JP5040438B2 - Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof - Google Patents
Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP5040438B2 JP5040438B2 JP2007134535A JP2007134535A JP5040438B2 JP 5040438 B2 JP5040438 B2 JP 5040438B2 JP 2007134535 A JP2007134535 A JP 2007134535A JP 2007134535 A JP2007134535 A JP 2007134535A JP 5040438 B2 JP5040438 B2 JP 5040438B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- polynucleotide
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 146
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 145
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 76
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 title description 20
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 title description 20
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 title description 10
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 title description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 157
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 157
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 157
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 135
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 61
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 claims description 60
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 26
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- -1 coelenterazine peroxide Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 64
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 39
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108010041089 apoaequorin Proteins 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- CJIIERPDFZUYPI-UHFFFAOYSA-N oxidized Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(=O)NC1=NC=C(C=2C=CC(O)=CC=2)N=C1CC1=CC=CC=C1 CJIIERPDFZUYPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N (E)-3-(indol-2-yl)acrylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(/C=C/C(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- MGTUVUVRFJVHAL-UHFFFAOYSA-N 2,8-dibenzyl-6-(4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2ccccc2)nc2c(Cc3ccccc3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 MGTUVUVRFJVHAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102000011720 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101710128071 Mitrocomin Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 229910003797 SPO1 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003798 SPO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100150136 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 101100478210 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589196 Sinorhizobium meliloti Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000006451 grace's insect medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、抗体結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。より具体的には、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するプロテインGドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるアポイクオリンとの融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。 The present invention relates to a fusion protein of an antibody binding domain and a calcium-binding photoprotein, a gene encoding the same, and uses thereof. More specifically, the present invention relates to a fusion protein of a protein G domain capable of binding to an Fc region of IgG and apoaequorin, which is a calcium-binding photoprotein, a gene encoding the same, and uses thereof.
カルシウム結合発光蛋白質は、アポ蛋白質と、発光基質のペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する発光蛋白質である。カルシウム結合発光蛋白質は、カルシウムイオンと結合すると瞬間的に発光するという性質を有している。
カルシウム結合発光蛋白質としては、イクオリン、オべリン、クライチィン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインなどが知られている。なかでもイクオリンはカルシウム結合発光蛋白質の代表的なものであり、その高次構造および発光メカニズムなどが詳細に報告されている（例えば、非特許文献１：Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158、非特許文献２：Head et al. (2000) Nature 405, 372-376など参照）。イクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高いので、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムイオンの濃度変化の測定などに利用されている。
イクオリンは、アポイクオリンと、発光基質セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在している。イクオリンにカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
The calcium-binding photoprotein is a photoprotein that exists in a state where an apoprotein and a peroxide of a luminescent substrate form a complex. Calcium-binding photoprotein has the property of emitting light instantaneously when bound to calcium ions.
Known examples of calcium-binding photoproteins include aequorin, oberin, criticine, mitrocomin, minopsin, and bervoin. Among them, aequorin is a typical calcium-binding photoprotein, and its higher-order structure and luminescence mechanism have been reported in detail (for example, Non-Patent Document 1: Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158, Non-Patent Document 2: Head et al. (2000) Nature 405, 372-376, etc.). Since aequorin is very sensitive to calcium ions, it is used for detection and quantification of trace calcium ions and measurement of changes in intracellular calcium ion concentration.
Aequorin exists in a state in which apoaequorin and a peroxide of a luminescent substrate coelenterazine form a complex. When calcium ions bind to aequorin, it emits instantaneous light and produces coelenteramide, which is an oxide of coelenterazine, and carbon dioxide.
プロテインGは、グループGの連鎖状球菌（Streptococci）細胞壁由来の蛋白質である。プロテインGは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域と特異的に結合し、その結合能はプロテインAより高いことが知られている（例えば、非特許文献３：J. Immunol. (1984)133：969-974）。ビオチン化イクオリンをビオチン化した抗体（ＩｇＧもしくはＩｇＭ）とストレプトアビジンを介して複合体を形成させ、プロテインＧを検出する方法や、ビオチン化イクオリンをビオチン化プロテインＧとストレプトアビジンを介して複合体を形成させ、抗体（ＩｇＧもしくはＩｇＭ）を検出する方法は報告されている（例えば、非特許文献４：J Biochem Biophys Methods. (1996) 32: 7-13など参照）。しかし、プロテインＧとイクオリンの融合蛋白質を用いたイムノアッセイ法の報告はなされていない。一方、ＩｇＧを認識するStaphylococcus aureus菌由来のプロテインAが知られているが、プロテインGは異なる動物種由来（ヤギ、ウシ、ヒツジ）のＩｇＧについての結合能がプロテインAより高く、またＩｇＧサブクラスへの結合能も異なる。
上記状況において、従来の融合蛋白質よりＩｇＧとの結合能力が高く、より感度よくＩｇＧを検出することができるカルシウム結合発光蛋白質が望まれていた。 In the above situation, a calcium-binding photoprotein that has higher binding ability to IgG than conventional fusion proteins and can detect IgG more sensitively has been desired.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するプロテインGドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるイクオリンとの融合蛋白質を効率良く作成し、従来の融合蛋白質より感度よくＩｇＧを検出することができる（すなわち、ＩｇＧの検出限界が低い）ことを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors efficiently produced a fusion protein of a protein G domain having binding ability to the Fc region of IgG and aequorin which is a calcium-binding photoprotein, It has been found that IgG can be detected with higher sensitivity than conventional fusion proteins (that is, the detection limit of IgG is low). As a result of further studies based on these findings, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、
〔１〕 （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質、
〔２〕 （１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記〔１〕記載の融合蛋白質、
〔３〕（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質、
〔４〕 さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の融合蛋白質、
〔５〕 配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質、
〔６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質、
〔７〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔８〕 （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド、
〔９〕 （１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、上記〔８〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１０〕 配列番号：６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔１１〕 上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
〔１２〕 上記〔１０〕記載の組換えベクターが導入された形質転換体、
〔１３〕 上記〔１２〕記載の形質転換体を培養し、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法、
〔１４〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むキット、
〔１５〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
〔１６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法
〔１７〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法
などを提供する。
That is, the present invention
[1] (1) A first region selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a region consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and having a function capable of binding to the Fc region of IgG;
(C) a region comprising an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG; and (d) SEQ ID NO: 2 A region comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of and having a function capable of binding to the Fc region of IgG; When,
(2) A second region selected from the group consisting of the following (e) to (h):
(E) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(F) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and bound to the peroxide of coelenterazine or the peroxide of a coelenterazine derivative, A region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by action;
(G) A holoprotein comprising an amino acid sequence having an identity of 70% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to emit light by the action of calcium ions. And (h) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 4. And a region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative;
A fusion protein containing,
[2] (1) A group in which the first region is composed of the following (a) to (d):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a region having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG;
(C) a region comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG, and (d) SEQ ID NO: 2 A region comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of and having a function capable of binding to the Fc region of IgG;
Selected from
(2) A group in which the second region is composed of the following (e) to (h):
(E) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(F) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and binds to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to form a calcium ion A region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by action;
(G) A holoprotein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and binding to a peroxide of coelenterazine or a coelenterazine derivative to emit light by the action of calcium ions. And (h) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 4. And a region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative;
A fusion protein according to [1], selected from
[3] (1) a region consisting of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a fusion protein comprising a region consisting of the second amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
[4] The fusion protein according to any one of [1] to [3], further comprising an amino acid sequence for promoting translation and / or an amino acid sequence for purification,
[5] A fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
[6] A holoprotein comprising the fusion protein according to any one of [1] to [5] above and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative,
[7] A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of [1] to [5],
[8] (1) A first coding sequence selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a poly that encodes a region having a function of hybridizing with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and capable of binding to the Fc region of IgG A polynucleotide containing nucleotides,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (d) one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 deleted, substituted, inserted and And / or a polynucleotide comprising a polynucleotide that encodes a region consisting of an added amino acid sequence and having a function capable of binding to the Fc region of IgG;
(2) A second coding sequence selected from the group consisting of the following (e) to (h):
(E) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4,
(F) Hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and binds with a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to emit light by the action of calcium ions. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region having a function capable of forming a holoprotein,
(G) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (h) one to a plurality of amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region comprising an amino acid sequence added and / or having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative nucleotide;
A polynucleotide comprising
[9] (1) A group in which the first coding sequence is composed of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) encodes a region having a function of hybridizing with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions and capable of binding to the Fc region of IgG A polynucleotide containing the polynucleotide;
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (d) 1-5 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a region consisting of an added amino acid sequence and having a function capable of binding to an Fc region of IgG;
(2) The group in which the second coding sequence is composed of the following (e) to (h):
(E) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4,
(F) Hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and binds with a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to emit light by the action of calcium ions. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region having a function capable of forming a holoprotein,
(G) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (h) 1-10 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region comprising an amino acid sequence added and / or having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative nucleotide;
The polynucleotide according to [8], selected from
[10] a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6;
[11] A recombinant vector containing the polynucleotide according to any one of [7] to [10] above,
[12] A transformant introduced with the recombinant vector of [10] above,
[13] Any of the above [1] to [5], comprising a step of culturing the transformant according to [12] and generating the fusion protein according to any of [1] to [5]. A method for producing the fusion protein according to
[14] A kit comprising the fusion protein according to any one of [1] to [5] or the holoprotein according to [6],
[15] An immunoassay kit comprising the fusion protein according to any one of [1] to [5] or the holoprotein according to [6].
