JP5023323B2 - アクアポリン5の発現亢進剤 - Google Patents
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Description
好ましくは、アクアポリン5の機能異常に起因する疾患は、口渇、ドライアイ、鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、又は肺水腫である。
細胞膜の水分輸送を促進する水チャネルの一種であるaquaporin 5 (AQP5) は、唾液腺、涙腺、汗腺および気管支腺を始めとした種々の腺組織に存在し、水の外分泌の効率化に関わっている。また、肺胞内腔の大部分を覆う肺胞I型上皮細胞にも発現しており肺胞内の水分のクリアランスにも関わっていると考えられている。従って、AQP5の発現量を増加させる薬物は、例えばシェーグレン症候群の患者に生じるドライアイ、口渇などの種々の乾燥症状を緩和し、気道の滋潤化により咳や痰を鎮め、また肺水腫の治療に有効と考えられるが、これまでにAQP5の発現促進物質は知られていない。
(1)実験材料
マウス肺胞上皮細胞株MLE-12細胞は米国細胞バンクAmerican Type Culture Collection (ATCC)より入手した。培養には、10% 牛胎仔血清 (FBS)および抗生物質(penicillin 100 unit/mL,streptomycin 100 μg/mL)を含む培地DMEMを用い、炭酸ガス培養器内に5% CO2、37℃下に静置培養した。なお,本実施例で用いたレチノイン酸はSigma社より購入したretinoic acid (Cat#: R2625)を用いた。ICR系雄性マウス(6週齢)は、日本チャールズリバー社より購入し、25℃下、自由飲水、自由摂食にて飼育した。
細胞をRIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% Deoxycholate, 1% proteinase inhibitor cocktail)により可溶化し、遠心 (14,000 xg, 4(C, 10 min) した上清を試料とした。各サンプルは12%アクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、PVDF膜に転写、5% スキムミルクを含むPBSで室温、1時間ブロッキングを行った。その後、0.1% Tweenを含むPBS (0.1% tween-PBS)で洗浄し、一次抗体(抗AQP5抗体,Alomon社;4℃,8時間)および二次抗体(抗ウサギ抗体;室温,1時間)を行い、ECL western blotting detection reagent (Amersham社) を用いて免疫複合体を化学発光させ、バイオイメージングアナライザー(LAS1000, Fuji Film社)により検出した。
細胞からのRNAの抽出には、Trizol試薬(Gibco BRL社)を用いた。抽出操作は、全て本試薬のマニュアルに準じ、得られたRNAの収量および純度は260 nmおよび280 nmのUV吸収により算出し、OD260/OD280比が1.8以上の高純度のものだけを用いた。抽出したRNA 1μgを鋳型とし、RNA PCR KIT Ver.2 (Takara社)を用いて、逆転写およびDNA増幅しAQP5および内部標準としてのGAPDHを検出した。本キットに含まれるoligo-dT プライマーを用いて、42℃、60分間反応させRNAをDNA化し、下記に示すプライマーを用いたDNA増幅反応によってAQP5および内部標準としてのGAPDHを増幅した。得られたDNA断片は、1.5%アガロースゲル電気泳動をethidium bromide 染色により可視化した。
AQP5 Reverse;5'-GGC TGG GTT CAT GGA ACA GCC-3' (配列番号2)
GAPDH Forward;5'-CGG GAA GCT TGT GAT CAA TGG-3' (配列番号3)
GAPDH Reverse;5'-GGC AGT GAT GGC ATG GAC TG-3' (配列番号4)
AQP5プロモータは、ラットのゲノムよりLA Taq polymerase (Takara社)を用いたPCRによりクローニングした-160/+69の229 bp断片を用いた。クローニングしたゲノムDNA断片をpGL2 basic ベクター(Promega社)のルシフェラーゼ配列の上流に挿入した。プロモーター上に存在するSp1結合部位の点変異体は、Quick change II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene社)を用いて作成した。
レチノイン酸処理したMLE-12細胞をPBSで洗浄し、遠心(1000 X g for 5 min, at 4°C)にて集め、100μlの緩衝液(10 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium orthovanadate, 30 mM β-glycerophosphate and 1%v/v protease inhibitor cocktail (Sigma))に懸濁した。これを凍結後氷上で10分間溶かし、6 μlの10% Nonidet P-40を加えてvoltex mixerを用いて30秒間激しく攪拌した。その後、遠心(15000 X g for 15 s, at 4°C)して、沈渣として得られた核に50μlの緩衝液(20 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 1.5 mM MgCl2, 0.42 M NaCl, 0.2 mM EDTA (pH 8.0), 25% glycerol, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium orthovanadate, 30 mMβ-glycerophosphate and 1%v/v protease inhibitor cocktail)を加え、再び30秒間激しく攪拌した。その後、遠心(15000 X g for 15 s, at 4°C)により上清を回収し、核抽出物とした。
