JP5540367B2 - Chaperonin mutant and DNA encoding the same - Google Patents
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Description
本発明は、シャペロニン変異体およびこれをコードするＤＮＡに関する。 The present invention relates to a chaperonin mutant and a DNA encoding the same.
シャペロニンは、基質タンパク質の正しいフォールディングを介助するいわゆる分子シャペロンの１種である。シャペロニンファミリーは、分子量５０〜６０ｋＤａのタンパク質であり、リング状の複合体構造をとり、ＡＴＰ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助するという共通の特徴を有している。シャペロニンの中でも、ＧｒｏＥＬは大腸菌が有するシャペロニンであり、ＡＴＰとＧｒｏＥＳ依存的にタンパク質のフォールディングを介助することが明らかにされている。
シャペロニンＧｒｏＥＬは、ＧｒｏＥＬサブユニットの７量体が１つのリングを構成し、このリングがさらに背中合わせに２つ重なった状態の合計で１４量体の構造をしている。また、ひとつのＧｒｏＥＬサブユニットはＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。
Chaperonins are a class of so-called molecular chaperones that help the correct folding of substrate proteins. The chaperonin family is a protein having a molecular weight of 50 to 60 kDa, and has a common feature of taking a ring-shaped complex structure and assisting the folding of the substrate protein in an ATP-dependent manner. Among the chaperonins, GroEL is a chaperonin possessed by Escherichia coli, and has been shown to assist protein folding in an ATP- and GroES-dependent manner.
The chaperonin GroEL has a 14-mer structure in total in which a 7-mer of GroEL subunits constitutes one ring, and this ring is further overlapped two back to back. One GroEL subunit is composed of an equator domain containing an ATP binding site, a vertex domain containing a binding site between a substrate protein and GroES, and an intermediate domain connecting both domains.
基質タンパク質のフォールディングにおいては、まずシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットで構成されたリングの「入り口」に基質タンパク質が結合し、リングを構成するシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットに７つのＡＴＰがそれぞれ結合すると、シャペロニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こって補因子であるＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合可能となる。次いで、ＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合すると、基質タンパク質がリングの空洞内に落とし込まれ、シャペロニン複合体を形成する。シャペロニン複合体ではリングの空洞内で落とし込まれた基質タンパク質のフォールディングが進行する。次いでリング内のＡＴＰが加水分解されるとＧｒｏＥＳが解離し、それと同時にリング内のフォールディングされた基質タンパク質も解離する。すなわち、ＡＴＰの加水分解の時間がシャペロニンＧｒｏＥＬの反応サイクルのタイマーになっている。
ＡＴＰの加水分解の時間は、野生型ＧｒｏＥＬでは約８秒である。一方、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸がアラニンに置換されたＧｒｏＥＬ変異体（以下、「ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）」ということがある）では、ＡＴＰの加水分解活性が野生型の２％以下となり複合体の半減期が３０分以上となることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
The hydrolysis time of ATP is about 8 seconds for wild type GroEL. On the other hand, among the amino acid sequence of wild-type GroEL, in the GroEL mutant in which the aspartic acid at position 398 is substituted with alanine (hereinafter sometimes referred to as “GroEL (D398A)”), the hydrolysis activity of ATP is wild-type. It is known that the complex has a half-life of 30% or more (for example, see Non-Patent Document 1).
非特許文献１に記載のシャペロニン変異体は、シャペロニンによるフォールディング反応の生化学的解析に利用されているが、より詳細な解析等のため、半減期がより長いシャペロニン変異体が要望されている。
本発明は、従来のシャペロニン変異体よりもＡＴＰの加水分解活性が低下し、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体および該シャペロニン変異体をコードするＤＮＡを提供することを課題とする。
The chaperonin mutant described in Non-Patent Document 1 is used for biochemical analysis of the folding reaction by chaperonin, but a chaperonin mutant having a longer half-life is desired for more detailed analysis.
An object of the present invention is to provide a chaperonin mutant in which the hydrolytic activity of ATP is lower than that of a conventional chaperonin mutant and the retention time of the chaperonin complex is extended, and a DNA encoding the chaperonin mutant. .
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
すなわち本発明の第１の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。
また本発明の第２の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を少なくとも１つ含むシャペロニン変異体である。
Specific means for solving the above problems are as follows.
That is, in the first aspect of the present invention, the GroEL subunit variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contains one or more amino acids other than the 52nd and 398th alanines. It is a GroEL subunit variant consisting of a substituted, deleted, or added amino acid sequence and having molecular chaperone activity.
The second aspect of the present invention is a chaperonin mutant comprising at least one GroEL subunit mutant.
本発明の第３の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡである。前記ＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。 A third aspect of the present invention is DNA comprising a base sequence encoding the GroEL subunit mutant. The DNA is a DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and encodes a protein having molecular chaperone activity. Is preferred.
本発明の第４の態様は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターである。また本発明の第５の態様は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体である。 The fourth aspect of the present invention is a recombinant vector comprising a DNA comprising a base sequence encoding the GroEL subunit mutant. The fifth aspect of the present invention is a transformant transformed with the recombinant vector.
本発明の第６の態様は、前記シャペロニン変異体および被内包物を接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記被内包物を内包すること、を含むシャペロニン複合体の製造方法である。
さらに本発明の第７の態様は、前記シャペロニン変異体と目的タンパク質とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記タンパク質を内包することと、目的タンパク質の構造を解析することと、を含む目的タンパク質の構造解析方法である。
A sixth aspect of the present invention is a method for producing a chaperonin complex, which comprises bringing the chaperonin mutant and the inclusion into contact with each other and encapsulating the inclusion in the chaperonin mutant.
Furthermore, the seventh aspect of the present invention is a target protein comprising: bringing the chaperonin mutant into contact with the target protein, encapsulating the protein in the chaperonin mutant, and analyzing the structure of the target protein This is a structural analysis method.
本発明によれば、従来のシャペロニン変異体よりもＡＴＰの加水分解活性が低下し、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体および該シャペロニン変異体をコードするＤＮＡを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a chaperonin mutant in which the hydrolysis activity of ATP is lower than that of a conventional chaperonin mutant and the retention time of the chaperonin complex is extended, and a DNA encoding the chaperonin mutant. .
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するタンパク質である。
かかる構成のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットのアミノ酸配列における５２番目と３９８番目のアスパラギン酸がアラニンに変異しているため、ＡＴＰの加水分解活性が顕著に低下している。このため、これを含んで構成されるシャペロニン変異体の反応サイクルを従来のシャペロニン変異体、例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）と比べて、フォールディング活性を低下させることなく、飛躍的に延ばすことができる。
The GroEL subunit mutant of the present invention is a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids other than alanine at positions 52 and 398 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted or deleted Or a protein consisting of an added amino acid sequence and having molecular chaperone activity.
