JP4501211B2 - Luminescence standard substance - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関する。詳細には、発光測定装置検定において発光量標準物質として発光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に学術研究の分野では、発光測定装置の検定および測定値フォトンの絶対量の決定を行う場合、そのフォトン量の絶対標準物質として半減期が５７３０年の放射性同位元素14Ｃ溶液が使用されてきた。しかし、14Ｃは、使用場所が法令上放射線同位元素の使用が許可されている場所に限定されるばかりか、取扱者がその放射線に曝されるという問題があった。
【０００３】
一方、発光測定検査は特に医薬や食品の分野において分析や検査の目的で重要な役目を担うようになり、発光測定装置の設置および使用は放射線管理区域外で行われるようになっている。しかし、放射線管理区域外では発光量標準物質として14Ｃを使用することができず、測定に際しては相対値（relative light unit）を用いているため、測定バッチ間および／または他の測定装置との間でデータを統一的に評価、管理することができないという問題が指摘されていた。
【０００４】
このため、化学発光反応系あるいは生物発光由来の酵素反応系、例えばルシフェラーゼによって生成される発光を発光量標準に用いることが考案されてきたが、これらの反応系は反応条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素濃度等の影響を比較的受けやすく、発光標準物質としては不適切であるとして、汎用法としては普及していない。
【０００５】
そこで、放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質が求められている。そのような発光量標準物質を用いて発光測定装置の検定を行うことができれば、各分析・検査において絶対量を決定することができ、各バッチ間でのデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られるデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一的に評価管理することが可能になる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用いることができ、非放射性物質からなり、生体系に影響を与えず、安定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質を提供することを目的とする。発光量標準物質としては、発光反応が反応条件による影響を受けにくく発光量が安定していること、さらに取扱いが容易であることが必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、14Ｃをフォトン量標準物質として使用する場合と同様に、その標準物質を測定装置にセットすることにより簡単に検定する方法を開発するべく検討を行った結果、カルシウムイオン結合によりフォトンを誘発するイクオリンを代表とする発光蛋白質が発光量標準物質として使用可能であることを明らかにした。即ち、発光測定装置検定において発光量標準物質として前記発光蛋白質を用いる。
【０００８】
従って、本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質を含む発光測定装置の検定用発光量標準物質に関する。
【０００９】
本発明はまた、発光蛋白質がカルシウム結合型発光蛋白質である発光量標準物質に関する。
【００１０】
本発明はまた、発光蛋白質が、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群から選択される天然由来または組換え蛋白質である、発光量標準物質に関する。本発明において、前記発光蛋白質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているものも包含される。
【００１１】
本発明はまた、発光蛋白質が、
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
を有する蛋白質である発光量標準物質に関する。前記発光蛋白質には、その１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換されている発光蛋白質も包含される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の発光量標準物質において、発光蛋白質として使用されるイクオリンは、シアトル近郊に生育する発光オワンクラゲ（Aequorea aequorea）の発光器から単離される蛋白質であり、蛋白質部分であるアポイクオリン（アポタンパク）と発光基質に相当するセレンテラジン、分子状酸素が複合体を形成した状態で存在している。そして、イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（λmax＝４６５nm）の瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド、二酸化炭素を生成する。イクオリンは、プレチャージ型蛋白質と称されるように、発光のエネルギーを分子内に蓄積しており、カルシウム溶液を添加することのみで、瞬間光（＝フォトン）が発生する。
【００１３】
イクオリンまたは、そのカルシウムイオンに対する感受性の高さから微量カルシウムイオンの検出、定量（検出限界１０nM）や細胞内カルシウムの動的変化のイメージプローブ（カルシウムセンサー）として用いられてきた。クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質も同様な目的で使用されてきた。
【００１４】
イクオリンの発光量は蛋白質濃度に比例し、イクオリンの正確な濃度を決定することによって発光量を規定することができるため、イクオリンを発光量標準物質として使用することができる。即ち、本発明は、14Ｃに代わる発光量標準物質として使用という、イクオリンの全く新しい使用方法を開示する。
【００１５】
本発明者は、発光オワンクラゲからイクオリン遺伝子を単離し（特開昭６１−１３５５８６号公報）、その後イクオリン変異体を用いてその発光機構を明らかにした（特開昭６３−２９１５９３号公報、特開昭６３−２９１５８６号公報、特開昭６４−０４７３７９号公報）。さらに、大腸菌系を用いるイクオリンの製造法を確立し、高純度イクオリンを製造した（特開平１−１３２３９７号公報）。
