hybridizes to the Ehd3 gene using the nucleotide sequence of the Ehd3 gene (for example, the DNA described in either SEQ ID NO: 1 or 2) or a part thereof as a probe. As a primer, isolating a homologous gene of the Ehd3 gene from various plants is usually possible.
このような相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4xSSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 In order to isolate DNA encoding such a homologous gene, a hybridization reaction is usually carried out under stringent conditions. Those skilled in the art can appropriately select stringent hybridization conditions. One example is pretreatment overnight at 42 ° C. in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 × SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 × Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA. After hybridization, a labeled probe is added and hybridization is performed by incubating overnight at 42 ° C. The cleaning solution and temperature conditions for the subsequent cleaning are about 1xSSC, 0.1% SDS, 37 ° C, more severe conditions are about 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and more severe conditions are about 0.2xSSC. , 0.1% SDS, about 65 ° C. ”. Thus, isolation of DNA having high homology with the probe sequence can be expected as the conditions for washing hybridization are more severe. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
単離されたDNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。 The homology of the isolated DNA is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) in the entire amino acid sequence. And the like). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Yes. When analyzing a base sequence by BLASTN, parameters are set to score = 100 and wordlength = 12, for example. Further, when the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
また、本発明は植物の感光性を制御するために用いるDNAであって下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNAを提供する。
（ａ）Ehd3遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA
（ｂ）Ehd3遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
（ｃ）植物細胞における発現時に、RNAi効果により、Ehd3遺伝子の発現を抑制するRNAをコードするDNA
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、Ehd3遺伝子の発現を抑制するRNAをコードするDNA
The present invention also provides a DNA as described in any one of (a) to (d) below for use in controlling the photosensitivity of a plant.
(A) DNA encoding antisense RNA complementary to the transcription product of Ehd3 gene
(B) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the Ehd3 gene
(C) DNA encoding RNA that suppresses the expression of the Ehd3 gene due to the RNAi effect during expression in plant cells
(D) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the Ehd3 gene due to a co-suppression effect during expression in plant cells
本発明において、Ehd3遺伝子の発現を抑制する植物には特に制限はなく、植物の感光性を制御させたい所望の植物を用いることができるが、産業的な観点からは農作物が好適である。有用農作物としては、特に制限はないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。
これらの感光性を制御するために用いるDNAは、例えば有用農作物において、感光性を制御することで出穂を遅延させるために有用である。
In the present invention, the plant that suppresses the expression of the Ehd3 gene is not particularly limited, and a desired plant that is desired to control the photosensitivity of the plant can be used. However, crops are preferable from an industrial viewpoint. There are no particular restrictions on useful crops, but examples include monocotyledonous plants such as rice, corn, wheat, barley, oat, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, sugarcane, pearl millet, And dicotyledonous plants such as soybean, cotton, tomato and potato.
These DNAs used for controlling photosensitivity are useful for delaying heading by controlling photosensitivity, for example, in useful crops.
本明細書における「Ehd3遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。 As used herein, “suppression of Ehd3 gene expression” includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. Also included is a decrease in expression as well as complete cessation of DNA expression.
「Ehd3遺伝子の発現を抑制するために用いるDNA」の一つの態様は、Ehd3遺伝子と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することにより、初めて実証された（Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986）。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（Krol et. al., Nature 333: 866, 1988）、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。 One embodiment of the “DNA used to suppress the expression of the Ehd3 gene” is a DNA encoding an antisense RNA complementary to the Ehd3 gene. The antisense effect in plant cells was demonstrated for the first time when antisense RNA introduced by electroporation using a transient gene expression method exerts an antisense effect in plants (Ecker and Davis, Proc. Natl Acad. USA, 83: 5372, 1986). Subsequently, tobacco and petunia have also been reported to decrease the expression of target genes by the expression of antisense RNA (Krol et. Al., Nature 333: 866, 1988), and currently suppress gene expression in plants. Established as a means to
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。 There are several factors as described below for the action of an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene. Inhibition of transcription by triplex formation, suppression of transcription by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, transcription inhibition by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, intron and exon Of splicing by hybrid formation at the junction with the protein, suppression of splicing by hybridization with the spliceosome formation site, suppression of transition from the nucleus to the cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with capping sites and poly (A) addition sites Splicing suppression by formation, translation initiation suppression by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, peptization by hybridization with the mRNA translation region and polysome binding site For example, inhibition of gene chain elongation is prevented, and hybridization between nucleic acid and protein interaction sites is performed. They inhibit transcription, splicing, or translation processes and suppress target gene expression (Hirashima and Inoue, "Neurochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid IV Gene Replication and Expression", edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin , pp.319-347, 1993).