In the GroEL subunit mutant having such a configuration, since the aspartic acid at positions 52 and 398 in the amino acid sequence of the wild-type GroEL subunit is mutated to alanine, the hydrolysis activity of ATP is significantly reduced. For this reason, the reaction cycle of the chaperonin mutant comprising this can be dramatically extended without lowering the folding activity as compared with the conventional chaperonin mutant, for example, GroEL (D398A).
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）変異体における５２番目のアスパラギン酸をアラニンにさらに変異させることで、相乗的にＡＴＰの加水分解活性が低下するという本発明者らが初めて見出した知見に基づいて完成されたものである。
尚、本明細書においては、ＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ」、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の１４量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体」、「シャペロニンＧｒｏＥＬ」と基質タンパク質等との複合体を「シャペロニン複合体」と称する。
The present inventors have found for the first time that the GroEL subunit mutant of the present invention synergistically reduces ATP hydrolysis activity by further mutating the 52nd aspartic acid to alanine in the GroEL (D398A) mutant. It was completed based on the findings.
In the present specification, the 14-mer of the GroEL subunit is “chaperonin GroEL”, the 14-mer of the GroEL subunit variant is “chaperonin GroEL mutant”, a complex of “chaperonin GroEL” and a substrate protein, etc. Is referred to as a “chaperonin complex”.
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、ＡＴＰの加水分解活性が低下しているものであれば特に制限はない。
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列のうち５２番および３９８番のアラニン以外の位置における、アミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１５以下、より好ましくは１０以下であり、さらに好ましくは５以下である。
In the present invention, the GroEL subunit mutant consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids other than alanine at positions 52 and 398 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, or added is ATP. There is no particular limitation as long as the hydrolytic activity is reduced.
In the present invention, the number of amino acid substitutions, deletions, or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 other than the 52nd and 398th alanines is preferably 15 or less, more preferably 10 Or less, more preferably 5 or less.
前記アミノ酸の置換としては、以下のような例が挙げられる。
一般にタンパク質の機能を維持するためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、Ａｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は好ましく許容される。
Examples of the amino acid substitution include the following.
In general, in order to maintain the function of a protein, the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution. Such amino acid substitutions are called conservative substitutions. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are all classified as nonpolar amino acids, and thus have similar properties to each other. Further, examples of non-chargeability include Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gln. Moreover, Asp and Glu are mentioned as an acidic amino acid. Examples of basic amino acids include Lys, Arg, and His. Amino acid substitutions within each of these groups are preferably tolerated.
本発明におけるアミノ酸の置換は、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体に機能を追加するものであってもよい。新たな機能を付加する置換の具体例としては、例えば、野生型ＧｒｏＥＬの４９０番のアスパラギン酸をシステインに変異させた変異体（Nat. Biotechnol., 2001 Sep; 19(9): 861-5.）が挙げられる。かかる変異は、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体をガラス基板等に固定化することを可能にする。また、２６５番のアスパラギンをアラニンに変異させた変異体（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Jan 27; 267(3): 842-9.）を挙げることもできる。かかる変異は変性タンパク質をより強固にシャペロニンＧｒｏＥＬ変異体に結合することを可能にする。 The amino acid substitution in the present invention may add a function to the GroEL subunit mutant of the present invention. As a specific example of the substitution for adding a new function, for example, a mutant obtained by mutating aspartic acid No. 490 of wild type GroEL to cysteine (Nat. Biotechnol., 2001 Sep; 19 (9): 861-5. ). Such a mutation enables the chaperonin GroEL mutant to be immobilized on a glass substrate or the like. Moreover, the mutant (Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Jan 27; 267 (3): 842-9.) Which mutated asparagine of No. 265 to alanine can also be mentioned. Such a mutation makes it possible to bind the denatured protein more firmly to the chaperonin GroEL mutant.
また前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体において、さらにアミノ酸が欠失、付加（挿入）された変異体は、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体と同様の機能を有するものであっても、さらに機能が追加されたものであってもよい。これらの具体例としては、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニットにおけるＣ末端の繰返し配列を欠失、付加した変異体（Cell, 2006 Jun 2; 125(5): 903-14.）を挙げることができる。かかる変異は、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体の空洞の体積を変化させることを可能とする。
更に本発明におけるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、用途に応じて、１以上のアミノ酸がさらに付加したものであってもよい。このような付加可能なアミノ酸としては、シグナルペプチド、タグ配列等を挙げることができる。
In addition, in the GroEL subunit mutant, a mutant in which an amino acid is further deleted or added (inserted) has the same function as the GroEL subunit mutant, but has a function added. It may be. Specific examples thereof include a mutant (Cell, 2006 Jun 2; 125 (5): 903-14.) In which the C-terminal repetitive sequence in the GroEL subunit is deleted and added. Such a mutation makes it possible to change the volume of the cavity of the chaperonin GroEL mutant.
Furthermore, the GroEL subunit variant in the present invention may be one in which one or more amino acids are further added depending on the use. Examples of such addable amino acids include signal peptides and tag sequences.
本発明における配列番号１のアミノ酸配列中、５２番と３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬ変異体サブユニットとしては、前記具体例として挙げた変異以外の変異を有するものであってもよい。そのような変異としては例えば、Cell. 2002 Dec 27; 111(7): 1027-39．等に記載された特定のタンパク質をより効率的にフォールディングすることを可能にする変異や、Cell. 1995 Nov 17; 83(4): 577-87.等に記載された単一のリングからなる７量体を形成することを可能にする変異等をあげることができる。 In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the present invention, the GroEL mutant subunit consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids other than alanine at positions 52 and 398 are substituted, deleted, or added is the above-mentioned specific example It may have a mutation other than the mutation mentioned as an example. Examples of such mutation include Cell. 2002 Dec 27; 111 (7): 1027-39. 7 consisting of a single ring described in Cell. 1995 Nov 17; 83 (4): 577-87. Examples include mutations that make it possible to form a monomer.
本発明におけるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを通常用いられる方法で発現させることで製造することができる。具体的には、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを、組換えベクターに応じて選択される宿主細胞に感染させて、宿主細胞を培養することで製造することができる。 The GroEL subunit variant in the present invention can be produced, for example, by expressing a DNA comprising a base sequence encoding the GroEL subunit variant by a commonly used method. Specifically, it is produced by infecting a host cell selected according to the recombinant vector with a recombinant vector containing a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding a GroEL subunit mutant, and culturing the host cell. be able to.
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットをコードする塩基配列からなるＤＮＡに、対応する変異を導入することで得ることができる。導入する変異は少なくともアミノ酸配列における５２番目と３９８番目のアスパラギン酸をアラニンに変異するものであればよい。
変異の導入方法としては、通常用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、ＰＣＲを用いる方法や、部位特異的突然変異導入キット（例えば、Stratagene社製等）を用いる方法等を挙げることができる。
DNA comprising a base sequence encoding a GroEL subunit variant of the present invention can be obtained by introducing a corresponding mutation into DNA comprising a base sequence encoding a wild type GroEL subunit. The mutation to be introduced may be any mutation that mutates at least the 52nd and 398th aspartic acids in the amino acid sequence to alanine.