(1)肺上皮細胞株MLE-12のAQP5 mRNA発現量に対するレチノイン酸の作用(図1)
MLE-12細胞の培養液に、レチノイン酸(10μM)を加え、その後、6、12、24および48時間培養しRNAを抽出、上記のRT-PCRによりAQP5 mRNAを検出した(図1のA)。レチノイン酸は時間依存的にAQP5のmRNAA量を増加させた。なお、各試料間のRNAが一定であることをGAPDH mRNAを同時に増幅、検出することにより確認した。
MLE-12細胞の培養液に、レチノイン酸(10μM)を加え、その後、6、12、24および48時間培養しcell lysate を調製、上記のWestern blot法によりAQP5タンパク質を検出した(図2のA)。レチノイン酸は時間依存的にAQP5のタンパク質量を増加させた。なお、抗体反応の陽性対照として、ラット唾液腺のホモジネートを同時に処理した(Lane P)。なお、各試料間のタンパク質量が一定であることをβ-actinの抗体を用いて確認した(panel 下段)。
AQP5プロモーター(-160/+69)および本プロモーターに含まれる三ヶ所のSp1/Sp3転写因子結合部位を点変異させたプロモーター(mut1, mut2およびmut3)を用いたルシフェラーゼレポータージーンアッセイを行った。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入したMLE-12細胞にレチノイン酸(10μM)を加え、48時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した(図3)。AQP5プロモーター上には、レチノイン酸受容体の特異的結合配列はないが、AQP5プロモーター活性を著明に亢進した(-160/+69の実験結果より)。従って、レチノイン酸は、AQP5の転写を亢進することが実証された。
レチノイン酸(10μM)で48時間処理したMLE−12細胞から、上記の方法により各抽出物を調製し、これを試料としてSp1およびSp3転写因子の量をWestern blot法により調べた(図4)。レチノイン酸は、これらの転写因子の発現量に著明な影響を与えなかった。
レチノイン酸(10μM)で48時間処理したMLE−12細胞から、上記の方法により各抽出物を調製し、これを試料としてSp1/Sp3の結合配列をもつoligo DNAプローブを用いたEMSAを行った(図5)。MLE-12細胞の核抽出物には、Sp1およびSP3と考えられる2本のバンド(Panel A, →で示した)が検出された。このうち、高分子側の主要なバンドはSp1抗体の処理によって消失し、本プロモーターに結合する主要な転写因子がSp1であると考えられた。細胞をレチノイン酸(10μM)で48時間処理すると、Sp1に相当するバンドが著明に増加した。(4)の実験結果と併せて考えると、レチノイン酸は、Sp1転写因子の量を変えることなく、DNA結合能を増加させたと考えられた.
レチノイン酸10 mg/kgを1日1回5日間投与したマウス肺のAQP5発現量を、上記の方法により、対照としてsesame oilを投与したマウスと比較検討した(図6)。対照群のAQP5発現量の平均値を100%として表すと、レチノイン酸を投与したマウス肺のAQP5発現量は約140%に増加した。この増加は、Student's T-testにより危険率0.0018をもって有意な変化と判定された。
SEQUENCE LISTING
<110> Kumamoto University
<120> An agent for increasing expression of aquaporinn-5
<130> A61423A
<160> 4
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 1
ggccacatca atccagccat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 2
ggctgggttc atggaacagc c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
cgggaagctt gtgatcaatg g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 4
ggcagtgatg gcatggactg 20
Claims (1)
- レチノイン酸又はその塩を有効成分として含む、アクアポリン5の発現亢進剤。
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Applications Claiming Priority (1)
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JP2006163070A JP5023323B2 (ja) | 2006-06-13 | 2006-06-13 | アクアポリン5の発現亢進剤 |
Publications (2)
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---|---|
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JP2006163070A Active JP5023323B2 (ja) | 2006-06-13 | 2006-06-13 | アクアポリン5の発現亢進剤 |
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2006
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