【００１６】
本発明において、発光量標準物質として使用するイクオリンは、天然由来または組換え体の何れでもよいが、正確な濃度を決定するという観点から均一で高純度のものが好ましく、上述の高純度組換えイクオリンがさらに好ましい。
【００１７】
また、天然型イクオリンの発光は高濃度カルシウムイオン（最終濃度が０.１mM以上）添加により数秒間で完了する高速発光反応であり、測定装置において発光をより正確に検出するためには、カルシウムイオンが高濃度であってもゆっくり反応が起きる変異型イクオリンがより好ましい。そのような変異型イクオリンは、本出願人の特開昭６３−２９１５９３号公報に記載されており、天然型イクオリンのアミノ酸配列において、１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換されているイクオリン変異体が特に好ましい。
【００１８】
本発明において使用し得る変異型イクオリンは、特に限定しないが公知の遺伝子組換え技術、例えば特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の方法によって製造することができる。このようにして得られるイクオリンの組換え変異体は、天然型イクオリンと同様に発光量標準物質として使用することができる。
【００１９】
また、イクオリンは天然型または変異体ともに、発光反応後にＥＤＴＡ等のキレート剤で処理することによりアポイクオリンからカルシウムを除去し、還元剤、セレンテラジン、酸素とともに低温でインキュベーションすることによって再生させて再利用することが可能である。
【００２０】
本発明において、発光量標準物質としてイクオリンを使用するためには、その活性を長期間安定的に保持させることが重要である。従って、本発明はまた、イクオリンの安定保存法に関する。高純度イクオリンの活性を維持するためには、使用目的あるいは使用場所にあわせて以下のような保存方法を採用することが好ましい。
１．濃度０.１mMのＥＤＴＡを含む１.０Ｍ以上の濃度の硫酸アンモニウム水溶液中１０℃以下で保存する。この保存方法の場合、最低２ヶ月は活性の低下が認められない。
２．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム溶液を液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。
３．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム水溶液が飽和硫酸アンモニウム水溶液になるように硫酸アンモニウムを添加することにより高純度イクオリンを塩析沈澱させ、液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。
４．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム水溶液に硫酸アンモニウムを徐々に加え、母液が薄く濁りはじめたら１０℃以下に保持して結晶を析出させ、結晶化したイクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム水溶液を１０℃以下で保存する。この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。
【００２１】
イクオリンについて得られた上述の知見から、イクオリンと同様に微量カルシウムイオンの検出等に使用されているクライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質についても、発光量標準物質として使用することができる。
【００２２】
イクオリンを発光蛋白質の代表例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
実施例１
高純度イクオリンの製造
１）組換えアポイクオリンの大腸菌での発現
大腸菌においてアポイクオリンを発現させるために、イクオリン遺伝子を包含するｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報）から構築した、アポイクオリン遺伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９７号公報）を用いた。宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、常法によりｐｉＰ−ＨＥで該菌株を形質転換した。得られた形質転換株を３０℃で一晩培養後、アンピシリン（５０μg／ml）を含有する５０mlのＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７.２）に植菌し、さらに３０℃で８時間培養した。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２Ｌに添加し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離した。菌体および培養液はともに発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
【００２４】
２）菌体からのイクオリンの精製
集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液中に懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、上澄み液を集めた。得られた上澄み液に化学合成したセレンテラジンを産生アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、４℃で５時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから溶液の２８０nmでの吸光度が０.０５以下になるまで２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.６でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオリン画分を０.１Ｍ−ＮａＣｌ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出させた。
【００２５】
再生イクオリンと未再生のアポイクオリンとの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２Ｍになるように調整した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、その上澄み液を、２Ｍ−硫酸アンモニウムを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６で平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イクオリン画分を収集した。