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 The antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. In one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the gene is designed, it will be effective for inhibiting translation of the gene. However, sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, a DNA containing an antisense sequence of a non-translated region as well as a translated region of a gene is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
アンチセンスDNAは、例えば、配列番号：１または２に記載のDNAの配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988）などにより調製することが可能である。調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。 Antisense DNA can be prepared by, for example, the phosphorothioate method (Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988) based on the sequence information of DNA described in SEQ ID NO: 1 or 2. Is possible. The prepared DNA can be transformed into a desired plant by a known method. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the transcription product of the endogenous gene of the plant to be transformed, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. . The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) to the transcript of the target gene. In order to effectively inhibit the expression of the target gene using the antisense sequence, the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
内因性のEhd3遺伝子の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990)。 Suppression of endogenous Ehd3 gene expression can also be performed using a DNA encoding a ribozyme. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type or a size of 400 nucleotides or more like M1RNA contained in RNaseP, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, 1990).
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。 For example, the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves on the 3 ′ side of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to form a base pair with A at position 9, and the base at position 15 is In addition to C, it has been shown to be cleaved by A or U (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 228: 225, 1988). If the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA. (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 239: 285, 1988, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990, Koizumi et. Al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989).
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, 及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。 Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, and Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992).
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (Taira et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、Taira et. al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991)。 A ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells. However, at that time, if an extra sequence is added to the 5 ′ end or 3 ′ end of the transcribed RNA, the ribozyme activity may be lost. In such a case, in order to accurately cut out only the ribozyme part from the RNA containing the transcribed ribozyme, another trimming ribozyme that acts in cis for trimming is placed on the 5 'side or 3' side of the ribozyme part. (Taira et.al., Protein Eng. 3: 733, 1990, Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989, Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19 : 3875, 1991, Taira et. Al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991).
また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。 In addition, such structural units can be arranged in tandem so that multiple sites in the target gene can be cleaved, thereby further enhancing the effect (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271 , 1992). Such a ribozyme can be used to specifically cleave the transcription product of the target gene in the present invention, thereby suppressing the expression of the gene.
内在性遺伝子の発現の抑制はさらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる「共抑制」によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997、Curr. Biol. 6: 810, 1996)。 Suppression of endogenous gene expression can also be achieved by “co-suppression” resulting from transformation of DNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence. “Co-suppression” refers to a phenomenon in which the expression of both a foreign gene and a target endogenous gene to be introduced is suppressed when a gene having the same or similar sequence as that of the target endogenous gene is introduced into a plant by transformation. Say. Details of the mechanism of co-suppression are not clear, but are often observed in plants (Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6: 810, 1996).
例えば、Ehd3遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、Ehd3遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からEhd3変異体の形質を有する植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。 For example, in order to obtain a plant body in which the Ehd3 gene is co-suppressed, a vector DNA prepared so that the Ehd3 gene or a DNA having a similar sequence can be expressed is transformed into the target plant, and the resulting plant is obtained. A plant having an Ehd3 mutant trait may be selected from the body. The gene used for co-suppression need not be completely identical to the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% or more).
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。 Furthermore, suppression of the expression of the endogenous gene in the present invention can also be achieved by transforming a gene having a dominant negative trait of the target gene into a plant. A gene having a dominant negative trait refers to a gene having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type gene inherent in a plant by expressing the gene.
「Ehd3遺伝子の発現を抑制するために用いるDNA」の他の一つの態様は、内因性のEhd3遺伝子の転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNAである。RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA（以下dsRNA）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3’末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。 Another embodiment of the “DNA used for suppressing the expression of the Ehd3 gene” is a DNA encoding a dsRNA complementary to a transcription product of an endogenous Ehd3 gene. RNAi is a phenomenon in which, when a double-stranded RNA (hereinafter referred to as dsRNA) having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. When dsRNA of about 40 to several hundred base pairs is introduced into a cell, a RNaseIII-like nuclease called Dicer with a helicase domain is present in the presence of ATP, and dsRNA is about 21 to 23 base pairs from the 3 ′ end. Cut out and produce siRNA (short interference RNA). A protein specific to this siRNA binds to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex). This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the mRNA of the target gene at the center of siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. In addition to this pathway, the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA. There is also a possibility that this dsRNA becomes Dicer's substrate again to generate new siRNA and amplify the action.
本発明のRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。 The RNA of the present invention can be expressed from an antisense coding DNA that encodes an antisense RNA to any region of the target gene mRNA and a sense code DNA that encodes a sense RNA of any region of the target gene mRNA. . Moreover, dsRNA can also be produced from these antisense RNA and sense RNA.