[16] Method for detecting or quantifying calcium ion using the fusion protein according to any one of [1] to [5] or the holoprotein according to [6] [17] [5] An immunoassay method using the fusion protein according to any one of [5] or the holoprotein according to [6] above.
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
さらに、本発明の融合蛋白質は、組換え蛋白質の発現系として広く用いられている原核細胞を宿主として用いることによって、細胞質中に可溶性タンパク質として発現させることができるので、効率的に製造することができる。
When the fusion protein of the present invention is brought into contact with coelenterazine, which is a luminescent substrate, a holoprotein containing the fusion protein of the present invention and a coelenterazine peroxide can be easily formed. The holoprotein of the present invention is present in the form of a complex of the fusion protein of the present invention and coelenterazine peroxide in the presence of coelenterazine and oxygen. When calcium ions are bound to the complex, instantaneous light emission is exhibited. Therefore, the fusion protein of the present invention, the holoprotein of the present invention, and the like can be suitably used for detection or measurement of calcium ions.
Moreover, the fusion protein of the present invention has a high binding ability to IgG. As described above, the holoprotein composed of the fusion protein of the present invention and the peroxide of coelenterazine, which is a luminescent substrate, can be made to emit light by calcium ions. Therefore, the fusion protein of the present invention, the holoprotein of the present invention and the like can be suitably used for the detection of IgG.
Furthermore, the fusion protein of the present invention can be expressed as a soluble protein in the cytoplasm by using a prokaryotic cell widely used as a recombinant protein expression system as a host. it can.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．本発明の融合蛋白質
本発明の融合蛋白質とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域と、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
1. Fusion protein of the present invention The fusion protein of the present invention is selected from a region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a region having substantially the same activity or function as the region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A first region containing a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a second region selected from a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 It means a fusion protein.
本明細書中、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域を、「プロテインGドメイン」と称することがある。配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域を、「アポイクオリン」または「アポＡＱ」と称することがある。 In the present specification, a first region selected from a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is referred to as “protein”. Sometimes referred to as “G domain”. A second region selected from a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is referred to as “apoiquorin” or “apo It may be referred to as “AQ”.
本発明の融合蛋白質はさらに翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのペプチド配列を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、例えば、ＴＥＥ配列などが挙げられる。精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列などが挙げられる。 The fusion protein of the present invention may further contain an amino acid sequence for promoting translation and / or a peptide sequence for purification. A peptide sequence used in this technical field can be used as an amino acid sequence for promoting translation. Examples of amino acid sequences for promoting translation include TEE sequences. The peptide sequence used in this technical field can be used as the peptide sequence for purification. Examples of the peptide sequence for purification include a histidine tag sequence having an amino acid sequence of 4 or more, preferably 6 or more histidine residues, and an amino acid sequence of a binding domain to glutathione of glutathione S-transferase Etc.
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合蛋白質としては、化学合成により合成した融合蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合蛋白質であってもよい。本発明の融合蛋白質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合蛋白質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を作製することができる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合蛋白質の発現系での発現などについては、後記する。 There is no restriction | limiting in particular about the acquisition method of the fusion protein of this invention. The fusion protein of the present invention may be a fusion protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant fusion protein produced by a gene recombination technique. When the fusion protein of the present invention is chemically synthesized, it can be synthesized by, for example, the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), or the like. Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instruments, Syntheselvega, Perceptive, Shimadzu, etc. You can also. When the fusion protein of the present invention is produced by a gene recombination technique, it can be produced by an ordinary gene recombination technique. More specifically, the fusion protein of the present invention can be prepared by introducing a polynucleotide (eg, DNA) encoding the fusion protein of the present invention into an appropriate expression system. The polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention and the expression of the fusion protein of the present invention in the expression system will be described later.
本発明の融合蛋白質を、発光基質であるセレンテラジンまたはその誘導体（例えば、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、ｆ-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなど）と、酸素存在下に接触させることにより、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を得ることができる。以下、「セレンテラジンまたはその誘導体」を、単に「セレンテラジン」と称することがある。本明細書中、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を、「本発明のホロ蛋白質」または「プロテインG−イクオリン」もしくは「ProG−ＡＱ」と称することがある。また、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を、「本発明の発光蛋白質」と称することもある。 Contacting the fusion protein of the present invention with coelenterazine or a derivative thereof (for example, h-coelenterazine, e-coelenterazine, f-coelenterazine, ch-coelenterazine, hcp-coelenterazine, etc.) in the presence of oxygen, A holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative can be obtained. Hereinafter, “coelenterazine or a derivative thereof” may be simply referred to as “coelenterazine”. In the present specification, a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of coelenterazine or a coelenterazine derivative is referred to as “the holoprotein of the present invention” or “protein G-equorin” or “ProG-AQ”. There is. A holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative may be referred to as “photoprotein of the present invention”.