【００２６】
一方、未再生のアポイクオリンは、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６でのみ溶出された。再生イクオリン画分について、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％で、８０mgの高純度イクオリンを得た。
【００２７】
３）培養液からのイクオリンの精製
培養液からの高純度アポイクオリンの精製は、特開平１−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同様にＱ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、純度９８％以上のイクオリンを取得した。得られた精製イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。得られた高純度アポイクオリン５０mgから高純度イクオリン４５mgを得た。
【００２８】
実施例２
イクオリン変異体の製造
大腸菌においてイクオリン変異体を製造するために、特開昭６１−１３５５８６号公報に記載のｐＡＱ４４０の代わりに特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の変異型イクオリン遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、上述のｐｉＰ−ＨＥと同様に大腸菌においてイクオリン変異体（本実施例においては代表例として、１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基が全てセリンに置換された変異体）を発現させた。次いで、実施例１と同様に精製した。精製したイクオリン変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示し、その純度は９８％以上であった。
【００２９】
実施例３
イクオリンの純度検定およびイクオリンを用いた発光測定装置の評価
実施例１および２で取得した９８％以上の純度をもつ組換えイクオリン０.００１μgに高濃度のカルシウム溶液を添加し、その全発光量を14Ｃの標準溶液により補正された発光測定装置にて測定し、蛋白質１mgあたりの絶対発光量を算出した。その結果、得られた絶対発光量は、実施例１の天然型イクオリン、実施例２の変異体ともに蛋白質１mgあたり４.８×１０15フォトンであった。また、組換えイクオリン濃度を吸光度法にて測定した結果、吸収スペクトル２８０nmにおける０.０１％（ｗ／ｖ）イクオリンの吸光度は０.３０であった。
【００３０】
次いで、実施例１の組換えイクオリン（１２pg、６０pg、１２０pg、６００pgまたは１２００pg）に高濃度カルシウム溶液を添加し、上述の発光測定装置を用いて、その全発光量を実測値として相対発光量（rlu）を測定した。また、各々の量の組換えイクオリンについて、絶対発光量を蛋白質１mgあたりの絶対発光量４.８×１０15フォトンから求めた。そして、下記の式により、１相対発光量の絶対量を算出した。
１相対発光量の絶対量＝絶対発光量（フォトン）／相対発光量（rlu）
その結果を下記の表に示す。
【００３１】
【表１】
表１の結果から、組換えイクオリンの濃度と発光量は直線性を示し、絶対発光量から算出した１相対発光量の絶対量もほぼ一定であった。このようにイクオリンを用いて相対発光量を絶対発光量に変換すれば、他のバッチおよび／または他の測定装置で得られた測定値（相対値）を絶対発光量として評価することができる。
【００３３】
実施例４
＜高純度イクオリンの保存試験＞
実施例１のブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法で得られた高純度イクオリン画分について保存試験を行った結果を下記に示す。
（１）ＥＤＴＡ０.１mMを含む濃度１.０Ｍ以上の硫酸アンモニウム水溶液である実施例１で得られた高純度イクオリン画分を４℃で保存したところ、２ヶ月を超えても活性の低下は認められなかった。
（２）前記の高濃度硫酸アンモニウム溶液を含む高純度イクオリン画分を液体チッソを用い−８０℃で凍結保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかった。
（３）前記の高純度イクオリン画分に対し硫酸アンモニウム濃度が飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して高純度イクオリンを塩析沈殿させ、−８０℃で凍結させて保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかった。
（４）前記の高純度イクオリン画分を結晶化のための母液として、それに硫酸アンモニウムを徐々に加え母液が薄く濁りはじめたところで温度を下げ５℃に維持して結晶を析出させた。この結晶化したイクオリンを含む硫酸アンモニウム水溶液をそのまま５℃で保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質が提供される。本発明の発光量標準物質を用いて発光測定装置の検定を実施すれば、各分析・検査において絶対発光量を決定することができ、各バッチ間でのデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られるデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一的に評価管理することが可能である。
【００３５】
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a luminescence standard substance characterized by using a photoprotein. More specifically, the present invention relates to a luminescence standard substance characterized in that a luminescent protein is used as a luminescence standard substance in a luminescence measurement apparatus test.