As a method for introducing mutation, a commonly used method can be used without particular limitation. Examples thereof include a method using PCR and a method using a site-directed mutagenesis kit (for example, manufactured by Stratagene).
本発明においてＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。
本発明における配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、対応するＧｒｏＥＬサブユニットのアミノ酸配列のうち５２番目と３９８番目に相当するアスパラギン酸がアラニンに変異しているタンパク質をコードすることが必要である。
In the present invention, the DNA consisting of the base sequence encoding the GroEL subunit mutant hybridizes with the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, And it is preferably a DNA encoding a protein having molecular chaperone activity.
DNAs that hybridize with a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the present invention under stringent conditions and that encode a protein having molecular chaperone activity are the 52nd and 398th amino acids of the corresponding GroEL subunit. It is necessary to encode a protein in which the second corresponding aspartic acid is mutated to alanine.
またストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 Stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed .
本発明の組換えベクターは、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードするＤＮＡを含む。また本発明の形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されたものである。かかる組換えベクター、および形質転換体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の製造に好適に用いることができる。 The recombinant vector of the present invention contains DNA encoding the GroEL subunit mutant. The transformant of the present invention is one transformed with the above recombinant vector. Such recombinant vectors and transformants can be suitably used for the production of GroEL subunit mutants.
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードするＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。前記ＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YEp24、YCp50等)などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。 The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating (inserting) the DNA encoding the GroEL subunit mutant into an appropriate vector. The vector for inserting the DNA is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. As plasmid DNA, plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50, etc.) And λ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, etc.). Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can also be used.
ベクターに前記ＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。本発明において前記ＤＮＡは、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターには、プロモーター、前記ＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）等が挙げられる。 In order to insert the DNA into a vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector DNA, and then linked to the vector. . In the present invention, the DNA needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene is exhibited. Therefore, the recombinant vector of the present invention contains, in addition to the promoter and the above DNA, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like as desired. Can be linked. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an antibiotic resistance gene (for example, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene) and the like.
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的ＤＮＡが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。またサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母も挙げられる。さらに、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞や、Ｓｆ９等の昆虫細胞も挙げられる。 The transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target DNA can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention. For example, bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida, and the genus Rhizobium meliloti such as Rhizobium meliloti Is mentioned. Moreover, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe are also included. Furthermore, animal cells such as COS cells and CHO cells, and insect cells such as Sf9 are also included.
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) ＤＨ５α、Ｙ１０９０、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。 When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium, and at the same time is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a gene of the present invention, and a transcription termination sequence. Is preferred. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli DH5α, Y1090, BL21 (DE3), and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis, but the present invention is not limited thereto. Is not to be done.
また前記プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
宿主細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
Any promoter may be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage, such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, etc. are used. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used.
The method for introducing the recombinant vector into the host bacterium is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into the bacterium. For example, a method using calcium ions [Cohen, SNet al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110 (1972)], electroporation method and the like can be mentioned.
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J.Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。
When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris and the like are used. In this case, the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter and the like. Can be used.
The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, the electroporation method [Becker, DM et al .: Methods. Enzymol., 194: 182 (1990 )], Spheroplast method [Hinnen, A. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929 (1978)], lithium acetate method [Itoh, H .: J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)].
目的ＤＮＡが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常用いられる条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。 Whether or not the target DNA has been incorporated into the host can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like. For example, DNA is prepared from the transformant, PCR is performed by designing a DNA-specific primer. PCR can be performed under the conditions normally used. Thereafter, the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplification product is detected as one band, It can be confirmed that it has been transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, it is possible to employ a method in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or enzyme reaction.
本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。 The GroEL subunit mutant of the present invention can be obtained by culturing the transformant and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells or cultured cells, or disrupted cells or cells.
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。 The method for culturing the transformant of the present invention is carried out according to a usual method used for culturing a host. As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物（例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等）が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。 Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol. Nitrogen sources include inorganic or organic acid ammonium salts (eg, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc.), and other nitrogen-containing compounds (eg, peptone, meat extract, corn steep liquor, etc.) Is mentioned. Examples of the inorganic substance include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で行う。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。 The culture is usually performed at 37 ° C. under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. The pH of the medium is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the Lac promoter, a microorganism transformed with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like with an expression vector using the trp promoter is cultured. Sometimes indole acetic acid (IAA) or the like may be added to the medium.
宿主の培養後、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抽出することができる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を単離精製することができる。 When the GroEL subunit mutant of the present invention is produced in the cells or cells after culturing the host, it can be extracted by disrupting the cells or cells. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, From the above, the GroEL subunit mutant of the present invention can be isolated and purified.
本発明のシャペロニン変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、または、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体の少なくとも１種を含む。
すなわち、本発明のシャペロニン変異体を構成する７以上（好ましくは１４）のＧｒｏＥＬサブユニットのうち、少なくとも１つは上記のＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。
The chaperonin mutant of the present invention is a GroEL subunit mutant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, one or more amino acids other than alanine at positions 52 and 398 are substituted, It comprises at least one GroEL subunit variant consisting of a deleted or added amino acid sequence and having molecular chaperone activity.
That is, at least one of the seven or more (preferably 14) GroEL subunits constituting the chaperonin mutant of the present invention is the above GroEL subunit mutant.
かかる構成のシャペロニン変異体は、従来知られているシャペロニン変異体（例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ））と比べて顕著にＡＴＰの加水分解活性が低下して、この変異体が基質タンパク質等と形成するシャペロニン複合体の保持時間を延長することを可能としながら、フォールディング活性は低下していないという優れた効果を奏する。さらに本発明のシャペロニン変異体は、シャペロニン変異体を構成する２つのリング（空洞）に同時に被内包物（例えば、タンパク質）を内包することができるため、より効率的に被内包物をシャペロニン複合体内に内包することができる。 The chaperonin mutant having such a structure has a significantly lower ATP hydrolyzing activity than a conventionally known chaperonin mutant (for example, GroEL (D398A)), and this mutant forms a chaperonin with a substrate protein or the like. While it is possible to extend the retention time of the complex, there is an excellent effect that the folding activity is not lowered. Furthermore, since the chaperonin mutant of the present invention can encapsulate the inclusion (for example, protein) in two rings (cavities) constituting the chaperonin mutant at the same time, the inclusion is more efficiently contained in the chaperonin complex. Can be included.