本発明のdsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモーターを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類を異ならせることが好ましい。 When the dsRNA expression system of the present invention is retained in a vector or the like, the antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, and the antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively. There is. For example, antisense RNA and sense RNA can be expressed from the same vector as an antisense RNA in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of the antisense code DNA and the sense code DNA. It can be constructed by constructing an expression cassette and a sense RNA expression cassette, respectively, and inserting these cassettes into the vector in the same direction or in the opposite direction. It is also possible to construct an expression system in which the antisense code DNA and the sense code DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands. In this configuration, one double-stranded DNA (siRNA-encoding DNA) in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof. A promoter is provided oppositely so that it can be expressed. In this case, in order to avoid adding extra sequences downstream of the sense RNA and antisense RNA, a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide. As this terminator, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used. Moreover, in this palindromic style expression system, it is preferable that the types of the two promoters are different.
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。 In addition, as a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from different vectors, for example, antisense coding DNA and an antisense in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of sense coding DNA. An RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be held in different vectors.
本発明のRNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の相同性を有する。 In the RNAi of the present invention, siRNA may be used as dsRNA. “SiRNA” means a double-stranded RNA consisting of short strands that are not toxic in cells, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 Can be ~ 30 base pairs. Alternatively, the siRNA to be expressed is transcribed and the length of the final double-stranded RNA portion is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. be able to. The DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more sequence homology. .
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
本発明は、植物の感光性を制御する機能が欠損したEhd3変異体を含む。
The part of the double-stranded RNA in which the RNAs in dsRNA are paired is not limited to a perfect pair, but mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (no base corresponding to one strand) ) Or the like may include an unpaired portion. In the present invention, both bulges and mismatches may be included in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
The present invention includes Ehd3 mutants that lack the function of controlling plant photosensitivity.
Ehd3変異体は、Ehd3タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。具体的には、Ehd3タンパク質のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、WHAT IF（Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56 ）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、Ehd3タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるPCR法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、Ehd3変異体をそれぞれコードする遺伝子が得られる。 The Ehd3 mutant is produced by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of the Ehd3 protein. Specifically, the secondary structure of the amino acid sequence of the Ehd3 protein is predicted using a known molecular modeling program such as WHAT IF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). Further, it is performed by evaluating the influence on the whole of the amino acid residue to be substituted. After determining the appropriate replacement amino acid residue, each vector is inserted into the Ehd3 mutant by using a vector containing the nucleotide sequence encoding the Ehd3 protein as a template, so that the amino acid is replaced by the usual PCR method. The encoding gene is obtained.
本発明のEhd3変異体としては、より具体的には、植物の感光性を制御する機能が欠損したEhd3変異体であって、植物由来のタンパク質をコードする、下記（ｅ）〜（ｈ）に記載のDNAを挙げることができる。
（ｅ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｆ）配列番号：４または５に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｇ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA
（ｈ）配列番号：４または５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
More specifically, the Ehd3 mutant of the present invention is an Ehd3 mutant that lacks a function of controlling plant photosensitivity, and encodes a plant-derived protein, as described in (e) to (h) below. Mention may be made of the DNA described.
(E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
(G) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(H) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
Ehd3変異体では、最もN末端寄りのPHDフィンガードメイン内の11bpの欠失によるフレームシフトでストップコドンが出現し、PHDフィンガードメインが含まれる領域の全てが失われており、これにより感光性を制御する機能を有さないことが判明した（図３および４）。
例えば有用農作物のEhd3遺伝子をEhd3変異体に改変することで、出穂遅延を図ることができる。
In the Ehd3 mutant, a stop codon appeared due to a frameshift due to an 11 bp deletion in the PHD finger domain closest to the N-terminus, and all regions containing the PHD finger domain were lost, thereby controlling photosensitivity (Figs. 3 and 4).
For example, by changing the Ehd3 gene of a useful crop to an Ehd3 mutant, heading delay can be achieved.
また本発明は、Ehd3遺伝子またはEhd3遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクターならびに形質転換植物細胞を提供する。 The present invention also provides a vector containing the Ehd3 gene or a DNA that suppresses the expression of the Ehd3 gene, and a transformed plant cell.
本発明のベクターには、上述のRNAiを誘導するために構築されたベクターが含まれる。本発明のベクターは、本発明のDNAが含まれるため、細胞に導入された場合には該細胞において転写によって形成される一本鎖RNAが分子内で対合してdsRNAを形成する。このようなRNAiを誘導するために構築されたベクターは、結果として内在性遺伝子の転写活性化を誘導することができる。 The vector of the present invention includes a vector constructed for inducing the above-mentioned RNAi. Since the vector of the present invention contains the DNA of the present invention, when introduced into a cell, single-stranded RNA formed by transcription in the cell paired within the molecule to form dsRNA. A vector constructed for inducing such RNAi can consequently induce transcriptional activation of the endogenous gene.