[0002]
[Prior art]
In general, in the field of academic research, when calibrating luminescence measuring devices and determining the absolute amount of measured photons, a radioactive isotope 14 C solution with a half-life of 5730 years is used as an absolute standard for the photon amount. I came. However, 14 C is not only limited to places where the use of radioisotopes is permitted by law, but also has a problem in that operators are exposed to the radiation.
[0003]
On the other hand, the luminescence measurement inspection has come to play an important role for the purpose of analysis and inspection, particularly in the fields of medicine and food, and the installation and use of the luminescence measurement apparatus is performed outside the radiation control area. However, 14 C cannot be used as a luminescence standard substance outside the radiation control area, and relative values (relative light units) are used for measurement. Therefore, between measurement batches and / or with other measurement devices It was pointed out that the data could not be evaluated and managed in a unified manner.
[0004]
For this reason, it has been devised to use chemiluminescence reaction systems or bioluminescence-derived enzyme reaction systems, such as luminescence generated by luciferase, as luminescence standard, but these reaction systems are used for reaction conditions such as temperature, pH, Since it is relatively susceptible to dissolved oxygen concentration and the like, it is not suitable as a luminescent standard substance, and is not widely used as a general-purpose method.
[0005]
Therefore, there is a need for a luminescence standard substance that can be used for the calibration of a luminescence measuring device instead of the radioactive isotope 14 C. If the luminescence measuring device can be verified using such a luminescence standard substance, the absolute amount can be determined in each analysis / inspection, and data between batches and / or various luminescence measuring devices can be determined. Data, especially analysis and inspection data related to pharmaceutical foods, can be evaluated and managed in a unified manner.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention can be used for the calibration of a luminescence measuring device in place of the radioactive isotope 14 C, is made of a non-radioactive material, does not affect the biological system, can be stably supplied, and has a highly reliable luminescence standard. The purpose is to provide substances. As the luminescence standard substance, it is necessary that the luminescence reaction is hardly affected by the reaction conditions, the luminescence quantity is stable, and the handling is easy.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor studied to develop a simple assay method by setting the standard substance in a measuring device in the same manner as when using 14 C as a photon amount standard substance. It has been clarified that photoproteins such as aequorin that induce photons can be used as luminescence standards. That is, the photoprotein is used as a luminescence standard substance in a luminescence measuring apparatus test.
[0008]
Therefore, the present invention relates to a luminescence standard substance for calibration of a luminescence measuring device containing a calcium-binding photoprotein .
[0009]
The present invention also relates to a luminescence standard substance in which the photoprotein is a calcium-binding photoprotein.
[0010]
The present invention also relates to a luminescence standard substance, wherein the photoprotein is a naturally derived or recombinant protein selected from the group consisting of aequorin, clytin, oberin, mitrocomin, minneopsin and velvoin. In the present invention, amino acid sequences of the photoprotein include those in which one or several amino acids are deleted, substituted or added.
[0011]
The present invention also provides a photoprotein,
(A) A luminescence standard that is a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence of (a) in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added Concerning substances. The photoprotein also includes a photoprotein in which at least one of the cysteine residues at positions 145, 152, and 180 is substituted with serine.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The aequorin used as a photoprotein in the luminescence standard substance of the present invention is a protein isolated from a luminescent jellyfish (Aequorea aequorea) that grows in the vicinity of Seattle, and apoaequorin (apoprotein) which is a protein part. And coelenterazine corresponding to the luminescent substrate and molecular oxygen are present in the form of a complex. When calcium ions are bound to aequorin molecules, blue (λmax = 465 nm) instantaneous light emission is generated, and coelenteramide, which is an oxide of coelenterazine, and carbon dioxide are generated. Aequorin accumulates luminescence energy in the molecule as called a precharge type protein, and instantaneous light (= photon) is generated only by adding a calcium solution.