本発明のシャペロニン変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニットの数は、被内包物を内包可能であれば特に制限はないが、７量体であることが好ましく、より好ましくは１４量体である。またこれらのサブユニットのうち、配列番号１のアミノ酸配列またはこれと同等のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体の数は少なくとも１であるが、ＡＴＰの加水分解活性の観点から、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の７量体であることが好ましく、より好ましくは１４量体である。
尚、本発明のシャペロニン変異体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニットの集合から、通常の条件下、例えば、ＡＴＰ依存的（Nature, 1990 Nov 22; 348(6299): 339-42）に形成される。
The number of GroEL subunits constituting the chaperonin mutant of the present invention is not particularly limited as long as the inclusion can be encapsulated, but is preferably a 7-mer, and more preferably a 14-mer. In addition, among these subunits, the number of GroEL subunit variants consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence equivalent thereto is at least 1. From the viewpoint of ATP hydrolysis activity, the GroEL subunit mutation It is preferably a heptamer, more preferably a 14-mer.
In addition, the chaperonin mutant of the present invention can be obtained from a group of GroEL subunits including a GroEL subunit mutant under normal conditions, for example, ATP-dependent (Nature, 1990 Nov 22; 348 (6299): 339-42). Formed.
本発明のシャペロニン複合体の製造方法は、前記シャペロニン変異体と、被内包物とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記被内包物を内包し、被内包物が内包されたシャペロニン複合体を形成することを含む。
本発明においては、シャペロニン変異体のＡＴＰ加水分解活性が低下していることで、被内包物を内包したシャペロニン複合体の状態を長時間維持することができる。
The method for producing a chaperonin complex of the present invention comprises contacting the chaperonin mutant with an inclusion, encapsulating the inclusion in the chaperonin mutant, and forming the chaperonin complex containing the inclusion. Forming.
In the present invention, since the ATP hydrolysis activity of the chaperonin mutant is reduced, the state of the chaperonin complex encapsulating the inclusion can be maintained for a long time.
本発明における被内包物は、シャペロニン変異体が内包可能なものであれば特に制限はない。具体的には例えば、タンパク質、凝集性の有機化合物等を挙げることができる。さらに例えば、Nature 2003 Jun 5; 423(6940): 628-32.等に記載されているような半導体ナノ粒子（量子ドット）等であってもよい。
また本発明における被内包物は、シャペロニン変異体に内包されることから、例えば、タンパク質の場合、６０ｋＤａ以下の大きさであることが好ましい。
The inclusion in the present invention is not particularly limited as long as the chaperonin mutant can be included. Specific examples include proteins and aggregating organic compounds. Further, for example, semiconductor nanoparticles (quantum dots) described in Nature 2003 Jun 5; 423 (6940): 628-32.
In addition, since the inclusion in the present invention is included in the chaperonin mutant, for example, in the case of a protein, the size is preferably 60 kDa or less.
本発明のシャペロニン複合体においては、シャペロニン変異体が、特定の変異を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成されているため、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）に比べて遥かに長時間にわたって被内包物をシャペロニン変異体内に内包した状態を維持することができる。具体的には例えば、野生型のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニンにおいては８秒程度の内包時間であり、公知の変異体であるＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）サブユニットからなるシャペロニン変異体においては１時間程度であるのに対して、本発明のＧｒｏＥＬ（Ｄ５２、３９８Ａ）サブユニットからなるシャペロニン変異体においては５日以上と圧倒的に長時間にわたってシャペロニン複合体の維持が可能となる。 In the chaperonin complex of the present invention, since the chaperonin mutant is composed of a GroEL subunit mutant having a specific mutation, the encapsulated substance is chaperonin for a much longer time than GroEL (D398A). The state encapsulated in the mutant can be maintained. Specifically, for example, the chaperonin composed of the wild type GroEL subunit has an inclusion time of about 8 seconds, and the chaperonin mutant composed of the known GroEL (D398A) subunit has about 1 hour. In contrast, in the chaperonin mutant comprising the GroEL (D52, 398A) subunit of the present invention, the chaperonin complex can be maintained over an extremely long time of 5 days or longer.
このように安定なシャペロニン複合体は種々の用途に適用することができる。例えば、凝集性の目的タンパク質の製造に適用することで、該目的タンパク質を凝集させることなく、正しいフォールディング状態で安定に製造することができる。また、被内包物の構造解析、被内包物の徐放、被内包物の分散等に用いることができる。 Such a stable chaperonin complex can be applied to various uses. For example, by applying to the production of an aggregating target protein, the target protein can be stably produced in the correct folded state without aggregating the target protein. Further, it can be used for structural analysis of the inclusion, sustained release of the inclusion, dispersion of the inclusion, and the like.
本発明のシャペロニン複合体の製造方法においては、前記シャペロニン変異体と被内包物とを接触させてシャペロニン変異体内に被内包物を内包させることを含むが、シャペロニン変異体と被内包物を接触させる際に、ＡＴＰと、ＧｒｏＥＳタンパク質と、金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）をさらに共存させることが好ましい。これにより、より効率的に被内包物をシャペロニン変異体内に内包することができる。 The method for producing a chaperonin complex of the present invention includes bringing the chaperonin mutant into contact with the inclusion, and encapsulating the inclusion in the chaperonin mutant, but bringing the chaperonin mutant into contact with the inclusion. At this time, it is preferable to further coexist ATP, GroES protein, and metal ion (preferably magnesium ion). Thereby, the inclusion can be encapsulated in the chaperonin mutant more efficiently.
前記ＧｒｏＥＳタンパク質は、シャペロニンＧｒｏＥＬの補因子として作用し、被内包物をシャペロニンＧｒｏＥＬの空洞内に閉じ込めることができる。本発明においてＧｒｏＥＳタンパク質は、野生型のＧｒｏＥＳタンパク質であっても、ＧｒｏＥＳ変異体であってもよい。またＧｒｏＥＳタンパク質に蛍光ラベル等を常法により付加したものであってもよい。前記蛍光ラベル等には通常用いられる蛍光ラベル等を特に制限なく用いることができる。 The GroES protein acts as a cofactor of the chaperonin GroEL, and can encapsulate the inclusion in the cavity of the chaperonin GroEL. In the present invention, the GroES protein may be a wild-type GroES protein or a GroES mutant. Moreover, what added the fluorescent label etc. to the GroES protein by the conventional method may be used. As the fluorescent label or the like, a commonly used fluorescent label or the like can be used without particular limitation.
また本発明においては、前記ＡＴＰの代わりにＡＴＰ代替化合物を用いてもよい。ＡＴＰ代替化合物としては、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体のＡＴＰ結合部位に結合可能で、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体の構造変化を引き起こすことが可能な化合物であれば特に制限はない。例えば、ＡＤＰ、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物（J. Biol. Chem., 279, 45737-45743 (2004).）、ＡＤＰとフッ化アルミニウムやフッ化ガリウムの付加物（J. Mol. Biol., 2003 May 23; 329(1): 121-34.）等を挙げることができる。
ＡＴＰ代替化合物として、ＧｒｏＥＬのＡＴＰ加水分解部位で加水分解されない化合物（例えば、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物等）を用いることで、さらに長時間にわたって被内包物が内包されたシャペロニン複合体を維持することができる。
In the present invention, an ATP substitute compound may be used instead of the ATP. The ATP surrogate compound is not particularly limited as long as it is a compound capable of binding to the ATP binding site of the GroEL subunit mutant and causing the structural change of the chaperonin GroEL mutant. For example, ADP, an adduct of ADP and beryllium fluoride (J. Biol. Chem., 279, 45737-45743 (2004).), An adduct of ADP and aluminum fluoride or gallium fluoride (J. Mol. Biol. , 2003 May 23; 329 (1): 121-34.) And the like.