本発明のベクターとしては、内在性遺伝子の転写活性化に用いられる上記ベクターの他、形質転換体作製のために細胞内で本発明のDNAを発現させるベクター、例えば形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のDNAを発現させるためのベクターも含まれる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えばプラスミド、ファージ、またはコスミドなどを例示することができる。 As the vector of the present invention, in addition to the above-mentioned vector used for the transcriptional activation of the endogenous gene, a vector for expressing the DNA of the present invention in a cell for preparing a transformant, for example, for preparing a transformed plant body Also included are vectors for expressing the DNA of the present invention in plant cells. The vector used for the transformation of plant cells is not particularly limited as long as the inserted gene can be expressed in the cells. For example, a plasmid, a phage, or a cosmid can be exemplified.
また上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。 The “plant cell” includes various forms of plant cells such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like.
本発明のベクターは、本発明のDNAを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有してもよい。 The vector of the present invention may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the DNA of the present invention.
当業者においては、所望のDNAを有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することができる。 Those skilled in the art can appropriately prepare a vector having a desired DNA by a general genetic engineering technique. Usually, various commercially available vectors can be used.
本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持したり、発現させるためにも有用である。 The vector of the present invention is also useful for retaining or expressing the DNA of the present invention in a host cell.
本発明におけるDNAは、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。即ち本発明は、本発明のDNAまたはベクターを保持する宿主細胞を提供する。該ベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のDNAを内在性遺伝子を有する細胞内に導入および発現させる目的としてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でDNAを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）、植物個体であればpBINPLUSベクター（van Engelen, F.A. et al., (1995). pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.）などを例示することができる。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法（Molecular Cloning, 5.61-5.63）により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。 The DNA in the present invention is usually carried (inserted) into an appropriate vector and introduced into a host cell. That is, the present invention provides a host cell carrying the DNA or vector of the present invention. The vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA. For example, if Escherichia coli is used as a host, a pBluescript vector (Stratagene) is preferred as a cloning vector, but commercially available. Various vectors can be used. An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of introducing and expressing the DNA of the present invention into a cell having an endogenous gene. The expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses DNA in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism. For example, in the case of in vitro expression, pBEST vector (manufactured by Promega), E. coli PET vector (manufactured by Invitrogen) if present, pME18S-FL3 vector (GenBank Accession No. AB009864) for cultured cells, pME18S vector (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)) for individual organisms, plants If it is an individual, a pBINPLUS vector (van Engelen, FA et al., (1995). PBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.) May be exemplified. The DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63), for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。本発明のDNAを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。 There is no restriction | limiting in particular as said host cell, According to the objective, various host cells are used. Examples of the cells for expressing the DNA of the present invention include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells ( Examples: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
また、生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポーレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの当業者に公知の方法により生体内に導入する方法などが挙げられる。
植物体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
In addition, as a method for expressing the DNA of the present invention in vivo, the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, polyethylene glycol method, electroporation method, Agrobacterium method, liposome method, cationic liposome method. , Calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (electroporation) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipofection method (GIBCO-BRL) ), A method of introducing into a living body by a method known to those skilled in the art, such as a microinjection method and a particle gun method.
Administration into a plant may be an ex vivo method or an in vivo method.
また、植物体内へ本発明のDNAを導入する場合、DNAは、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて、植物細胞に直接導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。このようなベクターを用いて、植物体内へ本発明のDNAを導入する場合の方法としては、好ましくは、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入するリーフディスク法（Jorgensen, R.A. et al., (1996). Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol. Biol. 31, 957-973.）が挙げられる。 In addition, when the DNA of the present invention is introduced into a plant body, the DNA can be directly introduced into a plant cell using a microinjection method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, etc. It can also be introduced into a plant cell indirectly via a virus or bacterium capable of infecting a plant as a vector. Examples of such viruses include cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus, gemini virus and the like as typical viruses, and Agrobacterium and the like as bacteria. When introducing a gene into a plant by the Agrobacterium method, a commercially available plasmid can be used. As a method for introducing the DNA of the present invention into a plant body using such a vector, the leaf disk method (Jorgensen, RA et al., (1996), preferably introducing a gene via Agrobacterium. ). Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol. Biol. 31, 957-973.).
なおこれら上述の形質転換方法は、宿主となる植物などの種類（例えば単子葉植物、双子葉植物）に応じて適宜選択することが好ましい。 These transformation methods described above are preferably selected as appropriate depending on the type of plant or the like that serves as the host (for example, monocotyledonous plants or dicotyledonous plants).
本発明において「植物」とは、特に制限されないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。花卉植物としては、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等を挙げることができる。 In the present invention, the “plant” is not particularly limited, but monocotyledonous plants such as rice, corn, wheat, barley, oat, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, sugarcane, pearl millet, etc. And dicotyledonous plants such as rapeseed, soybean, cotton, tomato and potato. Examples of flower plants include chrysanthemum, roses, carnations, and cyclamen.
