JP5044765B2 - 新規ペプチド、これを用いたエンドトキシン由来疾患治療剤およびこの治療剤の探索方法 - Google Patents
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Description
Yang QW et al., Novel TLR4-antagonizing peptides inhibit LPS-induced release of inflammatory mediators by monocytes, Biochem Biophys Res Commun. 2005 Apr 15;329(3):846-54. Nagaoka I et al., Augmentation of the lipopolisaccharide-neutralizing activities of human cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues, Clin Diagn Lab Immunol. 2002 Sep;9(5):972-82. Gruber A et al., Structural model of MD-2 and functional role of its basic amino acid clusters involved in cellular LPS recognition, J Biol Chem. 2004 Jul;279(27):28475-82.
No. 9:KRGISPGGGSDAQGEV (16aa)(配列番号15)
No. 24:GIPKQSTSNSTYTPTL (16aa) (配列番号16)
しかし、非特許文献1には、マウスの細胞を用いたin vitroの結果及び動物実験での効果の検討は提示されていない。
同ペプチドのLPS刺激に対する効果は両端のシステイン同士がS-S結合をしている場合にのみ認められ、その抑制レベルはペプチド濃度25μg/mlにおいてLPS刺激により活性化される転写因子NF-κBの活性化レベルを約40から60%程度抑制するに留まり、さらに高濃度におけるペプチドの効果また動物実験で検討結果は提示されていない。
[1]下記アミノ酸配列(1)
X0X1X2X3X4X5X6KVVVLLVWGSRX20
(式中、X0およびX20は、独立に任意の修飾基であるか、欠失してもよく、
X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、独立に任意のアミノ酸であるか、あるいはX1、X2、X3、X4、X5およびX6は、一部または全部が欠失する。)
で示され、LPSによるNF-κBの活性化を阻害するペプチド。
[2] [1]に記載のペプチドにおいて、X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、独立に任意のアミノ酸であることができる。
[3] [1]または[2]に記載のペプチドにおいて、X1はP(プロリン)であり、X2はG(グリシン)であり、X3はL(ロイシン)であり、X4はA(アラニン)であり、X5はS(セリン)であり、および/またはX6はR(アルギニン)であることができる。
[4] [1]〜[3]のいずれかに記載のペプチドにおいて、X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、一部または全部が欠失することができる。
[5] [1]〜[4]のいずれかに記載のペプチドにおいて、X0およびX20は欠失しており、ペプチドのN末端側のアミノ酸はアセチル化されており、かつC末端側のアミノ酸はアミド化されていることができる。
[6] [1]〜[5]のいずれかに記載のペプチドにおいて、配列表に示された配列番号1〜14のいずれか一つのアミノ酸配列を有することができる。
[7] [1]〜[6]のいずれかに記載のペプチドにおいて、X0および/またはX20は、結合性基または標識基であることができる。
[8][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するエンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤。
[9][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するグラム陰性菌感染症予防および/または治療剤。
[10][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する敗血症予防および/または治療剤。
[11][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するマクロファージ活性化阻害剤。
[12][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するメディエーター産生阻害剤。
[13][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する歯周病疾患予防および/または治療剤。
[14][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するエンドトキシン非感受性剤。
[15][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有するエンドトキシン検出試薬。