[0013]
Due to its high sensitivity to aequorin or its calcium ion, it has been used as an image probe (calcium sensor) for detection and quantification of trace calcium ions (detection limit 10 nM) and dynamic changes in intracellular calcium. Photoproteins such as Krytin, Oberin, Mytrocomin, Minneopsin, Belvoine have also been used for similar purposes.
[0014]
Since the amount of luminescence of aequorin is proportional to the protein concentration and the amount of luminescence can be defined by determining the exact concentration of aequorin, aequorin can be used as a luminescence standard substance. That is, the present invention discloses a completely new method of using aequorin, which is used as a luminescence standard substance instead of 14 C.
[0015]
The present inventor isolated an aequorin gene from a light emitting jellyfish (Japanese Patent Laid-Open No. 61-135586), and then clarified its luminescence mechanism using an aequorin mutant (Japanese Patent Laid-Open No. 63-291593, Japanese Patent Laid-Open No. Sho 63-291586, JP-A 64-047379). Furthermore, a method for producing aequorin using an E. coli system was established to produce high-purity aequorin (Japanese Patent Laid-Open No. 1-132397).
[0016]
In the present invention, the aequorin used as the luminescence standard substance may be either naturally derived or recombinant, but is preferably uniform and highly pure from the viewpoint of determining an accurate concentration. Aequorin is more preferred.
[0017]
The emission of natural aequorin is a fast luminescence reaction that can be completed in a few seconds by adding high-concentration calcium ions (final concentration of 0.1 mM or more). In order to detect luminescence more accurately in the measuring device, calcium ions Mutant aequorin that causes a slow reaction even at a high concentration is more preferred. Such mutant aequorin is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-291593 of the present applicant, and in the amino acid sequence of natural aequorin, at least one of cysteine residues at positions 145, 152 and 180 is present. Aequorin mutants substituted with serine are particularly preferred.
[0018]
The mutant aequorin that can be used in the present invention is not particularly limited, but can be produced by a known gene recombination technique, for example, the method described in JP-A-63-291586. The recombinant mutant of aequorin obtained in this way can be used as a luminescence standard substance in the same manner as natural aequorin.
[0019]
Aequorin, both natural and mutant, is treated with a chelating agent such as EDTA after the luminescence reaction to remove calcium from apoaequorin, and then regenerated by incubation with a reducing agent, coelenterazine, and oxygen at low temperatures for reuse. Is possible.
[0020]
In the present invention, in order to use aequorin as a luminescence standard substance, it is important to maintain its activity stably for a long period of time. Therefore, the present invention also relates to a method for stably storing aequorin. In order to maintain the activity of high-purity aequorin, it is preferable to adopt the following storage method according to the purpose of use or the place of use.
1. Store in an aqueous solution of ammonium sulfate at a concentration of 1.0 M or higher containing EDTA at a concentration of 0.1 mM at 10 ° C. or lower. In this storage method, no decrease in activity is observed for at least 2 months.
2. The high-concentration ammonium sulfate solution containing the aforementioned high-purity aequorin is frozen and stored in liquid nitrogen or the like. In this method, no decrease in activity is observed for at least one year.
3. The high-purity aequorin is salted out by adding ammonium sulfate so that the high-concentration aqueous ammonium sulfate solution containing the above-described high-purity aequorin becomes a saturated aqueous ammonium sulfate solution, and frozen and stored in liquid nitrogen. In this method, no decrease in activity is observed for at least one year.
4). Ammonium sulfate is gradually added to the high-concentration ammonium sulfate aqueous solution containing the above-described high-purity aequorin. When the mother liquor starts to become thin and turbid, it is kept at 10 ° C. or lower to precipitate crystals. Save with. In this method, no decrease in activity is observed for at least one year.
[0021]
From the above findings obtained for aequorin, photoproteins such as clitin, oberin, mitrocomine, minneopsin, and bervoin, which are used for detection of trace calcium ions as well as aequorin, can be used as a luminescence standard substance. it can.
[0022]
The present invention will be described by way of examples using aequorin as a representative example of a photoprotein, but the present invention is not limited to the following examples.