また、本発明は、本発明のDNAまたは本発明のベクターを保持する植物細胞を提供する。さらに本発明は、本発明の植物細胞を含む形質転換植物体を提供する。本発明のDNAまたは本発明のベクターが導入される細胞には、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はない。 The present invention also provides a plant cell carrying the DNA of the present invention or the vector of the present invention. Furthermore, this invention provides the transformed plant body containing the plant cell of this invention. The cells into which the DNA of the present invention or the vector of the present invention is introduced include plant cells for producing transformed plants. There is no restriction | limiting in particular as a plant cell.
本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。 The plant cells of the present invention include cultured cells as well as cells in the plant body. Also included are protoplasts, shoot primordia, multi-buds, and hairy roots.
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法などを挙げることができるが、特に制限されるものではない。いくつかの技術については既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。 Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells. For example, with regard to the technique for producing a transformed plant body, a method for regenerating a plant body by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol, a method for regenerating a plant body by introducing a gene into protoplasts using an electric pulse, or a gene for cells by a particle gun method. Can be mentioned, and a method for regenerating a plant body and a method for regenerating a plant body by introducing a gene via Agrobacterium are not particularly limited. Some techniques have already been established and are widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
本発明のDNAを含むベクターの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入することが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。 In order to efficiently select plant cells transformed by introduction of a vector containing the DNA of the present invention, the above recombinant vector contains an appropriate selection marker gene or is introduced into a plant cell together with a plasmid vector containing a selection marker gene. It is preferable to do. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the neomycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotics kanamycin or gentamicin, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to hygromycin, and the acetyl that is resistant to the herbicide phosphinothricin. Examples include transferase genes.
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられ、ジャガイモであればVisserら（Theor.Appl.Genet 78:594 (1989)）の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99:12(1971)）の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら（Plant Cell Reports 12:7-11 (1992)）の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら（特開平8-89113号公報）の方法が挙げられる。
Plant cells into which the recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing a suitable selection agent according to the type of the introduced selection marker gene and cultured. As a result, transformed plant cultured cells can be obtained.
Transformed plant cells can regenerate plant bodies by redifferentiation. The method of redifferentiation varies depending on the type of plant cell. For example, Fujimura et al. (Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)) can be used for rice, and Shillito et al. (Bio / Technology 7) for maize. : 581 (1989)) and Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603 (1990)), and for potatoes, Visser et al. (Theor. Appl. Genet 78: 594 (1989)). In the case of tobacco, the method of Nagata and Takebe (Planta 99:12 (1971)) can be cited, and in the case of Arabidopsis, the method of Akama et al. (Plant Cell Reports 12: 7-11 (1992)) can be cited as eucalyptus. Then, the method of Toi et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 8-89113) can be mentioned.
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。
この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。
In addition, the presence of introduced foreign DNA in a transformed plant that has been regenerated and cultivated in this way can be analyzed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of the DNA in the plant body. Can be confirmed.
In this case, extraction of DNA from the transformed plant body can be performed according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNA、あるいは本発明により改変されたDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。 When the foreign gene comprising the DNA of the present invention present in the regenerated plant body is analyzed using the PCR method, the amplification reaction is performed using the DNA extracted from the regenerated plant body as a template as described above. In addition, an amplification reaction is carried out in a reaction mixture in which the DNA of the present invention or a synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA modified according to the present invention is used as a primer. You can also In the amplification reaction, DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times to obtain an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention. When the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, it is possible to confirm that the amplified DNA fragments are fractionated and the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention.
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAまたはベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫およびクローンの繁殖材料は、植物の感光性を制御する方法に使用することが可能である。 Once a transformed plant into which the DNA of the present invention is introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. The present invention includes plant cells into which the DNA or vector of the present invention has been introduced, plant bodies containing the cells, progeny and clones of the plant bodies, and propagation materials for the plant bodies, their progeny, and clones. These plant cells, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials of the plants, their progeny and clones can be used in methods for controlling the photosensitivity of plants. .
本発明においては、植物のEhd3遺伝子の発現を促進することで、植物の感光性を増強することができる。本発明の方法で作製した植物は、例えば有用農作物において出穂を促進することが可能である。 In the present invention, the photosensitivity of a plant can be enhanced by promoting the expression of the plant Ehd3 gene. Plants produced by the method of the present invention can promote heading in useful crops, for example.