By using a compound that is not hydrolyzed at the ATP hydrolysis site of GroEL (for example, an adduct of ADP and beryllium fluoride, etc.) as an ATP substitute compound, the chaperonin complex containing the inclusion is maintained for a longer time. can do.
本発明のシャペロニン複合体の製造方法で得られるシャペロニン複合体においては、任意のタイミングで被内包物を放出させることができる。具体的にはシャペロニン複合体を構成する金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）の濃度を、通常用いられる方法（例えば、金属キレート化合物を用いる方法）で低下させることでシャペロニン複合体から被内包物を放出することができる。 In the chaperonin complex obtained by the method for producing the chaperonin complex of the present invention, the inclusions can be released at an arbitrary timing. Specifically, by reducing the concentration of metal ions (preferably magnesium ions) constituting the chaperonin complex by a commonly used method (for example, a method using a metal chelate compound), the inclusion is removed from the chaperonin complex. Can be released.
また、本発明のシャペロニン複合体の製造方法で得られるシャペロニン複合体においては、シャペロニン複合体を構成するＡＴＰの加水分解に伴って、徐々に（例えば、半減期５日以上）被内包物を放出することもできる。
このようなシャペロニン複合体の徐放性は、例えば、被内包物の構造解析、フォールディングされたタンパク質の製造方法、ドラッグデリバリーシステム等に応用することができる。
Further, in the chaperonin complex obtained by the method for producing the chaperonin complex of the present invention, the inclusions are gradually released (for example, 5 days or more) with hydrolysis of ATP constituting the chaperonin complex. You can also
Such sustained release properties of the chaperonin complex can be applied to, for example, structural analysis of inclusions, production methods of folded proteins, drug delivery systems, and the like.
本発明の目的タンパク質の構造解析方法は、本発明のシャペロニン変異体と、タンパク質とを接触させて、前記シャペロニン変異体内に前記目的タンパク質を内包することを含む。
本発明のシャペロニン変異体内に目的タンパク質を内包することで、目的タンパク質の構造を正しいフォールディング状態で構造解析を行うことができる。また、目的タンパク質の内包状態を長時間維持可能であることから、通常用いられる種々の構造解析方法を適用することが可能となる。
The method for analyzing the structure of the target protein of the present invention includes bringing the chaperonin mutant of the present invention into contact with the protein and encapsulating the target protein in the chaperonin mutant.
By encapsulating the target protein in the chaperonin mutant of the present invention, the structure of the target protein can be analyzed in the correct folded state. Moreover, since the encapsulated state of the target protein can be maintained for a long time, various commonly used structural analysis methods can be applied.
本発明の目的タンパク質の構造解析方法は、シャペロニン変異体と前記シャペロニン変異体に内包された目的タンパク質とを含むシャペロニン複合体を用いるものであれば特に制限はなく、通常用いられるタンパク質の構造解析方法を適用することができる。具体的には例えば、Ｘ線等を用いる結晶構造解析方法、電子顕微鏡法、ＮＭＲ等を挙げることができる。 The structure analysis method of the target protein of the present invention is not particularly limited as long as it uses a chaperonin complex containing a chaperonin mutant and the target protein encapsulated in the chaperonin mutant, and a structure analysis method for a protein that is usually used Can be applied. Specific examples include crystal structure analysis methods using X-rays, electron microscopy, NMR, and the like.
本発明におけるシャペロニン複合体は、長時間安定な状態で存在できるため、シャペロニン複合体として結晶化させることが可能である。かかるシャペロニン複合体結晶の構造と目的タンパク質を含まないシャペロニン変異体結晶の構造の差異から、目的タンパク質の正しいフォールディング状態での構造を解析することが可能となる（例えば、Nat. Struc. Mol. Biol., 2008 Jul; 15(7): 754-60）。
また本発明におけるシャペロニン複合体は、通常は凝集体を形成しやすい目的タンパク質を正しいフォールディング状態で長時間にわたって徐放することが可能であるため、例えば、ＮＭＲを用いた溶液状態での目的タンパク質の構造解析や結晶構造解析のための目的タンパク質の結晶成長が可能となる。
Since the chaperonin complex in the present invention can exist in a stable state for a long time, it can be crystallized as a chaperonin complex. From the difference between the structure of the chaperonin complex crystal and the structure of the chaperonin mutant crystal not containing the target protein, it is possible to analyze the structure of the target protein in the correct folding state (for example, Nat. Struc. Mol. Biol ., 2008 Jul; 15 (7): 754-60).
In addition, the chaperonin complex in the present invention can normally release a target protein that tends to form an aggregate over a long period of time in a correct folding state. For example, the target protein in a solution state using NMR Crystal growth of the target protein for structural analysis and crystal structure analysis becomes possible.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。また、本実施例で市販のキットを用いる場合は、そのキットの取扱説明書に従って操作を行った。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Unless otherwise specified, “%” is based on mass. When a commercially available kit was used in this example, the operation was performed according to the instruction manual for the kit.
１．ＧｒｏＥＬサブユニット変異体ＤＮＡの調製
出発遺伝子材料として、Escherichia coliのシャペロニンＧｒｏＥＬをコードする遺伝子断片を含有するプラスミドｐＥＴ−ＥＬ(Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000))を用いた。ｐＥＴ−ＥＬプラスミドの１本鎖ＤＮＡは、大腸菌ＣＪ２３６にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７(Amersham Pharmacia Biotech)を感染させることで調製した。
次いで、下記表１に示した合成ＤＮＡ１（配列番号３）を用いて、kunkel法(Methods Enzymol. 154, 367-382)により、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸がアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）をコードするＤＮＡを持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を作製した。
1. Preparation of GroEL subunit mutant DNA Plasmid pET-EL (Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849 (2000)) containing the gene fragment encoding the chaperonin GroEL of Escherichia coli is used as the starting genetic material. It was. Single-stranded DNA of pET-EL plasmid was prepared by infecting E. coli CJ236 with helper phage M13KO7 (Amersham Pharmacia Biotech).
Subsequently, using the synthetic DNA 1 (SEQ ID NO: 3) shown in Table 1 below, aspartic acid 398 of the wild-type GroEL amino acid was converted to alanine by the kunkel method (Methods Enzymol. 154, 367-382). A plasmid pET-EL (D398A) having a DNA encoding the mutated mutant GroEL (D398A) was prepared.