本発明のホロ蛋白質としては、（１）本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、（２）本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質としては、例えば、本発明の融合蛋白質とh-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とe-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とcl-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とch-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とhcp-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンとから、公知のカルシウム結合発光蛋白質（例えば、イクオリンなど）と同様にして製造することができる。より具体的には、本発明のホロ蛋白質は、例えば、Biochem. J. 261, 913-920 (1989)などに記載の製造方法に準じる方法によって製造することができる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体（本発明の発光蛋白質）を形成した状態で存在する。前記複合体（本発明の発光蛋白質）にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。 Examples of the holoprotein of the present invention include (1) a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a coelenterazine peroxide, and (2) a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of a coelenterazine derivative. Examples of the holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and a peroxide of a coelenterazine derivative include, for example, a holoprotein comprising the fusion protein of the present invention and h-coelenterazine peroxide, the fusion protein of the present invention, and a peroxide of e-coelenterazine. Holoprotein consisting of the fusion protein of the present invention and the peroxide of cl-coelenterazine, holoprotein consisting of the fusion protein of the present invention and the peroxide of ch-coelenterazine, the fusion protein of the present invention and the peroxide of hcp-coelenterazine The holoprotein consisting of The holoprotein of the present invention can be produced from the fusion protein of the present invention and coelenterazine in the same manner as known calcium-binding photoproteins (for example, aequorin and the like). More specifically, the holoprotein of the present invention can be produced by a method according to the production method described in, for example, Biochem. J. 261, 913-920 (1989). The holoprotein of the present invention exists in a state where the fusion protein of the present invention and a coelenterazine peroxide form a complex (photoprotein of the present invention). When calcium ions bind to the complex (the photoprotein of the present invention), it emits instantaneous light and produces coelenteramide, which is an oxide of coelenterazine, and carbon dioxide.
（第１の領域）
第１の領域とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能を意味する。ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能は、例えば、ウエスタンブロティング法、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
(First area)
The first region means a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
The activity or function substantially the same as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means, for example, an activity or function capable of binding to the Fc region of IgG. The activity or function capable of binding to the Fc region of IgG can be measured, for example, according to the Western blotting method, the method described in Examples described later, and the like.
第１の領域としては、より具体的には、例えば（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域などが挙げられる。
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
More specifically, as the first region, for example, (a) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) one or more amino acids are deleted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A region having an amino acid sequence inserted or added and having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
In the present specification, the range of “1 to plural” in “an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added” is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6 (1 to several), 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 One. In general, the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added, the better. Two or more of the amino acid residue deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously. Such regions are described in “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Current Protocols in Molecular Biology”, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene, 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) ”and the like.
また、第１の領域としては、例えば、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も挙げられる。さらに、第１の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる活性もしくは機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）やＦＡＳＴＡ（Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 The first region is, for example, (c) about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 92% or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A region having substantially the same activity or function as a region consisting of Furthermore, as the first region, more specifically, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of an amino acid sequence, and IgG Fc region And a region having an activity or a function capable of binding to. In general, the larger the numerical value of identity, the better. The identity of amino acid sequences and base sequences is determined by BLAST (see, for example, Altzshul SF et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)) or FASTA (Pearson WR, Methods in Enzymology 183, 63 (See (1990), etc.). When using BLAST or FASTA, the default parameters of each program are used.
さらに、第１の領域には、（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。 Furthermore, the first region comprises (d) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2; A region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is also included. The polynucleotide that hybridizes under stringent conditions will be described later.
（第２の領域）
第２の領域とは、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、（i）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を意味する。なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジンもしくはセレンテラジン誘導体を結合させ、カルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB-2200(アトー社製)、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。
(Second area)
The second region means a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
The activity or function substantially the same as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is, for example, (i) a function that allows the region to bind to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative, (ii) It means a function in which a region can be combined with a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to form a holoprotein that emits light by the action of calcium ions. The luminescence is measured by the method described in, for example,
第２の領域としては、より具体的には、例えば（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域；（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域などが挙げられる。ここで、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。 More specifically, as the second region, for example, (e) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (f) one or more amino acids are deleted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. And a region having an activity or function substantially the same as the region consisting of the inserted or added amino acid sequence and consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Here, the range of “1 to plural” in “an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added” is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 It is a piece. In general, the smaller the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added, the better.
また、第２の領域としては、例えば、（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も挙げられる。さらに、第２の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（i）セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、または（ii）セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。 The second region includes, for example, (g) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 A region having substantially the same activity or function as a region consisting of Furthermore, as the second region, more specifically, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of an amino acid sequence, and (i) coelenterazine Has the function of being able to bind to the peroxide of peroxide or a coelenterazine derivative, or (ii) the function of being able to form a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to the peroxide of coelenterazine or the peroxide of a coelenterazine derivative Area. In general, the larger the numerical value of identity, the better.
さらに、第２の領域には、（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。 Furthermore, the second region consists of (h) an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 4; A region having substantially the same activity or function as the region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is also included. The polynucleotide that hybridizes under stringent conditions will be described later.
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、前述した本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
2. Polynucleotide of the Present Invention The present invention also provides a polynucleotide encoding the above-described fusion protein of the present invention. The polynucleotide of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the base sequence encoding the fusion protein of the present invention, but is preferably DNA. Examples of DNA include genomic DNA, genomic DNA library, cell / tissue-derived cDNA, cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. The vector used for the library is not particularly limited and may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be amplified directly by reverse transcription polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
本発明のポリヌクレオチドには、（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。
The polynucleotide of the present invention includes (1) a first coding sequence selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) a poly that encodes a region having a function of hybridizing with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and capable of binding to the Fc region of IgG A polynucleotide containing nucleotides,
(C) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (d) one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 deleted, substituted, inserted and And / or a polynucleotide comprising a polynucleotide that encodes a region consisting of an added amino acid sequence and having a function capable of binding to the Fc region of IgG;
(2) A second coding sequence selected from the group consisting of the following (e) to (h):
(E) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4,
(F) Hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and binds with a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative to emit light by the action of calcium ions. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region having a function capable of forming a holoprotein,
(G) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and (h) one to a plurality of amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region comprising an amino acid sequence added and / or having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative nucleotide;
And the like.
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：２または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：１または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。 Here, “a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions (for example, DNA)” means a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, or SEQ ID NO: 1 or 3 A polynucleotide (for example, DNA) obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using as a probe all or part of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L NaCl using a filter on which a polynucleotide derived from colony or plaque was immobilized, and then 0.1 to 2 Wash the filter at 65 ° C using double-concentration SSC (Saline-sodium citrate) solution (composition of single-concentration SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate) Polynucleotides that can be identified by:
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。 Hybridization is described in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 3rd Edition), Ausbel FM et al., Current Protocols. In experimental documents such as in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley and Sons (1987-1997), Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) It can be carried out according to the method described.
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 50% (v / v) formamide, 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5 (w / v)% SDS, 50% (v / v) formamide, 50 ° C. The tighter the conditions, the higher the complementarity required for duplex formation. Specifically, for example, it can be expected that a polynucleotide (eg, DNA) having high homology as the temperature is increased can be efficiently obtained under these conditions. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。 In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, follow the protocol attached to the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：１または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。 Other hybridizable polynucleotides are approximately 60% of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 when calculated using FASTA, BLAST and other analysis programs using default parameters. Over 65%, over 70%, over 75%, over 80%, over 85%, over 88%, over 90%, over 92%, over 95%, over 97%, over 98%, over 99%, DNA having the identity of 99.3% or more, 99.5% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more can be mentioned. The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined using the method described above.
あるアミノ酸配列に対して、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有する領域をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350-367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。 A polynucleotide encoding a region having an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to a certain amino acid sequence can be obtained by site-directed mutagenesis (see, for example, Gotoh, T. et al. et al., Gene 152, 271-275 (1995), Zoller, MJ, and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983), Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984), Kramer W, and Fritz HJ, Methods.Enzymol. 154, 350-367 (1987), Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985), Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988), etc.), a method using amber mutation (for example, see Gapped duplex method, Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984), etc.) Can be obtained.
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。 PCR (for example, Ho SN et al., Gene 77, 51 (for example, Ho SN et al., Gene 77, 51 ( 1989), etc.) can also introduce mutations into polynucleotides.
