JP5021483B2 - ポリペプチドの選択方法 - Google Patents
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Description
本明細書において使用する場合、「ポリペプチドドメイン」という用語は、VHまたはVLドメイン等のポリペプチドドメインをコードする分子または分子構築物を示す。
エマルジョンに基づくin vitro選択において遺伝子型-表現型の相互連関性をもたらすDNA結合ドメインは幾つかの基準を満たす必要がある。
本明細書において使用する場合、「Tus DNA結合ドメイン」という用語は、Tus DNA結合タンパク質がTerオペレーターのようなDNA結合部位に結合するために必要なTus DNA結合タンパク質のドメインを意味する。Tus DNA結合タンパク質とDNA結合部位との結合は、エマルジョン破壊とそれに続くアフィニティー捕捉段階全体を通して、好ましくは少なくとも約1時間、維持されるであろう。
「DNA結合部位」という用語は、Tus DNA-結合ドメインが結合することができるDNA配列を意味する。
(a/n)gn(a/g)(t/n)gttgtaa(c/t)(t/g)a(a/n)(ここでn=a、t、cまたはg)
を含むヌクレオチド配列も作用するであろう。
本明細書において使用される場合、「タグ配列」という用語は、タンパク質の精製および/または単離を容易にするために付加される1以上の追加の配列を意味する。
好ましくは、リンカーはポリペプチドドメイン(1つまたは複数)とTus DNA結合ドメイン(1つまたは複数)を離隔する。
本発明のヌクレオチド配列には、任意の核酸(例えば、DNA、RNAまたはその天然もしくは人工の任意の類縁体)が含まれ得る。
本明細書において使用される場合、「発現」は、ヌクレオチド配列がその遺伝子産物に変換されることを意味するために、最も広い意味で使用される。
本明細書において使用される場合、「マイクロカプセル」という用語は区画(コンパートメント)を意味し、該区画を定める境界が、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド(例えば、抗体)ドメインの特異性により該ヌクレオチド配列の選別を可能にする、本明細書に記載の分子メカニズムの構成成分の交換を制限する。
本明細書中では、「単離」、「選別」、および「選択」という用語、ならびにそれらの変形を使用する。
したがって、本発明のさらなる態様では、次のステップ:(a)本発明のライブラリーから1以上のポリペチドドメインを選択すること;(b)遺伝子産物のレパートリーをコードするヌクレオチド配列のさらなるライブラリーを作製するために、選択したポリペプチドドメイン(1つまたは複数)を突然変異させること;および(c)特異性を増強したポリペプチドドメインを取得するために、ステップ(a)および(b)を反復繰り返すこと、を含むin vitro進化方法が提供される。
本発明によれば、コードするDNAと結合することができるポリペプチドドメインのみが選択され、それゆえ遺伝子産物とコード化遺伝子の間に表現型-遺伝子型の相互連関性を確立することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、ポリペプチドドメイン遺伝子産物に連結された該ポリペプチドドメインをコードする核酸を含むであろう。こうして、本発明の場合には、ヌクレオチド配列は、TerオペレーターのようなDNA結合部位とTus DNA結合ドメインとの結合を介してポリペプチドドメインに連結された該ポリペプチドドメインをコードする核酸を含むであろう。
本発明に従うと、転写/複製および/または翻訳、並びに選択の全工程を単一ステップで進行させる必要はないが、全ての反応は1つのマイクロカプセル内で起こることが理解されよう。選択手順は2以上のステップを含んでいてもよい。
本発明のさらなる態様によれば、前記方法は免疫吸着剤に結合したヌクレオチド配列を増幅させる更なるステップを含む。所望のポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列を濃縮する手段として選択的増幅を利用することができる。
「構築物」という用語は、「コンジュゲート」、「カセット」および「ハイブリッド」などの用語と同義であり、プロモーターに直接的または間接的に結合した核酸配列を含む。間接的な結合は例えば、プロモーターとヌクレオチド配列の間のイントロン配列のような好適なスペーサ基によりもたらされる。本発明に関連する「融合された」という用語にも同じことが当てはまり、直接または間接的な結合が含まれる。
本発明のヌクレオチド配列は、ベクター中に存在し得る。
