JP5036377B2 - 反応装置及び反応チップ - Google Patents
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Description
本発明は、反応装置及び反応チップに係り、特に、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（Ribonucleic acid：リボ核酸）などの核酸の増幅ができるＰＣＲ反応（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）を用いたＰＣＲ反応装置およびその反応チップに好適なものである。
最近、医療現場・食料品検査現場・危険物検査現場などで、ＤＮＡ分析に用いるＤＮＡチップが使われ始めている。このＤＮＡチップとは、多数の１本鎖ＤＮＡを固相上に多数固定化したものである。ＤＮＡチップを用いて塩基配列分析や診断分析を行うためには、微量であるＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸を分析に必要な量に増幅させなければならない。
核酸を増幅させる方法の一つとして、ＰＣＲ法がある。このＰＣＲ法によれば、例えば目標とする特定のＤＮＡを１０万倍以上に増幅することができる。ＤＮＡは４種類の塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）が連なった長い２本鎖からなる分子で構成され、一方の鎖のアデニンＡと他方の鎖のチミンＴとが対合し、一方の鎖のグアニンＧと他方の鎖のシトシンＣとが対合している。ＤＮＡは、高温（例えば９４℃）にすると２本の鎖がほどけて１本ずつばらばらになり、温度を下げると元通りの２本鎖に復元する性質がある。２本鎖がほどけたときに例えば５５℃で大量のプライマー（目的とするＤＮＡ領域の両末端の数塩基ほどの塩基配列を持つ１本鎖ＤＮＡの１組）を入れると、それぞれの鎖上の相補的な配列の部位に優先的に結合する。そこに例えば７２℃でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）と４種類の塩基があると、プライマーが結合した部分を起点としてそれぞれの鎖を合成していく。このＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、温度の上下（９４℃→５５℃→７２℃→９４℃）のサイクルを繰り返すだけでＤＮＡ合成の連鎖反応が起こり、ＤＮＡを増やすことが可能となる。
最近、反応流路を備えた小型チップを使って核酸の増幅実験が多く行われつつある。
例えば、非特許文献１である「Sensors and Actuators B 105 (2005) 251-258」にあるように、反応容器であるＰＣＲ反応チップ全体を加熱・冷却させ、反応液全体の温度を上下させることにより、核酸の増幅反応を行う手法が検討されている。
一方、特開２００５−２５３４６６号公報（特許文献１）にあるように、ＰＣＲ反応チップ内の異なる温度領域に対して流路を形成し、その流路に反応液を流すことでその反応液の温度を上下させて、核酸の増幅をさせる手法が検討されている。
しかし、上述した非特許文献１の手法では、ＰＣＲ反応チップ全体を加熱・冷却するため、加熱・冷却を繰り返してＰＣＲ反応を完了するまでに長い時間を要し、核酸の増幅に時間がかかるという問題があった。
また、上述した特許文献１の手法では、ＰＣＲ反応チップ全体を加熱して温度を変えるのではなく、チップ内に異なる温度領域を設定し、それぞれの領域に流路を構成し、その流路に反応液を流すことで反応液の温度を変えるので、非特許文献１と比較して反応時間を短くできるメリットがある。しかし、コストアップを抑制するため、ＰＣＲ反応チップはＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane、（Ｃ２Ｈ６ＳｉＯ）ｎ）などの樹脂で製作されるが、ＰＤＭＳの熱伝導率は０．２［Ｗ／ｍＫ］程度と小さく、金属のそれと比較すると、約１／１０００も小さい。しかも、周囲温度と設定温度の差が大きい。そのため、ＰＣＲ反応チップ下面から加熱してもＰＣＲ反応チップ内で温度差が生じ、その結果、反応液の各領域における温度が均一にならず、所定のＰＣＲ反応ができないおそれがあった。