また欠失変異体の一種である蛋白質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、その蛋白質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、その蛋白質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。 A polynucleotide encoding a partial fragment of a protein that is a kind of deletion mutant has a sequence that matches the 5'-end base sequence of the region encoding the partial fragment to be produced in the polynucleotide encoding the protein. It can be obtained by performing PCR using an oligonucleotide and an oligonucleotide having a sequence complementary to the base sequence at the 3 ′ end as a primer and using a polynucleotide encoding the protein as a template.
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。 Specific examples of the polynucleotide of the present invention include, for example, a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. Examples of the polynucleotide containing a polynucleotide encoding a fusion protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 include a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. .
本発明のポリヌクレオチドは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。 The polynucleotide of the present invention may include a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation and / or a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification. As the polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation, a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation used in the art may be used. it can. Examples of the amino acid sequence for promoting translation include those described above. As a polynucleotide encoding a peptide sequence for purification, a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification used in the art can be used. Examples of the peptide sequence for purification include those described above.
３．本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
3. Recombinant vector and transformant of the present invention Furthermore, the present invention provides a recombinant vector and a transformant containing the above-described polynucleotide of the present invention.
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。
(1) Production of recombinant vector The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating (inserting) the polynucleotide (DNA) of the present invention into an appropriate vector. More specifically, it can be obtained by cleaving a purified polynucleotide (DNA) with a suitable restriction enzyme, inserting it into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of a suitable vector, and ligating the vector. The vector for inserting the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmids, bacteriophages, animal viruses and the like. Examples of plasmids include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24, YCp50, etc.), and the like. can give. Examples of the bacteriophage include λ phage. Examples of animal viruses include retroviruses, vaccinia viruses, insect viruses (eg, baculoviruses) and the like.
また、本発明においては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）なども好適に使用することができる。後述の実施例などに具体的に示されているように、これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、本発明の融合蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性タンパク質として産生させることができる。 In the present invention, pCold I vector, pCold II vector, pCold III vector, pCold IV vector (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can also be suitably used. As specifically shown in the examples described later, when these vectors are used to express prokaryotic cells as a host, the fusion protein of the present invention is produced as a soluble protein in the cytoplasm of the host cells. Can be made.
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。 The polynucleotide of the present invention is usually operably linked downstream of a promoter in an appropriate vector. The promoter used is preferably an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SRα promoter or the like when the host to be transformed is an animal cell. When the host is Escherichia, a Trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter and the like are preferable. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter and the like are preferable. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter, etc. are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。 In addition to the above, the recombinant vector of the present invention may include those containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a selection marker, and the like as desired. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.
また、本発明の組換えベクターは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。 In addition, the recombinant vector of the present invention includes a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation and / or a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification. Also good. As the polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation, a polynucleotide containing a base sequence encoding an amino acid sequence for promoting translation used in the art may be used. it can. Examples of the amino acid sequence for promoting translation include those described above. As a polynucleotide encoding a peptide sequence for purification, a polynucleotide containing a base sequence encoding a peptide sequence for purification used in the art can be used. Examples of the peptide sequence for purification include those described above.
（２）形質転換体の作成
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
(2) Preparation of transformant A recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention (that is, the polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention) thus obtained is introduced into a suitable host. Thus, a transformant can be prepared. The host is not particularly limited as long as it can express the polynucleotide (DNA) of the present invention. For example, Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium, yeast, animal cells or Insect cells. Examples of the genus Escherichia include Escherichia coli. Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis. Examples of Pseudomonas spp. Include Pseudomonas putida. Examples of the genus Rhizobium include Rhizobium meliloti. Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Examples of animal cells include COS cells and CHO cells. Examples of insect cells include Sf9 and Sf21.
組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、例えばリン酸カルシウム法（Virology, 52, 456-457 (1973)）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)）、エレクトロポレーション法（EMBO J., 1, 841-845 (1982)）などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７５,1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。 The introduction method of the recombinant vector into the host and the transformation method thereby can be performed by various general methods. As a method for introducing a recombinant vector into a host cell, for example, calcium phosphate method (Virology, 52, 456-457 (1973)), lipofection method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) ), Electroporation method (EMBO J., 1, 841-845 (1982)). Examples of the transformation method of the genus Escherichia include the methods described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) and the like. Examples of the method for transforming Bacillus include the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979). Examples of yeast transformation methods include the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). Examples of methods for transforming animal cells include the method described in Virology, 52, 456 (1973). Examples of the method for transforming insect cells include the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). Thus, a transformant transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention (polynucleotide of the present invention) can be obtained.
４．本発明の融合蛋白質の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。本発明の融合蛋白質は、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
4). Production of fusion protein of the present invention The present invention also provides a method for producing the fusion protein of the present invention, comprising the steps of culturing the transformant to produce the fusion protein of the present invention. In the fusion protein of the present invention, the transformant is cultured under conditions capable of expressing the polynucleotide (DNA) encoding the fusion protein of the present invention, and the fusion protein of the present invention is produced, accumulated, separated and purified. Can be manufactured.
（形質転換体の培養）
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合蛋白質が蓄積される。
(Culture of transformants)
The transformant of the present invention can be cultured according to a usual method used for host culture. By the cultivation, the fusion protein of the present invention is produced by the transformant, and the fusion protein of the present invention is accumulated in the transformant or in the culture solution.
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。 As a medium for cultivating transformants whose hosts are Escherichia or Bacillus genus, it contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. necessary for the growth of the transformant, so that transformants can be cultured efficiently. Any natural or synthetic medium may be used as long as it can be performed automatically. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used. As the nitrogen source, ammonia, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, and the like are used. Examples of inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary. When cultivating a transformant transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating a transformant transformed with an expression vector using the Lac promoter, transformation by transforming isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) with an expression vector using the trp promoter When culturing the body, indoleacrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium.
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。 When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation is added. When the host is a genus Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や０.５％(w/v)カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for cultivating a transformant whose host is yeast, for example, a Burkholder minimum medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)) or 0.5% (w / v ) SD medium containing casamino acid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)). The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約５〜２０％(v/v)の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, 122, 501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell, for example, a MEM medium (Science, 122, 501 (1952)) containing about 5 to 20% (v / v) fetal calf serum, a DMEM medium (Virology) , 8, 396 (1959)). The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for cultivating transformants whose host is an insect cell, an appropriate addition of an additive such as 10% (v / v) bovine serum inactivated in Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) Is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
（本発明の融合蛋白質の分離・精製）
上記培養物から、本発明の融合蛋白質を分離・精製することによって、本発明の融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
(Separation and purification of the fusion protein of the present invention)
The fusion protein of the present invention can be obtained by separating and purifying the fusion protein of the present invention from the culture. Here, the culture means any of a culture solution, cultured cells or cultured cells, or disrupted cultured cells or cultured cells. Separation and purification of the fusion protein of the present invention can be carried out according to ordinary methods.
具体的には、本発明の融合蛋白質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明の融合蛋白質の粗抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により目的蛋白質を含む抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明の融合蛋白質を含む培養上清を得ることができる。 Specifically, when the fusion protein of the present invention is accumulated in cultured cells or cultured cells, after culturing, the cells or cells are removed by a usual method (for example, ultrasonic, lysozyme, freeze-thaw, etc.). After crushing, a crude extract of the fusion protein of the present invention can be obtained by ordinary methods (eg, centrifugation, filtration, etc.). When the fusion protein of the present invention is accumulated in the periplasmic space, an extract containing the target protein can be obtained by an ordinary method (for example, osmotic shock method) after completion of the culture. When the fusion protein of the present invention is accumulated in the culture solution, the cells or cells and the culture supernatant are separated from each other by a conventional method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after completion of the culture. A culture supernatant containing the fusion protein of the invention can be obtained.