次に、下記表１に示した合成ＤＮＡ２（配列番号４）および合成ＤＮＡ３（配列番号５）を用い、Quick Change site-directed mutagenesis法 (Stratagene社製)により、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、５２番のアスパラギン酸がアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２Ａ）をコードする遺伝子を持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２Ａ）を作製した。
得られたｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２Ａ）のＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片を切り出し、上記で得られたｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ３９８Ａ）のＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片と入れ替えることで、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の５２番と３９８番のアスパラギン酸がそれぞれアラニンに変異した変異体ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）をコードするＤＮＡを持つプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）を作製した。
Next, by using the synthetic DNA 2 (SEQ ID NO: 4) and the synthetic DNA 3 (SEQ ID NO: 5) shown in Table 1 below, by Quick Change site-directed mutagenesis method (Stratagene), among the amino acid sequences of the wild type GroEL, A plasmid pET-EL (D52A) having a gene encoding mutant GroEL (D52A) in which the 52nd aspartic acid was mutated to alanine was prepared.
By excising the Cla I-Hind III fragment of the obtained pET-EL (D52A) and replacing it with the Cla I-Hind III fragment of the pET-EL (D398A) obtained above, 52 of the amino acid sequence of the wild type GroEL Plasmid pET-EL (D52, 398A) having a DNA encoding mutant GroEL (D52, 398A) in which aspartic acid of No. 398 and No. 398 were mutated to alanine was prepared.
２．シャペロニン変異体の調製
上記で得られたプラスミドｐＥＴ−ＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地中、３７℃の温度条件で、６００ｎｍにおける吸光度が０．８になるまで培養し、１ｍＭのisopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを加えてさらに２時間培養した。
遠心により集菌し、超音波破砕用緩衝液（25mM Tris(pH 7.5)、1mM EDTA、1mM dithiothreitol(DTT)、1mM 4-(2-aminoethyl)-benzene-sulfonyl fluoride hydrochloride）で懸濁した後、超音波破砕した。遠心分離した上清をBiochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000)に記載された方法で精製し、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列の５２番と３９８番のアスパラギン酸がそれぞれアラニンに変異したシャペロニンＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体を得た。
また、補因子であるＧｒｏＥＳタンパク質は、ＧｒｏＥＳ発現用プラスミドｐＥＴ−ＥＳ２を用いてBiochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849(2000)に記載された方法で調製した。
2. Preparation of chaperonin mutant E. coli BL21 (DE3) carrying the plasmid pET-EL (D52,398A) obtained above was cultured in LB medium at 37 ° C. until the absorbance at 600 nm reached 0.8. Then, 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside was added and further cultured for 2 hours.
Bacteria were collected by centrifugation and suspended in an ultrasonic disruption buffer (25 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM 4- (2-aminoethyl) -benzene-sulfonyl fluoride hydrochloride). Ultrasonic crushing. The centrifuged supernatant was purified by the method described in Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849 (2000), and aspartic acid of amino acids 52 and 398 of wild type GroEL was converted to alanine, respectively. A mutated chaperonin GroEL (D52, 398A) mutant was obtained.
Moreover, GroES protein which is a cofactor was prepared by the method described in Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 842-849 (2000) using GroES expression plasmid pET-ES2.
３．ＡＴＰ加水分解活性の測定
シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体からのＡＤＰの解離を、ＡＴＰ再生法（Mol. Cell 114,423-434(2004)）を用いて測定することで、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体のＡＴＰ加水分解活性を測定した。
反応溶液はＨＫＭ緩衝液（20mM HEPES-KOH (pH 7.4)、100mM KCl、5mM MgCl2）中に0.2mM NADH、5mM phosphoenolpyruvate、100μg/ml pyruvate kinase、100μg/ml lactate dehydrogenase、5mM dithiothreitol(DTT)、20μM lactalbumin、および、０．２μＭ ＧｒｏＥＬと０．６μＭ ＧｒｏＥＳ（図１）または２．５μＭ ＧｒｏＥＬと５μＭ ＧｒｏＥＳ（図２）を含む。
反応液に１ｍＭのＡＴＰを加えることで反応を開始し、ＮＡＤＨの酸化に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を連続的に計測した。
結果を図１および図２に示した。なお、図１はＧｒｏＥＬ変異体の濃度が０．２μＭおよびＧｒｏＥＳの濃度が０．６μＭの結果を示し、図２はＧｒｏＥＬ変異体の濃度が２．５μＭおよびＧｒｏＥＳの濃度が５μＭの結果を示す。
3. Measurement of ATP hydrolysis activity ADP hydrolysis activity of chaperonin GroEL mutant is measured by measuring dissociation of ADP from chaperonin GroEL mutant using ATP regeneration method (Mol. Cell 114, 423-434 (2004)). did.
The reaction solution was 0.2 mM NADH, 5 mM phosphoenolpyruvate, 100 μg / ml pyruvate kinase, 100 μg / ml lactate dehydrogenase, 5 mM dithiothreitol (DTT) in HKM buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 ), 20 μM lactalbumin and 0.2 μM GroEL and 0.6 μM GroES (FIG. 1) or 2.5 μM GroEL and 5 μM GroES (FIG. 2).
The reaction was started by adding 1 mM ATP to the reaction solution, and the decrease in absorbance at 340 nm resulting from the oxidation of NADH was continuously measured.
The results are shown in FIG. 1 and FIG. 1 shows the results when the GroEL mutant concentration is 0.2 μM and the GroES concentration is 0.6 μM, and FIG. 2 shows the results when the GroEL mutant concentration is 2.5 μM and the GroES concentration is 5 μM.
図１および図２から、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２Ａ）変異体のＡＴＰ加水分解活性は、野生型ＧｒｏＥＬの２５％であり、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）変異体のＡＴＰ加水分解活性は野生型ＧｒｏＥＬの７．０％であることが分かる。これに対して、本発明のＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体のＡＴＰ加水分解活性は野生型ＧｒｏＥＬの３．６％にまで低下していることが分かる。 From FIG. 1 and FIG. 2, the ATP hydrolysis activity of the GroEL (D52A) mutant is 25% of the wild type GroEL, and the ATP hydrolysis activity of the GroEL (D398A) mutant is 7.0% of the wild type GroEL. I understand that there is. In contrast, it can be seen that the ATP hydrolysis activity of the GroEL (D52,398A) mutant of the present invention is reduced to 3.6% of that of the wild type GroEL.