本発明の目的は、反応液を短時間に均一に安定して反応をさせることができる反応装置および反応チップを提供することにある。
前述の目的を達成するための本発明の第１の態様は、複数の温度領域を設定し、これらの温度領域にまたがって形成した反応流路を有する樹脂製の反応チップと、前記反応チップの反応流路に反応液を送液するポンプと、前記反応液の送液を制御する制御装置と、前記反応チップの各温度領域を設定温度に加熱するヒーターとを備える反応装置において、前記反応チップの各温度領域を区分するようにその境界部分に凹溝を形成して断熱層を設けたことにある。
係る本発明の第１の態様におけるより好ましい具体的構成例は次の通りである。
（１）前記反応チップの各温度領域における蛇行反応流路を前記反応チップの加熱面側に設け、前記断熱層を反ヒーター加熱面側に迂回する流路で前記各蛇行反応流路を連通して構成したこと。
（２）前記反応チップの加熱面側に凹溝を形成して前記断熱層を構成したこと。
（３）前記反応チップの熱伝導率より高い熱伝導率を有する高熱伝導率部材を前記反応チップの各温度領域を囲むように設けたこと。
（４）前記高熱伝導率部材を装置側の反応ステージの上に設置したこと。
（５）前記高熱伝導率部材を装置側の反応ステージと共用して構成したこと。
（６）前記制御装置は、前記反応チップの各温度領域の反応流路における反応液を反応させる際にその反応液を往復送液するように制御すること。
（７）前記反応チップの各温度領域における反応流路の流路側面に凹凸の形状を設けたこと。
（１）前記反応チップの各温度領域における蛇行反応流路を前記反応チップの加熱面側に設け、前記断熱層を反ヒーター加熱面側に迂回する流路で前記各蛇行反応流路を連通して構成したこと。
（２）前記反応チップの加熱面側に凹溝を形成して前記断熱層を構成したこと。
（３）前記反応チップの熱伝導率より高い熱伝導率を有する高熱伝導率部材を前記反応チップの各温度領域を囲むように設けたこと。
（４）前記高熱伝導率部材を装置側の反応ステージの上に設置したこと。
（５）前記高熱伝導率部材を装置側の反応ステージと共用して構成したこと。
（６）前記制御装置は、前記反応チップの各温度領域の反応流路における反応液を反応させる際にその反応液を往復送液するように制御すること。
（７）前記反応チップの各温度領域における反応流路の流路側面に凹凸の形状を設けたこと。
また、本発明の第２の態様は、ヒーターにより加熱される複数の温度領域を設定し、これらの温度領域にまたがって形成した反応流路を有する樹脂製の反応チップにおいて、前記反応チップの各温度領域を区分するように前記各温度領域の境界部分に延びる凹溝を形成して断熱層を設けたことにある。
係る本発明の反応装置および反応チップによれば、反応液を短時間に均一に安定して反応をさせることができる。
以下、本発明の反応装置の一実施形態を図１から図６を参照しながら説明する。本実施形態の反応装置としてＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応装置を例にして説明するが、本発明はＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応装置でもよく、さらには、反応チップ内に複数の温度領域があり均一性を必要とする生化学反応装置にも適用可能である。
まず、本実施形態のＰＣＲ反応装置１００の全体構成に関して、図１を参照しながら説明する。
核酸を増幅する装置であるＰＣＲ反応装置１００は、反応チップ５０、反応ステージ２、ポンプ３、バルブ４、ヒーター５、移動ステージ６、モータドライバ７、制御基板８、電源９、情報アクセスパネル１０、その他の部品、これらを内部空間に収納するケース１などにより構成されている。