さらに、Ehd3遺伝子の配列情報を基に、植物の内因性のEhd3遺伝子の発現を抑制するために用いる、アンチセンスRNAをコードするDNA、dsRNAをコードするDNA、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、さらに共抑制効果を有するRNAをコードするDNA等を作製することも可能である。作製されたDNAは、植物の出穂を遅延させるために使用できる。 Furthermore, DNA encoding antisense RNA, DNA encoding dsRNA, and DNA encoding ribozyme activity are used to suppress the expression of endogenous Ehd3 gene in plants based on the sequence information of Ehd3 gene. Furthermore, it is possible to prepare DNA encoding RNA having a co-suppression effect. The produced DNA can be used to delay plant heading.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕 Ehd3遺伝子について
イネ日本型品種ササニシキにいもち病抵抗性を導入した「東北IL9号」に放射線照射を行なって得た極晩生突然変異の原因遺伝子であるEhd3は、遺伝解析により、第８染色体上に位置し（図２A）、野生型の遺伝子が出穂を促進することが明らかとなっていた。小規模分離集団を用いた連鎖解析では、Ehd3遺伝子はSSR（Simple Sequence Repeats）マーカーRM6369およびRM1019とRM6356との間に位置し、RM1381とは共分離することが判明していた(松原ら、育種学研究8（別1）、2006)。しかしながらこの連鎖解析の精度では、マップベースクローニングによる遺伝子の単離・同定は困難であった。「東北IL9号」とehd3突然変異系統「R0521」を異なる日長条件下で栽培し、それらの到穂日数を調査したところ、「R0521」では短日条件および自然日長条件下において「東北IL9号」よりも２２日程度出穂が遅延し、長日条件では365日調査を続けたが出穂しなかった（図１）(松原ら、育種学研究8（別1）、2006)。したがって、野生型遺伝子Ehd3が出穂を促進する機能を有し、突然変異系統ではその機能が欠損していることが推定されていた。
[Example 1] About the Ehd3 gene Ehd3, a causative gene of the extremely late mutation obtained by irradiating "Tohoku IL9" with rice blast resistance introduced into the rice cultivar Sasanishiki, Located on chromosome 8 (FIG. 2A), it was revealed that the wild type gene promotes heading. Linkage analysis using a small segregated population revealed that the Ehd3 gene was located between SRM (Simple Sequence Repeats) markers RM6369 and RM1019 and RM6356 and co-segregated with RM1381 (Matsubara et al., Breeding) Academic Research 8 (Another 1), 2006). However, with this linkage analysis accuracy, it has been difficult to isolate and identify genes by map-based cloning. “Tohoku IL9” and ehd3 mutant line “R0521” were cultivated under different day length conditions and their earliest days were examined. In “R0521”, “Tohoku IL9” was observed under short day conditions and natural day length conditions. The heading was delayed for about 22 days from the “No.” and the heading was continued for 365 days under long day conditions, but the heading did not occur (Fig. 1) (Matsubara et al., Breeding Research 8 (Another 1) 2006). Therefore, it was estimated that the wild-type gene Ehd3 has a function of promoting heading, and the mutant line lacks that function.
〔実施例２〕 高精度連鎖解析
マップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団によるEhd3領域の詳細な連鎖解析を行った。連鎖解析用の集団は「R0521」とインド型品種「G４(Guang Lu Ai 4 , 広陸矮4号)」の戻し交雑後代第１世代を用いた。戻し交雑後代からEhd3領域がヘテロ型となり、他のゲノム領域の大部分（約75％）が「R0521」に置換された個体を選抜した。選抜個体の自殖後代3214個体（F2集団相当）から、Ehd3を挟み込むSSRマーカーRM6369 (プライマー5'-AGCTAGCTTCACCTACCTACCTCACC-3'（配列番号：７）および5'-ATGGTCATGTCGTTGGTTTGC-3'（配列番号：８）)とRM6356 (プライマー5'-GAGACTTGGCGACTCTGATCTGC-3'（配列番号：９）および5'-TGATCTCCTCCTCCTTCGTCTACC-3'（配列番号：１０）) を利用して、Ehd3近傍に生じた組み換え染色体をもつ個体を選抜した。Ehd3遺伝子座の表現型の決定は、F3世代の後代検定によって行った。すなわち選抜個体（F2）の各自殖後代40個体をつくば市の実験圃場において栽培し、各系統内の到穂日数の分離状況からEhd3座の表現型を判定した。連鎖解析の結果、Ehd3はInDel（Insertion/Deletion）マーカーAP3909-1とAP3909-7の間に位置づけられ、それぞれのマーカーとEhd3座との組み換え個体は7個体および1個体であった（図２B）。AP3909-2、AP3909-5およびAP3909-6とは共分離し、最終的にEhd3遺伝子候補領域を約37kbに限定した（図２B）。