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明の融合蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明の融合蛋白質が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明の融合蛋白質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡのアミノ酸の配列を含有する場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。 Purification of the fusion protein of the present invention contained in the extract or culture supernatant thus obtained can be performed according to a conventional separation / purification method. Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to. When the fusion protein of the present invention contains the above-described peptide sequence for purification, it is preferably purified using this. Specifically, when the fusion protein of the present invention contains a histidine tag sequence, nickel chelate affinity chromatography, and when it contains a binding domain to glutathione of S-transferase, affinity chromatography using a glutathione-binding gel, When the amino acid sequence of protein A is contained, antibody affinity chromatography can be used.
精製した本発明のアポ蛋白質を、還元剤（たとえばメルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど）および酸素の存在下、発光基質であるセレンテラジンもしくはその誘導体と低温でインキュベーションすることにより、カルシウムイオン濃度依存的に発光する本発明のホロ蛋白質（発光蛋白質）を調製することができる。 Luminescence is dependent on calcium ion concentration by incubating the purified apoprotein of the present invention with coelenterazine or a derivative thereof as a luminescent substrate in the presence of a reducing agent (for example, mercaptoethanol, dithiothreitol, etc.) and oxygen. The holoprotein (photoprotein) of the present invention can be prepared.
５．本発明の融合蛋白質などの利用
（カルシウムイオンの検出または定量）
上述したように、本発明の融合蛋白質（アポ蛋白質）は、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができる。また、本発明のホロ蛋白質は、酸素存在下、カルシウムイオンの作用によって発光しうる複合体（本発明の発光蛋白質）として存在する。よって、本発明の融合蛋白質および本発明のホロ蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Centro LB９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、ホロ蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
5. Use of the fusion protein of the present invention (detection or quantification of calcium ions)
As described above, the fusion protein (apoprotein) of the present invention can bind to the peroxide of coelenterazine or the peroxide of coelenterazine derivatives to form a holoprotein (photoprotein) that can emit light by the action of calcium ions. Moreover, the holoprotein of the present invention exists as a complex (photoprotein of the present invention) that can emit light by the action of calcium ions in the presence of oxygen. Therefore, the fusion protein of the present invention and the holoprotein of the present invention can be used for detection or quantification of calcium ions. The detection or quantification of calcium ions can be performed by measuring the luminescence of the photoprotein of the present invention by calcium ions using a luminescence measuring device. As the luminescence measuring device, a commercially available device, for example, Centro LB960 (manufactured by Bertor) can be used. Quantification of the calcium ion concentration can be measured by creating a luminescence standard curve with respect to a known calcium ion concentration using holoprotein.
（発光による検出マーカーとしての利用）
本発明の融合蛋白質は、上述のように、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができ、かつ、ＩｇＧに結合する機能を有するので、例えば、イムノアッセイにおけるＩｇＧの検出に利用することができる。このようなＩｇＧの検出は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させ、カルシウムイオンによって発光させることによりＩｇＧを検出することができる。また、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させた後、酸素存在下、本発明の融合蛋白質をセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体と接触させることにより、本発明の発光蛋白質を形成させ、カルシウムイオンによって発光させてもよい。
(Use as a detection marker by luminescence)
As described above, the fusion protein of the present invention can form a holoprotein (photoprotein) that can emit light by the action of calcium ions, and has a function of binding to IgG. Can be used for detection. Such detection of IgG can be performed by a usual method. Specifically, IgG can be detected by binding the fusion protein of the present invention to IgG and emitting light with calcium ions. In addition, after the fusion protein of the present invention is bound to IgG, the photoprotein of the present invention is formed by contacting the fusion protein of the present invention with coelenterazine or a coelenterazine derivative in the presence of oxygen, and light is emitted by calcium ions. Also good.
６．本発明のキット
本発明は、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
6). Kit of the Present Invention The present invention also provides a kit comprising any one selected from the fusion protein of the present invention, the holoprotein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, the recombinant vector of the present invention and the transformant of the present invention. To do. The kit of the present invention may further contain coelenterazine or a derivative thereof. The kit of the present invention can be produced by commonly used materials and methods. The kits of the invention may include, for example, sample tubes, plates, instructions for kit users, solutions, buffers, reagents, samples suitable for standardization or control samples.
本発明のキットは、上述したカルシウムイオンの検出または定量、ＩｇＧの検出または定量などに利用することができる。 The kit of the present invention can be used for the above-described detection or quantification of calcium ions, detection or quantification of IgG, and the like.
発明を実施するための最良の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor, unless otherwise stated in the best mode for carrying out the invention and the examples. Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd A method described in a standard protocol collection such as. Or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily implement the present invention from the description of the present specification. it can. The best mode for carrying out the invention and specific examples show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or description, and the present invention is not limited thereto. Not what you want. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
実施例１ プロテインG−アポＡＱ融合遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌において組換えプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質を発現させるために、プロテインG遺伝子およびイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるプロテインGドメインをコードする Protein G遺伝子はＰＣＲ法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はpAQ440(特開昭61-135586号公報参照)のコーディング領域であるHindIII-EcoRI フラグメントを含むpAM-HEよりPCR法により調製した。発現ベクターとしてpCold II ベクター(タカラバイオ社)を使用した。プロテインG−アポＡＱ融合蛋白質発現ベクターの構築法は以下の通りである。
まず、pAM-HEを鋳型として2種のPCRプライマー：
AQ-EcoRI-Met（5' CCGGAATTC-ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3'（配列番号：７）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）および
AQ-C-SalI（5' cgcgtcgac-tta-ggg-gac-agc-tcc-acc-gta-gag-ctt 3'（配列番号：８）；SalI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／SalIにて消化した後、pColdIIの制限酵素EcoRI／SalI部位に連結することによって、発現ベクターpCold-AQを構築した。
一方、pCold II-K(6)-G(4)-proteinGを鋳型として2種のPCRプライマー：
ProG-N/XhoI（5' ｇｃｇ-CTC-GAG-GAC-ACT-TAC-AAA-TTA-ATC-CTT 3'（配列番号：９）；XhoI制限酵素部位はアンダーライン）および
ProG-C/EcoRI（5' ｃｇｃ-GAA-TTC-TTC-AGT-AAC-TGT-AAA-GGT-CTT 3'（配列番号：１０）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素XhoI／EcoRIにて消化した後、pCold-AQの制限酵素XhoI／EcoRI部位に連結することによって、図１に示す発現ベクターpCold-G-AQを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能なであり、発現したProtein G-apoAQは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
Example 1 Construction of Protein G-ApoAQ Fusion Gene Expression Vector In order to express a recombinant protein G-apoAQ fusion protein in E. coli, a protein G gene and an aequorin gene were prepared according to the method described below. Protein G gene encoding protein G domain which is IgG binding domain was prepared by PCR method. The aequorin gene encoding apoaequorin was prepared by PCR from pAM-HE containing HindIII-EcoRI fragment which is the coding region of pAQ440 (see JP-A-61-135586). A pCold II vector (Takara Bio Inc.) was used as an expression vector. A method for constructing a protein G-apo AQ fusion protein expression vector is as follows.
First, two types of PCR primers using pAM-HE as a template:
AQ-EcoRI-Met (5 'CCG GAATTC- ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3' (SEQ ID NO: 7); EcoRI restriction enzyme site underlined) and
PCR using AQ-C-SalI (5 'cgc gtcgac- tta-ggg-gac-agc-tcc-acc-gta-gag-ctt 3' (SEQ ID NO: 8); SalI restriction enzyme site is underlined) PCR (cycle condition 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 minute / 50 ° C., 1 minute / 72 ° C.) was performed using a kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to amplify the desired aequorin gene region. The obtained DNA fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen). The purified DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI / SalI by a conventional method and then ligated to the restriction enzyme EcoRI / SalI sites of pColdII to construct an expression vector pCold-AQ.