ケース１は、上面前部に、反応チップ５０を挿入するためのチップ取り入れ窓１ａを形成している。移動ステージ６は、チップ取り入れ窓１ａの下方の位置から後方に延びるように設置されている。反応ステージ２は移動ステージ６と共に移動可能である。反応チップ５０は、チップ取り入れ窓１ａを通してケース１内に挿入され、反応ステージ２に載置されて反応ステージ２と共に反応位置まで移動される。この反応位置で、チップ押え２１により押えられて固定状態とされる。そして、チップ押え２１を通して反応液が供給される。
ヒーター５は、反応ステージ２の下部に一体に設置されており、反応チップ５０を加熱する。ヒーター５は、例えばポリイミドフィルムなどの絶縁シートで挟んだカーボンヒーターを用い、ヒーター５の上面を放熱シートで覆うことによりヒーター自身の加熱温度の均一化を図るようになっている。このヒーター５は、設定すべき温度領域の数だけ設置される。
ポンプ３はＤＮＡサンプル液や洗浄液を反応チップ５０へ搬送するためのものであり、シリンジポンプが用いられる。バルブ４は、ＤＮＡサンプル液及び洗浄液の搬送を選択するようにポンプ３の搬送経路中に設けられている。ポンプ３及びバルブ４はＤＮＡサンプル液や洗浄液の送液を行う送液装置を構成するものである。
モータドライバ７及び制御基板８は、制御装置を構成するものであり、移動ステージ６、ポンプ４、バルブ４及びヒーター５などを制御する。電源９は各種部品に電気を供給する。情報アクセスパネル１０は、計測条件の入力に使う。なお、送液の制御には気液界面をカメラにより可視化して検出した結果に基づいて行われる。
チップ取り入れ窓１ａから反応チップ５０を入れ、移動可能な反応ステージ２と共に反応位置まで反応チップ５０を移動させる。シリンジポンプ３による加圧並びにバルブ４による切り替えによって、反応チップ５０の反応流路内にＤＮＡサンプル液や洗浄液を往復送液する。モータドライバ７及び制御基板８からなる制御装置は、情報アクセスパネル１０から入力された計測条件に基づいて、前述の反応チップ５０を移動、ＤＮＡサンプル液や洗浄液の往復送液を制御する。
次に、反応チップ５０について、図２から図５を参照しながら具体的に説明する。
図２は図１の反応チップの反応流路を説明する平面図、図３Ａは図１の反応チップの斜視図、図３Ｂは図３ＡのＡ−Ａ断面図である。反応チップ５０は、ＰＣＲ反応させる容器であるマイクロチップで構成され、コストアップを抑制するために、ＰＤＭＳなどの樹脂で製作されている。本実施形態では、この反応チップ５０は、反応流路５９などを形成した高さ約５ｍｍのＰＤＭＳ製のチップ本体７０と、その反応流路５９などを塞ぐ為の約１ｍｍの板状のＰＤＭＳ製の本体カバー７１とからなっている。本体カバー７１は、チップ本体７０の上下両面に接合され、チップ本体７０と共に流路を形成している。これによって、反応チップ５０を安価に且つ容易に作製することができる。
この反応チップ５０は、周囲温度領域６３と、ＰＣＲ反応を行うための複数の温度領域（本実施形態では、３つの温度領域）５６〜５８とに分けられている。この３つの領域は、破線５６で示す５５〜６０℃領域（第１の温度領域）と、破線５７で示す７２℃領域（第２の温度領域）と、破線５８ｂで示す９４℃領域（第３の温度領域）とからなっており、３つのヒーター５でそれぞれ加熱される領域である。
周囲温度領域６３には、試薬液や洗浄液を注入、抽出するためのハンドリングポート５１、５２、５３、５４、容器６０、６１が設けられている。容器６０には、ハンドリングポート５２を通して供給される液（例えばＰＣＲmixture）が貯留される。容器６１には、ハンドリングポート５３を通して供給される液（例えばプライマー）が貯留される。第１の領域５６には、ＤＮＡを抽出する細胞を採取するためのＤＮＡ抽出液溜め５５が設けられている。各領域５６〜５８、６３には、反応流路５９がまたがって形成されている。ＤＮＡ抽出液溜め５５には、ハンドリングポート５１を通してＤＮＡ抽出液が供給される。反応流路５９は蛇行した流路で形成されている。ＤＮＡサンプル液（反応液）を各温度領域の反応流路５９内で反応の際に往復送液することにより、反応を促進することができる。