[16][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドは、エンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤を探索するためのリード化合物として用いられることができる。
[17][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドは、グラム陰性菌感染症予防および/または治療剤を探索するためのリード化合物として用いられることができる。
[18][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドは、血症予防および/または治療剤を探索するためのリード化合物として用いられることができる。
[19][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドは、マクロファージ活性化阻害剤を探索するためのリード化合物として用いられることができる。
[20][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドは、メディエーター産生阻害剤を探索するためのリード化合物として用いられることができる。
[21][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドをリード化合物としてエンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤を探索する方法。
[22][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドをリード化合物としてグラム陰性菌感染症予防および/または治療剤を探索する方法。
[23][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドをリード化合物として敗血症予防および/または治療剤を探索する方法。
[24][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドをリード化合物としてマクロファージ活性化阻害剤を探索する方法。
[25][1]〜[7]のいずれかに記載のペプチドをリード化合物としてメディエーター産生阻害剤を探索する方法。
[26][21]〜[25]のいずれかに記載の方法において、前記リード化合物を化学修飾することでリード化合物の最適化を行うことができる。
[27][26]に記載の方法において、化学修飾が、一部のアミノ酸の変更および/若しくは除去、並びに/または少なくとも1つのアミノ酸の付加、挿入であることができる。
[28][26]または[27]に記載の方法において、リード化合物の最適化を行うことで、アミノ酸配列(1)で示すペプチドより、物性、薬物動態、および毒性の少なくとも一部が優れる物質を探索することができる。
本発明のペプチドは、下記アミノ酸配列(1)で示される。
X0X1X2X3X4X5X6KVVVLLVWGSRX20
(式中、X0およびX20は、独立に任意の修飾基であるか、欠失してもよく、
X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、独立に任意のアミノ酸であるか、あるいはX1、X2、X3、X4、X5およびX6は、一部または全部が欠失する。)
尚、上記ペプチド中のKはリシン、Vはバリン、Lはロイシン、Wはトリプトファン、Gはグリシン、Sはセリン、Rはアルギニンである。
X0RKX7X8X9X10X11X12X13X14X15RX20
(式中、X0およびX20は、独立に任意の修飾基あるか、欠失してもよく、
X7、X8およびX9は、少なくとも1つはV(バリン)であり、残りは独立に任意のアミノ酸であるか、あるいは一部または全部が欠失し、X10およびX11は、少なくとも1つはL(ロイシン)であり、残りは任意のアミノ酸であるか、あるいは欠失し、X12、X13、X14 およびX15は、独立に任意のアミノ酸であるか、あるいは一部または全部が欠失する。)
尚、上記ペプチド中のRはアルギニン、Kはリシン、Rはアルギニンである。
X7、X8およびX9は、少なくとも1つはV(バリン)であり、残りは独立に任意のアミノ酸であるか、あるいは一部または全部が欠失してもよい。アミノ酸配列RKVVVLLVWGSRを有するペプチド(配列番号6)のVVVモチーフの1つおよび2つのVが欠失したRKVVLLVWGSR(配列番号8)およびRKVLLVWGSR(配列番号14)は、いずれもアミノ酸配列RKVVVLLVWGSRを有するペプチド(配列番号6)と同様のLPS刺激による無秩序なメディエーター産生阻害活性を有する。したがって、X7、X8およびX9は、少なくとも1つがV(バリン)であれば、残りの1つまたは2つは独立に任意のアミノ酸であるか、あるいは残りの1つまたは2つは欠失してもよい。任意のアミノ酸のアミノ酸は、V(バリン)であるか、あるいは上記したV(バリン)以外のアミノ酸から適宜選択できる。
PGLASRKVVVLLVWGSR(配列番号1)
GLASRKVVVLLVWGSR(配列番号2)
LASRKVVVLLVWGSR(配列番号3)
ASRKVVVLLVWGSR(配列番号4)
SRKVVVLLVWGSR(配列番号5)
RKVVVLLVWGSR(配列番号6)
KVVVLLVWGSR(配列番号7)