[0023]
【Example】
Example 1
Production of high-purity aequorin 1) Expression of recombinant apoaequorin in E. coli Apoaequorin gene expression constructed from pAQ440 (Japanese Patent Laid-Open No. 61-135586) including the aequorin gene in order to express apoaequorin in E. coli Vector piP-HE (Japanese Patent Laid-Open No. 1-132397) was used. Escherichia coli WA802 strain was used as a host, and the strain was transformed with piP-HE by a conventional method. The obtained transformant was cultured overnight at 30 ° C., and then 50 ml of LB liquid medium containing ampicillin (50 μg / ml) (10 g of bactotryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, pH 7 per liter of water). .2) was inoculated and further cultured at 30 ° C. for 8 hours. The culture was then added to 2 L of fresh LB liquid medium and cultured overnight at 37 ° C. (18 hours). After culturing, the cells and the culture solution were separated by low-speed centrifugation (5000 × g). Both the bacterial cells and the culture broth contained apoaequorin that was expressed, so that they were stored and used as starting materials for aequorin purification.
[0024]
2) Purification of aequorin from bacterial cells Collected bacterial cells in 400 ml of 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.6 buffer containing 200 mg of dithiothreitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) as a reducing agent. The cells were suspended in ice and treated with an ultrasonic crusher for 2 minutes under ice-cooling to crush the cells. After centrifugation at 12000 × g for 20 minutes, the supernatant was collected. Coelenterazine chemically synthesized in the obtained supernatant was dissolved in a small amount of methanol so as to have a molar concentration 1.2 times that of the produced apoaequorin, and left at 4 ° C. for 5 hours or more. The supernatant was immediately added to a Q-Sepharose column (Pharmacia, diameter 2 cm × 10 cm) equilibrated with a buffer solution of 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.6 to adsorb aequorin, and the solution was removed from the column. The column was washed with 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 7.6 until the absorbance at 280 nm was below 0.05. Then, the apoaequorin adsorbed on the column and the aequorin fraction were eluted with a linear concentration gradient of 0.1 M-NaCl to 0.4 M-NaCl.
[0025]
Separation of regenerated aequorin and unregenerated apoaequorin was performed using butyl sepharose 4 first flow gel, which is hydrophobic chromatography. That is, the orange eluate from the Q-Sepharose column was adjusted so that the final concentration of ammonium sulfate was 2M. The insoluble fraction was then removed by centrifugation, and the supernatant was butyl sepharose 4 first flow column (Pharmacia, column size, equilibrated with 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.6 containing 2M ammonium sulfate. : 2 cm × 8 cm in diameter) and eluted with a linear concentration gradient up to an ammonium sulfate concentration of 1 M, and an orange regenerated aequorin fraction having luminescence activity was collected.
[0026]
On the other hand, unregenerated apoaequorin was eluted only with 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.6. The regenerated aequorin fraction was analyzed by SDS-PAGE using a 12% polyacrylamide gel in the reduced state. As a result, a single band corresponding to a protein with a molecular weight of 25 kDa was detected in the purified fraction, and the purity was 98% or more as measured with a densitometer. The recovery rate of aequorin from the cells was about 80%, and 80 mg of high-purity aequorin was obtained.
[0027]
3) Purification of aequorin from culture broth Purification of high-purity apoaequorin from culture broth was performed according to the method described in JP-A-1-132973. That is, the culture was acidified to pH 5 or lower and left at 4 ° C. Apoaequorin that became a white precipitate was isolated by centrifugation and dissolved in the above-mentioned buffer containing a reducing agent. And the aequorin of purity 98% or more was acquired using the Q-sepharose column chromatography method and the butyl sepharose 4 first flow column chromatography method similarly to the refinement | purification process of the aequorin from a microbial cell. The obtained purified aequorin was analyzed by SDS-PAGE using a 12% polyacrylamide gel in the reduced state. As a result, a single band corresponding to a protein with a molecular weight of 25 kDa was detected, and its purity was measured with a densitometer. It was 98% or more. 45 mg of high purity aequorin was obtained from 50 mg of the obtained high purity apoaequorin.