４．基質タンパク質のフォールディング活性の測定
自発的にフォールディングできないタンパク質であるRhodaneseを用いて、以下のようにしてＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体のフォールディング活性を測定した。
６Ｍ 塩酸グアニジンと１ｍＭ ＤＴＴを含む溶液中で変性したRhodaneseを、１μＭ ＧｒｏＥＬ変異体、２μＭ ＧｒｏＥＳ、２０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ ＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液中で４０倍に希釈して反応液とした。
それぞれの時間で反応液５μＬをサンプリングし、７５０μＬのアッセイ溶液(１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に添加して、反応を停止した。
Rhodanese活性の測定は、チオ硫酸イオンに由来するチオシアン酸イオンと硝酸鉄とによるチオシアン酸鉄の生成を４６０ｎｍの吸光度で計測する方法で行った(Acta Chem. Scand.7,1129-1136(1953))。天然型Rhodaneseは、チオ硫酸イオンとシアン化物からチオシアン酸イオンを生成する反応を触媒するが、変性Rhodaneseはこの反応を触媒することができない。従って生成したチオシアン酸鉄の濃度を測定することで、シャペロニン変異体における変性Rhodaneseから天然型Rhodaneseへのフォールディング活性を測定できる。
結果を図３に示した。図３より、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、野生型ＧｒｏＥＬと全く変わらないRhodaneseフォールディング活性を示したことがわかる。
4). Measurement of Folding Activity of Substrate Protein Using Rhodanese, a protein that cannot spontaneously fold, the folding activity of GroEL (D52, 398A) mutant was measured as follows.
Rhodanese denatured in a solution containing 6M guanidine hydrochloride and 1 mM DTT was diluted 40-fold in HKM buffer containing 1 μM GroEL mutant, 2 μM GroES, 20 mM Na 2 S 2 O 3 , 1 mM DTT, 4 mM ATP. It was set as the reaction liquid.
At each time, 5 μL of the reaction solution was sampled and added to 750 μL of assay solution (100 mM KH 2 PO 4 , 150 mM Na 2 S 2 O 3 , 1 mM EDTA) to stop the reaction.
The Rhodanese activity was measured by a method of measuring the generation of iron thiocyanate by thiocyanate ions derived from thiosulfate ions and iron nitrate at an absorbance of 460 nm (Acta Chem. Scand. 7, 1129-1136 (1953)). ). Natural Rhodanese catalyzes the reaction of producing thiocyanate ion from thiosulfate ion and cyanide, but modified Rhodanese cannot catalyze this reaction. Therefore, by measuring the concentration of the produced iron thiocyanate, the folding activity from the modified Rhodanese to the natural Rhodanese in the chaperonin mutant can be measured.
The results are shown in FIG. FIG. 3 shows that the GroEL (D52, 398A) mutant showed a Rhodanese folding activity that was not different from that of the wild-type GroEL.
５．シャペロニン複合体の解析
上記で得られたＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体が形成するシャペロニン複合体の構造を以下のようにしてゲルろ過クロマトグラフィーを用いて解析した。
5. Analysis of chaperonin complex The structure of the chaperonin complex formed by the GroEL (D52, 398A) mutant obtained above was analyzed using gel filtration chromatography as follows.
（１）ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）とＧｒｏＥＳの結合比率の評価
１ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＡＴＰとを含むＨＫＭ緩衝液中で、０．３μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）と０．３μＭ ＧｒｏＥＳ（常法によりＣｙ３にて蛍光ラベルしたＧｒｏＥＳ、以下、「Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ」という）と混合し、ＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）で分離した。結果を図４Ａに示した。
図４Ａから、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、ＧｒｏＥＳと１：１の弾丸型複合体を形成していることがわかる。
(1) Evaluation of GroEL (D52, 398A) and GroES binding ratio In HKM buffer containing 1 mM DTT and 1 mM ATP, 0.3 μM GroEL (D52, 398A) and 0.3 μM GroES (Cy3 by a conventional method) And fluorescently labeled GroES (hereinafter referred to as “Cy3-GroES”) and separated by HPLC gel filtration chromatography (G3000SWXL, manufactured by Tosoh Corporation). The results are shown in FIG. 4A.
FIG. 4A shows that the GroEL (D52, 398A) mutant forms a 1: 1 bullet complex with GroES.
次に、１ｍＭ ＤＴＴを含むＨＫＭ緩衝液中で、０．３μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体と０．６μＭ Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳと混合し、１ｍＭ ＡＤＰまたは１ｍＭ ＡＴＰを加えて、ＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）でそれぞれ分離した。結果を図４Ｂに示した。
図４Ｂから、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体とＧｒｏＥＳとは、ＡＤＰ存在下では弾丸型複合体を形成するが、ＡＴＰ存在下ではＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）：ＧｒｏＥＳ＝１:２のフットボール型複合体を形成することがわかる。
このようなフットボール型複合体は基質タンパク質を閉じ込めてフォールディングするチャンバー（空洞）が２つとも活性化された高効率の複合体である(J. Biol. Chem. 283, 23774-23781(2008))。
Next, in HKM buffer containing 1 mM DTT, 0.3 μM GroEL (D52,398A) mutant and 0.6 μM Cy3-GroES were mixed, 1 mM ADP or 1 mM ATP was added, and HPLC gel filtration chromatography ( G3000SWXL, manufactured by Tosoh Corporation). The results are shown in FIG. 4B.
From FIG. 4B, GroEL (D52, 398A) mutant and GroES form a bullet-type complex in the presence of ADP, but GroEL (D52, 398A): GroES = 1: 2 football-type complex in the presence of ATP. It turns out to form a body.
Such a football-type complex is a high-efficiency complex in which both chambers (cavities) for trapping and folding the substrate protein are activated (J. Biol. Chem. 283, 23774-23781 (2008)). .
（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価
次に、シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳまたは基質タンパク質の結合に要する時間を以下のようにして測定した。
１ｍＭ ＤＴＴと１ｍＭ ＡＴＰを含むＨＫＭ緩衝液中で１．５μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）と３μＭのＧｒｏＥＳ（非蛍光ラベル体）と混合することでフットボール型複合体を形成した（ｔ＝０とする）。３０秒のインキュベーションの後、複合体をゲルろ過クロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、GE Healthcare社製）で精製した。
複合体濃度を０．５μＭに調製し、１μＭ Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳと１ｍＭ ＡＴＰを加えた後、所定時間ごとにＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇ３０００ＳＷＸＬ、Ｔｏｓｏｈ社製）で分離し、新たなＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）の結合をＣｙ３の蛍光を測定して観察した（励起波長５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ）。結果を図５に示した。
(2) Evaluation of binding property of new GroES to chaperonin complex Next, the time required for binding of new GroES or substrate protein to the chaperonin complex was measured as follows.
A football-type complex was formed by mixing 1.5 μM GroEL (D52,398A) and 3 μM GroES (non-fluorescent label) in HKM buffer containing 1 mM DTT and 1 mM ATP (t = 0). . After incubation for 30 seconds, the complex was purified by gel filtration chromatography (PD-10 column, manufactured by GE Healthcare).
The complex concentration was adjusted to 0.5 μM, 1 μM Cy3-GroES and 1 mM ATP were added, and then separated by HPLC gel filtration chromatography (G3000SWXL, manufactured by Tosoh) at a predetermined time, and new GroES (Cy3-GroES) was added. ) Was observed by measuring the fluorescence of Cy3 (excitation wavelength 550 nm, fluorescence wavelength 570 nm). The results are shown in FIG.
