JP5021273B2

JP5021273B2 - 老化度の判断方法

Info

Publication number: JP5021273B2
Application number: JP2006299746A
Authority: JP
Inventors: 恵子黒澤; 達哉榊原; 直記丸山; 昭人石神
Original assignee: Kikkoman Corp; Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology (TMGHIG)
Current assignee: Kikkoman Corp; Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology (TMGHIG)
Priority date: 2006-05-18
Filing date: 2006-11-06
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2026-11-06
Also published as: JP2007330252A

Description

本発明は、簡便な老化度の判断方法に関する。

老化と加齢の定義は異なる。加齢とは生まれてから死ぬまでの時間経過を示している。また、老化とは性成熟期以降に、加齢に伴って身体機能が低下することである。これはヒトでは２０〜３０歳以降である。即ち、動物個体は“加齢”の間に“老化”が進行する（例えば、非特許文献１参照）。加齢のひとつの指標として年齢が挙げられる。しかしながら、年齢がそのまま身体的老化状態を表すものとはいえず、個体差が大きいものであることから、年齢以外の身体的老化度を判断する指標が待ち望まれている。

細胞の老化に関連して、ｐＨ６．０に至適をもつベータガラクトシダーゼの存在が知られている（例えば、特許文献１〜２、非特許文献２〜３参照）。細胞がどの程度老化しているかを、ｐＨ６．０でベータガラクトシダーゼ基質を用いて組織染色することにより判断する測定キットが販売されている。しかしながら、これらの情報は個々の細胞の老化を観察するものであり、細胞が老化していることを観察することはできても、個体そのものの老化程度を判断できるものではない。また、培養細胞抽出液中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨを変動させて測定し、長く培養を続けた細胞の抽出液中ではｐＨ６．０での活性が増加することが示されている（例えば、非特許文献４参照）。しかし、これは細胞レベルの結果であり、個体や組織の老化と直接関連するものではない。更に、人の表皮を採取し、上記方法と同様にして組織染色を行い、老化と関連付ける方法も開示されている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、皮膚の採取が必要であり、かつ顕微鏡観察が必要であるなど、非常に面倒なものであり、実用的なものではない。

米国特許第５４９１０６９号明細書米国特許第５７９５７２８号明細書特表昭６３−５０１５７号公報細胞工学、秀潤社、２００２、第２１巻、第７号、ｐ.７０４−７０８プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、（米国）、ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（The National Academy of Sciences）、１９９５、第９２巻、ｐ.９３６３−９３６７ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Journalof Cell Science）、（英国）、ザ・カンパニー・オブ・バイオロジスツ・リミテッド（The Company of Biologists Limited）、２０００、第１１３巻、ｐ.３６１３−３６２２アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、（米国）、エルシェビア（Elsevier）、２００５、第３４３巻、ｐ.３２９−３３４

本発明が解決しようとする課題は、簡便で実用的な個体の老化度の判断方法を提供することにある。

そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、血液中や尿中など、生体関連試料中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ５．５〜６．５、あるいは、ｐＨ３．５〜５．０およびｐＨ５．５〜６．５で測定し、得られた測定値をモデル曲線に当てはめることにより、極めて簡単に個体の老化度の判断をすることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）生体関連試料中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ５．５〜６．５で測定し、得られた測定値をモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
（２）生体関連試料中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ３．５〜５．０およびｐＨ５．５〜６．５で測定し、得られた測定値をモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
（３）生体関連試料中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ６．０で測定し、得られた測定値をモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
（４）生体関連試料中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ４．０およびｐＨ６．０で測定し、得られた測定値をモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
（５）生体関連試料が血液である上記（１）〜（４）記載の個体の老化度を判断する方法。
（６）生体関連試料が尿である上記（１）〜（４）記載の個体の老化度を判断する方法。

本発明によれば、簡便で実用的な個体の老化度の判断方法が提供された。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体関連試料中のベータガラクトシダーゼ活性を、ｐＨ５．５〜６．５、あるいは、ｐＨ３．５〜５．０およびｐＨ５．５〜６．５で測定し、得られた測定値をモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度、即ち身体的な加齢程度を判断する。

本発明で用いる生体関連試料としては、容易に採取可能であり、ベータガラクトシダーゼ活性が測定できるものであれば、何でもよく、例えば、血液、尿、唾液、涙、汗などが挙げられる。その中でも血液や尿は、採取が容易であることや、健康診断などで様々な測定に用いられており、他の項目と同時に測定可能であることから、新たに採取する必要がないという点で好ましい。

本発明におけるベータガラクトシダーゼ活性の測定は、ｐＨ５．５〜６．５、あるいは、ｐＨ３．５〜５．０およびｐＨ５．５〜６．５で測定でき、生体関連試料中の微量ベータガラクトシダーゼ活性を測定できるものであれば、どれでも使用できる。例えば、活性測定用の基質として、Ｘ−ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranoside）やＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside）など発色系ベータガラクトシダーゼ基質や、ルシフェリンガラクトシド(6-O-beta-galactopyranosyl-luciferin)のような生物発光基質にガラクトシル基が付いたもの、化学発光基質にガラクトシル基がついたものを基質として用いることができる。このうち、ルシフェリンガラクトシドは、ベータガラクトシダーゼによりルシフェリンに変換されるので、ルシフェラーゼにより発光させ、ルミノメータ（キッコーマン社製）などにより測定することができる。反応機構を次に示す。

ルシフェリンガラクトシド → ルシフェリン + ガラクトース
ルシフェリン + ATP + O₂ → オキシルシフェリン +AMP +PPi +CO₂ +光

また、化学発光基質としては、一例としてガラクトンスター (クローンテック社製、3-chrolo-5-(4-methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2'-(4'-chrolo)-tricyclo-(3.2.1.1^3,7)decan)-4-yl)phenyl beta-D-galactopyranoside)が挙げられる。ガラクトンスターはベータガラクトシダーゼによりガラクトシドが開環されると、自己崩壊しながら発光するので、ルミノメータなどにより測定することができる。

本発明においては、ベータガラクトシダーゼ活性を、ｐＨ５．５〜６．５、あるいは、ｐＨ３．５〜５．０およびｐＨ５．５〜６．５で測定できるが、特にｐＨ６．０、あるいは、ｐＨ４．０およびｐＨ６．０で測定することが好ましい。ベータガラクトシダーゼは、リソソーム中に局在しているとされており、その至適ｐＨは４．０付近である。しかしながら、老化に伴って、このベータガラクトシダーゼが変化し、至適ｐＨが中性域にシフトし、ｐＨ６．０付近が至適となったベータガラクトシダーゼが産生されるようになると言われている。血清中や尿中のベータガラクトシダーゼ活性については知られていなかったが、リソソームから漏れ出したものであると考えられる。従来の比色法によるベータガラクトシダーゼ活性測定法では感度不足であり、測定できなかったが、高感度測定法が開発されたことにより、測定可能になったものであるといえる。

ｐＨ６．０付近（例えば、ｐＨ５．５〜６．５）で測定することで、老化に伴って至適ｐＨが変化したベータガラクトシダーゼ量を推定することが出来る。また、ｐＨ４．０付近（例えば、ｐＨ３．５〜５．０）で測定することで、本来の正常なベータガラクトシダーゼ量を推定することができる。ｐＨ６．０付近での測定結果を用いて老化度を判断することもできるが、ｐＨ４．０付近での測定結果を用いてｐＨ６．０付近での測定結果を補正することもできる。例えば、ｐＨ６．０付近での測定結果をｐＨ４．０付近での測定結果で割ることにより、生体サンプル中において、どれくらいの割合のベータガラクトシダーゼが至適ｐＨを変化させているかを推定することができる。サンプルによっては、このような補正が非常に有効であるため、モデル曲線を作成する際には両方の曲線を作成した上で、より判断に適したモデル曲線を採用する必要がある。

次に、上記の方法で得られたベータガラクトシダーゼ活性の測定値を、モデル曲線に当てはめ個体の老化度、即ち身体的な加齢程度を判断する。
まず、正常な個体から採取した血清や尿についてベータガラクトシダーゼ活性を測定する。時間軸を横軸に、活性を縦軸にしたグラフにスポットしていく。時間軸はその個体の寿命によりスケールが異なってくるが、同一種の生物で一つのグラフを作成することができる。例えば、マウスであれば、時間軸の最大はおおよそ３０ヶ月前後、ヒトであれば、最大１１０年前後となると思われる。得られたグラフより、近似曲線を描き、モデル曲線とすることができる。できるだけ多くの個体から測定した結果を用いることで、精度の良いモデル曲線が作成できる。

モデル曲線は血液サンプルの場合、尿サンプルの場合でそれぞれ作成する必要がある。また、ｐＨ６．０付近（例えば、ｐＨ５．５〜６．５）で測定した結果から老化度を判断するためには、ｐＨ６．０付近の結果で作成したモデル曲線を用いる必要がある。同じく、ｐＨ６．０付近（例えば、ｐＨ５．５〜６．５）とｐＨ４．０（例えば、ｐＨ３．５〜５．０）付近の結果の比で判断するためには、ｐＨ６．０付近とｐＨ４．０付近の結果の比で作成したモデル曲線を用いる必要がある。また、ｐＨ４．０付近の結果でなく、一般的によく補正に用いるクレアチニン量などで補正した結果を用いて老化度を判断する場合には、同様に測定して得られた結果を用いて作成したモデル曲線を用いる必要がある。

次に、判断したい個体のサンプルを採取し、用いるモデル曲線を作成するのに用いた方法でベータガラクトシダーゼ活性を測定する。得られた活性値を先に作成したモデル曲線にあてはめ、相当する時間軸の値を読み取る。読み取った時間軸の値をその個体の老化度と判断することができる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

＜ルシフェリンガラクトシドを用いたｐＨ６．０でのベータガラクトシダーゼ測定方法＞
キッコーマン社製ルシフェールＣＴを用いて、ｐＨ６．０でベータガラクトシダーゼ活性を測定する方法を構築した。ＭＥＳでｐＨ６．０に調整した後、サンプルを添加し、反応させる。ｐＨ６．０では反応により生成されるルシフェリンを発光により測定する酵素ルシフェラーゼが反応しないため、ＢｉｃｉｎでｐＨを７．９に再調整した後に発光量を測定した。反応の一例を下に示した。
〔試薬の調整〕
ルシフェールＣＴ
ルシフェールＣＴは取扱説明書どおりに溶解液で溶解した。
０．６ＭＭＥＳ
１２．８ｇのＭＥＳを水に溶解し、１００ｍｌに定容した。
０．８ＭＢｉｃｉｎｅ
１３．１ｇのＢｉｃｉｎｅを水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨ９．１に調整したのち、１００ｍｌに定容した。
〔サンプル〕
大腸菌由来ベータガラクトシダーゼを生理食塩水で希釈し希釈系列を作製した。
〔測定〕
ルミチューブに２００μｌのルシフェールＣＴ、２０μｌのＭＥＳを混合しｐＨ６．０に調整した後、４０μｌのサンプルを添加した。２５℃で２０分インキュベートした後、２０μｌのＢｉｃｉｎｅを添加し、ｐＨを７．９に調整した。即座にルミテスターＫ２００（キッコーマン社製）で発光量を測定した（図１）。

＜ルシフェリンガラクトシドを用いたｐＨ４．０でのベータガラクトシダーゼ測定方法＞
コントロールとして、従来知られているｐＨ４．０でのベータガラクトシダーゼ活性を測定するためにｐＨ４．０となるよう試薬を調整した。
〔試薬の調整〕
ルシフェールＣＴ
ルシフェールＣＴは取扱説明書どおりに溶解液で溶解した。
１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）
１９．２ｇのクエン酸を水に溶解し、１Ｍ第二リン酸ナトリウムでｐＨ３．０に調整した後、１００ｍｌに定容した。
１Ｍトリスバッファー（ｐＨ９．５）
１２．１ｇのトリスを水に溶解し、塩酸でｐＨ９．５に調整したのち、１００ｍｌに定容した。
〔サンプル〕
生理食塩水
〔測定〕
ルミチューブに１００μｌのルシフェールＣＴ、１４μｌのクエン酸を混合することで反応液がｐＨ４．０に調整されることを確認した。２０μｌのサンプルを添加した。２５℃で２０分インキュベートした後、３０μｌのトリスを添加するとルシフェラーゼ反応に最適なｐＨを７．９に調整できることを確認した。最初に入れたルシフェールＣＴ由来のルシフェラーゼはｐＨ４．０にすることで失活するため、ｐＨをルシフェラーゼ至適のｐＨ７．９に戻しても、ルシフェラーゼ反応はおきない。ルシフェールＣＴを新たに２００μｌ添加し、即座にルミテスターＫ２００（キッコーマン社製）で発光量を測定することでｐＨ４．０でのベータガラクトシダーゼ活性が測定できるようになった。

＜ガラクトンスターを用いたｐＨ６．０でのベータガラクトシダーゼ活性測定方法＞
ベクトンディッキンソン社製化学発光キット（ルミネッシェントベータガル）を用いて、ｐＨ６．０でベータガラクトシダーゼ活性を測定する方法を構築した。ＭＥＳでｐＨ６．０に調整した後、サンプルを添加し、反応させた。
〔試薬の調整〕
反応バッファー混合液
反応基質は取り扱い説明書どおりに反応バッファー１９６μｌに４μｌの割合で混合した。
０．６ＭＭＥＳ
１２．８ｇのＭＥＳを水に溶解し、１００ｍｌに定容した。
〔サンプル〕
大腸菌由来ベータガラクトシダーゼ（１０００ユニット/ｍｌ）を生理食塩水で希釈系列を作製した。
〔測定〕
白色９６穴プレートに反応バッファー混合液２００μｌ、３０μｌのＭＥＳをいれ、１０μｌのサンプルを添加した。６０分室温でインキュベート後、ルミノメータＬＢ−９５０１（ベルトールド社製）で測定した結果、図２のようになった。

＜マウス血清中のベータガラクトシダーゼ活性＞
マウス血清を生理食塩水で１００倍に希釈し、実施例１記載の方法（ルシフェリンガラクトシドを用いる方法）を用いてｐＨ６．０で測定した。月齢が上がるに伴って発光量が上昇していることがわかった（図３）。この曲線を用いて、老化度未知個体の血清のベータガラクトシダーゼ活性を測定することによりその個体の身体的老化度を推定することが可能である。ヒト以外の生物、マウス、ハエ、センチュウなどにおいても、生存曲線はその動物種の最長寿命スケールをそろえることによりほぼ同一の曲線を描くことが知られている（非特許文献１）。マウスの２４ヶ月齢はヒトに当てはめると６５歳前後となる。

＜マウス血清中のベータガラクトシダーゼ活性＞
マウス血清を生理食塩水で１０倍に希釈し、実施例３記載の方法（ガラクトンスターを用いる方法）を用いて測定した。月齢があがるのに伴って発光量が上昇していることがわかった（図４）。

＜マウス尿中のベータガラクトシダーゼ活性＞
マウス尿中のベータガラクトシダーゼ活性をルシフェールＣＴを用いてｐＨ６．０、ｐＨ４．０で測定した。マウス尿は生理食塩水で１００倍に希釈したのち測定した。ｐＨ４．０での活性をコントロールとして、ｐＨ６．０での発光量の割合をグラフに示した（図５）。月齢が上がるにつれて、ｐＨ６．０／ｐＨ４．０の値が上昇していることがわかった。

＜ヒト血清中のベータガラクトシダーゼ活性＞
ヒト血清中のベータガラクトシダーゼ活性をルシフェ−ルＣＴを用いてｐＨ６．０、ｐＨ４．０で測定した。ヒト血清は生理食塩水で１００倍に希釈したのち測定した。ｐＨ４．０での活性をコントロールとして、ｐＨ６．０での発光量の割合をグラフに示した（図６）。年齢が上がるにつれて、ｐＨ６．０／ｐＨ４．０の値が上昇していることがわかった。

＜各ｐＨでの血清中ベータガラクトシダーゼ活性＞
マウス血清中のベータガラクトシダーゼ活性をルシフェールＣＴを用いて各ｐＨで測定した。測定方法について以下に説明する。ｐＨ３．０からｐＨ５．０については実施例２記載のｐＨ４．０での方法に準拠し、クエン酸添加量により各ｐＨとなるようあらかじめ調整し、反応後、ｐＨ７．９付近となるようトリスバッファー添加量を決定した。ｐＨ５．０からｐＨ７．０については実施例１記載のｐＨ６．０での方法に準拠し、ＭＥＳ添加量により各ｐＨとなるようあらかじめ調整し、反応後、ｐＨ７．９付近となるようＢｉｃｉｎ添加量を決定した。マウス血清を１００倍に生理食塩水で希釈し、測定を行った結果を図７（３月齢）および図８（３０月齢）に示した。この方法で測定すると、ｐＨ４．５およびｐＨ５．５に二つの活性ピークがあることがわかった。これより、ｐＨ４．０付近のベータガラクトシダーゼ活性としては、ｐＨ３．５からｐＨ５．０で測定することができ、ｐＨ６．０付近のベータガラクトシダーゼ活性としてはｐＨ５．５からｐＨ６．５で測定することができることがわかった。

ルシフェリンガラクトシドを用いた測定結果ガラクトンスターを用いた測定結果血清のｐＨ６．０でのベータガラクトシダーゼ活性（ルシフェリンガラクトシド）血清のｐＨ６．０でのベータガラクトシダーゼ活性（ガラクトンスター）尿中ベータガラクトシダーゼ活性割合ヒト血清中ベータガラクトシダーゼ活性割合各ｐＨでの血清中ベータガラクトシダーゼ活性（３月齢）各ｐＨでの血清中ベータガラクトシダーゼ活性（３０月齢）

Claims

血液中または尿中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ５．５〜６．５で測定し、得られた測定値を、時間軸を横軸に、ベータガラクトシダーゼ活性を縦軸にしたグラフにおいて、ベータガラクトシダーゼ活性をプロットして作成したモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
血液中または尿中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ３．５〜５．０およびｐＨ５．５〜６．５で測定し、得られた測定値を、時間軸を横軸に、ベータガラクトシダーゼ活性比率を縦軸にしたグラフにおいて、ベータガラクトシダーゼ活性比率をプロットして作成したモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
血液中または尿中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ６．０で測定し、得られた測定値を、時間軸を横軸に、ベータガラクトシダーゼ活性を縦軸にしたグラフにおいて、ベータガラクトシダーゼ活性をプロットして作成したモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。
血液中または尿中のベータガラクトシダーゼ活性をｐＨ４．０およびｐＨ６．０で測定し、得られた測定値を、時間軸を横軸に、ベータガラクトシダーゼ活性比率を縦軸にしたグラフにおいて、ベータガラクトシダーゼ活性比率をプロットして作成したモデル曲線に当てはめることにより、個体の老化度を判断する方法。