RKVVLLVWGSR(配列番号8)
RKVVVLVWGSR(配列番号9)
RKVVVLLWGSR(配列番号10)
RKVVVLLVGSR(配列番号11)
RKVVVLLVWSR(配列番号12)
RKVVVLLVWGR(配列番号13)および
RKVLLVWGSR(配列番号14)
Biotin-PGLASRKVVVLLVWGSR
FITC-linker-PGLASRKVVVLLVWGSR
いずれも上記配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端に修飾基としてビオチン(Biotin)またはリンカーを介して蛍光色素であるFITC(FITC-linker)を結合したペプチドである。リンカーは、例えば、ペプチド合成時のリンカーとして一般的によく用いられる6-アミノヘキサン酸であることができる。
本発明は、上記本発明のペプチドを有効成分として含有する(1)エンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤、(2)グラム陰性菌感染症予防および/または治療剤、(3)敗血症予防および/または治療剤、(4)歯周病疾患予防および/または治療剤、(5)マクロファージ活性化阻害剤、(6)メディエーター産生阻害剤、 (7)エンドトキシン非感受性剤、および(8)エンドトキシン検出試薬に関する。
医薬品製剤等の溶液により引き起こされるエンドトキシン誘導性炎症反応の阻害などに利用することができる。
(2)グラム陰性菌感染症予防および/または治療剤、並びに(3)敗血症予防および/または治療剤、(4)歯周病疾患予防および/または治療剤
グラム陰性細菌により惹起されるヒト及び脊椎動物のグラム陰性細菌感染症に対する治療に利用することができる。例えば同感染症により引き起こされる敗血症及びその合併症である播種性血管内凝固症候群、多臓器不全等や歯周病に対する治療に利用することができる。さらに、ヒト及び脊椎動物のグラム陰性細菌感染症の予防。例えば感染症を発症する可能性が高い外科手術前の患者、あるいは外傷を有する患者さらには歯周病への予防的処置に利用できる。
(5)マクロファージ活性化阻害剤、および(6)メディエーター産生阻害剤、(7)エンドトキシン非感受性剤、および(8)エンドトキシン検出試薬
新たなエンドトキシン試験法の開発に利用できる。例えば、ヒト由来マクロファージ等を用いて検体のマクロファージ活性化作用に対するペプチドの阻害効果から含まれるエンドトキシン量を定量化するシステムの開発に利用できる。またエンドトキシン刺激を阻害する必要のある処理全般に用いることができる。
本発明は、上記本発明のペプチドをリード化合物として上記(1)〜(8)の治療剤等を探索する方法(スクリーニング方法)に関する。本発明で探査する対象は、(1)エンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤、(2)グラム陰性菌感染症予防および/または治療剤、(3)敗血症予防および/または治療剤、(4)歯周病疾患予防および/または治療剤、(5)マクロファージ活性化阻害剤、および(6)メディエーター産生阻害剤、(7)エンドトキシン非感受性剤、および(8)エンドトキシン検出試薬である。
ペプチドスクリーニング方法
(方法)
CLONTECH(Palo Alto, CA)より購入したMATCHMAKER Random Peptide Libraryを用いて、yeast two-hybrid法でヒトTLR4細胞外領域に相互作用するペプチドをスクリーニングした。yeast two-hybrid法は、in vivoで相互作用を検討したい2種類のタンパク質を酵母細胞内で各々転写因子GAL4のDNA結合領域と転写活性化領域との融合タンパク質として発現させて、両タンパク質が相互作用した場合にGAL4の転写活性化機能が回復することを指標に相互作用を検証する方法である。CLONTECH(Palo Alto, CA)より購入したMATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3にあるpGBKT7 DNA-BD VectorにヒトTLR4細胞外領域のcDNAを挿入して、GAL4のDNA結合領域とヒトTLR4細胞外領域の融合タンパク質発現用プラスミド(pGhT4E)を構築した。次にロイシン・トリプトファン・ヒスチジンに対して栄養要求性を示す酵母AH109株に、pGhT4EとMATCHMAKER Random Peptide Library にあるGAL4の転写活性化領域のC末端側にランダムな16アミノ酸(ペプチド)が融合されたプラスミド(AD/libraryプラスミド)を形質転換した後、ロイシン・トリプトファン・ヒスチジン未添加の合成培地(synthetic minimal medium ; SD)のプレートに塗布した。pGhT4Eプラスミドにはトリプトファン栄養要求性を相補する遺伝子が、AD/libraryプラスミドにはロイシン栄養要求性を相補する遺伝子があり2つのプラスミドが同時に形質転換された酵母細胞はロイシンとトリプトファン未添加のSDプレート上で生育可能となる。またAH109株にはGAL4応答性プロモーターを持つヒスチジン栄養要求性を相補する遺伝子がゲノムに挿入されているため、酵母細胞内でGAL4が機能する場合には同株はヒスチジン未添加のSDプレート上で生育できる特徴を持つ。従ってロイシン・トリプトファン・ヒスチジン未添加のSD(SD/-Leu/-Trp/-His)プレート上でコロニーを形成した酵母細胞は、ヒトTLR4細胞外領域と相互作用するペプチドをコードしたプラスミドを保持している可能性がある。そこでコロニーを形成した酵母からプラスミドを抽出してペプチドをコードする塩基配列を決定することでTLR4に相互作用するペプチドの同定を行った。