On the other hand, two PCR primers using pCold II-K (6) -G (4) -proteinG as a template:
ProG-N / XhoI (5 'gcg- CTC-GAG- GAC-ACT-TAC-AAA-TTA-ATC-CTT 3' (SEQ ID NO: 9); XhoI restriction enzyme site underlined) and
PCR kit using ProG-C / EcoRI (5 'cgc- GAA-TTC-TTC -AGT-AAC-TGT-AAA-GGT-CTT 3' (SEQ ID NO: 10); EcoRI restriction enzyme site is underlined) PCR (cycle condition 25 cycles; 1 minute / 94 ° C., 1 minute / 50 ° C., 1 minute / 72 ° C.) was carried out (manufactured by Takara Bio Inc.) to amplify the desired DNA region. The obtained DNA fragment was purified with a PCR purification kit (Qiagen). The purified DNA fragment is digested with a restriction enzyme XhoI / EcoRI by a conventional method and then ligated to the restriction enzyme XhoI / EcoRI site of pCold-AQ to obtain the expression vector pCold-G-AQ shown in FIG. It was constructed. This expression vector is inducible at low temperatures, and the expressed Protein G-apoAQ has a histidine doug at the amino terminus.
実施例２ 組換えプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質の調製法
組換えプロテインG −AQ融合蛋白質の調製は、以下に記載するように、組換えプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質を大腸菌で発現させた後、発現した該融合蛋白質を抽出し、抽出した該融合蛋白質をニッケル−キレートクロマトグラフ法を用いて精製したのち、発光活性を有するProtein G−AQに変換した後、疎水性ブチルクロマト法に精製した。なお、精製過程における融合蛋白質の発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、50mM Tris-HCl (pH7.6)の緩衝液１ml 中で、Protein G−アポAQ融合蛋白質溶液、2−メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合した後、氷上(4℃)で2時間放置することにより発光活性を持つProtein G−AQ融合蛋白質を調製した。得られたProtein G−ＡＱ融合蛋白質溶液に50mM CaCl2 100μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性の測定を行った。発光活性（最大値（Imax）など）は、相対発光強度（rlu）で評価した。
Example 2 Preparation Method of Recombinant Protein G-Apo AQ Fusion Protein Recombinant protein G-AQ fusion protein was prepared by expressing recombinant protein G-apo AQ fusion protein in E. coli as described below. Then, the expressed fusion protein was extracted, the extracted fusion protein was purified using a nickel-chelate chromatography method, converted to protein G-AQ having luminescence activity, and then purified to a hydrophobic butyl chromatography method. . The measurement of the luminescence activity of the fusion protein during the purification process was performed as follows. First, after mixing Protein G-ApoAQ fusion protein solution, 2-mercaptoethanol (1 μl), and substrate coelenterazine dissolved in ethanol (1 μg / μl) in 1 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) buffer. Then, protein G-AQ fusion protein having luminescence activity was prepared by leaving it on ice (4 ° C.) for 2 hours. Luminescence reaction was started by adding 100 μl of 50 mM CaCl 2 to the obtained Protein G-AQ fusion protein solution, and luminescence activity was measured for 10 seconds with a luminescence measuring device PSN AB2200 (manufactured by ATTO). Luminescent activity (maximum value (Imax) etc.) was evaluated by relative luminescence intensity (rlu).
組換えプロテイン G−アポＡＱ融合蛋白質の大腸菌での発現
発現ベクターpCold-G-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を37℃で18時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン（100μg／ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地400 mlに添加して、37℃で2.5時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により５分間、5,000rpm（6000×g）で集菌した。
Expression expression vector pCold-G-AQ of recombinant protein G-apo AQ fusion protein in E. coli was introduced into E. coli BL21 strain by the polyethylene glycol method to obtain a transformed strain. The obtained transformant was cultured at 37 ° C. for 18 hours. After culturing, the transformed strain is inoculated into 10 ml of LB liquid medium (10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, pH 7.2 per liter of water) containing ampicillin (100 μg / ml). The culture was further performed at 37 ° C. for 18 hours. Subsequently, the cultured cell solution was added to 400 ml of a new LB liquid medium and cultured at 37 ° C. for 2.5 hours. After culturing, the cultured cell solution is cooled on ice water, and isopropyl-β-D (−)-thiogalactopyranoside (IPTG, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is cultured to a final concentration of 0.1 mM. And cultured at 15 ° C. for 17 hours. The cultured cells were collected at 5,000 rpm (6000 × g) for 5 minutes using a cooling centrifuge.
２） 培養菌体からのプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質の抽出
上記１）で集菌した菌体を20 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、ソニファイアーモデル250）を各20秒間、3回行った後、菌体破砕液を10,000rpm（12,000×g）で20分間遠心分離した。遠心分離により得られた不溶解性画分を再度20 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（3分間、2回）し、遠心分離を行った。この作業をもう一度繰り返し、得られた溶解性画分をProtein G−アポAQ融合蛋白質精製の出発材料とした。
2) Extraction of protein G-apoAQ fusion protein from cultured cells Suspend the cells collected in 1) above in 20 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) and sonicate with ice-cooling. (Branson, Sonifier Model 250) was performed 3 times for 20 seconds each, and then the cell disruption solution was centrifuged at 10,000 rpm (12,000 × g) for 20 minutes. The insoluble fraction obtained by centrifugation is suspended again in 20 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), and subjected to ultrasonic crushing treatment (3 minutes, twice) under ice-cooling, followed by centrifugation. It was. This operation was repeated once more, and the resulting soluble fraction was used as a starting material for protein G-apo AQ fusion protein purification.
３） ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法によるプロテインG−アポAQ融合蛋白質の精製
組換え蛋白質はアミノ末端に6個のヒスチジン配列を有しているので、ニッケルキレートゲルによるアフィニティークロマト法により組換え蛋白質を精製した。
上記２）で得られた溶解性画分（50 ml）を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×4.3 ｃｍ）に添加して吸着させた後、カラムを100 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を30 ｍｌの0.1 Mイミダゾール（和光純薬工業社製）を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)、17 mlの0.2 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)、20 mlの0.3 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)にて溶出した。0.1 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)にて発光活性を有するプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質の溶出が確認された（40 ml ;プロテインG−アポAQ活性画分）。
3) Purification of protein G-apo AQ fusion protein by nickel chelate column chromatography Since the recombinant protein has six histidine sequences at the amino terminus, the recombinant protein is purified by affinity chromatography using nickel chelate gel. did.
Add the soluble fraction (50 ml) obtained in 2) above to a nickel chelate column equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) (Amersham Biosciences, column size: 1.5 x 4.3 cm diameter) Then, the column was washed with 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6). The protein adsorbed on the column is 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 30 ml of 0.1 M imidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 17 ml of 0.2 M imidazole, Elution was carried out with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 20 ml of 0.3 M imidazole. Elution of protein G-apo AQ fusion protein having luminescence activity was confirmed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 0.1 M imidazole (40 ml; protein G-apo AQ active fraction).