上記において、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の代わりにＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を用いた以外は、上記と同様にして新たなＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）の結合をＣｙ３の蛍光を測定して観察した（励起波長５５０ｎｍ、蛍光波長５７０ｎｍ）。さらに同様にしてＣｙ３−Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ（常法によりＣｙ３で蛍光ラベルしたＲｈｏｄａｎｅｓｅ、基質タンパク質）との結合を測定した。結果を図６Ａおよび図６Ｂに示した。 In the above, except for using GroEL (D398A) instead of GroEL (D52, 398A), the binding of new GroES (Cy3-GroES) was measured and observed by measuring the fluorescence of Cy3 (excitation wavelength). 550 nm, fluorescence wavelength 570 nm). Furthermore, the binding to Cy3-Rhodane (Rhodane fluorescently labeled with Cy3 by a conventional method, substrate protein) was measured in the same manner. The results are shown in FIGS. 6A and 6B.
図５、図６Ａ、および図６Ｂから、ＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）の場合には、３０分後から基質タンパク質または新たなＧｒｏＥＳの結合が確認できるのに対して、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の場合には、５日後から新たなＧｒｏＥＳとの結合が観察されたことがわかる。
新たなＧｒｏＥＳとの結合は、フットボール型複合体の２つのチャンバー（空洞）の少なくとも一方の反応サイクルが一巡して、ＧｒｏＥＳが解離することにより起こることがわかっている(J. Biol. Chem. 283, 23774-23781(2008))。したがって、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体では、反応開始５日後から最初に結合したＧｒｏＥＳが解離し始めることが示された。
From FIG. 5, FIG. 6A and FIG. 6B, in the case of GroEL (398A), the binding of the substrate protein or new GroES can be confirmed after 30 minutes, whereas in the case of GroEL (D52, 398A) It can be seen that binding to new GroES was observed after 5 days.
Binding to the new GroES has been shown to occur as a result of GroES dissociating through a complete reaction cycle of at least one of the two chambers (cavities) of the football complex (J. Biol. Chem. 283). , 23774-23781 (2008)). Therefore, it was shown that the GroEL (D52, 398A) mutant started to dissociate the first bound GroES 5 days after the start of the reaction.
（３）シャペロニン複合体におけるＡＴＰ加水分解活性の評価
２μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）、４μＭ ＧｒｏＥＳ（Ｃｙ３−ＧｒｏＥＳ）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４を混合し、５分後にTSK-GEL guard column(Tosoh社製)でシャペロニン複合体を単離した。
所定時間経過ごとに、１．０％過塩素酸で処理して上清をＫ２ＣＯ３で中和し、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ、Ｔｏｓｏｈ社製）でＡＤＰとＡＴＰを分離して、２６０ｎｍにおける吸光度から、ＡＴＰとＡＤＰとをそれぞれ定量し、全ヌクレオチド中のＡＴＰおよびＡＤＰの割合を計算し、結果を図７に示した。
また、「（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価」と同様にしてＧｒｏＥＳの結合量の相対値を計算した。結果を図７に示した。
(3) Evaluation of ATP hydrolysis activity in chaperonin complex 2 μM GroEL (D52, 398A), 4 μM GroES (Cy3-GroES), 1 mM DTT, 1 mM ATP, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 50 mM KCl, 5 mM MgSO 4 was mixed, and 5 minutes later, the chaperonin complex was isolated with TSK-GEL guard column (Tosoh).
After each predetermined time, the supernatant was neutralized with K 2 CO 3 by treatment with 1.0% perchloric acid, and ADP and ATP were separated with a reverse phase HPLC column (ODS-80Ts, manufactured by Tosoh). From the absorbance at 260 nm, ATP and ADP were respectively quantified, the ratios of ATP and ADP in all nucleotides were calculated, and the results are shown in FIG.
Further, the relative value of the binding amount of GroES was calculated in the same manner as in “(2) Evaluation of binding ability of new GroES to chaperonin complex”. The results are shown in FIG.
上記において、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の代わりに、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）を用いた以外は、上記と同様にしてＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）複合体におけるＡＴＰの加水分解活性を評価した。ＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）１分子あたりのＡＴＰおよびＡＤＰの結合量を計算し、結果を図８に示した。
また、「（２）シャペロニン複合体への新たなＧｒｏＥＳの結合性の評価」と同様にして、ＧｒｏＥＳおよび基質タンパク質（Ｃｙ３−Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ）の結合量を計算した。結果を図８に示した。尚、空のＧｒｏＥＬ(Ｄ３９８Ａ)へのＧｒｏＥＳまたは基質タンパク質の結合量をそれぞれ２００％、１００％とした。
In the above, ATP hydrolysis activity in the GroEL (398A) complex was evaluated in the same manner as described above except that GroEL (D398A) was used instead of GroEL (D52, 398A). The binding amounts of ATP and ADP per molecule of GroEL (398A) were calculated, and the results are shown in FIG.
In addition, the amount of binding of GroES and substrate protein (Cy3-Rhodanese) was calculated in the same manner as in “(2) Evaluation of binding ability of new GroES to chaperonin complex”. The results are shown in FIG. The binding amount of GroES or substrate protein to empty GroEL (D398A) was 200% and 100%, respectively.
図７および図８から、ＧｒｏＥＬ（３９８Ａ）シャペロニン複合体においては、シャペロニン複合体に結合した１４のＡＴＰのうち、半分が加水分解してＡＤＰになるのに要する時間が３０分であるのに対して、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）シャペロニン複合体では結合したＡＴＰのうち半分が加水分解するのに５日以上を要することが示された。さらにＡＴＰの加水分解と同じくして最初のＧｒｏＥＳが解離し、次のＧｒｏＥＳの結合が可能となることが示された。 From FIG. 7 and FIG. 8, in the GroEL (398A) chaperonin complex, it takes 30 minutes for half of 14 ATPs bound to the chaperonin complex to hydrolyze to ADP. Thus, it was shown that it takes 5 days or more for half of the bound ATP to hydrolyze with the GroEL (D52,398A) chaperonin complex. Further, it was shown that the first GroES was dissociated in the same manner as ATP hydrolysis, and the next GroES could be bound.
以上の結果から、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むシャペロニン変異体においては、ＡＴＰの加水分解活性が低下してシャペロニン複合体の状態を長時間にわたって維持できたことがわかった。また、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むシャペロニン変異体においては、基質タンパク質のフォールディング活性が低下していなかったことがわかった。 From the above results, it was found that in the chaperonin mutant containing the GroEL subunit mutant of the present invention, the hydrolytic activity of ATP was reduced and the state of the chaperonin complex could be maintained for a long time. Further, it was found that the folding activity of the substrate protein was not decreased in the chaperonin mutant including the GroEL subunit mutant of the present invention.
Claims (8)
配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン以外の１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体。 GroEL subunit variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or
A GroEL subunit variant comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids other than alanine at positions 52 and 398 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, or added, and having molecular chaperone activity.
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。 DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, or
The DNA according to claim 3, which is a DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having molecular chaperone activity.
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