反応チップ５０のプロトコルは、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ処理の２つの工程に分けることができる。反応チップ５０を用いてＰＣＲ反応を実施するための反応プロトコルの例を以下に説明する。ここでは、ＤＮＡは口腔内粘膜から抽出した場合を想定している。
まず、口腔内粘膜を擦り付けたブラシをＤＮＡ抽出液溜め５５内のＤＮＡ抽出液に浸す。次いで、そのＤＮＡ抽出液を７２℃領域５７を通して９４℃領域５８ｂに送液し、蛇行流路５９Ｂで往復送液を行いながら、高温にインキュベートさせることにより、ＤＮＡを抽出する。
次いで、ＰＣＲ処理を行う。インキュベートされた液を数ｍＬを抜き取り、この抜き取った液と容器６０に貯蔵されたＰＣＲmixture及び容器６１に貯蔵されたプライマーの２種類とを蛇行流路５９Ｃで合流させ、周囲温度領域６３に設けられた蛇行流路５９Ｃ内で往復送液させながら混ぜ合わせる。その後、５５〜６０℃領域５６、７２℃領域５７、９４℃領域５８ｂに順次送液し、それぞれの温度領域内で往復送液を繰り返すことにより、温度サイクルを実施してＤＮＡを増幅させる。最後に、この増幅したＤＮＡを取り出し口５４から抽出する。
なお、本実施形態では、温度領域を５５〜６０℃領域５６、７２℃領域５７、９４℃領域５８の３種類としたが、温度領域は２種類以上であれば何種類であってもよく、異なる温度領域が必要となるチップに対して本発明は有効になる。
各温度領域５６〜５８における反応液の温度を均一にするために、反応チップ５０の各温度領域５６〜５８を区分するようにその境界部分に断熱層を設けている。この断熱層として、一番簡単で効果的な空気断熱層６２を形成している。空気断熱層６２は、反応チップ５０の加熱面側に凹溝を形成したものであり、この点からもより一層簡単な構成となっている。
本実施形態では、反応チップ５０の各温度領域５６〜５８、６３における蛇行反応流路５９Ａ〜５９Ｆを反応チップ５０の加熱面側に設け、空気断熱層６２を反ヒーター加熱面側に迂回する送液流路５９Ｇで各蛇行反応流路５９Ａ〜５９Ｆを連通している。これにより、各温度領域５６〜５８、６３における温度の均一化をより一層向上することができる。
図４に示すように、反応チップ５０より熱伝導率の高いリング状の高熱伝導率部材８０で各温度領域５６〜５８、６３を囲むようにしている。これにより、各温度領域５６〜５８、６３の周囲からの熱的影響を均等にすることができ、各温度領域５６〜５８、６３における温度の均一化を図ることができる。
図５Ａ及び図５Ｂに示すように装置側の反応ステージ２をリング状の高熱伝導率部材８０と同一形状及び同一材料にし、反応チップ５０をヒーター５に近くに設置する。この場合には、各温度領域５６〜５８、６３における温度の均一化をより一層向上することができる。
本実施形態では、各温度領域５６〜５８、６３での反応、混合を促進するために、各温度領域５６〜５８、６３の蛇行反応流路５９Ａ〜５９Ｆは曲率の大きな曲がりを多数設けた蛇行した流路としている。この曲がりにより、反応液の流れは２次流れを伴ったものとなる。これにより、蛇行反応流路５９Ａ〜５９Ｆ内の流れは３次元流れとなり、反応液の混合がより促進されることにより反応が促進される。さらには、蛇行反応流路５９Ａ〜５９Ｆの側面に凹凸を設けることにより、反応液の流れが乱されてさらに反応液の混合が促進され、反応時間を短くすることができる。
なお、反応液を各温度領域５６〜５８、６３に送液することにより反応させる場合、反応液を空気の界面が崩壊し、反応液が複数の液体に分解してしまうという問題がしばしば起こる。しかし、蛇行反応流路５９Ａ〜５９Ｆにすること、並びに、反応液を往復させることにより、反応液の表面張力により反応液自身の崩壊を防ぐことができ、反応液が２つに分裂することを防止できる。
本発明の有効性を調べるために、本実施形態の反応チップ５０と、空気断熱層６２を有しない比較例の反応チップとに対して、熱流体解析を実施した。加熱面側の温度分布を比較した結果を図６に示す。図中の数字は温度を表す。上図は比較例の反応チップに対する加熱面側温度分布である。３つの温度領域にそれぞれヒーターにより加熱しているにもかかわらず、大きな温度分布がついていることがわかる。下図は本実施形態の反応チップ５０に対する加熱面側の温度分布である。各温度領域でほぼ一様な温度分布となっていることがわかる。この解析結果から、本実施形態による構造は、各温度領域を均一にすることができ、反応速度を短縮しつつ、均一に安定してＰＣＲ反応を実行できることがわかる。