酵母AH109株にpGhT4EとAD/libraryプラスミドを形質転換して得られた形質転換体は推定で約74,000個であった。配列番号1で示されるペプチドはこのうちSD/-Leu/-Trp/-Hisプレート上でコロニーを形成した酵母から同定したものであり、約1/74,000の確率で単離されたものである。
表1に示すペプチドをFmoc法により合成した。即ち、Nα位のFmoc基を外しながらペプチドの伸長を行い、所定のアミノ酸配列のペプチドが得られたら、各アミノ酸の保護基の切断および除去を行い、最後に、固相(樹脂)から、ペプチドを遊離させた。尚、No.28BおよびNo.28Fのペプチドを除いて、各ペプチドのN末端側のアミノ酸のアミノ基はアセチル化されており、かつC末端側のアミノ酸のカルボキシル基はアミド化されている。No.28BおよびNo.28Fは、N末端側のアミノ酸にビオチンまたはFITCを修飾し、C末端側のアミノ酸のカルボキシル基はアミド化されている。C末端側のアミノ酸のカルボキシル基のアミド化は、上記Fmoc法の固相(樹脂)にアミド樹脂を用いることで行った。TFAにより固相(樹脂)からペプチドを遊離(切断)することでC末端側がアミド化されたペプチドを得た。N末端側のアミノ酸のアミノ基のアセチル化は、N末端のFmoc基を外した後に20%無水酢酸NMP溶液を加え、30分間反応させることで実施した。N末端側のアミノ酸のFITC修飾は、N末端のFmoc基を外した後に、FITC(4.0当量)およびピリジン(4.0当量)を含むDMF溶液を加え攪拌下、一晩反応させて行った。N末端側のアミノ酸のビオチン修飾は、N末端のFmoc基を外した後に、ビオチンカルボン酸、HOBt、HBTUおよびNMMの混合物を加え、攪拌下、一晩反応させて行った。
LPS刺激によるマクロファージ活性化に及ぼすペプチドの効果
LPSによるNF-κBの活性化に及ぼすペプチドの作用
ヒト単球由来株化細胞THP-1を用いて配列番号1で示されるペプチド(No. 28)によるLPS誘導性シグナルの阻害効果を転写因子NF-κBの活性化レベルを指標に検討した。まずSigma(St. Louis, MO)より購入したphorbol myristate acetateとWako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)より購入した1,25-dihydroxy vitamin D3を各々100 ng/ml、100 nMを含むDMEM培地にて1-3 x 105 cells/mlとなるよう調製した細胞溶液を12穴プレートに各ウェルあたり1.0 ml加え37℃にて72時間培養することによりマクロファージ様細胞に分化したTHP-1細胞を得た。得られた細胞をphosphate-buffered saline(PBS)で洗浄後、各ウェル当たりDMEM培地0.5mlを加えFuGene6試薬(Roche, Mannheim, Germany)3.0μlを用いNF-κB応答性ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されているプラスミド(pELAM-L)0.5μgと内部標準としてphRL-TK (Promega, Madison, WI)0.025μgをトランスフェクトした。24時間後PBSで洗浄した細胞に上記ペプチドを含むDMEM培地0.5 mlを加え1時間培養したのちSigma(St. Louis, MO)より購入した精製LPS(E. coli O111:B4)を添加し6時間後Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System(Promega, Madison, WI)を用いルシフェラーゼ活性を測定しNF-κB活性化の指標とした。その結果、溶媒のみ(0.4% DMSO)ではLPSの濃度依存的にレポーター活性の上昇が認められ10 ng/mlで最大反応に達した。本条件下では配列番号1で示されるペプチド(No. 28)はLPS誘導性NF-κBの活性化を濃度依存的に抑制し、ペプチド20μM存在下では10 ng/mlのLPSによるNF-κBの活性化をほぼ完全に阻害した。一方、ペプチド単独刺激ではルシフェラーゼ活性の上昇は認められなかった(図1)。これより上記ペプチドは単独ではNF-κBの活性化作用を持たずLPSによるNF-κBの活性化を濃度依存的に阻害することが明らかとなった。
ヒト単球由来株化細胞THP-1を用いてLPS誘導性TNF-α産生に及ぼす配列番号1で示されるペプチド(No. 28)の効果を検討した。図1と同様にTHP-1細胞をマクロファージに分化させPBSで洗浄した細胞にペプチドを含むDMEM培地0.5 mlを加え1時間培養したのちSigma(St. Louis, MO)より購入した精製LPS(E. coli O111:B4)を添加し16時間後に上清を回収し測定時まで-80℃に保存した。サンプル中のTNF-α量はヒトTNF-αELISA kit (TECHNE Corporation, Minneapolis, MN)を用いて定量した。コントロール(0.4% DMSO)では加えたLPS の濃度の増加に伴いTNF-α産生量は増大したが、その増大はペプチドの濃度依存的に抑制されペプチド40μM存在下では100 ng/mlのLPS刺激により誘導されるTNF-αの産生を完全に阻害した。尚、図1と同様にペプチド単独処理によるTNF-αの産生作用は認められなかった(図2)。