[0028]
Example 2
Production of aequorin mutant In order to produce aequorin mutant in E. coli, the mutant aequorin gene described in JP-A-63-291586 is used instead of pAQ440 described in JP-A-61-135586. In the same manner as the above-described piP-HE, an aequorin mutant in E. coli (in this example, cysteine residues at positions 145, 152 and 180 are all substituted with serine. Mutants) were expressed. Subsequently, it refine | purified like Example 1. FIG. The purified aequorin mutant showed a single band in SDS-PAGE, and its purity was 98% or more.
[0029]
Example 3
Purity test of aequorin and evaluation of luminescence measuring apparatus using aequorin A high concentration calcium solution was added to 0.001 μg of recombinant aequorin having a purity of 98% or more obtained in Examples 1 and 2, The total luminescence was measured with a luminescence measuring device corrected with a 14 C standard solution, and the absolute luminescence per mg of protein was calculated. As a result, the obtained absolute luminescence amount was 4.8 × 10 15 photons per 1 mg of protein for both the natural aequorin of Example 1 and the mutant of Example 2. As a result of measuring the concentration of recombinant aequorin by the absorbance method, the absorbance of 0.01% (w / v) aequorin in the absorption spectrum at 280 nm was 0.30.
[0030]
Next, a high-concentration calcium solution was added to the recombinant aequorin (12 pg, 60 pg, 120 pg, 600 pg or 1200 pg) of Example 1, and the relative luminescence ( rlu) was measured. Further, for each amount of recombinant aequorin, the absolute luminescence amount was determined from the absolute luminescence amount 4.8 × 10 15 photons per 1 mg of protein. And the absolute amount of 1 relative luminescence amount was computed by the following formula.
1 Absolute amount of relative luminescence = Absolute luminescence (photon) / Relative luminescence (rlu)
The results are shown in the table below.
[0031]
[Table 1]
From the results in Table 1, the concentration of the recombinant aequorin and the luminescence amount showed linearity, and the absolute amount of one relative luminescence amount calculated from the absolute luminescence amount was almost constant. When the relative luminescence amount is converted into the absolute luminescence amount using aequorin as described above, the measurement value (relative value) obtained with another batch and / or another measurement apparatus can be evaluated as the absolute luminescence amount.
[0033]
Example 4
<Preservation test of high purity aequorin>
The results of a storage test on the high-purity aequorin fraction obtained by the butyl sepharose 4 first flow column chromatography method of Example 1 are shown below.
(1) When the high-purity aequorin fraction obtained in Example 1, which is an aqueous ammonium sulfate solution containing 0.1 mM EDTA and having a concentration of 1.0 M or more, was stored at 4 ° C., a decrease in activity was observed even after 2 months. There wasn't.
(2) When the high-purity aequorin fraction containing the high-concentration ammonium sulfate solution was frozen and stored at −80 ° C. using liquid nitrogen, no decrease in activity was observed even after the storage period exceeded one year.
(3) Ammonium sulfate was added to the high-purity aequorin fraction so that the ammonium sulfate concentration was saturated to salt out the high-purity aequorin, and it was frozen at -80 ° C and stored. Even if it exceeded, the fall of activity was not recognized.
(4) Using the high-purity aequorin fraction as a mother liquor for crystallization, ammonium sulfate was gradually added thereto, and when the mother liquor began to become lightly turbid, the temperature was lowered and maintained at 5 ° C. to precipitate crystals. When this aqueous ammonium sulfate solution containing crystallized aequorin was stored at 5 ° C. as it was, no decrease in activity was observed even after a storage period of one year.
[0034]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a luminescence standard substance that can be used for the calibration of a luminescence measuring device instead of the radioactive isotope 14 C. If the luminescence measuring device is calibrated using the luminescence standard substance of the present invention, the absolute luminescence amount can be determined in each analysis / inspection, and the data between each batch and / or various luminescence measuring devices can be determined. It is possible to uniformly evaluate and manage data obtained in particular, analysis and inspection data related to pharmaceutical foods.
[0035]
[Sequence Listing]
Claims (6)
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
を有するカルシウム結合型発光蛋白質である、請求項１に記載の発光量標準物質。 Calcium-binding photoprotein
(A) a calcium-binding photoprotein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence of (a) in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added. The luminescence standard substance according to claim 1, wherein
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