以上説明したように、本実施形態によれば、反応チップ内の各温度領域で所定の温度に均一にすることができるため、ＰＣＲ法により核酸を安定的に増幅させることができる。また、均一な領域が実質的に増えるために反応チップ自身の大きさを小さくすることができる。
また、反応チップはＰＤＭＳなどの樹脂材料で製作できるため、使い捨てのチップとして利用することができる。反応チップは複数の温度領域を設定する必要があるため、反応流路の形状の自由度が高いが、反応チップ自身をＰＤＭＳなどの樹脂材料で作成することができるため流路設計が容易になる。
反応流路を蛇行流路とすることにより、曲がり部の２次流れによる３次元流れにより反応を促進することができる。さらに、送液を単一方向ではなく、往復送液することにより、反応効率を向上させるとともに、流路長さを短くすることができる。さらに、反応流路を矩形流路ではなく、流路表面に突起をつけた流路構造とすることにより、反応量をさらに効率よく増大させることができる。これらにより、小型で反応効率の高いＰＣＲ反応装置とすることができる。
１…チップ取り入れ窓、２…反応ステージ、３…ポンプ、４…バルブ、５…ヒーター、６…移動ステージ、７…モータドライバ、８…制御基板、９…電源、１０…情報アクセスパネル、２１…チップ押え、５０…反応チップ、５１…ハンドリングポート、５２…ハンドリングポート、５３…ハンドリングポート、５４…ハンドリングポート、５５…ＤＮＡ抽出溜め、５６…５５〜６０℃領域（第１の温度領域）、５７…７２℃領域（第２の温度領域）、５８…９４℃領域（第３の温度領域）、５９…反応流路、５９Ａ〜５９Ｆ…蛇行反応流路、５９Ｇ…送液流路、６０…容器、６１…容器、６２…断熱空気層、６３…周囲温度領域、７０…チップ本体、７１…本体カバー、８０…高熱伝導率部材、１００…反応装置。
Claims (9)
- 複数の温度領域を設定し、これらの温度領域にまたがって形成した反応流路を有する樹脂製の反応チップと、
前記反応チップの反応流路に反応液を送液するポンプと、
前記反応液の送液を制御する制御装置と、
前記反応チップの各温度領域を設定温度に加熱するヒーターとを備える反応装置において、
前記反応チップの各温度領域を区分するようにその境界部分に凹溝を形成して断熱層を設けたことを特徴とする反応装置。 - 請求項１において、
前記反応チップの各温度領域における蛇行反応流路を前記反応チップの加熱面側に設け、前記断熱層を反ヒーター加熱面側に迂回する流路で前記各蛇行反応流路を連通して構成したことを特徴とする反応装置。 - 請求項２において、
前記反応チップの加熱面側に凹溝を形成して前記断熱層を構成したことを特徴とする反応装置。 - 請求項１において、
前記反応チップの熱伝導率より高い熱伝導率を有する高熱伝導率部材を前記反応チップの各温度領域を囲むように設けたことを特徴とする反応装置。 - 請求項４において、
前記高熱伝導率部材を装置側の反応ステージの上に設置したことを特徴とする反応装置。 - 請求項４において、
前記高熱伝導率部材を装置側の反応ステージと共用して構成したことを特徴とする反応装置。 - 請求項１において、
前記制御装置は、前記反応チップの各温度領域の反応流路における反応液を反応させる際にその反応液を往復送液するように制御することを特徴とする反応装置。 - 請求項１において、
前記反応チップの各温度領域における反応流路の流路側面に凹凸の形状を設けたことを特徴とする反応装置。 - ヒーターにより加熱される複数の温度領域を設定し、これらの温度領域にまたがって形成した反応流路を有する樹脂製の反応チップにおいて、前記反応チップの各温度領域を区分するように前記各温度領域の境界部分に延びる凹溝を形成して断熱層を設けたことを特徴とする反応チップ。
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