本発明のヌクレオチド配列は複製可能な組換えベクターに挿入することができる。このベクターを用いて、適合性の宿主細胞内でおよび/または該細胞からヌクレオチド配列を複製させ発現させることができる。発現は、プロモーター/エンハンサーやその他の発現調節シグナルを含む制御配列を用いて制御しうる。原核型プロモーターおよび真核細胞内で機能するプロモーターを使用することができる。上記の2種類以上の異なるプロモーターからの配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用してもよい。
本発明のアミノ酸配列は、例えば抽出および精製を促進させるためにタグ配列を用いて、融合タンパク質として産生させることができる。
本明細書中で用いる「宿主細胞」とは、本発明のヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチドを発現させるために使用できる細胞のことである。
ある応用例では、ポリヌクレオチドを調節配列に連結させることができ、こうした調節配列は所定の宿主細胞によるヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。一例として、本発明は、そのような調節配列と機能的に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクター(すなわた、該ベクターは発現ベクターである)を包含する。
本発明は、本明細書に記載するヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の変異体、相同体、誘導体および/または断片の使用を包含する。
本発明は、特に断らない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の慣用技術を使用するものである。そのような技術は文献に記載されている。例えば、J. Sambrook, E.F. FritschおよびT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M.ら (1995および定期的増補; Current Protocols in Molecular Biology, 第9, 13および16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. CrabtreeおよびA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M.J. Gait(編集), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; ならびにD.M.J. LilleyおよびJ.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的参考書のそれぞれは参照により本明細書中に組み入れるものとする。
用いる構築物の構築および発現
pIE2
TusのN末端に融合させたドメイン抗体のin vitro発現用の遺伝子エレメントは、pIE2 in vitro発現ベクターに基づいている(図1)。リン酸化オリゴヌクレオチドAS5 (配列番号10)およびAS6 (配列番号11)のアニーリングから形成されたDNA二本鎖を、ゲル精製したNcoI/NotI切断pIE1ベクターに連結させることにより、pIE2を組み立てる。pIE1を組み立てるには、リン酸化オリゴヌクレオチドAS1 (配列番号12)およびAS2 (配列番号13)のアニーリングから形成されたDNA二本鎖を、ゲル精製したNcoI/BamHI切断pIVEX2.2b Nde (Roche) in vitro発現ベクターに連結させる。典型的には、反応に用いる両方のオリゴヌクレオチドは、T4 DNAリガーゼバッファー(NEB)中の5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)を用いて、50μl容量中2μMの濃度で同時にリン酸化する。反応混合物を95℃で5分インキュベーションしてポリヌクレオチドキナーゼを不活性化し、続いて40℃での30分の冷却ステップによりオリゴヌクレオチドのアニーリングを起こさせる。アニーリングしたリン酸化DNA二本鎖の0.1μlアリコートを、消化してリン酸化したベクター100 ngに添加し、50単位のT4 DNAリガーゼ(NEB)を用いて5μl容量中室温で1時間連結させる。その後、連結反応物の0.5μlアリコートを用いて、スーパーコンピテントXL-10大腸菌細胞(Stratagene)の5μlアリコートをメーカーの使用説明書に従って形質転換する。一晩培養物から調製したプラスミドDNAミニプレプ(Qiagen)のDNA配列解析により挿入断片の配列を確認する。
Tusは大腸菌TG1ゲノムDNAからプライマーAS102 (配列番号14)およびAS103 (配列番号15)を用いてSuperTaq DNAポリメラーゼによりPCR増幅した。この産物を精製して制限酵素BamH IおよびBgl II (NEB)で消化した。消化した産物をpIE2のBamH I部位に連結させてpIE2Tを得た。この構築物をDNA配列解析により確認した。
pIE2tTのNot I部位を切断し、AS120 (配列番号19)-AS121 (配列番号20)キナーゼ処理二本鎖を挿入することによりpIE7'tTを得た。続いて、pIE7'tTのNot I部位を切断して、AS120 (配列番号19)-AS121 (配列番号20)キナーゼ処理二本鎖の挿入を繰り返すことによりpIE7tTを得た(図3)。
抗βガラクトシダーゼVkクローンE5、TNFa結合VkクローンTAR1-5-19およびTAR1-5、ならびにサイトカインA結合VkクローンXはすべて、Tus構築物および3つのTerBオペレーターをすでに保有するSal I/Not I切断pIE7t3Tベクターにクローニングすることができる。一例として、TusのN末端へのVk(E5) (配列番号7)の融合構築物(pIE7t3Tシリーズ)を図4に示す。ここでは、3つのTerBオペレーター部位がBgl II部位に挿入されて、構築物pIE7t3T.Vk(E5)をもたらす。
Tusとの融合により影響されないドメイン抗体の機能性
所定の抗原と特異的に結合するドメイン抗体を単離するために、ドメイン抗体は溶液中で単量体として機能するときと同様にTusと融合させたときにも機能することが好ましい。
TusのDNA結合機能性はドメイン抗体とのN末端融合により実質的に影響されない
好ましくは、ドメイン抗体はTusとの融合によって実質的な影響を受けてはならず、また、TusのDNA結合特性が実質的に保持されるべきである。実施例2ですでに記載したように、ドメイン抗体の結合親和性を評価する場合には、Tusの結合を測定することができる。
DNA結合機能性もV κ の抗原結合親和性も他方の成分の同時添加によって影響されない
これまでの実施例で、本発明者らは、ドメイン抗体がTusと融合させたときに溶液中での親和性と同様の親和性でその抗原を認識することを実証した。同様に、Tusは文献記載の半減期値に近似した半減期でそのTerBオペレーターDNAと結合する。このことは、融合させた場合にもその機能性が失われないことを示している。しかしながら、これらの実験からは、両イベント(ドメイン抗体が抗原と結合すること、およびTusがDNAと結合すること)が互いに影響を及ぼすことなく同時に機能しうるのか不明である。したがって、本発明者らはTusおよびdAbとの同時結合を検証することにした。
反応物を個別の反応バイアル中に区画化して選択を行う場合には、安定した遺伝子型-表現型の相互連関性が保持される
これまでの実施例で、本発明者らは、in vitro翻訳された融合タンパク質として発現させたときのドメイン抗体とTus DNA結合タンパク質の機能性を実証した。しかし、これらの融合タンパク質を用いて選択を行うためには、遺伝子型-表現型の相互連関性、つまりdAb-Tus融合タンパク質のその対応するDNAへの結合が選択に際して溶液中で保持されることがきわめて重要である。そのために、既知であるが異なる親和性の2つのdAb間、例えばVk(TAR1-5-19) (配列番号5) (Kd 50 nM)とVk(TAR1-5) (配列番号6) (>5μM)の間でモデル選択を行うことができる。TerBオペレーターとT7プロモーターの間のBglII部位に小さな非相互作用性DNAスタッファー断片(z3、150 bp)を挿入することにより、各dAbのDNAに特定の長さをもたせることができ、こうしてこの領域のPCR産物のサイズによりdAbを迅速に同定することが可能となる。次の構築物を使用した: 7t3T.Vk(TAR1-5)および7t3z3T.Vk(TAR1-5-19)。各構築物をプライマーAS11 (配列番号21)およびAS17 (配列番号23)によりPCR増幅させてin vitro転写/翻訳に必要なPCR断片を得た。個別の反応バイアル中で各PCR断片を翻訳させた。典型的な反応混合物は実施例2に記載したものと類似していたが、DNA濃度をより低くして、反応50μlあたりたった150 ngとし、また、ビオチン化TNFaをIVTの間に20 nMで存在させる。この反応混合物を室温で1時間インキュベートする。両方の抽出物をPBS/T-20/bio-TNFa (20nM)で1:16に希釈し、その後例えば1:100および1:1 (TAR1-5-19:TAR1-5) の比で混合する。この反応混合物50μlをストレプトアビジンコーティングPCRチューブ(Abgene)(PBS+2% Tween-20で1時間ブロッキングしておく)に移す。これらのウェル内でインキュベーションを45分間行い、その後ウェルを洗浄し(PBS+T-20)、オリゴヌクレオチド対AS12 (配列番号22)およびAS87n (配列番号28)を用いたPCRを行って、TAR1-5-19とTAR1-5のDNA鋳型を区別するスタッファー断片を増幅させる。このPCRはplatinum pfx DNAポリメラーゼを用いて30サイクル(95℃で30秒の融解、60℃で45秒のアニーリング、68℃で1分の伸長)行う。
乳化を用いるモデル選択
これまでの実施例で、本発明者らは、構築物を個別のバイアル内でin vitro翻訳させてから翻訳産物を混合する場合には、遺伝子型-表現型の相互連関性が保持される、ことを示した。しかし、選択を複数の鋳型を用いて行おうとする場合には、各鋳型についてのin vitro翻訳を個別のバイアル内で行うことによって区画化することはもはや実行可能でない。この問題に対する解決策は、油を水中で乳化することにより作られたマイクロカプセル内でin vitro翻訳反応を行うことであろう。各マイクロカプセルは典型的には、in vitro転写/翻訳を行うのに必要な全ての成分に加えて、単一のDNA鋳型を含むべきである。翻訳後、産生されたdAb-Tus融合タンパク質は同じマイクロカプセル内に存在するDNA鋳型と結合するだろう。このタンパク質-DNA相互作用は、その後のエマルジョンの破壊および融合タンパク質のドメイン抗体部分の結合特性についての選択に耐えるよう十分に安定でなければならない。
ドメイン抗体のライブラリーからのサイトカイン結合性ドメイン抗体の親和性成熟
本発明のある適用例はドメイン抗体の親和性成熟である。多くの場合、抗体は抗原に対して所定の親和性を有する。しかしながら、この親和性は、例えば治療上有用であるためには、その抗体にとって不十分である。したがって、抗体の親和性をさらに高めることが望まれる。ほとんどのアプローチでは、親抗体の変異体を数多く作製して、より良好な結合体を選択する必要がある。Tus DNA結合ドメインと組み合わせたマイクロカプセル内でのin vitro転写/翻訳による遺伝子型-表現型の相互連関性を用いると、より優れた結合特性について108の抗体変異体の多様性を評価することが可能であると考えられる。
1) IVT反応混合物にサイトカインYを50 nM濃度で添加した。これは、in vitro転写/翻訳の間、抗原がエマルジョン中に含まれてマイクロカプセル内にすでに存在していたことを意味する。
ドメイン抗体のライブラリーからのサイトカインX結合性ドメイン抗体の親和性成熟
本発明者らの技術をドメイン抗体の親和性成熟に使用することが1つの標的に限られないことを証明するために、異なるドメイン抗体(Vk (Y))と異なるサイトカイン(サイトカインX)を用いて親和性成熟のための第2の選択を行った。この実験の実施は実施例7と非常に類似している。その実施例で説明したとおり、Genemorph II (Stratagene)を用いて作製した>108個の変異体(Vk (Y)に基づく)のエラープローンPCRライブラリーをpIE7t3Tベクターに連結させ、プライマーAS12 (配列番号22)およびAS18 (配列番号24)によるPCR増幅を行って第1ラウンドの選択のためのインプット物質を得た。このライブラリーのエラー率を、実施例7に記載したようにして得られた個々のクローンのDNA配列決定により調べたところ、ドメイン抗体遺伝子あたり平均2.1ヌクレオチドであることが見出された。
1つのTerBオペレーターを含むTUSベクターを用いた、サイトカインY結合性ドメイン抗体の親和性成熟
これまでに記載した親和性成熟に関する実施例では、用いたベクターが常にpIE7t3Tであり、このベクターは3つのTerBオペレーターを含んでいた。3つのオペレーターはより強固な遺伝子型-表現型の相互連関をもたらすが、1つのDNAオペレーターのみを含む全くの一価系を用いて選択を行うことが有利であるかもしれない。これは、3つのオペレーターの使用と関連している可能性がある、どのような結合活性成分をも回避すると考えられる。したがって、本発明者らは、単一TerBオペレーター系を用いて、サイトカインYに対するドメイン抗体についての親和性成熟選択を行った。
Anderson, C.W., Straus, J.W. and Dudock, B. S. (1983) Methods Enzymol, 101, 635-44.
Anderson, J.E. (1993) Curr. Op. Struct. Biol., 3, 24-30.
Ash, M. and Ash, I. (1993) Handbook of industrial surfactants. Gower, Aldershot.
Barany, F. (1991) PCR Methods Applic., 1, 5-16.
Bass, S., Greene, R. and Wells, J.A. (1990) Proteins, 8, 309-14.
Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York.
Benita, S., Ed. (1996). Microencapsulation: methods and industrial applications. Drugs and pharmaceutical sciences. Swarbrick編集, J. New York: Marcel Dekker.
Benner, S.A. (1994) Trends Biotechnol, 12, 158-63.
Blattner, F.R. and Dahlberg, J.E. (1972) Nature New Biol, 237, 227-32.
Bru, R. & Walde, P. (1991). Product inhibition of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. Eur J Biochem 199(1), 95-103.
Bru, R. & Walde, P. (1993). Catalytic activity of elastase in reverse micelles. Biochem Mol Biol Int 31(4), 685-92.
Cahill, P., Foster, K. and Mahan, D. E. (1991) Clin Chem, 37, 1482-5.
Chakrabarti, A. C., Breaker, R. R., Joyce, G. F. & Deamer, D. W. (1994). Production of RNA by a polymerase protein encapsulated within phospholipid vesicles. J Mol Evol 39(6), 555-9.
Chang, T. M. (1987). Recycling of NAD(P) by multienzyme systems immobilized by microencapsulation in artificial cells. Methods Enzymol 136(67), 67-82.
Chang, T. M. S. (1992). Recent advances in artificial cells based on microencapsulation. In Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy (Donbrow, M., ed.), pp. 323-339. CRC Press, Boca Raton, Florida.
Chapman, K.B. and Szostak, J.W. (1994) Curr. op. Struct. Biol., 4, 618-622.
Choo Y, Klug A. (1993) 21(15):3341-6.
Chetverin, A.B. and Spirin, A.S. (1995) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 51, 225-70.
Clackson, T. and Wells, J.A. (1994) Trends Biotechnol, 12, 173-84.
Creagh, A. L., Prausnitz, J. M. & Blanch, H. W. (1993). Structural and catalytic properties of enzymes in reverse micelles. Enzyme Microb Technol 15(5), 383-92.
Cull, M.G., Miller, J.F. and Schatz, P.J. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 1865-9.
Dickinson, E. (1994) In Wedlock, D.J. (ed.), Emulsions and droplet size control. Butterworth-Heine-mann, Oxford, Vol. pp. 191-257.
Ellington, A.D. and Szostak, J.W. (1990) Nature, 346, 81822.
Ellman, J., Mendel, D., Anthony, C.S., Noren, C.J. and Schultz, P.G. (1991) Methods Enzymol, 202, 301-36.
Fahy, E., Kwoh, D.Y. and Gingeras, T.R. (1991) PCR Methods Appl, 1, 25-33.
Finch, C. A. (1993). Encapsulation and controlled release. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. 138, 35.
Freese, E. (1959) J. Mol. Biol., 1, 87.
Friedberg, E.C., Walker, G.C. and Siede, W. (1995) DNA repair and mutagenesis. ASM Press, Washington D.C.
Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, 0. and Yarus, M. (1995) Annu Rev Biochem, 64, 763-97.
Green, R. and Szostak, J.W. (1992) Science, 258, 1910-5.
Gregoriadis, G. (1976) Methods Enzymol, 44, 21 8-27.
Griffiths, A.D., Williams, S.C., Hartley, O., Tomlinson, I. M. , Waterhouse, P., Crosby, W. L., Kontermann, R. E. , Jones, P.T., Low, N.M., Allison, T.J. and et a.l. (1994) Embo J, 13, 3245-60.
Haber, J., Maslakiewicz, P., Rodakiewicz, N. J. & Walde, P. (1993). Activity and spectroscopic properties of bovine liver catalase in sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate/isooctane reverse micelles. Eur J Biochem 217(2), 567-73.
Hoogenboom, H.R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62-70.
Hopp TP, Pricket KS, Price VL, Libby RT, March CJ, Ceretti DP, Urdal DL, Conlon PJ (1988) Bio/Technology 6:1204-1210.
Janda, K.D., Lo, L.-C., Lo, C.-H.L., Sim, M., -M., Wang, R., Wong, C.-H. and Lerner, R.A. (1997) Science, 275, 945-948.
Joyce, G.F. (1994) Curr. op. Structural Biol., 4, 331-336.
Karmirantzou M, Hamodrakas SJ. (2001) Protein Eng. Jul;14(7):465-72.
Katanaev, V.L., Kurnasov, O.V. and Spirin, A.S. (1995) Febs Lett, 359, 89-92.
Kowalczykowski, S.C., Dixon, D.A., Eggleston, A.K., Lauder,S.D. and Rehrauer, W.M. (1994) Microbiol Rev, 58, 401-65.
Kumar, A., Kumar, A. & Katiyar, S. S. (1989). Activity and kinetic characteristics of glutathione reductase in vitro in reverse micellar waterpool. Biochim Biophys Acta 996(1-2), 1-6.
Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J. and Hood, L. (1988) Science, 241, 1077-80.
Lesley, S.A. (1995) Methods Mol Biol, 37, 265-78.
Lesley, S.A., Brow, M.A. and Burgess, R.R. (1991) J Biol Chem, 266, 2632-8.
Leung, D.W., Chen, E. and Goeddel, D.V. (1989) Technique, 1, 11-15.
Liao, H., McKenzie, T. and Hageman, R. (1986) Proc Natl Acad Sci U S A, 83, 576-80.
Lim, F. & Sun, A. M. (1980). Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science 210(4472), 908-10.
Lim, F., Ed. (1984). Biomedical applications of microencapsulation. Boca Raton, Florida: CRC Press.
Lissant, K.J., ed Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1974.
Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1974.
Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1984.
Low, N.M., Holliger, P.H. and Winter, G. (1996) J Mol Biol, 260, 359-68.
Lowman, H.B., Bass, S.H., Simpson, N. and Wells, J.A. (1991) Biochemistry, 30, 10832-8.
Luisi, P. L. & B., S.-H. (1987). Activity and conformation of enzymes in reverse micellar solutions. Methods Enzymol 136(188), 188-216.
Manley, J.L., Fire, A., Samuels, M. and Sharp, P.A. (1983) Methods Enzymol, 101, 568-82.
Mao, Q. & Walde, P. (1991). Substrate effects on the enzymatic activity of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. Biochem Biophys Res Commun 178(3), 1105-12.
Mao, Q., Walde, P. & Luisi, P. L. (1992). Kinetic behaviour of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. A stopped-flow study. Eur J Biochem 208(1), 165-70.
Mattheakis, L.C., Bhatt, R.R. and Dower, W.J. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 9022-6.
McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. and Chiswell, D.J. (1990) Nature, 348, 552-4.
Melton, D.A., Krieg, P.A., Rebagliati, M.R., Maniatis, T., Zinn, K. and Green, M.R. (1984) Nucleic Acids Res, 12, 703556.
Mendel, D., Cornish, V.W. and Schultz, P.G. (1995) Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 435-62.
Menger, F. M. & Yamada, K. (1979). J. Am. Chem. Soc. 101, 6731-6734.
Miele, E.A., Mills, D.R. and Kramer, F.R. (1983) J Mol Biol, 171, 281-95.
(1984) EMBO J. 1985 Jun;4(6):1609-14.
Moore, M.J. (1995) Nature, 374, 766-7.
Moore M, Choo Y, Klug A. (2001) 98(4), 1432-6.
New, R. R. C., Ed. (1990). Liposomes: a practical approach. The practical appraoch series. Edited by Rickwood, D. & Hames, B. D. Oxford: Oxford University Press.
Nissim, A., Hoogenboom, H.R. I Tomlinson, I.M., Flynn, G. , Midgley, C., Lane, D. and Winter, G. (1994) Embo J, 13, 692-8.
Oberholzer, T., Albrizio, M. & Luisi, P. L. (1995a). Polymerase chain reaction in liposomes. Chemistry and Biology 2, 677-682.
Oberholzer, T., Wick, R., Luisi, P. L. & Biebricher, C. K. (1995b). Enzymatic RNA replication in self-reproducing vesicles: an approach to a minimal cell. Biochem Biophys Res Commun 207(1), 250-7.
Parmley, S.F. and Smith, G.P. (1988) Gene, 73, 305-18.
Pelham, H.R. and Jackson, R.J. (1976) Eur J Biochem, 67, 247-56.
Perelson, A.S. and Oster, G.F. (1979) J Theor Biol, 81, 64570.
Perez, G. M., Sanchez, F. A. & Garcia, C. F. (1992). Application of active-phase plot to the kinetic analysis of lipoxygenase in reverse micelles. Biochem J.
Raumann, B. E., Rould, M. A., Pabo, C. O. And Sauer, R. T. (1994) Nature 367, 6465, 754-7.
Roberts, B.E., Gorecki, M., Mulligan, R.C., Danna, K.J., Rozenblatt, S. and Rich, A. (1975) Proc Natl Acad Sci U S A, 72, 1922-6.
Roberts, J.W. (1969) Nature, 224, 1168-74.
Roberts, R. & Szostak, J. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12297-12302.
Rosenberg, M., Weissman, S. and Decrombrugghe, B. (1975) J Biol Chem, 250, 4755-64.
Ryabova, L. A., Desplancq, D., Spirin, A. S. And Pluckthun (1997) Nat Biotechnol 15(1): 79-84.
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. and Erlich, H.A. (1988) Science, 239, 487-91.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, London.
Smith, G.P. (1985) Science, 228, 1315-7.
Soumillion, P., Jaspers, L., Bouchet, M., Marchand, B.J., Winter, G. and Fastrez, J. (1994) J Mol Biol, 237, 415-22.
(Speight, R. E., Hart, D. J., Sutherland, J. D. and Blackburn, J. M. (2001) Chem & Biol 8, 951-956.
Stemmer, W.P. (1994a) Nature, 370, 389-91.
Stemmer, W.P. (1994b) Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 10747-51.
Stofko, H.R., Carr, D.W. and Scott, J.D. (1992) Febs Lett, 302, 274-8.
Sun, A. M., Vasek, I. & Tai, I. (1992). Microencapsulation of living cells and tissues. In Microencapsulation and nanoparticles in medicine and pharmacy (Donbrow, M., ed.), pp. 315-322. CRC Press, Boca Raton, Florida.
Tuerk, C. and Gold, L. (1990) Science, 249, 505-10.
van Hal, D. A., Bouwstra, J. A. & Junginger, H. E. (1996). Nonionic surfactant vesicles containing estradiol for topical application. In Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 329-347. Marcel Dekker, New York.
Walde, P., Goto, A., Monnard, P.-A., Wessicken, M. & Luisi, P. L. (1994). Oparin's reactions revisited: enzymatic synthesis of poly(adenylic acid) in micelles and self-reproducing vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, 7541-7547.
Walde, P., Han, D. & Luisi, P. L. (1993). Spectroscopic and kinetic studies of lipases solubilized in reverse micelles. Biochemistry 32(15), 4029-34.
Walde, P., Peng, Q., Fadnavis, N. W., Battistel, E. & Luisi, P. L. (1988). Structure and activity of trypsin in reverse micelles. Eur J Biochem 173(2), 401-9.
Walker, G.T., Fraiser, M.S., Schram, J.L., Little, M.C., Nadeau, J.G. and Malinowski, D.P. (1992) Nucleic Acids Res, 20, 1691-6.
Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J. and Roeder, R.G. (1979) Cell, 18, 469-84.
Whateley, T. L. (1996). Microcapsules: preparation by interfacial polymerisation and interfacial complexation and their applications. In Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 349-375. Marcel Dekker, New York.
Wick, R. & Luisi, P. L. (1996). Enzyme-containing liposomes can endogenously produce membrane-constituting lipids. Chem Biol 3(4), 277-85.
Widersten, M. and Mannervik,. B. (1995) J Mol Biol, 250, 115-22.
Winter, G., Griffiths, A.D., Hawkins, R.E. and Hoogenboom, H.R. (1994) Annu Rev Immunol, 12, 433-55.
Yamagishi, J., Kawashima, H., Matsuo, N., Ohue, M., Yamayoshi, M., Fukui, T., Kotani, H., Furuta, R., Nakano, K. and Yamada, M. (1990) Protein Eng, 3, 713-9.
Yelamos, J., Klix, N., Goyenechea, B., Lozano, F., Chui, Y.L., Gonzalez, F.A., Pannell, R., Neuberger, M.S. and Milstein, C. (1995) Nature, 376, 225-9.
Zubay, G. (1973) Annu Rev Genet, 7, 267-87.
Zubay, G. (1980) Methods Enzymol, 65, 856-77.
Claims (27)
- (i)Tus DNA結合ドメインが結合することができる、少なくとも1つのTerオペレーター、(ii)1つまたは複数のTus DNA結合ドメインをコードする配列であって、該Tus DNA結合ドメインが配列番号1に示した配列を含むか、または該配列からなる、上記配列、ならびに(iii)少なくとも1つのポリペプチドドメインをコードする配列、を含む核酸融合体であって、発現されると該核酸融合体は該少なくとも1つのポリペプチドドメインと該1つまたは複数のTus DNA結合ドメインからなる融合体を産生する、上記核酸融合体。
- 少なくとも1つのポリペプチドドメインが抗体ドメインである、請求項1に記載の核酸融合体。
- 前記抗体ドメインがVL、VHまたはラクダ科動物VHHドメインである、請求項2に記載の核酸融合体。
- 前記核酸融合体が、発現されるとタグ配列を産生する配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- 前記タグをコードする配列が前記核酸融合体の3’末端に含まれる、請求項4に記載の核酸融合体。
- 前記タグをコードする配列がHA、FLAGまたはc-Mycからなる群より選択されるタグ配列を産生する、請求項4または請求項5に記載の核酸融合体。
- 前記ポリペプチドドメインが発現されると、Tus DNA結合ドメインのN末端と直接的または間接的に融合される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- Tus DNA結合ドメインをコードする配列が配列番号2に示した配列を含むか、または該配列からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- 前記核酸融合体が1つまたは複数のリンカーをさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- 前記核酸融合体が1、2または3つのTerオペレーターを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- TerオペレーターがTerBを含むか、またはTerBからなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- TerBが配列番号3または配列番号4に示した配列を含むか、または該配列からなる、請求項11に記載の核酸融合体。
- 抗体VLドメインがVκである、請求項3〜12のいずれか1項に記載の核酸融合体。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体を含有する構築物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体を含有するベクター。
- 請求項14に記載の構築物または請求項15に記載のベクターを含有する宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体と結合された請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体によりコードされるタンパク質を含んでなるタンパク質-DNA複合体。
- 請求項17に記載のタンパク質-DNA複合体の製造方法であって、以下のステップ:
(a) 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体、請求項14に記載の構築物、または請求項15に記載のベクターを用意すること、
(b) 該核酸融合体を発現させてその対応するタンパク質を産生させること、
(c) タンパク質-DNA複合体を形成させること、
を含んでなる上記方法。 - 所望の結合特異性を有するポリペプチドドメインをコードする1つまたは複数の核酸を単離する方法であって、以下のステップ:
(a) 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体、請求項14に記載の構築物、または請求項15に記載のベクターを用意すること、
(b) 該核酸融合体をマイクロカプセル内に区画化すること、
(c) 該核酸融合体を発現させてその対応するポリペプチドドメインを産生させること、
(d) 該マイクロカプセルを共通の区画にプールすること、
(e) 所望の結合特異性を有するポリペプチドドメインを産生する核酸を選択すること、
を含んでなる上記方法。 - 追加のステップとして、
(f) 前記ポリペプチドドメインに1つまたは複数の突然変異を導入すること、
をさらに含む、請求項19に記載の方法。 - ステップ(a)〜(e)の1つ以上を反復して繰り返すことをさらに含む、請求項19または20に記載の方法。
- 前記ポリペプチドドメインを増幅させることをさらに含む、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドドメインがアフィニティー精製により選別される、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドドメインがプロテインLを用いて選別される、請求項23に記載の方法。
- 前記ポリペプチドドメインが、所望の結合特異性を有さないポリペプチドドメインの選択的除去により選別される、請求項19〜24のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドドメインの調製方法であって、以下のステップ:
(a) 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体、請求項14に記載の構築物、または請求項15に記載のベクターを用意すること、
(b) 該核酸を区画化すること、
(c) 該核酸を発現させてその対応する遺伝子産物を産生させること、
(d) 所望の結合特異性を有するポリペプチドドメインを産生する核酸を選別すること、
(e) 所望の結合特異性を有するポリペプチドドメインを発現させること、
を含んでなる上記方法。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸融合体を含む人工のマイクロカプセル。
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