４） プロテインG−AQ融合蛋白質の調製法
ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法により得られたプロテインG−アポAQ融合蛋白質から発光活性を有するプロテインG−AQ融合蛋白質への変換を行った。精製プロテインG−アポAQ融合蛋白質（40 ml中30 mlを使用）を10mM DTTおよび、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 20 mlに溶解し、エタノールに溶解したセレンテラジン 500 μgを加え、4℃で一昼夜放置し、プロテインG−ＡＱ融合蛋白質へと変換した。このプロテインG−ＡＱ融合蛋白質に、硫酸アンモニウムを終濃度2 Mとなるよう添加し10,000rpm（12,000×g）で10分間遠心分離した。得られた不溶解性画分を6 mlの1.2 M硫酸アンモニウムを含む2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH7.6)に溶解した。
4) Preparation method of protein G-AQ fusion protein Protein G-Apo AQ fusion protein obtained by nickel chelate column chromatography was converted to protein G-AQ fusion protein having luminescence activity. Dissolve the purified protein G-apo AQ fusion protein (30 ml in 40 ml) in 10 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM DTT and 10 mM EDTA, and add 500 μg of coelenterazine dissolved in ethanol. It was allowed to stand at 4 ° C. for a whole day and night to be converted into protein G-AQ fusion protein. To this protein G-AQ fusion protein, ammonium sulfate was added to a final concentration of 2 M and centrifuged at 10,000 rpm (12,000 × g) for 10 minutes. The obtained insoluble fraction was dissolved in 6 ml of 2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 1.2 M ammonium sulfate.
５） ブチルカラムクロマトグラフ法によるProtein G−ＡＱ融合蛋白質の精製
上記４）で得られたプロテインG−ＡＱ活性画分の一部を、1.2 M硫酸アンモニウムを含む2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したブチルカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×7cm）に添加してプロテインG−ＡＱ融合蛋白質を吸着させた。吸着したProtein G−ＡＱ融合蛋白質を、0.8 M硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）を含む2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH7.6)で溶出した（20 ml ; Protein G−ＡＱ活性画分）。また、精製過程の試料を12％SDS−PAGE分析を行った結果、精製プロテインG-AQ 蛋白質の純度95％以上であることが明らかとなった（図２）。
5) Purification of Protein G-AQ Fusion Protein by Butyl Column Chromatography A portion of the protein G-AQ active fraction obtained in the above 4) was added to 2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (1.2 M ammonium sulfate). The protein G-AQ fusion protein was adsorbed by adding to a butyl column (Amersham Biosciences, column size: diameter 1.5 × 7 cm) equilibrated with pH 7.6). The adsorbed Protein G-AQ fusion protein was eluted with 2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 0.8 M ammonium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (20 ml; Protein G-AQ activity fraction) Min). In addition, as a result of 12% SDS-PAGE analysis of the sample in the purification process, it was revealed that the purity of the purified protein G-AQ protein was 95% or more (FIG. 2).
実施例３ プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質の蛋白量と発光量との直線性
プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質を検出用プローブとして使用するためには、蛋白量と発光量とが直線性を示すことが必要である。プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質の濃度を100ピコグラムから1ナノグラムとして、50 mM CaCl2 100μlを注入し、発光測定装置Centro LB960（ベルトール社製）で発光活性を測定した。発光活性の最大値（Imax）と蛋白質濃度の相関を図３に示した。発光強度とプロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質との間に直線性の相関が認められた。この結果から、プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質の蛋白質量を、発光によって定量することが可能であることが示された。
Example 3 Linearity of protein amount and luminescence amount of protein G-AQ fusion protein In order to use a protein G-AQ fusion protein as a detection probe, it is necessary that the protein amount and luminescence amount exhibit linearity. It is. The concentration of the protein G-AQ fusion protein was changed from 100 picograms to 1 nanogram, 100 μl of 50 mM CaCl 2 was injected, and the luminescence activity was measured with a luminescence measuring apparatus Centro LB960 (manufactured by Bertol). The correlation between the maximum value of luminescence activity (Imax) and the protein concentration is shown in FIG. A linear correlation was observed between the luminescence intensity and the protein G-AQ fusion protein. From this result, it was shown that the protein amount of the protein G-AQ fusion protein can be quantified by luminescence.
実施例４ プロテインＧ−ＡＱ蛋白質を用いた競合法によるビオチンの定量法
ビオチン化BSA（シグマ社製）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（pH9.6）にて希釈し、5μｇ／ｍｌに調製した。得られた5μｇ／ｍｌのビオチン化BSA溶液を、96マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃437796）に100 μｌ／ウェル分注し、4℃にて一晩静置して、プレートをビオチン化BSAでコートした。静置後、前記プレートからビオチン化BSA溶液を除去した。前記プレートに、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳを200 μｌ／ウェル分注し、4℃で１6時間静置した。前記プレートから１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去した後、ＴＢＳＴ−Ｅを 340 μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄後、0.1％ＢＳＡ、2 ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＴＢＳにて、8 ｎｇ／ｍｌから1000 ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオチンBSA溶液50 μｌと抗ビオチンモノクローナル抗体溶液（シグマ社製、１２０００倍希釈溶液を使用）50 μｌを順次添加し、30℃で1時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを 340 μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。次に、前記プレートにプロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質（500 ｎｇ／ｍｌ）100 μｌを加え、25℃で１時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを 340 μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄したプレートに、50 ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する50 ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6）を100 μｌ／ウェル注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０にて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。その結果を図４に示した。この結果は、プロテインＧ−ＡＱ融合タンパク質によって、ビオチンに結合している抗ビオチンモノクローナル抗体が定量的に検出されたことを示している。すなわち、遊離ビオチンと固定化したビオチンとの間の、抗ビオチンモノクローナル抗体への結合の競合反応を利用することにより、遊離ビオチンの定量が可能であることが明らかとなった。
Example 4 Determination of biotin by competitive method using protein G-AQ protein Biotinylated BSA (manufactured by Sigma) was diluted with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) to prepare 5 μg / ml. The obtained 5 μg / ml biotinylated BSA solution is dispensed into a 96 microwell plate (Nunc, # 437796) at 100 μl / well and left to stand at 4 ° C. overnight. Coated. After standing, the biotinylated BSA solution was removed from the plate. 200 μl / well of TBS containing 1% BSA was dispensed onto the plate and allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. After removing TBS containing 1% BSA from the plate, TBST-E was dispensed at 340 μl / well to wash the plate, and then TBST-E was removed. The washing operation was further repeated twice. After washing, 50 μl of biotin BSA solution prepared by dilution from 8 ng / ml to 1000 ng / ml with TBS containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA and anti-biotin monoclonal antibody solution (Sigma, 12000-fold diluted solution) 50 μl was sequentially added and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour. After standing, the reaction solution was removed, TBST-E was dispensed at 340 μl / well to wash the plate, and then TBST-E was removed. The washing operation was further repeated twice. Next, 100 μl of protein G-AQ fusion protein (500 ng / ml) was added to the plate and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. After standing, the reaction solution was removed, TBST-E was dispensed at 340 μl / well to wash the plate, and then TBST-E was removed. The washing operation was repeated two more times to wash the plate. 100 μl / well of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 50 mM CaCl 2 was injected into the washed plate, and the luminescence intensity was measured with a luminescence plate reader Centro LB960 for 5 seconds. The emission intensity was evaluated by the maximum emission intensity value (Imax). The results are shown in FIG. This result indicates that the anti-biotin monoclonal antibody bound to biotin was quantitatively detected by the protein G-AQ fusion protein. That is, it has been clarified that free biotin can be quantified by utilizing a competitive reaction of binding to anti-biotin monoclonal antibody between free biotin and immobilized biotin.