[Example 2] High-precision linkage analysis Detailed linkage analysis of the Ehd3 region was performed using a large-scale segregation population essential for map-based cloning. As the group for linkage analysis, the first generation of the backcross progenies of “R0521” and the Indian type “G4 (Guang Lu Ai 4)” was used. From the backcross progeny, individuals were selected in which the Ehd3 region became heterozygous and most of the other genomic regions (about 75%) were replaced with “R0521”. SSR marker RM6369 (primer 5'-AGCTAGCTTCACCTACCTACCTCACC-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-ATGGTCATGTCGTTGGTTTGC-3' (SEQ ID NO: 8) that sandwich Ehd3 from 3214 self-propagating progeny of the selected individuals (corresponding to F2 population) ) And RM6356 (Primers 5'-GAGACTTGGCGACTCTGATCTGC-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5'-TGATCTCCTCCTCCTTCGTCTACC-3' (SEQ ID NO: 10)) are used to select individuals with recombinant chromosomes generated near Ehd3 did. The phenotype of the Ehd3 locus was determined by the F3 generation progeny test. That is, 40 self-propagating progenies of the selected individuals (F2) were cultivated in an experimental field in Tsukuba City, and the phenotype of the Ehd3 locus was determined from the segregation status of arrival days within each line. As a result of linkage analysis, Ehd3 was positioned between InDel (Insertion / Deletion) markers AP3909-1 and AP3909-7, and there were 7 and 1 recombination individuals between each marker and Ehd3 locus (FIG. 2B). . AP3909-2, AP3909-5 and AP3909-6 were co-separated and finally the Ehd3 gene candidate region was limited to about 37 kb (FIG. 2B).
〔実施例３〕 候補遺伝子の特定
Ehd3遺伝子候補領域約37kbおよびその上下流について、既知の日本晴ゲノム塩基配列における予測遺伝子の確認および類似性解析を行ったところ、領域内には４つの遺伝子が存在していることが明らかとなった（図２C）。「東北IL9号」および「R0521」について、Ehd3遺伝子候補領域37kbの全ゲノム塩基配列を解読し、比較を行った。両者の違いは１カ所のみ、予測遺伝子PHD（Plant Homeo Domain）フィンガーファミリータンパク遺伝子のコード領域内に存在していた。そこで、予測されたPHDフィンガーファミリータンパク遺伝子について「東北IL9号」のcDNAの全長を決定し、ゲノム塩基配列と比較したところ、この遺伝子は、6個のエクソンからなり、転写領域の全長は2154bp、563アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた（図３）。また、C末側に３つのPHDフィンガードメインを持つ独特の構造をしており、系統解析により、Ehd3の3つのPHDフィンガードメインが、他の機能同定されたPHDフィンガーファミリータンパク遺伝子のPHDフィンガードメインとは別のグループに属していることが明らかとなった（図５）。Ehd3変異体「R0521」では最もN末寄りのPHDフィンガードメイン内の11bpの欠失によるフレームシフトでストップコドンが出現し、PHDフィンガードメインが含まれる領域の全てが失われていることが判明した（図２C、図３および図４）。これらの結果から、この遺伝子をEhd3の候補として以降の解析を行った。
[Example 3] Identification of candidate genes
Confirmation of the predicted gene and similarity analysis of the known Nipponbare genome sequence for the Ehd3 gene candidate region of about 37 kb and its upstream and downstream revealed that there were four genes in the region. (Figure 2C). For "Tohoku IL9" and "R0521", the entire genome base sequence of the 37 kb Ehd3 gene candidate region was decoded and compared. The only difference between the two was in the coding region of the predicted gene PHD (Plant Homeo Domain) finger family protein gene. Therefore, when the total length of the cDNA of “Tohoku IL9” was determined for the predicted PHD finger family protein gene and compared with the genomic base sequence, this gene consists of 6 exons, and the total length of the transcription region is 2154 bp, It encoded a protein of 563 amino acids (FIG. 3). In addition, it has a unique structure with three PHD finger domains on the C-terminal side, and by phylogenetic analysis, the three PHD finger domains of Ehd3 are combined with the PHD finger domains of other PHD finger family protein genes whose functions have been identified. Was found to belong to another group (Figure 5). In the Ehd3 mutant “R0521”, it was found that a stop codon appeared due to a frameshift due to the 11 bp deletion in the PHD finger domain closest to the N-terminus, and the entire region containing the PHD finger domain was lost ( 2C, 3 and 4). From these results, this gene was used as a candidate for Ehd3 and the subsequent analysis was performed.
〔実施例４〕 Ehd3候補遺伝子の機能証明
形質転換には、PHDフィンガータンパク遺伝子の全長と5’上流域1.2kbおよび3’下流域0.3kbを含む約5.7kbの日本型品種「日本晴」由来のゲノム断片を使用した。「日本晴」を使用した理由は、既にゲノムライブラリーを所持していたことと、相当する5.7kbの塩基配列が「東北IL9号」と全く一致していたためである。「日本晴」のゲノムDNAから作成されたPACライブラリー（Baba et al., Bulletin of the NIAR 14: 41-49, 2000）に対して、Ehd3遺伝子候補領域内の塩基配列を増幅するプライマー対Ehd3-2U/1L（5’-CCAGCGACATCATGCCAAAA-3’ （配列番号：１１）および5’-CAGTCGCAGATCCAGCCTCC-3’ （配列番号：１２））およびEhd3-50U/59L（5’-GTCAACACTCACCACAAATATCA-3’ （配列番号：１３）および5’-AATGGTTTGGTTGATCCTGAAGC-3’ （配列番号：１４））によるスクリーニングを行い、Ehd3候補遺伝子をカバーするPACクローンを選抜した。選抜されたクローンより候補遺伝子領域を含む KpnI-DraI 5.7kb断片（図3）を切り出し、Ti-プラスミドベクターpPZP2H-lac（Fuse et al. Plant Biotechnology 18: 219-222, 2001）に組み込み、アグロバクテリウムを介してehd3突然変異系統「R0521」に導入した。再分化植物体は速やかに長日条件（14.5時間明）のグロースチャンバーに移して育成し、出穂までの所要日数を調査した。形質転換当代（T0）では、ベクターのみを導入した個体（10個体）は200日以上出穂しなかったのに対し、5.7kb断片を導入した個体（1〜8コピー導入、24個体）のすべてが移植後83日までに出穂した（図６）。これより、PHDフィンガー遺伝子を含む5.7kb断片が長日条件下で出穂を著しく遅延させるEhd3遺伝子の作用を持つことが証明された。
以上の結果から、マップベースクローニング法により同定した候補遺伝子がイネの出穂促進遺伝子Ehd3であると判断した。
[Example 4] Proof of function of Ehd3 candidate gene For transformation, the entire length of the PHD finger protein gene and an approximately 5.7 kb Japanese cultivar “Nipponbare” including 1.2 kb of 5 ′ upstream region and 0.3 kb of 3 ′ downstream region Genomic fragments were used. The reason for using “Nipponbare” is that it already had a genomic library and that the corresponding 5.7 kb nucleotide sequence was exactly the same as “Tohoku IL9”. Primer pair Ehd3- for amplifying the nucleotide sequence in the Ehd3 gene candidate region against a PAC library (Baba et al., Bulletin of the NIAR 14: 41-49, 2000) created from genomic DNA of Nipponbare 2U / 1L (5'-CCAGCGACATCATGCCAAAA-3 '(SEQ ID NO: 11) and 5'-CAGTCGCAGATCCAGCCTCC-3' (SEQ ID NO: 12)) and Ehd3-50U / 59L (5'-GTCAACACTCACCACAAATATCA-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5′-AATGGTTTGGTTGATCCTGAAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)) were screened to select PAC clones covering Ehd3 candidate genes. A KpnI-DraI 5.7 kb fragment (Fig. 3) containing the candidate gene region was excised from the selected clone and incorporated into Ti-plasmid vector pPZP2H-lac (Fuse et al. Plant Biotechnology 18: 219-222, 2001). It was introduced into the ehd3 mutant line “R0521” via um. Redifferentiated plants were quickly transferred to a growth chamber under long-day conditions (14.5 hours light) and grown, and the number of days required for heading was investigated. In the transformation generation (T0), individuals (10 individuals) into which only the vector was introduced did not head for more than 200 days, whereas individuals (1 to 8 copies introduced, 24 individuals) into which the 5.7 kb fragment was introduced Heading occurred by 83 days after transplantation (FIG. 6). This proved that the 5.7 kb fragment containing the PHD finger gene has an Ehd3 gene action that significantly delays heading under long-day conditions.
From the above results, it was determined that the candidate gene identified by the map-based cloning method was the rice heading promoting gene Ehd3.
Claims (7)
（ａ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：４に記載の塩基配列における1612位〜1713位、1858位〜2061位、2151位〜2471位、3382位〜3471位、3657位〜3701位および3791位〜3970位のコード領域を含むDNA
（ｃ）配列番号：５に記載の塩基配列における239位〜1180位のコード領域を含むDNA Encoding a protein of plant origin that functions to control the photosensitive deficient of plants, DNA according to the following (a) (c).
(A) SEQ ID NO: 6 DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence of
( B ) codes of positions 1612 to 1713, 1858 to 2061, 2151 to 2471, 3352 to 3471, 3657 to 3701, and 3791 to 3970 in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4. DNA containing the region
(C) DNA containing the coding region at positions 239 to 1180 in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5
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