NF-κB応答性ルシフェラーゼ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を含むレポータープラスミド(pcELAM-L)6μgをBgl IIで直鎖状にし、25cm2のフラスコに約40%コンフルエントにまいたRAW 264細胞にFuGene6試薬(Roche, Mannheim, Germany)18μlを用いてトランスフェクトし、24時間後 Sigma(St. Louis, MO)より購入したG418を1.0 mg/ml含むDMEM培地中でプラスミドを取り込んだ細胞を選別した。得られた細胞を0.5 mg/mlのG418を含むDMEM培地にて1-3 x 105 cells/mlとなるよう調製した細胞溶液を12穴プレートに各ウェルあたり1.0 ml加え37℃にて24時間培養後PBSで洗浄したのち、ペプチドを含むDMEM培地0.5 mlを加え1時間培養し次に細胞にSigma(St. Louis, MO)より購入した精製LPS(E. coli O111:B4)を添加し6時間培養後Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System(Promega, Madison, WI)を用いルシフェラーゼ活性を測定した。得られた数値はBio-Rad Protein Assay試薬(BIO-RAD, Hercules, CA)を用いて測定したタンパク質濃度で補正しタンパク質濃度あたりのルシフェラーゼ活性を求めNF-κBの活性化の指標とした。配列番号1に示すペプチドをN末端側より3アミノ酸欠失したDelta 3aaにおいても濃度依存的にLPS誘導性NF-κBの活性化が抑制された(図4)。ビオチン修飾したペプチドのLPS誘導性NF-κBの活性化抑制試験結果は図5に示す。
図1と同様の方法により抑制作用を示す配列番号1関連ペプチドの抑制効果を検討した。方法は、図1(実施例2)と同様とし、以下の条件で求めた。
ペプチド使用濃度:40 M
刺激時のLPS濃度:10 ng/ml
残存活性:ペプチド非存在下におけるNF-κBレポーター活性を100%として算出した。尚、N.D.はNot Detectedの略であり、検出限界以下を意味し、活性をほぼ完全に抑制したことを意味する。
その結果、配列番号1に示すペプチドのN末端側にビオチン若しくはFITC修飾したペプチドも明確なLPS誘導性NF-κB活性化の抑制作用を持つことが明らかとなった。配列番号1に示すペプチドのN末端側から順次6アミノ酸を欠失したペプチドについても本条件下では全ての配列において明確なLPS誘導性NF-κB活性化の抑制作用が確認された。さらに配列番号6内の各種1アミノ酸欠失したペプチドにおいても、さらに配列番号6アミノ酸配列内のVVVモチーフのVVを欠失させたペプチド(配列番号14)においても同様の抑制作用が確認された(表2)。
LPS以外のPAMPsによるマクロファージの活性化に及ぼすペプチドの影響
マウスマクロファージ由来細胞株であるRAW 264を用いて各種PAMPs刺激により誘導されるNF-κBの活性化に対する配列番号1で示されるペプチド(No. 28)の効果を検討した。RAW 264細胞をDMEM培地にて1-3 x 105 cells/mlとなるよう調製した細胞溶液を12穴プレートに各ウェルあたり1.0 ml加え37℃にて24時間培養後上清を除去したのち、各ウェル当たりDMEM培地0.5 ml を加えてFuGene6試薬(Roche, Mannheim, Germany)3.0μlを用いNF-κB応答性ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されているプラスミド(pELAM-L)0.5μgと内部標準としてphRL-TK (Promega, Madison, WI)0.025μgをトランスフェクトした。24時間培養後PBSで洗浄した細胞に0.4%DMSOもしくはペプチド40μMを含むDMEM培地0.5 mlを加え1時間培養したのち各種PAMPsとしてTLR4リガンドにSigma(St. Louis, MO)より購入した精製LPS(E. coli O111:B4)、TLR9リガンドにQiagen(Valencia, CA)に合成依頼したCpG-DNA(配列:5'-TCCATGACGTTCTTGACGTT-3')(配列番号19)、TLR1/TLR2複合体のリガンドにBachem(Bubendorf, Switzerland)より購入したリポペプチド(Pam3CSK4)、TLR3のリガンドにAmersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire, UK)より購入したPoly I:Cを用いて細胞を刺激し6時間後Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System(Promega, Madison, WI)を用いルシフェラーゼ活性を測定した。その結果図1と同様に配列番号1で示されるペプチド(No. 28)は検討した各LPS濃度に対してNF-κBの活性化を抑制したことから、マウス由来のマクロファージ様細胞に対しても本ペプチドはLPS誘導性NF-κBの活性化を阻害する効果を持つことが明らかとなった。一方、その他のPAMPsに対してペプチドは抑制効果を示さなかった。これよりペプチドはTLR4を介したNF-κBの活性化に特異的であることが強く示唆された(図3)。
エンドトキシン由来疾患に及ぼすペプチドの効果
エンドトキシン由来疾患抑制効果
ガラクトサミン負荷マウスのLPS誘導性致死をエンドトキシンショックモデルとしてペプチドの効果を検討した。Specific Pathogen Free のオス6週齢のC57BL/6マウスを1週間馴化し実験を開始した。Sigma(St. Louis, MO)より購入したLPS(E. coli O111:B4)、Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)より購入したガラクトサミン塩酸塩及び化学合成した配列番号1に示すペプチドをマウスあたりの投与量が各々10 ng、12 mg、0.02 〜 20 μgとなるよう注射用水に混合した。次に1群あたり5 〜 10匹のマウスに対して同混合溶液100μlを腹腔内投与しその後7日間における生存率を観察した。尚、ペプチド非投与群においてはペプチド投与群同様の溶媒(2.13% DMSO)を投与した。ペプチド未投与のLPS処理マウスでは生存率は20%であったが、ペプチドの投与量の増加に従い生存率は上昇し、20μg/mouseではガラクトサミンのみで処理したコントロールと同じ100%に達した(図6)。LPS未投与のペプチド処理群も同様に生存率100%を示した。これよりペプチドは濃度依存的にマウスのエンドトキシンショックに対し防御能を有することが明らかとなった。一方、ペプチド単独によるマウスの致死作用は認められなかった。
図6と同様の実験系でペプチドのエンドトキシン由来疾患防御能を検討した。LPSを10 ng/mouse投与した群は致死率80%であるが、同時に20 μgの配列番号1に示すペプチドを投与することで致死率は0%となった。このペプチドによる致死率の抑制効果はLPSの投与量を10 μg/mouseまで増加しても観察され、20μgのペプチド投与により致死率は100%から20%に低下した(図7)。従って、致死率80%を示す10 ngの1000倍量、つまり10μgのLPSに対してもペプチド20μgの投与は有効であることが明らかとなった。
図6と同様の実験系で各群5匹のマウスを用いてペプチドによるエンドトキシン由来疾患抑制効果に与えるペプチド投与時期の影響を検討した。LPS及び配列番号1に示すペプチド投与量は各々10 ng/mouse、20 μg/mouseとし、ペプチドの投与方法については図6と同様の方法でLPSとガラクトサミン塩酸塩の混合溶液を投与後、各時間後に新たにペプチド溶液のみを腹腔内投与した。LPSの投与により生存率が0%となる条件下で20 μgのペプチドを同時投与した群(0 h)は生存率100%を示すが、LPS投与後5時間経過した後にペプチドを投与しても生存率は60%を維持し、ペプチドによるエンドトキシンショック抑制作用が確認された(図8)。この結果から本ペプチドは既にエンドトキシンショック症状を呈する状態で投与した場合でも治療効果を有することが期待された。
生理的条件下におけるペプチドとTLR4の相互作用の確認
実施例1において酵母細胞内で予想された本発明のペプチドとTLR4間の相互作用を、哺乳類動物細胞に発現させたTLR4で確認した。あわせてTLR4と相互作用しLPSの認識に関与するMD-2とCD14についても本発明のペプチドとの相互作用の可能性を検証した。ペプチドとしては、ビオチン化したNo. 28(No. 28B)およびNo. 28D5PD8(No. 28D5PD8B)を用いた。
エンドトキシンショックに及ぼすペプチドの効果
エンドトキシンショックモデルとしてガラクトサミン負荷マウスのLPS誘導性致死を用いて、ペプチドとLPS/ガラクトサミンを別途に腹腔内投与(ip)した場合におけるNo. 28とNo. 28D5PD8の効果を比較検討した。Specific Pathogen Free のオス6週齢のC57BL/6マウスを1〜3週間馴化し実験を開始した。Sigma(St. Louis, MO)より購入後再精製したLPS(E. coli O111:B4)、Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)より購入したガラクトサミン塩酸塩及び化学合成したペプチドを表に示す用法・容量にて投与した。なお、溶媒にはOtsuka Pharmaceutical(Tokyo, Japan)より購入した注射用水を使用した。
微生物の増殖に及ぼすペプチドの作用
抗菌作用を示す物質の一つとして、これまでに抗菌ペプチドの存在が報告されている。そこで微生物の増殖に対する本発明のペプチドの影響を検証するために、大腸菌を例にペプチドNo. 28D5PD8の作用を検討した。なお本実験では、抗菌ペプチドのポジティブコントロールとしてSigma(St. Louis, MO)より購入したPolymyxin B Sulfate(Polymyxin B)を使用した。
Claims (28)
- 下記アミノ酸配列(1)
X0X1X2X3X4X5X6KVVVLLVWGSRX20
(式中、X0およびX20は、独立に任意の修飾基であるか、欠失してもよく、
X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、独立に任意のアミノ酸であるか、あるいはX1、X2、X3、X4、X5およびX6は、一部または全部が欠失する。)
で示され、LPSによるNF-κBの活性化を阻害するペプチド。 - X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、独立に任意のアミノ酸である請求項1に記載のペプチド。
- X1はP(プロリン)であり、X2はG(グリシン)であり、X3はL(ロイシン)であり、X4はA(アラニン)であり、X5はS(セリン)であり、および/またはX6はR(アルギニン)である請求項1または2に記載のペプチド。
- X1、X2、X3、X4、X5およびX6は、一部または全部が欠失する請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
- X0およびX20は欠失しており、ペプチドのN末端側のアミノ酸はアセチル化されており、かつC末端側のアミノ酸はアミド化されている請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- 配列表に示された配列番号1〜14のいずれか一つのアミノ酸配列を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- X0および/またはX20は結合性基または標識基である請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有するエンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有するグラム陰性菌感染症予防および/または治療剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有する敗血症予防および/または治療剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有するマクロファージ活性化阻害剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有するメディエーター産生阻害剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有する歯周病疾患予防および/または治療剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有するエンドトキシン非感受性剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分として含有するエンドトキシン検出試薬。
- エンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤を探索するためのリード化合物として用いられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- グラム陰性菌感染症予防および/または治療剤を探索するためのリード化合物として用いられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- 敗血症予防および/または治療剤を探索するためのリード化合物として用いられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- マクロファージ活性化阻害剤を探索するためのリード化合物として用いられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- メディエーター産生阻害剤を探索するためのリード化合物として用いられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドをリード化合物としてエンドトキシン由来疾患予防および/または治療剤を探索する方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドをリード化合物としてグラム陰性菌感染症予防および/または治療剤を探索する方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドをリード化合物として敗血症予防および/または治療剤を探索する方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドをリード化合物としてマクロファージ活性化阻害剤を探索する方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドをリード化合物としてメディエーター産生阻害剤を探索する方法。
- 前記リード化合物を化学修飾することでリード化合物の最適化を行う請求項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 化学修飾が、一部のアミノ酸の変更および/若しくは除去、並びに/または少なくとも1つのアミノ酸の付加、挿入である請求項26に記載の方法。
- リード化合物の最適化を行うことで、アミノ酸配列(1)で示すペプチドより、物性、薬物動態、および毒性の少なくとも一部が優れる物質を探索する請求項26または27に記載の方法。
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