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
When the fusion protein of the present invention is brought into contact with coelenterazine, which is a luminescent substrate, a holoprotein containing the fusion protein of the present invention and a coelenterazine peroxide can be easily formed. The holoprotein of the present invention is present in the form of a complex of the fusion protein of the present invention and coelenterazine peroxide in the presence of coelenterazine and oxygen. When calcium ions are bound to the complex, instantaneous light emission is exhibited. Therefore, the fusion protein of the present invention, the holoprotein of the present invention, and the like can be suitably used for detection or measurement of calcium ions.
Moreover, the fusion protein of the present invention has a high binding ability to IgG. As described above, the holoprotein composed of the fusion protein of the present invention and the peroxide of coelenterazine, which is a luminescent substrate, can be made to emit light by calcium ions. Therefore, the fusion protein of the present invention, the holoprotein of the present invention and the like can be suitably used for the detection of IgG.
［配列番号：１］プロテインGドメインのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−G−ＡＱに挿入された、プロテインG−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡにコードされている、プロテインG−アポイクオリン融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−G−ＡＱに挿入された、プロテインG−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
[SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of protein G domain.
[SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 3] This shows the amino acid sequence of apoaequorin.
[SEQ ID NO: 4] This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[SEQ ID NO: 5] Amino acid of protein G-apoiquorin fusion protein encoded by DNA encoding protein G-apoiquorin fusion protein inserted into expression vector pCold-G-AQ prepared in Example 1 Indicates the sequence.
[SEQ ID NO: 6] This shows the base sequence of the DNA encoding the protein G-apoaequorin fusion protein inserted into the expression vector pCold-G-AQ prepared in Example 1.
[SEQ ID NO: 7] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
[SEQ ID NO: 8] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
[SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of the primer used in Example 1.
[SEQ ID NO: 10] This shows the base sequence of the primer used in EXAMPLE 1.
Claims (17)
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｄ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質。 (1) A first region selected from the group consisting of the following (a) to ( c ):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a region having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG; And (c) a region comprising an amino acid sequence having 90 % or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG ;
(2) A second region selected from the group consisting of the following ( d ) to ( f ):
( D ) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
( E ) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and binds to a peroxide of coelenterazine or a coelenterazine derivative to form a calcium ion A region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by action, and ( f ) an amino acid sequence having 90 % or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a coelenterazine peroxide or coelenterazine A region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions in combination with a peroxide of a derivative ; and
A fusion protein containing
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群：
（ｄ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、請求項１記載の融合蛋白質。 (1) A group in which the first region is composed of the following (a) to ( c ):
(A) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a region having an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG; And (c) a region comprising an amino acid sequence having 95 % or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a function capable of binding to the Fc region of IgG ;
Selected from
(2) A group in which the second region is composed of the following ( d ) to ( f ):
( D ) a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
( E ) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and binds to a peroxide of coelenterazine or a coelenterazine derivative to form a calcium ion A region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by action, and ( f ) an amino acid sequence having 95 % or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a coelenterazine peroxide or coelenterazine A region having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions in combination with a peroxide of a derivative ;
The fusion protein of claim 1 selected from
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質。 (1) a region consisting of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) A fusion protein comprising a region consisting of the second amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｄ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド。 (1) A first coding sequence selected from the group consisting of the following (a) to ( c ):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 ,
(B) SEQ ID NO: a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region consisting of amino acid sequences, and (c) SEQ ID NO: 10 amino acids are deleted 1 in 1 amino acid sequence, substitution, insertion and And / or a polynucleotide comprising a polynucleotide that encodes a region consisting of an added amino acid sequence and having a function capable of binding to the Fc region of IgG;
(2) A second coding sequence selected from the group consisting of the following ( d ) to ( f ):
( D ) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 ;
( E ) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and ( f ) 1-10 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region comprising an amino acid sequence added and / or having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative nucleotide;
A polynucleotide comprising
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群：
（ｄ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド。 (1) A group in which the first coding sequence is composed of the following (a) to ( c ):
(A) a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 ,
( B ) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and ( c ) 1-5 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a region consisting of an added amino acid sequence and having a function capable of binding to an Fc region of IgG;
(2) A group in which the second coding sequence is composed of the following ( d ) to ( f ):
( D ) a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 ;
( E ) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and ( f ) 1-10 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, inserted and A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a region comprising an amino acid sequence added and / or having a function capable of forming a holoprotein that emits light by the action of calcium ions by binding to a peroxide of coelenterazine or a peroxide of a coelenterazine derivative nucleotide;
The polynucleotide of claim 8 selected from.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007134535A JP5040438B2 (en) | 2007-05-21 | 2007-05-21 | Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007134535A JP5040438B2 (en) | 2007-05-21 | 2007-05-21 | Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008283944A JP2008283944A (en) | 2008-11-27 |
| JP5040438B2 true JP5040438B2 (en) | 2012-10-03 |
Family
ID=40144267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007134535A Expired - Fee Related JP5040438B2 (en) | 2007-05-21 | 2007-05-21 | Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5040438B2 (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02154688A (en) * | 1988-12-06 | 1990-06-14 | Chisso Corp | Aequorin fused to protein having specific bonding capability and production thereof |
| JP4501211B2 (en) * | 2000-03-24 | 2010-07-14 | チッソ株式会社 | Luminescence standard substance |
| US8221998B2 (en) * | 2005-05-20 | 2012-07-17 | Glaxosmithkline Llc | Expression of protein GB1 domain fusion proteins in mammalian cells |
| JP2008048607A (en) * | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | FUSION PROTEIN OF Fc-BINDING DOMAIN AND CALCIUM-BINDING PHOTOPROTEIN, GENE ENCODING THE SAME AND USE THEREOF |
-
2007
- 2007-05-21 JP JP2007134535A patent/JP5040438B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2008283944A (en) | 2008-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101665352B1 (en) | Synthetic oplophorus luciferases with enhanced light output | |
| JP6110591B2 (en) | Luciferase biosensor for cAMP | |
| WO2007029747A1 (en) | Mutant firefly luciferase, gene, recombinant vector, transformant, and method for production of mutant firefly luciferase | |
| JP2008048607A (en) | FUSION PROTEIN OF Fc-BINDING DOMAIN AND CALCIUM-BINDING PHOTOPROTEIN, GENE ENCODING THE SAME AND USE THEREOF | |
| US8563270B2 (en) | Calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof | |
| JP2011528908A (en) | Identification of modulators of ubiquitin ligase | |
| US20050130262A1 (en) | Mutated photoproteins and their uses | |
| JP2002320482A (en) | New luciferase and photoprotein | |
| KR20190060024A (en) | Novel peptide for enhancing expression efficiency and fusion protein including the same | |
| JP5540367B2 (en) | Chaperonin mutant and DNA encoding the same | |
| JP5040438B2 (en) | Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof | |
| CN115161296B (en) | Mutant of spiny shrimp luciferase Nluc and application thereof | |
| JP6424101B2 (en) | Fusion protein of Fc-binding domain and calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof | |
| JP5251048B2 (en) | Polypeptide having luminescent catalytic activity | |
| JP2018012721A (en) | Fusion protein of fc-binding domain and calcium binding luminescent protein, gene encoding the same and use thereof | |
| US7241864B2 (en) | Recombinant photoproteins and their conjugates | |
| US8481702B2 (en) | Fusion protein having luminescence activity | |
| JP5703545B2 (en) | Fusion protein having photocatalytic activity | |
| JP5359155B2 (en) | Novel Gaussia luciferase mutant with cysteine introduced | |
| JP5589369B2 (en) | Mutant Gaussia luciferase | |
| JP2010142201A (en) | Method for producing photoprotein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091117 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20110331 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120313 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120511 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20120511 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120612 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120625 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5040438 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150720 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |